CN105368920A - 一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、固相支持物、含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液以及显色试剂。本发明的试剂盒不仅将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，使得核酸杂交与酶联反应合二为一进行，而且将洗膜与底物显色过程合二为一进行，避免了大量的洗涤操作步骤和反应溶液，为操作人员带来了便利，节省了大量实验时间和试剂，此外还大幅度提高了样品中靶核酸的检测通量，能够使得检测结果保持较高的特异性。

Description

一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌及其耐药基因突变检测领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(结核菌)感染所导致的疾病。自20世纪后期开始，结核病发病率逐渐上升，至今仍然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病之一。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)2012年的最新统计报告，全球将近三分之一的人口曾经或者现在感染结核分枝杆菌。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，我国仍然是结核病高负担国家，虽然结核病发病率较上次调查呈现下降趋势，但又出现了新的问题。由于结核菌生长缓慢，临床结核病的诊断和耐药分析一直是一个难题，造成对结核病患者的不规范治疗现象，引起结核分枝杆菌的耐药性不断提高，严重影响患者的治疗效果。

在引起的临床结核病的致病菌中，除了结核分枝杆菌外，还有一部分非结核分枝杆菌(NTM，指分枝杆菌属中除了结核分枝杆菌外的其他分枝杆菌菌种)感染率已经占所有分枝杆菌感染的11.1％。NTM所致疾病的临床表现、X线特征和痰涂片与结核分枝杆菌导致的结核病极其相似，但治疗方式却不同，大多数非结核分枝杆菌(NTM)对临床抗结核药物呈天然的抗药性，治疗方案相差较大，因此与结核分枝杆菌结核病的鉴别诊断显得尤为重要。所以运用分子诊断手段检测结核分枝杆菌的同时，需要对引起疾病极为相似的非结核分枝杆菌进行鉴别诊断。所述引起结核病的常见非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等。

随着科学技术的逐渐发展，结核病的的耐药机制及分子基础正被慢慢解开，目前的研究发现结核菌发生耐药的原因是抗结核药物作用相关基因发生突变导致抗结核药物与药物作用结合位点亲和力下降所致。越来越多的研究者试图利用各种快捷方法进行结核病耐药检测。目前耐药结核病的诊断方法种类繁多，主要可以分为表型检测和基因检测两个方面。表型检测方法主要有结核分枝杆菌药敏试验、快速检查耐药突变显微镜观察法、噬菌体药敏法、流式细胞术药敏试验，但这些种方法均存在较大局限性，远不能满足临床需求。因此结核菌的耐药研究方向逐渐转向基因检测。在临床上，五种一线抗结核药物中利福平(RFP)\异烟肼(INH)是主要药物，是国家推荐联合化疗方案的基石，但临床上已经出现严重的对利福平和异烟肼耐药的结核分枝杆菌结核病。其中利福平耐药机制比较明确，其是由于rpoB基因发生突变引起所编码RNA多聚酶β亚单位变异而导致利福平无法与RNA聚合酶结合引起耐药的。现已证明90％～95％的利福平耐药结核分枝杆菌存在rpoB基因突变，且集中于81bp核心区。因此，通过对该区域基因序列的突变检测可以获得对利福平的耐药信息。

耐药结核病基因检测主要方法有聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、双脱氧指纹图法(ddF)、直接测序法以及基因芯片法等，但这些方法都由于操作繁琐、成本较高、技术复杂或者效率较低等缺陷，未能在临床上大范围普及使用。

出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及其应用

发明内容

本发明的目的是提供一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其具有低成本、易操作、耗时短、灵敏度高、特异性好等突出技术效果，可广泛应用于临床检测。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、固相支持物、含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液以及显色试剂；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的核酸探针。

本发明的试剂盒直接将碱性磷酸酶标记链霉亲和素加入到杂交液中，可以在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在固相支持物表面形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，省去了传统反向分子杂交技术中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤以及其他多个操作步骤，极大缩短了传统方法检测靶核酸的耗时。

在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。

在本发明的试剂盒中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C₂上有一戊酸侧链；生物素分子通过其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。

在本发明的试剂盒中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数(K)为1015L/mol。在本发明的方法中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，将所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的时间。

根据本发明的一个具体实施例，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。在本发明的方法中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于：0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1μg/ml、1.1μg/ml和1.2μg/ml。

在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶DNA检测结果的准确性。

根据本发明的一个具体实施例，所述杂交液包括锌离子、镁离子、蛋白、非离子型表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述蛋白选自白蛋白、酪蛋白和明胶，所述非离子型表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，蛋白占杂交液的0.1％～10％(w/v)，非离子型表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，蛋白占杂交液的1％～5％(w/v)，非离子型表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

根据本发明的一个具体实施例，所述锌离子可以选自含锌离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含锌离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锌、氯化锌以及其他各种在溶液状态可以解离出锌离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述镁离子可以选自含镁离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含镁离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镁、乙酸镁、氯化镁以及其他各种在溶液状态可以解离出镁离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20(Tween-20)、吐温21(Tween-21)、吐温40(Tween-40)、吐温60(Tween-60)、吐温61(Tween-61)、吐温80(Tween-80)、吐温81(Tween-81)和吐温85(Tween-85)，其中吐温20是特别优选的。

根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优选的。

在本发明的试剂盒中，本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，酸、碱、盐离子或温度条件的变化都可能会改变甚至使碱性磷酸酶完全失去活性，因此为了实现本发明的目的，杂交液成分的选择是极为重要的。在本发明的试剂盒中，发明人通过在杂交液中添加锌离子、镁离子、蛋白和非离子型表面活性剂，一方面有助于提高核酸杂交效率，另一方面防止杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素因吸附而变性，再一方面防止碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变性。

在本发明的试剂盒中，所述蛋白分子与非离子表面活性剂在杂交液中还能够进一步发生协同效应，共同通过范德华力结合到固相支持物的表面，有效防止未反应的碱性磷酸酶标记链霉亲和素和/或生物素标记靶标核酸在固相支持物表面的非特异性吸附，起到很好的封闭作用，从而使本发明的方法可以省去杂交反应前的预杂交步骤。

在本发明的试剂盒中，所述阳离子型聚合物能够与生物素标记的靶核酸分子(通过PCR扩增获得的生物素标记靶核酸分子)产生静电吸附作用，使单链核酸分子(带许多负电荷)带上一个正电荷部分，从而在核酸分子杂交过程中同步吸附到固相支持物的表面。由于碱性磷酸酶标记链霉亲和素也带有正电荷，这样就避免了碱性磷酸酶非特异性吸附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合物可以使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成以后标记在核酸偶联物上的碱性磷酸酶保持活性状态，从而使得碱性磷酸酶构象的平衡转换朝着天然状态移动。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在本质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括其他成分，可以列举的杂交液中其他成分的实例包括但不限于：氯化钠、杂交缓冲溶液、Denhardt's溶液、十二烷基肌氨酸钠或十二烷基磺酸钠。可以用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液不包括乙二胺四乙酸盐、无机磷酸盐和乙醇胺。

根据本发明的一个具体实施例，所述显色试剂包括底物溶液和显色缓冲溶液；其中，所述显色缓冲溶液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷。

本发明的试剂盒通过在显色试剂中添加烷基葡萄糖苷，在不影响酶催化底物反应的前提下，使得显色试剂具有了显著的洗涤效果，从而可以省略传统酶显色之前的洗涤步骤，极大缩短了传统方法检测靶核酸的耗时。

根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述显色溶液包含Tris-HCl缓冲溶液，优选PH9.5的Tris-HCl缓冲溶液。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的试剂盒中，所述Tris-HCl缓冲溶液能够在显色反应过程与烷基葡萄糖苷发生协同配合作用，实现对固相支持物表面的清洗，去除非特异性吸附在固相支持物表面的物质，从而在杂交反应后无须经过单独的洗膜步骤就可以直接在显色溶液中通过酶促反应使底物形成有色产物而显色。

根据本发明的一个具体实施例，所述底物溶液包括但不限于：硝基蓝四氮唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)溶液、坚牢红溶液和萘酚ASMX溶液。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自尼龙膜、硝酸纤维素膜或聚丙烯膜；其中，尼龙膜和硝酸纤维素膜是优选的，硝酸纤维素膜是特别优选的。

在本发明的方法中，选择合适的固相支持物处理方法以及核酸探针在固相支持物表面的固定方法在本领域技术人员的知识范围内。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针，优选选自长度为16～25个碱基的寡核苷酸探针。

本发明的试剂盒选择了合适的核酸探针长度和组成，降低了核酸探针与生物素标记靶核酸杂交的温度，从而使得杂交反应与酶联反应能够统一成一个一步反应过程进行。本发明的发明人经过大量实验发现，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针时比较合适，优选选自长度为16～25个碱基的寡核苷酸探针，此时杂交反应的温度可以为37～42℃。特别优选的DNA探针的长度包括16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个碱基。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针包括：

用于检测结核分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：11～13；

用于检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：14～16；

用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：17～19；

用于检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：20～22；

用于检测脓肿分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：23～25

用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：26～28；

用于检测T533C野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：29～30；

用于检测T533C突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：31～32；

用于检测C531T野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：33～34；

用于检测C531T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：35～36；

用于检测526野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：37～38；

用于检测C526G突变探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：39～40；

用于检测C526T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：41～42；

用于检测A526T突变探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：43～44；

用于检测A526G突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：45～46；

用于检测A516T野生型探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：47～48；

用于检测A516T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：49～50；

用于检测T511C野生型探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：51～52；

用于检测T511C突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：53～54。

本发明的试剂盒以编码16SrRNA基因序列作为细菌分类基础，通过一次检测实验就可鉴定致病性的、分离率最高的6种分枝杆菌作为试剂盒检测指标：结核、鸟、胞内、偶然、脓肿和堪萨斯分枝杆菌。此外，本发明的试剂盒还可以检测rpoB基因531、526、516、533、511和513氨基酸位点的8-10个基因突变型(临床总覆盖率超过90％)，以反映结核菌对利福平的耐药性。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针包括：

用于检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：17所示；

用于检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：20所示；

用于检测脓肿分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：23所示；

用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：26所示；

用于检测T533C野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：29所示；

用于检测T533C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：31所示；

用于检测C531T野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：33所示；

用于检测C531T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：35所示；

用于检测526野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：37所示；

用于检测C526G突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：39所示；

用于检测C526T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：41所示；

用于检测A526T突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：43所示；

用于检测A526G突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：45所示；

用于检测A516T野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：47所示；

用于检测A516T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：49所示；

用于检测T511C野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：51所示；

用于检测T511C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：53所示。

本发明的核酸探针具有灵敏度高和特异性高的优点，用于检测分支杆菌的探针是根据分枝杆菌的16SrDNA基因序列设计的。16SrDNA是细菌系统分类学中最有用的和最常用的分子钟，存在于所有生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构和功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。16Sr大小适中，碱基长度约1.5kb左右，方便用于PCR扩增和测序，成为系统发育关系分类的标准方法。16SrDNA结构由可变区和恒定区组成，不同细菌的恒定区序列基本保守，而可变区序列则因细菌而异，因此，可以根据其恒定区的序列设计引物将16SrDNA扩增出来，利用可变区序列的差异来对设计特异的探针对不同的细菌进行分类。本发明设计的分枝杆菌探针能够分别特异地鉴定结核分枝杆菌群(包括人型结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌，这三种分枝杆菌基因序列及其致病性高度一致，无需再分)、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌而不与其它细菌菌种及其它分枝杆菌菌种交叉反应。用于检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的探针：针对每种碱基突变型都设置了2种探针，即该型的野生型(即未突变型)探针和该突变型的突变探针。例如，当检测的rpoB基因在531位点未发生突变时，531野生型探针会呈阳性而对应的C531T突变探针则呈阴性；当检测的rpoB基因在该位点发生531C→T突变时，531野生型探针会呈阴性而C531T突变型探针则呈阳性。从而能够高度地识别不同的单碱基突变的存在情况。同时，为了克服传统探针检测单碱基突变的信号不够灵敏的缺点，本发明进行了专门的设计，在引入人工错义突变的基础上显著增加了寡核苷酸探针的长度，从而在保持这些探针的高度特异性型的基础上大大提高了核酸探针的杂交信号。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阳性对照探针，其序列选自SEQIDNOs：55～56。本发明的阳性对照探针可以来自人体Actin基因序列，其不仅能够高度特异地检测样本中的人体基因组的存在，而且能够用于质控临床样本核酸的提取质量，并质控检测反应过程的正常进行。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阴性对照探针，其序列如SEQIDNO：57所示。本发明的阴性对照探针可以来自引物设计软件随机生成的一段序列，其特点是不与任何生物的核酸序列相似，其能够起到很好的阴性对照作用，质控检测反应的特异性。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括第一引物组，所述第一引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：1所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：2所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端均用生物素标记。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括第二引物组，所述第二引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：4所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端用生物素标记。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括用于扩增作为阳性对照品的Actin基因的引物对；其中，

用于扩增Actin基因的上游引物序列如SEQIDNO：9所示，5’端生物素标记；

用于扩增Actin基因的下游引物序列如SEQIDNO：10所示；

本发明的试剂盒使用多重PCR引物对靶核酸进行PCR扩增和生物素标记，其中一组引物对用于扩增16SrDNA基因，产物通过固相支持物表面固定的核苷酸序列选自SEQIDNOs：11～28的寡核苷酸探针来检测，可以鉴定结核、鸟、胞内、偶然、脓肿或堪萨斯分枝杆菌；另一组引物对用于扩增rpoB基因，产物通过固相支持物表面固定的核苷酸序列选自SEQIDNOs：29～54的寡核苷酸探针来检测，可以鉴定C531T、C526G、T533C、C526T、A526T、A526G、A516T或T511C位点的突变；此外，本发明的试剂盒还有一组阳性对照引物对用于质控PCR反应体系。由此，本发明的试剂盒可以在鉴定出结核分枝杆菌的同时，检测其对利福平药物是敏感还是耐药。

为了提高本发明的试剂盒中核酸探针检测靶核酸的特异性，本发明的试剂盒专门为每条用于检测基因突变的核酸探针引入了一个人工错义突变碱基。常规方法检测单个碱基突变时，为了达到识别单个碱基差异的目的，需要把核酸探针序列缩短为15～16个碱基，但缺点是核酸探针的杂交信号很弱，而且由于单个碱基的错配仍然容易产生交叉反应。为了解决这个问题，本发明的试剂盒在用于检测基因突变的核酸探针序列中专门引入一个人为的错义突变(此位点靠近核酸探针的一端)，同时增加核酸探针的长度为18～20个碱基，从而显著提高了核酸探针的杂交效率。因此，当将本发明的试剂盒用于检测野生型rpoB基因时，核酸探针序列与靶核酸存在2个碱基的不匹配，就不会杂交，而野生型探针与靶核酸虽然也有一个碱基不匹配，但这个碱基靠近核酸探针的一端，因此仍然会与靶核酸产生有效的杂交；而当将本发明的试剂盒用于检测突变型rpoB基因时，野生型探针序列与靶核酸存在2个碱基的不匹配，就不会杂交，而突变检测探针与靶核酸虽然也有一个碱基不匹配，但这个碱基也靠近核酸探针的一端，因此仍然会与靶核酸产生有效的杂交。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括用于增强所述引物对的PCR扩增效率的加强引物对；其中，

所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO：7所示，5’端生物素标记；

所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO：8所示。

在本发明的试剂盒中，所述加强引物对的序列同时也是第一引物组或第二引物组的序列的一部分，可以用于提高所述两个引物组的PCR扩增效率。

根据本发明的一个具体实施例，当将加强引物对与第一引物组一起作为混合引物使用时，可以增强用于扩增rpoB基因的引物对的PCR扩增的效率。

根据本发明的一个具体实施例，当将加强引物对与第二引物组一起作为混合引物使用时，可以同时增强用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对的PCR扩增效率。

在本发明的试剂盒中，所述加强引物对的工作原理如下：除了PCR反应体系中加入加强引物对外，扩增rpoB基因的引物对或/和16SrDNA引物对的5’端也连接了加强引物的序列。这样，扩增样品开始阶段，rpoB基因或/和16SrDNA的片段被扩增出来，这时这些片段中就被引入了加强引物序列，于是加强引物对(浓度较高)开始工作，高效率地扩增rpoB基因或/和16SrDNA的片段，因此，rpoB基因或/和16SrDNA的扩增效率增加明显，显著提高了rpoB基因突变的检测灵敏度。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括TaqDNA聚合酶、4xdNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、缓冲溶液剂、镁离子及其他必要成分。其中，所述缓冲溶液可以是10～50mmol/LTris-HCl缓冲溶液，镁离子的浓度可以选自1.5～2.5mM，优选浓度是2mM。

在本发明的试剂盒中，所述的“核酸探针”是指在含有与靶序列互补的碱基序列核酸中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探针具有与所述靶序列至少一部分互补的序列，由此，可在适宜的条件下与靶序列进行杂交。

在本发明的试剂盒中，所述的“靶核酸”是指具有靶序列的核酸，其可以来自于被检测者的痰液、血液、支气管洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌基因组核酸样品。

在本发明的试剂盒中，所述的“靶序列”是指在靶核酸中包含的序列，靶序列用于检测靶核酸。

本发明的试剂盒可以使用常规核酸提取方法或市售的核酸提取试剂盒从临床样品中提取靶核酸。

本发明的试剂盒不仅将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，使得核酸杂交与酶联反应合二为一进行，而且可以将洗膜与显色过程合二为一进行，避免了大量的洗涤操作步骤和反应溶液，从而把传统反向分子杂交技术变成了一项简易操作的模式，既为操作人员带来了便利，实验不再容易出错，又节省了大量实验时间和试剂，此外还大幅度提高了样品中靶核酸的检测通量，能够使得检测结果保持较高的特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见，下面简述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示本发明的实施例9的显色结果图。

图2表示本发明的实施例10的显色结果图。

图3表示本发明的实施例11的显色结果图。

图4表示本发明的实施例12的显色结果图。

图5表示本发明的实施例13的显色结果图。

图6表示本发明的实施例14的显色结果图。

图7表示本发明的实施例15的显色结果图。

图8表示本发明的实施例16的显色结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，牛血清白蛋白(以下简称BSA)、阳离子型聚丙烯酰胺(以下简称CPAM)、碱性磷酸酶标记链霉亲和素(以下简称SA-AP)、多聚赖氨酸(以下简称PLL)、聚乙二醇8000、烷基葡萄糖苷的浓度是以g/ml计的质量体积百分比浓度；Tween-20和TritonX-100的浓度是指体积百分比浓度。

以下为结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒的制备实施例

实施例1：

主要原料及试剂

硝酸纤维素膜：由密理博公司(Millipore)生产，0.45μm孔径规格；

20×SSC缓冲溶液，其配制过程如下：称取88.2g柠檬酸三钠(购自上海生工)和175.3gNaCl溶解于800ml纯水中，充分混匀，用浓HCl调节溶液pH值至7.0±0.1，补加纯水至1000ml即可；

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)：5U/μl，100μl购自上海江莱生物科技有限公司；

10×TdT缓冲液：与TdT酶配套，由上海江莱生物科技有限公司提供；

dTTP：100mmol/L，购自promega公司；

用于检测结核分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：11所示；

用于检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：17所示；

用于检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：20所示；

用于检测脓肿分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：23所示；

用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：26所示；

用于检测T533C野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：29所示；

用于检测T533C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：31所示；

用于检测C531T野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：33所示；

用于检测C531T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：35所示；

用于检测526野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：37所示；

用于检测C526G突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：39所示；

用于检测C526T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：41所示；

用于检测A526T突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：43所示；

用于检测A526G突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：45所示；

用于检测A516T野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：47所示；

用于检测A516T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：49所示；

用于检测T511C野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：51所示；

用于检测T511C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：53所示。

阳性对照探针，其序列如SEQIDNO：55所示；

阴性对照探针，其序列如SEQIDNO：57所示；

GoTaq酶：5U/μl，购自promega公司；

10×Taq酶反应缓冲溶液：购自promega公司；

MgCl₂：25mM，购自promega公司；

dNTPsMix：10mM，购自promega公司；

碱性磷酸酶标记链霉亲和素购自Gibcol公司；

氯化锌：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

牛血清白蛋白(BSA)：购自Sigma-Aldrich；

Tween-20：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

多聚赖氨酸：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

聚乙二醇8000、正十二烷基葡萄糖苷、硝基蓝四氮唑(以下简称NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(以下简称BCIP)均直接购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

(一)固相支持物的制备

1.1固相支持物的处理：将硝酸纤维素膜裁成2cm×1cm，用镊子取硝酸纤维素膜放置在15×SSC中浸泡15min，取出后置于滤纸上，60℃烘干1.5小时。

1.2核酸探针溶液配制：对6种用于检测分枝杆菌的探针、13种用于检测rpoB基因突变的探针以及阳性对照探针和阴性对照探针，用灭菌纯水分别溶解上述21种探针的干粉，配制成浓度为100μM的探针溶液。

1.3核酸探针加尾：对每种核酸探针溶液(100μM，即100pmol/μl)，取2μl即200pmol的核酸探针量加入到100μl含有60UTdT酶、1×TdT反应缓冲液和100nmol/L的dTTP溶液中，37℃温育60min；然后加入100μl的10mmol/LEDTA终止反应(此时探针终浓度为1pmol/μl)。

1.4核酸探针在固相支持物表面的固定：对加尾后核酸探针(1pmol/μl))、阳性对照探针和阴性对照探针溶液，分别取1μl(含1pmol的探针量)点于硝酸纤维素膜上，将膜置于用TE浸湿的纸上，经254nm紫外光照射10min固定。

核酸探针在硝酸纤维素膜表面的排布顺序如下表1所示：

表1

(二)PCR反应试剂的制备

2.1引物溶液配制：分别用灭菌纯水溶解用于扩增16SrDNA的上游引物SEQIDNO：1和下游引物SEQIDNO：2、用于扩增rpoB基因的上游引物SEQIDNO：5和下游引物SEQIDNO：6以及用于扩增Actin基因的上游引物SEQIDNO：9和下游引物SEQIDNO：10这6种引物的干粉，配制成浓度为100μM的引物溶液。

2.2按照下列比例配制50μl反应体系的PCR反应试剂：

GoTaq酶：1U；

酶反应缓冲溶液：1×；

用于扩增16SrDNA的上游引物(SEQIDNO：1)，5’端生物素标记；：0.2μM；

用于扩增16SrDNA的下游引物(SEQIDNO：2)：0.2μM；

用于扩增rpoB基因的上游引物(SEQIDNO：5)，5’端生物素标记；：0.2μM；

用于扩增rpoB基因的下游引物(SEQIDNO：6)：0.2μM；

用于扩增Actin基因的上游引物(SEQIDNO：9)，5’端生物素标记；：0.2μM；

用于扩增Actin基因的下游引物(SEQIDNO：10)：0.2μM；

MgCl₂：2.0mM；

dNTPsMix：每种核苷酸的浓度均为0.2mM；

余量为水；

将上述各组分混匀，即可配成PCR反应试剂。

(三)杂交液的制备

表2

原料名称	每1000ml用量
		20×SSC	150ml
ZnCl2	1.36g
		MgCl2·6H2O	2.03g
Tween-20	5ml
		PLL	1g
聚乙二醇8000	20g
		SA-AP	1mg
BSA	20g
		纯水	700ml

分别量取150ml的20×SSC缓冲液和700ml的纯水，充分混匀；然后向其中分别加入1.36g的ZnCl₂、2.03g的MgCl₂·6H₂O、5ml的Tween20、1g的PLL、20g的聚乙二醇8000以及1mg的SA-AP和20g的BSA，充分溶解、混匀，补加纯水至1000ml，即可得到组成如下的杂交液：PH7.0，3×SSC，1μg/mlSA-AP，10mMZnCl₂，10mMMgCl₂，2％BSA，0.5％Tween-20，0.1％PLL，2％聚乙二醇8000，余量为水。

(四)显色缓冲溶液的制备

表3

原料名称	每1000ml用量
		NaCl	5.8g
MgCl2·6H2O	10.2g
		Tris	12.1g
正十二烷基葡萄糖苷	0.7g
		纯水	900ml

在900ml纯水中，加入5.8gNaCl、10.2gMgCl₂·6H2O、12.1gTris以及0.7g正十二烷基葡萄糖苷充分溶解混匀，用浓HCl调节溶液pH值至9.5±0.1，转移到容量瓶中加纯水定容至1000ml，得到组成如下的显色缓冲液：PH9.5、0.1mol/LNaCl、0.1mol/LTris-HCl、50mMMgCl₂以及0.07％正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。

(五)底物制备

5.1底物1的制备：称取100mg的NBT溶于1ml的70％二甲基甲酰胺配成100mg/ml的NBT水溶液，即底物1。

5.2底物2的制备：称取50mg的BCIP溶于1ml的100％二甲基甲酰胺配成50mg/ml的BCIP水溶液，即底物2。

因此，本实施例的一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒的试剂盒的具体组分如下表4所示，其包括PCR反应试剂、固相支持物、含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液以及显色试剂；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的核酸探针。

表4

实施例2：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液的组成调整为：3×SSC、0.1μg/mlSA-AP、5mMZnCl₂、5mMMgCl₂、0.5％BSA、0.03％Tween-20、0.03％PLL和2％聚乙二醇8000，余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.33mg/mlNBT、0.17mg/mlBCIP和0.03％正十六烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例3：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为：3×SSC、1.5μg/mlSA-AP、50mMZnCl₂、50mMMgCl₂、7％BSA、1.5％Tween-20、0.3％CPAM和4％聚乙二醇8000，余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.33mg/mlNBT、0.17mg/mlBCIP和0.2％正辛基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例4：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为：3×SSC，0.5μg/mlSA-AP，20mMZnCl₂，20mMMgCl₂，1％BSA，0.05％TritonX-100，0.05％CPAM，4％聚乙二醇8000，余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.33mg/mlNBT、0.17mg/mlBCIP和0.05％正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例5：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为：3×SSC、1.2μg/mlSA-AP、40mMZnCl₂、40mMMgCl₂、5％BSA、1％TritonX-100、0.2％PLL和4％聚乙二醇8000，余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.33mg/mlNBT、0.17mg/mlBCIP和0.1％正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例6：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中PCR反应试剂中的引物替换为：用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：4所示；用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；用于扩增Actin基因的上游引物序列如SEQIDNO：9；用于扩增Actin基因的引物序列如SEQIDNO：10。每个引物对的上游引物的5’端用生物素标记。其他条件不变。

实施例7：

同实施例1，不同之处在于在实施例1中PCR反应试剂还包括用于增强所述引物对的PCR扩增效率的加强引物对；其中，所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO：7所示，5’端生物素标记；所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO：8所示。其他条件不变。

实施例8：

同实施例6，不同之处在于在实施例1中PCR反应试剂还包括用于增强所述引物对的PCR扩增效率的加强引物对；其中，所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO：7所示，5’端生物素标记；所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO：8所示。其他条件不变。

以下为检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒的应用实施例

实施例9：用实施例1的试剂盒对临床样品进行检测

本实施例中的临床样品来自一名对利福平耐药的临床结核病患者的痰样本(经过提取核酸进行PCR测序实验证实其rpoB基因在533位点发生了T→C的核酸碱基变异)。

(一)靶核酸的提取

取1ml痰样本与1ml浓度为4M的NaOH溶液混匀，室温放置30min液化痰，混匀后，取1ml加到离心管内以12000rpm转速离心2min，弃上清，加入1ml生理盐水悬浮，再以12000rpm转速离心2min，弃上清。余下步骤参照专利EP1407051B1的方法进行：在离心管内加入200μlTris-EDTA缓冲液(即TE缓冲液，PH8.0)振荡悬浮；再分别加入两种规格玻璃珠(200μm直径和900μm直径，4∶1质量比例)；涡旋振荡5min，然后把经振荡处理过的离心管置于90℃的水浴中加热10min，以12000转/分转速离心，取上清备用。

(二)靶核酸的扩增

2.1加模板：取49μlPCR反应试剂，加入1μl步骤(一)中提取的核酸。

2.2PCR扩增反应：首先95℃预变性5min；然后95℃1.5min；55℃1.5min；72℃，1min，35个循环；最后72℃延伸5min。

2.3PCR产物的变性：将PCR产物在95℃孵育10min，然后冰浴5min。

(三)一步反应

将表面固定有核酸探针的固相支持物放入1ml杂交液中，同时加入10μl的步骤(二)中变性后的PCR产物，混匀后于37℃反应15min。

(四)显色反应

4.1配制显色溶液：在显色缓冲液中分别加入底物1和底物2各33μl，配制成10ml组分如下所示的显色溶液：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.07％正十二烷基葡萄糖苷、0.33mg/mlNBT和0.17mg/mlBCIP，余量为水。

4.2显色反应：用镊子夹住步骤(三)中反应后的硝酸纤维素膜，让固定有核酸探针的硝酸纤维素膜表面向上，稍微倾斜膜，使得膜的一端高于另一端。用注射器取显色溶液从膜的上端的上方持续滴落显色溶液，使得显色溶液从上至下(从膜的上端滴入，从下端流出滴落)，连续流过硝酸纤维素膜的表面，流动时间为10min，观察显色结果。

本实施例的显色结果如图1所示。

实施例10

同实施例9，不同之处在于利用实施例2的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图2所示。

实施例11

同实施例9，不同之处在于利用实施例3的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图3所示。

实施例12

同实施例9，不同之处在于利用实施例4的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图4所示。

实施例13

同实施例9，不同之处在于利用实施例5的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图5所示。

实施例14

同实施例9，不同之处在于利用实施例6的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图6所示。

实施例15

同实施例9，不同之处在于利用实施例7的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图7所示。

实施例16

同实施例9，不同之处在于利用实施例8的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图8所示。、

从图1～8可以看出，检测结核分枝杆菌的探针点为阳性，另外5种分枝杆菌探针点检测阴性；检测rpoB突变的探针中：T533C突变探针点为阳性，而对应此位点的野生型探针点为阴性；C531T野生型探针点为阳性，C531T突变型探针点为阴性；526野生型探针点为阳性，C526G突变探针点为阴性，C526T突变探针点为阴性，A526T突变探针点为阴性，A526G突变探针点为阴性；A516T野生型探针点为阳性，A516T突变探针点为阴性；T511C野生型探针点为阳性，T511C突变探针点为阴性，因此这份待测临床样本中含有结核分枝杆菌，不含有其它分枝杆菌；而且这株分枝杆菌的rpoB基因在533位点发生了C→T突变，而在526位点没有发生任何突变，在516位点未发生突变，在511位点也未发生突变。由此可以推测由于rpoB基因在533位点发生了C→T突变，将会导致此株结核分枝杆菌对利福平耐药。此外，阳性对照点显示阳性，阴性对照点显示阴性，表明本次实验的检测结果正常。由于结核患者同时含有结核分枝杆菌和人体的基因组核酸，所以检测一份样本能够同时显示分枝杆菌菌种鉴定结果、rpoB基因突变情况和人体Actin基因的检测结果。如果临床样本的核酸提取步骤失败，则阳性对照探针(Actin基因探针)将会显示阴性，从而能够更好地质控实验全过程。

因此，本发明的试剂盒可以准确地检测临床样本中的结核分枝杆菌并对样本中可能存在的其它常见致病性分枝杆菌进行鉴别诊断，同时还能够检测临床样本中结核分枝杆菌的rpoB基因的突变情况，有利于指导对结核病患者的指导用药。

本发明的试剂盒不仅将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，使得核酸杂交与酶联反应合二为一进行，而且将洗膜与显色过程合二为一进行，避免了大量的洗涤操作步骤和反应溶液，从而把传统反向分子杂交技术变成了一项简易操作的模式，既为操作人员带来了便利，实验不再容易出错，又节省了大量实验时间和试剂，此外还大幅度提高了样品中靶核酸的检测通量，能够使得检测结果保持较高的特异性。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (11)

1.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、固相支持物、含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液以及显色试剂；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的核酸探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液包括锌离子、镁离子、蛋白、非离子型表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述蛋白选自白蛋白、酪蛋白和明胶，所述非离子型表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，蛋白占杂交液的0.1％～10％(w/v)，非离子型表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，蛋白占杂交液的1％～5％(w/v)，非离子型表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂包括底物溶液和显色缓冲溶液；其中，所述显色缓冲溶液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括第一引物组，所述第一引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：1所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：2所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端均用生物素标记。

7.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括第二引物组，所述第二引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：4所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端用生物素标记。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括用于增强所述引物对的PCR扩增效率的加强引物对；其中，

所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO：7所示，5’端生物素标记；

所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO：8所示。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针包括：

用于检测结核分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：11～13；

用于检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：14～16；

用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：17～19；

用于检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：20～22；

用于检测脓肿分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：23～25；

用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：26～28；

用于检测T533C野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：29～30；

用于检测T533C突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：31～32；

用于检测C531T野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：33～34；

用于检测C531T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：35～36；

用于检测526野生型的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：37～38；

用于检测C526G突变探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：39～40；

用于检测C526T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：41～42；

用于检测A526T突变探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：43～44；

用于检测A526G突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：45～46；

用于检测A516T野生型探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：47～48；

用于检测A516T突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：49～50；

用于检测T511C野生型探针的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：51～52；

用于检测T511C突变的寡核苷酸探针，其序列选自SEQIDNOs：53～54。

10.根据权利要求1～8中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针包括：

用于检测结核分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：11所示；

用于检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：17所示；

用于检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：20所示；

用于检测脓肿分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：23所示；

用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：26所示；

用于检测T533C野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：29所示；

用于检测T533C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：31所示；

用于检测C531T野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：33所示；

用于检测C531T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：35所示；

用于检测526野生型的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：37所示；

用于检测C526G突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：39所示；

用于检测C526T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：41所示；

用于检测A526T突变探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：43所示；

用于检测A526G突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：45所示；

用于检测A516T野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：47所示；

用于检测A516T突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：49所示；

用于检测T511C野生型探针的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：51所示；

用于检测T511C突变的寡核苷酸探针，其序列如SEQIDNO：53所示。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物选自尼龙膜、硝酸纤维素膜或聚丙烯膜，优选尼龙膜和硝酸纤维素膜。