CN102424859B

CN102424859B - 结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒

Info

Publication number: CN102424859B
Application number: CN 201110458909
Authority: CN
Inventors: 何海华; 李烈军
Original assignee: Hybribio Ltd
Current assignee: Hybribio Ltd
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102424859A

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒，包括：（1）一个基因芯片，其上带有：（

）核苷酸探针，其中探针为SEQIDNos：1-31或与SEQIDNos：1-31互补的序列；（

）标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQIDNo.32；（

）结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列，序列为SEQIDNo.33；（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQIDNos.34-41。本发明所述试剂盒能够检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性，为结核病预防和治疗提供参考依据有极其重要的意义。

Description

结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因领域，具体是结核分枝杆菌（MTB）耐药（利福平和异烟肼）突变基因检测试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)侵入人体后引起的一种具有强传染性的慢性消耗性疾病，其发病率较高，危害性极大。WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，并于1995年起将每年的3月24日定为“世界防治结核病日”，以提醒公众加深对结核病的认识。

据WHO报道，全世界有2000万结核病人，每年新增病例800万之多，每年约有300万人死于结核病，位居各类传染病死亡人数之首。根据最新的卫生部调查显示：我国有5.5亿人感染过结核杆菌，目前有肺结核病人约450万，其中传染性肺结核病人约150万，结核病患者数量居世界第二位。中国每年约有130万新发病例，是全球22个结核病高负担国家之一，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。

近几年由于抗生素类药物的滥用和不合理的治疗方案，加上结核杆菌的变异性较大，导致结核病多重耐药株的出现和传播，给临床上治疗结核病带来极大的困扰。耐多药结核病(MDR-TB )是指耐异烟肼和利福平两种或两种以上抗结核药物的结核分枝杆菌引起的结核病。1992年美国发生了多起耐多药结核病的暴发流行，不仅耐药菌传播快，而且患者病情进展迅速，从诊断到死亡平均4～6周，死亡率高(37%)，而在人免疫缺陷病毒感染者中死亡率更高(72%～89%) ，已被称为“第三种流行病”(第一种是AIDS，第二种是结核病)。MDR患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的结核化疗方案治疗无效，而传统的药敏试验需1～2月时间，有些患者在药敏结果出来前已死亡。耐药菌不仅在AIDS 患者中播散，也传染给医护人员和其它AIDS 接触者。我国的结核病疫情和耐药情况也很严重。耐多药结核患者所携带的结核分枝杆菌对健康人群的威胁比不耐药的结核病患者更大，而在治疗花费上，一般的结核病人的治疗费用在每人150～200元，耐药病人则需要每人1.5万～2万元。因此，耐药结核既是严重的公共卫生问题，也是沉重的经济问题。

在结核病治疗和控制的初期必须依赖于准确检测方法的实施，目前在临床实验室仍然用常规方法，即绝对浓度法、比例法和抗性比率法，但这些方法均以细菌生长为终点判断结果，由于结核分枝杆菌生长缓慢，在得到分离培养物后仍需4～8周方能获得结果，所以急需建立快速、准确、可靠的药物敏感性试验方法。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，结核分枝杆菌的耐药机制及耐药的分子基础大部分已被阐明，建立了快速检测结核分枝杆菌耐药基因的方法，为结核分枝杆菌快速药物敏感性试验开辟了一条新的途径。

经研究发现，异烟肼的耐药性50%-70%是由katG基因的315位点突变引起的，5%-10%是由inhA基因的突变引起的；利福平的耐药性95%-99%以上是由编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变引起，突变均发生在rpoB 509～533位的25个氨基酸（75bp）组成的区域内，且临床上多数耐利福平药物的菌株也耐异烟肼。

杂交法能提升DNA分析的特异性，但是大多数杂交方法耗时耗力，无法达到临床快速检测的要求。将PCR检测灵敏性高的特点配合特异性极高的反斑点杂交技术以一种简单、快速且省钱的方式结合起来，利用导流杂交技术(美国专利5,741,647和6,020,187；中国专利02102795.1)可大大提高杂交的效率，且操作方便。因此，研制和开发一种可利用导流杂交技术快速、简便、特异、敏感检测3个耐药基因（rpoB、katG、inhA）主要突变，提示对两种一线抗结核药物（利福平和异烟肼）耐药性的检测试剂和仪器具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种结核分枝杆菌（MTB）耐药（利福平和异烟肼）突变基因检测试剂盒，包括：

（1）一个基因芯片，其上带有：

（

）结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针，其中探针为SEQ ID Nos：1-31或与SEQ ID Nos：1-31互补的序列，探针序列如下：

名称序列序列号

rpoB WT1 5′- ACTCGGCTGGTGCCGAAGA -3′ SEQ ID NO.1

rpoB WT2 5′- TGGCATGAATTGGCTCAGC -3′ SEQ ID NO.2

rpoB WT3 5′- CGCATGGACCAGAACAACC -3′ SEQ ID NO.3

rpoB WT4 5′- CAGCGGGTCAACCCCGA -3′ SEQ ID NO.4

rpoB WT5 5′- CGTGACCCACAAGCGC -3′ SEQ ID NO.5

rpoB WT6 5′- GGGACTGTCGGCGCTG -3′ SEQ ID NO.6

rpoB MT1 5′- CCACCAGCCAGCCGAG -3′ SEQ ID NO.7

rpoB MT2 5′- CAGCTGAGCAAATTCATGGAC -3′ SEQ ID NO.8

rpoB MT3 5′- CAGCTGAGCCCATTCATGGAC -3′ SEQ ID NO.9

rpoB MT4 5′- CAGAGCCAATTCTTCATGGAC -3′ SEQ ID NO.10

rpoB MT5 5′- AACGCCAATTCATGTACCAGAAC -3′ SEQ ID NO.11

rpoB MT6 5′- CCATTCATGGGCCAGAACAA -3′ SEQ ID NO.12

rpoB MT7 5′- ACCCAATTCATGGTCCAGAACA -3′ SEQ ID NO.13

rpoB MT8 5′- CCGCTGTTGGGGTTGAC -3′ SEQ ID NO.14

rpoB MT9 5′- CCGCTGCAGGGGTTGAC -3′ SEQ ID NO.15

rpoB MT10 5′- GGGTTGACCAACAAGCGC -3′ SEQ ID NO.16

rpoB MT11 5′- CGGTTGACCTACAAGGCGG -3′ SEQ ID NO.17

rpoB MT12 5′- CGGGGTTGACCGACAAGC -3′ SEQ ID NO.18

rpoB MT13 5′- CAGACCCTCAAGCGCCG -3′ SEQ ID NO.19

rpoB MT14 5′- CGCGTTGACCCGCAAG -3′ SEQ ID NO.20

rpoB MT15 5′- GGGACTGTTGGCGCTGG -3′ SEQ ID NO.21

rpoB MT16 5′- GGGACTGTGGGCGCTG -3′ SEQ ID NO.22

katG WT 5′- CACCAGCGGCATCGAT -3′ SEQ ID NO.23

katG MT1 5′- CACCACCGGCATCGAGAT -3′ SEQ ID NO.24

katG MT2 5′- TCACCACAGGCATCGAGGGA -3′ SEQ ID NO.25

katG MT3 5′- ACCAACGGCATCGAGGATC -3′ SEQ ID NO.26

inhA WT 5′- ACGATAGGTTGTCGGGGTGAG -3′ SEQ ID NO.27

inhA MT1 5′- GCGAGATGATAGGTTGTGCG -3′ SEQ ID NO.28

inhA MT2 5′- ACGATAGGATGTCGGGGTGAG -3′ SEQ ID NO.29

inhA MT3 5′- GCGATACGATAGGTTGTGCG -3′ SEQ ID NO.30

inhA MT4 5′- CGATAGGCTGTCGGGGTAGA -3′ SEQ ID NO.31

（

）标记有生物素点的DNA序列（Bio），用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No.32：

Bio 5′- CGTAGAAGGGGAAACTGATCT -3′ （SEQ ID No.32）;

（

）结核分枝杆菌复合群的IS6110 DNA序列（IC），作为内控点，用于监控PCR体系及是否为结核分枝杆菌复合群，序列为SEQ ID No.33：

IC 5′- CTCGACACATAGGTGAGGTCTG -3′ （SEQ ID No.33）；

（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos.34-41，引物序列如下：

名称序列序列号

rpoB F 5′- CAGGCGATCACACCGCAGA -3′ SEQ ID NO.34

rpoB R 5′- CGCCCGGCACGCTCA -3′ SEQ ID NO.35

katG F 5′- TCGAGGCTGCTCCGCC -3′ SEQ ID NO.36

katG R 5′- TCATTTCGACGGGGTGTC -3′ SEQ ID NO.37

inhA F 5′- CTTGAGTCACACCGACAAACG -3′ SEQ ID NO.38

inhA R 5′- CCAGGACTGAACGGGATACTAA -3′ SEQ ID NO.39

IS6110F 5′-GCCGATCTCGTCCACC-3′ SEQ ID NO.40

IS6110R 5′-GAGGCGTCGGTGACAAAG-3′ SEQ ID NO.41

上述包括结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点。本发明针对rpoB、katG和inhA设计的探针有着合理的碱基成分，探针的退火温度在44.5℃到47℃之间，相对比较均一，即探针和对应的PCR产物杂交时最适宜的温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。

本发明上述的试剂盒，所述探针5′或3′端经过胺基化处理。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。

本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

（1）DNA探针的制备：分别合成与结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA 主要突变位点序列DNA互补的5′末端经过胺基化的DNA片段

分别从结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA主要突变位点序列DNA中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5′末端经过胺基化的DNA片段；

（2）固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上

先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；

（3）制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。

利用本发明所述的试剂盒检测结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA主要突变位点的方法包括以下步骤：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。

具体步骤如下：

第一步：扩增样品

将临床样本中提取的DNA通过试剂盒进行扩增，所用引物的5′端标记有生物素，扩增得到5′端带有生物素标记的DNA产物；

第二步：杂交

使用导流杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的DNA探针、Bio和IC进行反应；

第三步：显色

在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系统显色，肉眼直接观察结果。

在基因检测中，由于操作步骤繁琐，操作失误难以避免，本发明在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和扩增结核分枝杆菌复合群的IS6110 DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系以及检测是否为结核分枝杆菌复合群，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。另外，在现有技术中，一般使用传统杂交方法进行杂交，操作起来较为麻烦，检测时间长，一般至少都在6个小时以上；本发明使用尼龙膜做为探针载体，不但有利于导流杂交技术的应用，且具有很好的弹性，便于生产和操作，缩短了检测时间，只需要3.5小时左右，显色结果的背景干净。

利福平和异烟肼临床上最常见的一线抗结核药物。本发明所述试剂盒——结核分枝杆菌（MTB）耐药（利福平和异烟肼）突变基因检测试剂盒检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，无疑对指导临床上选择有效的抗结核药物，保证治疗效果及减少耐药菌株的扩散，研究普通人群中耐药MTB流行状况，为结核病预防和治疗提供参考依据有极其重要的意义。

附图说明

以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1是表示基因芯片上探针和监控点的类型和具体的分布位置的图片，字母代表耐药基因rpoB、katG和inhA的野生型和主要突变位点，“Bio”代表标记有生物素点的DNA序列，“IC”代表结核分枝杆菌复合群的IS6110 DNA序列，“-—”代表空位置，不标记。

图2是表示结果阴性的图片。

图3.1～图3.6表示结核分枝杆菌耐利福平的结果图片。

图4.1～图4.4表示结核分枝杆菌耐异烟肼的结果图片。

图5.1～图5.2是表示结核分枝杆菌同时耐利福平和异烟肼的结果图片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

实施例中，20%的EDAC溶液、0.1% SDS、 0.25%脱脂奶粉、0.05%硫柳汞、0.05% 叠氮钠均是指质量比，0.1% Tween 20 是指体积比。

步骤1 基因芯片的制备

根据结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA主要突变位点设计和合成5′端带有胺基的特异性基因探针，探针具体为SEQ ID Nos：1-31，并制备IC、Bio和引物，序列分别为SEQ ID No.33、SEQ ID No.32、SEQ ID Nos.34-41，用于结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的检测。

DNA基因芯片的制作步骤如下：将制备的探针、IC和Bio首先溶解在超纯水中，制成浓度为200uM的母液，然后溶解在pH=8.4的0.5M Na₂CO₃和0.5M NaHCO₃的溶液中，使其最终浓度为2 uM。

对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放进20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。

通过微量移液设备将上述制备好的探针、IC和Bio分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4 ul。点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。

步骤2 样品制备

步骤2-1 阳性对照组样品的制备

利用引物对插入到pMD-T vector中的耐药基因rpoB、katG和inhA主要突变位点片段进行扩增。PCR反应体系为50ul，包含10x buffer, 5.0ul; 25mM MgCl₂，6.0ul; 10mM dNTP，0.5ul; 100uM生物素标记的引物混合物，0.5ul; ddH₂O，35.4ul; UNGase(1U/ ul), 0.2ul; TaqDNA聚合酶, 0.4ul; 膜板DNA，2.0ul；共50 ul。PCR反应程序为：首先37℃，5分钟，95℃变性11分钟，然后95℃，30秒；58℃，30秒；72℃，50秒；进行40个循环，最后72℃延伸5分钟。

步骤2-2 结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点标准品的制备

同步骤2-1相似步骤制备生物素结合的样本DNA扩增产物，不同之处在于利用上述各种质粒作为模板。

步骤2-3 临床样本中DNA样品的制备

提取临床样本中的DNA，然后参照步骤2-1中的方法扩增得到带有生物素标记的DNA。

步骤3 利用DNA基因芯片检测样本DNA

利用导流杂交技术，将步骤2中扩增得到的DNA样品用步骤1中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针、Bio和IC反应，最后根据显色情况进行判断，有显色的探针点表示相应的病原体感染，IC点显色表示扩增成功，Bio点显色表示杂交成功。进行临床样本检测的同时，做阳性对照和阴性对照。

将扩增获得的50ul产物95℃下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到事先温浴到45℃的0.5ml杂交液中（2xSSC/0.1%SDS）,混匀后加入到杂交仪的反应孔中，应用于步骤1制得的基因芯片，45℃杂交10分钟。然后用溶液B（2xSSC/0.1%SDS，45℃温浴）清洗3遍。加入0.5ml封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25℃封闭5分钟。抽干后加入0.5ml的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用0.8ml溶液A（TBS，0.1% Tween 20 及 0.05% 叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5ml的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。

序列表

<110> 广东凯普生物科技股份有限公司

<120> 结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒

<160> 41

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT1

<400> 1

actcggctgg tgccgaaga 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT2

<400> 2

tggcatgaat tggctcagc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT3

<400> 3

cgcatggacc agaacaacc 19

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT4

<400> 4

cagcgggtca accccga 17

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT5

<400> 5

cgtgacccac aagcgc 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB WT6

<400> 6

gggactgtcg gcgctg 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT1

<400> 7

ccaccagcca gccgag 16

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT2

<400> 8

cagctgagca aattcatgga c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT3

<400> 9

cagctgagcc cattcatgga c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT4

<400> 10

cagagccaat tcttcatgga c 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT5

<400> 11

aacgccaatt catgtaccag aac 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT6

<400> 12

ccattcatgg gccagaacaa 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT7

<400> 13

acccaattca tggtccagaa ca 22

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT8

<400> 14

ccgctgttgg ggttgac 17

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT9

<400> 15

ccgctgcagg ggttgac 17

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT10

<400> 16

gggttgacca acaagcgc 18

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT11

<400> 17

cggttgacct acaaggcgg 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT12

<400> 18

cggggttgac cgacaagc 18

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT13

<400> 19

cagaccctca agcgccg 17

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT14

<400> 20

cgcgttgacc cgcaag 16

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT15

<400> 21

gggactgttg gcgctgg 17

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB MT16

<400> 22

gggactgtgg gcgctg 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG WT

<400> 23

caccagcggc atcgat 16

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG MT1

<400> 24

caccaccggc atcgagat 18

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG MT2

<400> 25

tcaccacagg catcgaggga 20

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG MT3

<400> 26

accaacggca tcgaggatc 19

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA WT

<400> 27

acgataggtt gtcggggtga g 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA MT1

<400> 28

gcgagatgat aggttgtgcg 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA MT2

<400> 29

acgataggat gtcggggtga g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA MT3

<400> 30

gcgatacgat aggttgtgcg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA MT4

<400> 31

cgataggctg tcggggtaga 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bio

<400> 32

cgtagaaggg gaaactgatc t 21

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IC

<400> 33

ctcgacacat aggtgaggtc tg 22

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB F

<400> 34

caggcgatca caccgcaga 19

<210> 35

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rpoB R

<400> 35

cgcccggcac gctca 15

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG F

<400> 36

tcgaggctgc tccgcc 16

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> katG R

<400> 37

tcatttcgac ggggtgtc 18

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA F

<400> 38

cttgagtcac accgacaaac g 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> inhA R

<400> 39

ccaggactga acgggatact aa 22

<210> 40

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IS6110F

<400> 40

gccgatctcg tccacc 16

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IS6110R

<400> 41

gaggcgtcgg tgacaaag 18

Claims

1.一种结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒，包括：

（1）一个基因芯片，其上带有：

（

）结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针，其中探针为SEQ ID Nos.1-31或与SEQ ID Nos.1-31互补的序列；

（

）标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.32；

（）结核分枝杆菌复合群的IS6110 DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.33；

（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos.34-41。

2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述探针5′或3′端经过胺基化处理。

3. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

4. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上的。

5. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。