CN1085957A

CN1085957A - 由sod族衍生的寡核苷酸类

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Publication number: CN1085957A
Application number: CN93118923A
Authority: CN
Inventors: W·佐尔格
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-10-12
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2013-10-12
Also published as: JPH06197769A; NO933678L; US5525463A; FI106804B; CA2108247C; AU4891993A; KR970005053B1; NZ248896A; PT592894E; FI934500A; EP0592894A1; CN1053472C; ZA937420B; FI934500A0; IL107220A; ES2158854T3; DE69330263T2; DK0592894T3; BR9304214A; EP0592894B1

Abstract

本发明描述了用超氧物歧化酶(SOD；EC 1.15.1.1)基因体系作为靶来检测和分化病原及非病原生物体(包括细菌、真菌和原生动物)。更具体地讲，描述了由SOD基因族衍生的寡核苷酸类，它们能与单链核酸序列(靶序列)杂交，此靶序列可以使用聚合酶链反应(PCR)和一对引物，通过扩增和变性一段编码超氧物歧化酶(SOD)基因片段获得。这些寡核苷酸类可以引物和探针的形式使用，来扩增和检测由SOD基因衍生的靶序列。

Description

本发明涉及用超氧物歧化酶（SOD;EC 1.15.1.1）基因体系作为靶来检测和分化病原和非病原生物体，这些生物体包括：细菌、真菌及原生动物类。另一方面，本发明涉及由SOD基因族衍生的寡核苷酸类。更具体地讲，本发明涉及能够同单链核酸序列（靶序列）杂交的寡核苷酸类，单链核酸序列可以用聚合酶链反应（PCR）及一对引物通过扩增和变性编码超氧物歧化酶（SOD）的基因片段而获得。第一个引物含有下列序列作为引物序列：

5′-AGC TTC ACC ACA GCA AGC ACC A-3′（Seq.Id.No.1;Z205）

而第二个引物含有下列序列作为引物序列：

5′-TCG^G _TCC CAG TTC ACG AC^A ₆TTC CA-3′（Seq.Id.No.2;Z212）

这些寡核苷酸类可以以引物和探针的形式使用以扩增和检测由SOD基因衍生的靶序列，特别是由病原生物体类（包括细菌、真菌及原生动物）的SOD基因衍生的靶序列。本发明的引物和探针也可以用来扩增和检测由非病原生物体SOD基因衍生的靶序列。

本发明的目的是前面提到的寡核苷酸类;基于这些寡核苷酸类的引物和探针;用来扩增和检测由SOD基因衍生的靶序列以及诊断由原核生物体类而引起的感染的方法、试剂和试剂盒;所说的寡核苷酸类在前面提到的各种目的中的应用。

SOD是一个酶，它催化超氧化物自由基（O^- ₂）的歧化，产生如下的分子氧和过氧化氢：

所得的过氧化物然后再被过氧化氢酶或过氧化物酶转变成H₂O。超氧化物（O^- ₂）是有氧呼吸的毒性副产物，它与过氧化物（O^2- ₂）反应会对蛋白质类、类脂类和核酸类造成损害。超氧物歧化酶（SOD）通过将超氧化物转变成分子氧和过氧化物而抑制了自由基的有毒作用。

术语“聚合酶链反应”或“PCR”指得是扩增一个或多个特定核酸序列的过程。其中（1）决定待扩增序列未端的寡核苷酸引物与实验样品中的单链核酸类退火，（2）一种核酸聚合酶使退火后引物的3′-端延伸，产生一核酸链，该链与同引物退火的核酸序列互补，（3）生成的双链核酸经变性产生两条单链核酸，（4）引物退火、引物延伸和产物变性过程重复足够多次，生成容易鉴别和测定量的序列，该序列是由引物限定的。接续的退火、延伸和变性步骤的实际控制是通过改变反应容器的温度实现的，通常是以重复的循环方式实现的。退火和延伸最适宜发生在37℃-80℃的温度范围（准确值依赖于引物浓度和序列），而变性需要的温度范围是80℃-100℃（准确值依赖于靶序列和浓度）。

术语“寡核苷酸”是指一个单链核酸，它含有两个或多个脱氧核糖核苷酸，例如引物、探针、待检测的核酸片段和核酸控制。一个寡核苷酸的大小由多种因素决定，且依赖于该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸类可以用任何适宜的方法制备，例如，包括克隆、适当序列的限定和直接化学合成。直接化学合成方法有磷酸三酯法（Narang等人，Meth Enzymol.68，90-99（1979））;磷酸二酯法（Brown等人，Meth.Enzymol.68，109-151（1979））;氨基磷酸二乙酯法（Beaucage等人，Tetrahedron Lett.22，1859-1862（1981））;以及美国专利说明书第4，458，066号中所述的固相载体法。

术语“引物”指一个寡核苷酸，不管是天然的，还是合成的，它能在一定条件下作为DNA合成的起始点。在该条件下可诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成，即在适当缓冲液和适宜温度下在不同的三磷酸核苷类和聚合试剂（如DNA聚合酶或逆转录酶）存在下。引物的适宜长度依赖于其预期的用途，但典型地是从15到40个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的温度来与模板形成足够稳定的杂交复合物。一个引物不必反映模板的准确序列，但必须是充分地互补以与模板杂交，并用来在所选择的反应条件下起始DNA合成。

术语“引物”可以指不只一个引物，特别是在这样的情况，其中待扩增的靶区域的一端或两端的信息不清楚。假如一个保留区域显示出显著的种群多态性水平，则可以制备引物混合物来扩增这样的序列，或者引物可被设计成扩增甚至错配的序列。如果需要，引物可以被标记，方法是掺入可以通过放射性、分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的标记物。例如，有用的标记物包括：³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶类（常用于ELISAs）、生物素或半抗原和蛋白质类，抗血清或单克隆抗体是适宜的半抗原和蛋白质。标记物也可以用来“捕获”引物，以促使引物或引物延伸产物（如扩增的DNA）在一种固相载体上定位。

术语“探针”指一种寡核苷酸，它包含一个杂交序列，此序列可以与靶序列的一部分互补。寡核苷酸可以用标记物标记，或接到一固相载体上。依赖用于检测在探针和核酸序列间形成的杂交体的测定方法，除杂交区域外，探针还可以含有附加的特性。例如，在斑点印迹法中，探针一般被标记。如果探针先被固定，像下面所述的“逆向”斑点印迹法中那样，探针也可含有长的多聚-dT臂，此臂可以经照射被固定在尼龙载体上，此技术在PCT专利公报No.89/11548上进行了更详细的描述。探针的合适长度依赖于其预期的用途，但一般为15-40个核苷酸。短的探针分子通常需要较低的温度以与靶分子形成足够稳定的杂交复合物。一个探针不必反映模板的准确序列，但必须充分地互补以与靶序列杂交。

本发明的探针可以使用上述用于合成寡核苷酸类的技术进行合成和标记。例如，通过把探针与³²P-ATP和激酶一起温育，探针可以在5′-端标记上³²P。一个适宜的探针非放射性标记物是辣根过氧化物酶（HRP）。制备和检测含有此种标记物的探针的方法在美国专利说明书第4，914，210号和第4，962，02号中进行过描述。有关此标记探针的应用的进一步信息参见美国专利说明书第4，789，630号;Saiki等人，N.Eng.J.Med.319，537-541（1988）;及Bugawan等，Biol/Technology6，943-947（1988）。有用的色原包括红色染料隐色基和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）。Helmuth描述了PCR产物的非同位素检测方法（PCR Protocols，San.Diego，California，Academic Press，Inc.1990，pp.119-128）。

本发明优选的寡核苷酸类是那些能与靶序列的一个区域杂交的寡核苷酸类，此靶序列在不同生物体（如细菌、真菌和原生动物（通用引物））的SOD基因中基本上得到保留，或者此靶序列在属于一个特定属的不同种的SOD基因中基本上得到保留（属特异寡核苷酸类）;以及那些能与靶序列的一个区域杂交的寡核苷酸类，而此序列在一定程度上是可变的，即允许属于一特定属的不同种的SOD基因的分化（种特异寡核苷酸类）。

能够与单链核酸序列（靶序列）杂交的寡核苷酸类是特别优选的，而此靶序列是使用聚合酶链反应（PCR）和一对引物，通过扩增编码分枝杆菌种的超氧物歧化酶（SOD）的基因片段获得的，第一个引物含序列Seq.Id.No.3（Z261，见表17）作为引物序列，第二个引物含上面序列Seq.Id.No.2（Z212）作为引物序列。其中，具有以下特点的寡核苷酸是更加优选的：能与靶序列的一个区域杂交，此序列在属于分枝杆菌属的不同种的SOD基因中是基本上得到保留的（属特异寡核苷酸类），和能够与靶序列的一个区域杂交，此序列在一定程度上是可变的，即允许属于分枝杆菌属的不同种的SOD基因的分化（种特异寡核苷酸类）。

像早些时候提到的，本发明的寡核苷酸类可以引物和探针的形式用于扩增和检测由病原生物体和非病原生物体的SOD基因衍生来的靶序列。病原生物体包括细菌、真菌和原生动物。在一个优选的方面，靶核酸是通过PCR，并使用一对引物进行扩增的，这对引物允许属于一特定属的不同种的SOD基因片段的扩增。然后，属检测可以通过将扩增的核酸与属特异探针混合并检测是否存在杂交来完成的，而种的鉴定是通过测定扩增的核酸与种特异探针杂交的类型来完成。

在一特别优选的实施方案中，本发明涉及能以引物和探针的形式使用，以扩增和检测靶序列的寡核苷酸类。此靶序列是由分枝杆菌种（优选病原分枝杆菌种）的SOD基因衍生而来的。靶核酸通过PCR用一对引物扩增，这对引物允许属于分枝杆菌属的不同分枝杆菌种的SOD基因片段的扩增。优选的是，这对引物的组成是：第一个引物，它含有作为引发序列，基本上与序列Seq.Id.No.3（Z261）同源的序列;第二个引物，它含有作为引发序列，基本上与序列Seq.Id.No.2（Z212）同源的序列。更优选的是，这对引物由作为引发序列的含有序列Seq.Id.No.3（Z261）的第一引物和含有序列Seq.Id.No.2（Z212）的第二引物组成。

然后属检测可以通过将扩增的核酸与属特异探针混合以及检测杂交是否存在来完成。属特异探针由作为杂交序列的寡核苷酸序列Seq.Id.No.4组成，优选探针库，它包含作为杂交序列的寡核苷酸序列Z310-Z317（表18）。种鉴定可以通过测定扩增的核酸与种特异探针的杂交类型来完成，这种种特异探针能与靶序列的一个区域杂交，此靶序列在一定程度上是可变化的，即允许属于分枝杆菌属的不同种的SOD基因的分化。

本发明可以利用的优选种特异探针是那些含有作为杂交序列，基本上与以下序列同源的序列的探针：对于胞内分枝杆菌为5′-CCT TCG GAT CCT TCG ACC GGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3′（Z303，Seq.Id.No.13）;对于结核分枝杆菌为5′-GCT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3′（Z336，Seq.Id.No.17）和5′-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG CTG CTG C-3′（Z302，Seq.Id.No.22）及5′-AGT CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3′（Z337，Seq.Id.No.23）;对于偶发分枝杆菌为5′-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3′（Z369，Seq.Id.No.21）;对于戈氏分枝杆菌为5′-TCT GCG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3′（Z366，Seq.Id.No.15）;对于蟾分枝杆菌为5′-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC GCG TTC A-3′（Z309，Seq.Id.No.18）;对于瘰疬分枝杆菌为5′-TGA CAC ACT CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT CCA GCT T-3′（Z306，Seq.Id.No.20）;对于猿分枝杆菌为5′-GTC CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3′（Z304，Seq.Id.No.16）;对于堪萨斯分枝杆菌为5′-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3′（Z340，Seq.Id.No.19）;以及对于鸟分枝杆菌/布兰分枝杆菌为5′-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGC C-3′（Z301，Seq.Id.No.14）。

在用引物Z205和Z212得到的扩增子（amplicon）的序列内的其它区域也可以用来设计种特异探针。

本发明提供的诊断由病原生物体引起的感染的方法由几步组成：扩增靶序列（如果存在的话），并通过探针杂交测定来检测和鉴定扩增子（如果有的话）。

本发明的一个重要方面是编码SOD的基因片段的扩增。使用本发明者应当注意，尽管聚合酶链反应是优选的扩增方法，但是一个样品中靶序列的扩增可以用任何已知方法来完成，例如，连接酶链反应（LCR）、转录扩增和自身连续序列复制以及其他此处未列出的方法。每一种方法都提供了足够的扩增，以使靶序列能通过核酸与一个或多个合适探针杂交而得到检测。

尽管PCR方法在本领域中是公知的（参见美国专利说明书第4，683，195号;4，683，202号和4，965，188号），下面仍提供一些一般的PCR知识，目的是让那些不熟悉PCR方法的人弄清楚并完全了解本发明。

为了通过PCR来扩增样品中的靶核酸序列，此序列必须容易接近扩增体系的组分。总之，这种可及性通过从样品中分离核酸类得到保证。各种从生物样品中抽提核酸类的技术在本领域中都是已知的。例如，参见Higuchi等在PCR Technology（Erlich ed.，Stockton Press，New York，1989）中描述的技术。另外，如果样品很易破坏，核酸在用PCR技术扩增前不必纯化，即如果样品是由细胞组成，特别是由末梢血液淋巴细胞或aminiocytes组成，那么细胞内组分的溶胞作用和分散可以仅仅通过把细胞悬浮在低渗缓冲液中就可完成。

PCR的每一个循环都包括由引物延伸形成的核酸双链的解链。在PCR方法的一个优选实施方案中，链解离是通过加热反应到足够高的温度，并持续有效的时间以引起双链变性，但不会造成聚合酶的不可逆变性（参见美国专利说明书第4，965，188号），这样来完成。典型的热变性包括温度范围约80°到105℃，时间从几秒到几分钟。然而，链解离也可用任何适宜的变性方法来实现，这包括物理、化学或酶方法。例如，链解离可（例如）由解旋酶（helicase），或一个能表现解旋酶活性的酶诱导。例如，酶RecA在ATP存在下有解旋酶活性。适合解旋酶链解离的反应条件在本领域中是已知;参见Kuhn Hoffman-Berling，CSH-Quantitative Biology 43，63-67（1978）和Radding，Ann.Rev.Genetics 16，405-436（1982）。

然而，不管怎样达到链解离，一旦链分开，PCR的下一步包括解离的链与同靶序列相接的引物的杂交。然后引物被延伸，形成靶链的互补拷贝。对于成功的PCR扩增，引物是如此设计的：每一个引物沿双链序列杂交的位置是由一个引物合成的延伸产物，一旦从模板（补体）上解离，可以作为另一引物延伸的模板。变性、杂交和延伸的循环按需要重复许多次以获得期望量的扩增核酸。

在足量的三磷酸脱氧核糖核苷（通常是dATP，dGTP，dCTP和dTTP;如果结合下面描述的UNG净化系统，dUTP用来代替dTTP，或除dTTP外再加入dUTP）及在由适宜的盐类、金属阳离子和pH缓冲体系组成的反应介质中，用聚合试剂催化PCR中依赖于模板的引物延伸。适宜的聚合试剂是催化依赖模板的DNA合成中已知的酶。适合于DNA模板使用的聚合酶的实例包括：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或此酶的Klenow片段、T₄DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶、从水栖热菌中分离出的一个热稳定DNA聚合酶。后一种酶广泛用于核酸类的扩增和测序。对于使用Taq DNA聚合酶的反应条件是在本领域中已知的，并在上述Gelfand，PCR Technology（1989）中进行了描述。其它热稳定聚合酶也可以是适宜的。

PCR方法可以逐步的方式进行（其中在每一步后都加入新试剂）;或以将所有试剂同时加入的方式;或以部分逐步方式进行（其中新鲜试剂或不同试剂是在一给定数目步骤之后加入）。例如，如果链解离由热引起，并且聚合酶是热敏感的，那么聚合酶不得不在链解离每一回合后加入。然而，假如（例如）一解旋酶用于变性，或如果一种热稳定聚合酶用于延伸，那么所有试剂开始就可以加入，或者，用另一种方法，如果试剂的摩尔比对反应重要，那么可以定期补充试剂，因为它们在合成反应中被耗尽。

本领域的普通技术人员将知道PCR方法最常使用热稳定酶作为一种自动化方法进行。在此方法中，反应混合物的温度通过变性区、引物退火区和反应区进行循环。特别适合于热稳定酶使用的仪器（热循环器）可以购买到。

本领域的普通技术人员也会意识到PCR的污染问题，它来自前几步反应扩增的核酸。减少这一问题的方法是让酶降解任何来自前几步反应扩增的DNA。PCR扩增是在dUTP而不是dTTP存在下进行的，所产生的双链含尿嘧啶的产物易于被尿嘧啶N-糖基酶（glycosylase）（UNG）降解，而正常含胸腺嘧啶的DNA不能被UNG降解。在扩增开始前，向扩增反应混合物中加入UNG，会降解所有可能作为靶的含尿嘧啶的DNA。由于含尿嘧啶的DNA的唯一来源是在先反应的扩增产物，这一方法有效地净化反应混合物，消除来自在先反应的污染问题（遗留物）。UNG可被热暂时失活，因此在扩增过程中的变性步骤也可用作使UNG失活。因此，通过掺入尿嘧啶，新的扩增产物在无UNG的环境中生成且不被降解。

在本方法的成功实施中，本发明的另一重要方面是探针杂交。本发明的寡核苷酸探针特定地与一待检测和鉴定的生物体的SOD基因的特殊片段杂交，并且就属特异探针来说，该探针同来自不同生物体的序列有足够的去稳定的错配;而就种特异探针来说，该探针与相同属的其他种生物体的序列有足够的去稳定错配。

通过测定探针是否结合到存在于样品中的序列上，本发明的探针能用于确定核酸序列中是否在样品中存在。为了本发明目的，用于检测在探针和样品中核酸序列间形成的杂交体的合适测定方法在本领域中是已知的。例如，该检测可通过Southern印迹法和使用斑点印迹法的液体杂交法来实现。在斑点印迹法中，未标记的扩增样品结合到固相载体上，例如膜，此膜与标记的探针在适宜的杂交条件下温育，未杂交的探针通过洗涤除掉，并监测滤器以确定结合探针的存在。当用少量探针分析多倍样品时，例如许多样品用属特异探针筛选以确定一个特殊属的核酸的存在就是这种情况，斑点印迹法是相当有用的。

当要使用许多不同探针时，一个可供替代的方法相当有用。这种方法是一种“逆”斑点印迹，其中扩增的序列含有一个标记物，并且探针结合到固相载体上。在此方法中，未标记的探针结合到膜上，并在适宜的杂交条件下暴露于标记的样品中。未杂交的标记样品然后在适宜条件下通过洗涤除去，并且随后监视滤器以确定结合序列的存在。因为种的确定对每一扩增样品来说都需要使用多倍种特异探针，逆斑点印迹法在这一步是优选的实验方法。

或者理想的是可以使用具有许多探针杂交位点或孔的检测方法。例如，一种固相载体，如微滴定板在本方法的大规模临床应用中特别有用。PCR扩增的DNA的杂交/捕获方法或固相载体是已知的。在这些方法的一个实施方案中，扩增的靶DNA在PCR反应的扩增过程中被标记（如用生物素）。标记的DNA通过PCR产物的杂交特定地被捕获到一靶特异寡核苷酸捕获探针上，此探针已被结合到微滴定板孔上。此结合产物根据所用的标记物的类型进行适当地检测。例如，如果用生物素做标记物，则加入抗生物素蛋白HRP复合物并将其与下列两者之一反应：（a）过氧化氢底物和邻苯二胺（OPD）色原，或（b）过氧化氢底物和四甲基联苯胺色原（TMB）。发展起来的彩色测量信号可以用作PCR扩增的DNA的定量检测。

正如在实验室中所实践的那样，利用微滴定板测定的检测方法可对大范围的靶标准化。考虑到所用探针的长度，为保证最大专一性，有必要分别确定适宜的杂交和严格的条件。

在另一适宜的测定体系中，在PCR扩增过程中加入标记的探针。在每一合成步骤中，任何与靶DNA杂交的探针都可以被用于催化引物延伸的聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性降解。然后检测来自探针的降解产物。因此，降解产物的存在表明在探针和靶DNA之间的杂交发生了。

在发明还涉及成套试剂，它们用于扩增编码超氧物歧化酶（SOD）的基因片段，尤其是分枝杆菌种的SOD的基因片段，还涉及用于检测分枝杆菌种和区分属于分枝杆菌属的不同种的成套试剂。

用于扩增的成套试剂包含本发明的引物，即一对通用引物和/或一对适于扩增属于一种特殊属的不同种的SOD基因片段的引物，特别是一对适于扩增分枝杆菌种的SOD基因片段的引物。它们也可以任选包含一个DNA聚合酶，例如，前面提到的DNA聚合酶之一，和/或上面提到过的底物三磷酸核苷和/或用于PCR的合适缓冲液。除以上组分外，这些成套试剂也可以含有执行本发明的扩增的指令。

检测分枝杆菌种的成套试剂包含一个或多个属特异探针，特别是本发明的属特异探针库。在某些情况下，探针可以被固定在一合适的载体膜上。试剂盒的其它任选组分包括，例如用于标记和/或检测标记物的方法（例如，一个抗生物素蛋白-酶结合物、酶底物和色原，如果标记物是生物素）和用于杂交反应的合适缓冲液。除以上组分外，成套试剂也可以含有执行本发明的检测方法的指令。

用于区分属于分枝杆菌属的不同种的成套试剂包含一个或多个本发明的种特异探针。在某些情况下，探针可以被固定在一合适的载体膜上，试剂盒的其它任选组分包括，例如用于标记和/或检测标记物的方法（例如，一个抗生物素蛋白-酶结合物、酶底物和色原，如果标记物是生物素）和用于杂交反应的合适缓冲液。除以上组分外，成套试剂也可含有执行本发明的区分方法的指令。

此外，用于检测分枝杆菌种以及用于区分属于分枝杆菌属的不同种的成套试剂也可以含有一个或多个上面提到的用于扩增的成套试剂的组分。

在本发明的其它实施方案中，用于扩增、检测和区分的成套试剂也可以含有阳性和/或阴性对照。阳性对照优选包括一核酸序列，它可利用用于扩增试验样品中所期望的靶核酸类的相同引物对进行扩增。使用阳性对照的方法（其中可以存在或不存在的靶以及阳性对照使用相同引物对）对于本领域的普通技术人员是已知的。阳性对照的优选设计是使产物DNA具有与靶的大小易于区分的显然有别的大小，或以对于本领域普通技术人员已知的方式修饰（突变/限定位置）。

下列实施例是为了更详细地描述本发明。它们只用于说明目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：用引物Z205和Z212扩增分枝杆菌SOD-序列

引物是利用DNA合成试剂盒在MilliGen/Biosearch Cyclone Plus合成仪上合成的，序列最多达50个核苷酸（Millipore GmbH，Eschborn FRG）。此寡核苷酸类用25%NH₄OH从柱体上洗脱下，真空干燥，并溶解（未经进一步纯化）至最终浓度为20μM。

将约1ng预先纯化的表1a所列的分枝杆菌种和表2a所列的非分枝杆菌种的染色体DNA，按下面的循环程序，在热循环仪480（Perkin Elmer）中通过PCR扩增：在98℃加热5分钟（初变性），冷至55℃，然后加入5U Taq聚合酶（Perkin Elmer AG，Küsnacht，Switzerland），并循环35次，其条件是：在94℃30秒（变性）;在37-55℃30秒（退火）;在72℃30秒（延伸），并在72℃保持10分钟。

一个标准的PCR反应组成是：10μl 10X缓冲液（100mM Tris;室温下pH＝8.3;500mM KCl;15mM MgCl₂;0.015%明胶），16μl脱氧核糖核苷酸混合液（dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25μmol），5μl引物Z205（20μM），5μl引物Z212（20μM），10μl待扩增的DNA和53μlH₂O。10μl的扩增后混合物上样到1%琼脂糖凝胶上，在200V分离，用123bp和1kb带作为大小标准（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg）。适当分离后，凝胶用溴化乙锭染色并拍照。进一步实验细节见：Molecular Cloning，1989，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis;（eds.）;Cold Spring Harbor Laboratory Press.

结果汇集在表1a和2a中，“+”表示得到了可见的扩增子。在37℃的退火温度下，使用引物对Z205和Z212时，来自被试的分枝杆菌的27个不同种（列于表1a中）及列于表2a中全部106个非分枝杆菌种的所有DNA样品，在染色凝胶上都有可见的扩增子。最主要的（和大多数情况下唯一可见的片段）是一个与预期扩增子共迁移的DNA片段，该扩增子是来自结核分枝杆菌的489bp，跨越结核分枝杆菌序列的188至678区域。因此，引物对Z205和Z212可以认为是通用引物。

实施例2：用引物Z205和Z212从所选细菌所获得的扩增子的克隆及测序

在下面所列9种分枝杆菌种中的结核分枝杆菌和4种非分枝杆菌种的SOD基因中，相应于188至666位置的区域用引物对Z205和Z212扩增。扩增子然后克隆、测序如下：

结核分枝杆菌（ATCC 1400）;鸟分枝杆菌（ATCC 25291）;胞内分枝杆菌（DSM 43223）;瘰疬分枝杆菌（ATCC 19981）;堪萨斯分枝杆菌（DSM 43224）;偶发分枝杆菌（ATCC 6841）;猿分枝杆菌（ATCC 25275）;戈氏分枝杆菌（DSM 610）;蟾分枝杆菌（ATCC 19250）;白喉棒状杆菌（ATCC 11913）;假白喉棒状杆菌（RC 181）;星状诺卡氏菌（ATCC 43005）和粘性放线菌（Actinomyces Viscosus）（ATCC 15987）。

操作细节可在前面参考的实验室提南中找到：“Molecular Cloning”。约lng来自13个前面所列生物体的染色体DNA像实施例1中描述的那样进行扩增。PCR扩增子的可能缺损端用四种脱氧核苷酸（dNTP）和Klenow聚合酶来填补。未掺入的引物和dNTP通过稀释反应并遵照生产商（Diagen，Dü sseldort，FRG）的建议使反应液流过Quiagen tip 5而从扩增子中分离出来。洗脱并沉淀的DNA溶解并用5′-端标记试剂盒（Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，FRG）磷酸化。经填补和激酶的扩增子在NuSieve CTG琼脂糖（FMC，BioProducts Europe，Vallensbaek Strand，Denmark）上电泳分离，并将与结核分枝杆菌的489bp片段共迁移的扩增子切下。将DNA从胶片中回收，并用上面所述Quiagen tip 5纯化。沉淀后得到的小球溶解、定量并用于联结。

质粒pUC19用SmaⅠ消化完全，用苯酚抽提、沉淀，并在用小牛胸腺碱性磷酸酶脱磷酸化前溶解。载体DNA再经苯酚抽提、沉淀，稀释到约1ng/μl。载体制备中所用的载体DNA和全部酶来自Boehringer Mannheim（Mannheim，FRG）。

被消化和脱磷酸化的载体DNA用1U T₄-连接酶在22℃经18小时连接到纯化的SOD扩增子上。DH5a反应潜能细胞（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，USA）用2-5μl连接酶混合物转化，并依供者建议接种于含X-gal、IPTG和α-氨基苄青霉素的LB-琼脂上（详细内容见“Molecular Cloning）。

从13个克隆的扩增子的每一个转化中，挑出10个（无色的）重组克隆并分别在含200μl LB-肉汤的微量滴定板孔内生长。粗DNA样品用煮沸-冰冻方法处理，合适等分的DNA溶液未经进一步纯化用pUC-测序和逆测序引物（Boehringer Mannheim;Mannheim，FRG）通过PCR扩增。13个不同扩增中，每个都有两孔含有期望插入的592bp大小的质粒（103bp来自多克隆位点，而489bp来自SOD扩增子），它们用于进一步测序。从上列13种不同生物体中每个得到的2个独立克隆的重组质粒DNA，用Quiagen“质粒”大试剂盒（Diagen，Dü sseldorf，FRG）纯化，并遵照生产商（Boehringer Mannheim，Mannheim，FRG）建议用带S³⁵的pUC测序试剂盒采用双脱氧法测序。

图1显示用于测序的引物位置。除了在pUC19（pUC正向和pUC反向）的多克隆位点退火的两个引物外，用于克隆的同样两个引物（Z205和Z212）也用于测序反应。对所有分枝杆菌种和星状诺卡氏菌，还用另外两个正向引物（Z256和Z243）和一个反向引物（Z244）。这一策略可使测序胶获得完美的重叠阅读而在任一反应中只有大约150bp被阅读。专门用于来自剩余共栖细菌的SOD-扩增子的测序的引物位置也在图1中表示出来（白喉棒状杆菌用Z257和Z245，假白喉棒状杆菌用Z258和Z247，粘性放线菌用Z246）。表3给出所有SOD基因中测序引物的序列。因为引物Z212含2个可变碱基，使确保来自13个种中每一个种的两个独立克隆的测序成为可能。

从来自9种分枝杆菌和4种非分枝杆菌种的26个克隆中，读出全部29.1kb。表4-16显示其一致序列。

实施例3：比较SOD序列以确定分枝杆菌特异的PCR引物

表4-16中所示的每一个SOD序列被排列起来以利于相互比较，目的是为了确定分枝杆菌属成员中显著同源性的区域以及与非分枝杆菌种相应区域比较时的显著异源性。用GCG-程序（Genetics Computer Group Sequence Analysis software，Version 7.1，Dervereux等，NAR 12，387-395（1984）;GAP-Alignment）进行排列。

以这种方式可得到分枝杆菌属的所有27种特异的引物，这使通过引物与保留区域退火连接的SOD编码序列片段得到扩增，这些在分枝杆菌属中的保留区域当与那4个测出序列的非分枝杆菌种的相应区域比较时显示出许多错配。所以，由那些准则选择出的引物很有可能会阻止非分枝杆菌种的扩增。

选出的引物序列（Z261和Z212）是测试它们扩增所有27种分枝杆菌（表1a）能力的几个组合之一，而不是93个非分枝杆菌靶DNA（表2a）的引物序列组合。这两个引物之一（Z212）用于扩增分枝杆菌和非分枝杆菌DNA。Z212的序列与结核分枝杆菌SOD基因中位置677-655对应。来自分枝杆菌和非分枝杆菌种的DNA扩增的差别对待取决于反引物Z261（在结核分枝杆菌SOD基因中位置是245-269）。表17显示Z261序列与分枝杆菌属的9个测序种和4个所选非分枝杆菌种中的错配。随着两个可变碱基（位置249和264）的引人，9个测序的分枝杆菌种中最多存在2个错配。引物3′-端的最后5个核苷在所有9个测序的分枝杆菌中是得到保留的。

实施例4：用属特异引物Z261和Z212扩增

利用来自结核分枝杆菌的DNA，用引物对Z261/Z212获得的扩增子长为434bp。用来自结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、白喉棒状杆菌、星状诺卡氏菌的DNA以及人DNA作为典型试验DNA，并用实施例1中所描述的PCR标准条件，对属特异扩增的退火温度进行优化。对于下列温度进行了评估：37℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、64℃、67℃和70℃。在非严格温度（37℃和45℃）下用非分枝杆菌DNA可见的扩增子在较高的退火温度（＞58℃）下开始消失。在64℃仍能用人DNA看到一系列片段，而在67℃便不存在了。引物对Z261和Z212采用60℃或67℃。在60℃时扩增子的可见量较高，尽管67℃显然是差别更分明温度。最适宜的镁浓度是1.5mM。所以，属特异引物（Z261和Z212）的最后循环程序是：在98℃加热5分钟，冷至55℃，加入1μl Taq（5U）并扩增35个循环，其条件是在94℃、60℃或67℃、72℃各30秒，随后72℃温育10分钟。

结果汇集在表1a和2a中，“+”表示得到了可见的扩增子，而“-”表示没有或得到很少的扩增子。所有27种分枝杆菌种用属特异引物Z261和Z212扩增，退火温度是67℃（表1a），同时通过凝胶电泳证实。然而，用鳕分枝杆菌、海分枝杆菌和嗜血分枝杆菌在凝胶上得到的信号比另外24个种的信号要弱。增加循环时间到1分钟后，也可得到所讨论的这3个种的可见信号。

根据在琼脂糖凝胶上不存在可见信号，断定引物Z261和Z212不扩增106个非分枝杆菌种中的102个（表2a）。为了保证PCR反应中加入可扩增物质的正确用量，用引物对Z205和Z212平行试验所有DNA（并发现为阳性）。在所用PCR条件下，有四种细菌种在凝胶上给出弱信号，即：迟钝爱德华氏菌、Ewingella americana、肺炎克氏杆菌和豪顿沙门氏菌。然而，这四个种的扩增子没有一个在大小和强度上完全与用分枝杆菌DNA获得的扩增子对应。

实施例5：属特异探针的选择

将用属特异引物Z261和Z212通过扩增9种分枝杆菌和4种非分枝杆菌的DNA获得的序列进行排列（表4-16），并分析分枝杆菌中具最大的同源性区域和非分枝杆菌种中最大异源性区域。最终选择的属特异探针包含结核分枝杆菌序列中位置382-421。表18所示共有序列以及在测序的非分枝杆菌种中存在的错配。在星状诺卡氏菌中只出现2个错配，但此DNA在用属特异引物Z261和Z212时，在所述的条件下不扩增，因为存在11个错配。我们选择分别合成每一个属特异寡核苷酸，而不是引入全部14个可变碱基来覆盖9种测序的分枝杆菌（表18）的所有错配，得到8个寡核苷酸库（胞内分枝杆菌和蟾分枝杆菌分在一组），其中每种探针以等摩尔量存在。表19表示组成属特异探针库的寡核苷酸的序列。探针Z310检测结核分枝杆菌，Z311检测胞内分枝杆菌和蟾分枝杆菌，Z312检测鸟分枝杆菌，Z313检测戈氏分枝杆菌，Z314检测偶发分枝杆菌，Z315检测瘰疬分枝杆菌，Z316检测猿分枝杆菌，Z317检测堪萨斯分枝杆菌。

实施例6：与属特异探针杂交

将属特异探针库（表19）标记如下：遵循5′-标记试剂盒（Boehringer Mannheim，Mannheim，FRG）的提供者的建议，将80 pmol等摩尔混合的8种探针（Z310-Z317）在5′-端用100γCi的³²P-γ ATP（10mCi/ml，5000 Ci/mmol）标记至比活性约为3×10⁷/μg。未掺入的标记物用Biospin 6柱（BioRad，Richmond USA）去掉。由属特异引物Z261和Z212从27种分枝杆菌种（表1a）和106种非分枝杆菌种（表2a）获得的20μl碱-变性的PCR混合物用100μl TE-缓冲液稀释，并用96孔点样器（Schleicher ＆ Schuell，Dassel，FRG）点在预先湿润的固相载体上（“Gene Screen plus”滤器;Du Pont de Nemours，Bad Homburg，FRG）。滤器交联在Stratagene UV-linker（Statagene，La Jolla，USA）上，并在含5ml预杂交液（6XSSC，10mM磷酸钠pH6.8，1mM EDTA pH8.0，1%SDS，变性的鲑精子DNA 100μg/ml）的50ml Falcon管中预杂交。在旋转杂交烘箱中，在60℃预杂交60分钟。倾去预杂交液，换用5ml杂交液（3M氯化四甲基铵，10mM磷酸钠pH6.8，1mM EDTA pH7.6，0.5%SDS，变性的鲑精子DNA 100μg/ml以及5-8×10⁶cpm标记的属特异探针）。缓冲液制备的细节能在早些时候提到的“分子克隆”摘要中找到。杂交在65℃进行3-16小时。滤器在70℃在预热（70℃）的2XSSC/0.2% SDS中洗4×15分钟，然后在-70℃用增感屏进行1-2小时放射自显影。

结果汇集于表1a和2a中，“+”表示得到了杂交信号，而“-”表示没有得到杂交信号。属特异探针库（Z310-Z317）用于探测所有27种分枝杆菌（表1a）。探针库识别9种测序的分枝杆菌（表4-12）：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、猿分枝杆菌、蟾分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。除此之外，下列13种未测序的分枝杆菌用属特异探针库识别：非洲分枝杆菌、阿加普尔分枝杆菌、牛分枝杆菌、布兰分枝杆菌、龟分枝杆菌、转黄分枝杆菌、海分枝杆菌、胃分枝杆菌、地分枝杆菌、次要要枝杆菌、M.nonchromaticum、M.oboense和耻垢分枝杆菌（在表1a中用“+”表示）。在所述的杂交条件下，用嗜血分枝杆菌、鳕分枝杆菌、M.szlugai和草分枝杆菌得到弱信号（在表1a中用“（+）”表示）。红皮杆菌未得到信号（在表1a中用“（-）”表示）。

用属特异引物Z261和Z212由列于表2a（凝胶上不可见）的非分枝杆菌种，以及在凝胶上给出弱可见信号的4种（见实施例7）得到的扩增子没有一个被属特异探针库（Z310-Z317）检测出，结果总结在表2a中。

实施例7：种特异探针的识别

用属特异引物Z261和Z212（表4-12）通过扩增9个分枝杆菌DNA获得的扩增子序列如实施例3中叙述的那样排列起来，并逐个分析每个分枝杆菌序列，确定与剩下的分枝杆菌序列相比显著不均一性的区域。这样，种特异序列能被识别并进行实验分析。数字上显示最大错配数的区域（在所用排序程序上是最大不均一性）证明不总是导致最大差别杂交结果的区域。一个序列当与其它序列比较时的错配数依赖于用来排列的准则，这也是值得注意的。所给出的种特异探针的位置与衍生出它们的序列有关（表4-12），而与在不同排列程序中分配给它们的数目无关。

实施例7.1结核分枝杆菌特异探针

由下列序列选出三个区域（表4）：

Z302、Z336和Z337被标记并依实施例6中所述方式沿滤器进行杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。杂交温度对Z302是70℃，对剩下的两个探针是60℃。杂交进行1-16小时，洗涤温度对Z302是80℃，对Z337是65℃，对Z336是60℃。胶片曝光1-3小时。

37个核苷酸长的探针Z302在所用条件下只识别结核分枝杆菌以及与牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG及非洲分枝杆菌以“大群集”的形式结合的相近物（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，1974，8th Edition，Waverly Press Inc，Baltimore，R.E.Buchanon+N.E.Gibons（Eds.））。Z302不能识别列于表1b中剩下的23种分枝杆菌种以及列于表2b中的106种非分枝杆菌种中的任何一种。

探针Z336代表在原探针Z302 3′-端的最后26个核苷酸。截去顶端的探针Z336在所述改良条件下仅与结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和非洲分枝杆菌杂交。同列于表1b中的剩余23种分枝杆菌种以及列于表2b的106种非分枝杆菌种中的任何一种没有交叉反应。

定位于SOD基因测序部分末端的Z337（一个具有22个核苷酸的探针）对结核分枝杆菌-牛分枝杆菌-非洲分枝杆菌复合体是特异的，并不与列于表1b的剩余23种分枝杆菌种以及列于表2b的106种非分枝杆菌种中的任何一种发生交叉反应。

尽管三个探针Z302、Z336和Z337的专一性是类似的，但探针Z336和Z337是优选的，因为它们有较低的洗涤温度。

实施例7·2鸟分枝杆菌-布兰分枝杆菌特异探针

选择的区域423-459（表5），具有下列序列：

Z301被标记并依实施例6所述方式沿滤器进行杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的分枝杆菌扩增子。对于Z301，杂交在70℃进行1-16小时，对于Z301的洗涤温度是80℃，胶片曝光3小时。用鸟分枝杆菌-布兰分枝杆菌特异探针Z301，鸟分枝杆菌的扩增子与布兰分枝杆菌的扩增子（n＝6，扩增子从同一贮备DNA样品衍生得到）一起被识别。对布兰分枝杆菌未得到测序数据，所以对该种合理的探针设计是不可能的。在这一点上，不能完全排除布兰分枝杆菌贮备液事实上被鸟分枝杆菌扩增子污染。在新的布兰分枝杆菌贮备液被培养出以前，扩增并测序的Z301当作识别鸟分枝杆菌和布兰分枝杆菌两者的探针。Z301不识别表1b所列的其它分枝杆菌种中的任一种。而且没有一个列于表2b的实验的非分枝杆菌DNA与鸟分枝杆菌-布兰分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

实施例7·3胞内分枝杆菌特异探针

选择的区域416-452（表6）具有下列序列：

Z303被末端标记并依实施例6所述方式沿滤器进行杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在60℃杂交16小时，洗涤温度是70℃，并且胶片曝光3小时、6小时和16小时。图2显示（16小时曝光）所选择的对于胞内分枝杆菌的种特异探针的专一性的一个例子，并且结果总结在表1b中。

滤器上的DNA排列如下：

A2 结核分枝杆菌(临床分离得到1400)

A3 结核分枝杆菌 27294

A4 鸟分枝杆菌 25291

A5 偶发分枝杆菌 6841

A6 戈氏分枝杆菌 DSM610

A7 堪萨斯分枝杆菌 DSM43224

A8 瘰疬分枝杆菌 19981

A9 猿分枝杆菌 25275

A10 蟾分枝杆菌 19250

A11 胞内分枝杆菌 DSM43223

B2 阿加普尔分枝杆菌 14473

B3 非洲分枝杆菌 25420

B4 牛分枝杆菌BCG 1401

B5 牛分枝杆菌 19210

B6 布兰分枝杆菌 23434

B7 龟分枝杆菌 35752

B8 转黄分枝杆菌 DSM43219

B9 胃分枝杆菌 15754

B10 耻垢分枝杆菌 14468

B11 地分枝杆菌 15755

C2 次要分枝杆菌 23292

C3 海分枝杆菌 927

C4 嗜血分枝杆菌 29548

C5 无色分枝杆菌 19530

C6 M.obuense 27023

C7 草分枝杆菌 DSM750

C8 红皮杆菌 27024

C9 M.szulgai 35799

C10 鳕分枝杆菌 27726

H₂O

在与上述分枝杆菌各种的同样条件下，非分枝杆菌生物体实验的106个种中没有一个发生反应。

实施例7·4瘰疬分枝杆菌特异探针

选择的区域501-537（表7）具有下列序列：

Z306被标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交。滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在70℃杂交1-16小时，洗涤温度是80℃，且胶片曝光3小时、6小时和16小时。Z306只与瘰疬分枝杆菌DNA杂交，而不与列于表1b中的任何其它分枝杆菌杂交。表2b所列的106个实验的非分枝杆菌DNA中，没有一个与瘰疬分枝杆菌探针杂交。

实施例7·5：堪萨斯分枝杆菌特异探针

选择的区域546-567（表8）具有以下序列。

Z340: 5'-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3'

(Seq.Id.No.19).

Z340被标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在60℃杂交1-16小时，洗涤温度为65℃，并且将胶片曝光3小时、6小时和16小时。Z340只与堪萨斯分枝杆菌DNA杂交，而不与表1b所列的任何其它分枝杆菌杂交。列于表2b的106个实验的非分枝杆菌DNA中，没有一个与堪萨斯分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

实施例7·6：偶发分枝杆菌特异探针

选择的区域500-521（表9）具有下列序列。

Z369: 5'-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3'

(Seq.Id.No.21).

Z369末端被标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交。滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在60℃杂交1-16小时，洗涤温度是70℃且胶片曝光3小时、6小时和16小时。Z369仅与偶发分枝杆菌DNA杂交，而不与列于表1b中的任何其它分枝杆菌杂交。表2b所列的106个实验的非分枝杆菌DNA中没有一个与偶发分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

实施例7·7：猿分枝杆菌特异探针

选择的区域360-396（表10），具有下列序列：

Z304被标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在70℃杂交1-16小时。洗涤温度为80℃，胶片曝光3小时、6小时和16小时。Z304仅与猿分枝杆菌DNA杂交，而不与列于表1b的任何其它分枝杆菌杂交。表2b所列的106个实验的非分枝杆菌DNA中，没有一个与猿分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

实施例7·8：戈氏分枝杆菌特异探针

选择的区域507-531（表11）具有下列序列：

Z366: 5'-TCT GGG CGG CCG GTT GCT CAC CTT T-3'

(Seq.Id.No.15).

Z366被末端标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在60℃杂交1-16小时，洗涤温度是70℃，胶片曝光3小时、6小时和16小时。Z366仅与戈氏分枝杆菌DNA杂交，而不与列于表1b的任何其它分枝杆菌杂交。表2b所列的106个实验的非分枝杆菌DNA中，没有一个与戈氏分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

实施例7·9：蟾分枝杆菌特异探针

选择的区域280-316（表12）具有下列序列：

Z309被末端标记并依实施例6所述方式沿滤器杂交，滤器上固定有用Z261和Z212得到的28个分枝杆菌扩增子（26个不同种）。在70℃杂交1-16小时，洗涤温度为80℃，胶片曝光3小时、6小时、16小时。Z309仅与蟾分枝杆菌DNA杂交，而不与列于表1b的任何其它分枝杆菌杂交。表2b所列的106个实验的非分枝杆菌DNA中，没有一个与蟾分枝杆菌特异探针发生交叉反应。

图1：在SOD-基因中测序引物的位置。

图2：用由属特异探针Z261和Z212得到的，沿探针Z303杂交的定位的扩增子进行的斑点-印迹，这对于胞内分枝杆菌是特定的。

表1a：分枝杆菌种，其起源，用通用引物Z205和Z212扩增，用属特异引物Z261和Z212扩增以及与属特异探针库Z310-Z317杂交。

表1b：分枝杆菌种，它们的起源以及与种特异探针Z301（鸟分枝杆菌/布兰分枝杆菌）;Z337、Z336和Z302（结核分枝杆菌）;Z303（胞内分枝杆菌）;Z304（猿分枝杆菌）;Z340（堪萨斯分枝杆菌）;Z306（瘰疬分枝杆菌）;Z366（戈氏分枝杆菌）;Z369（偶发分枝杆菌）和Z309（蟾分枝杆菌）杂交。

表2a：非分枝杆菌种，它们的起源，用通用引物Z205和Z212扩增，用属特异引物Z261和Z212扩增以及与属特异探针库（Z310-Z317）杂交。

表2b：非分枝杆菌种，它们的起源和与上面表1b中提到的种特异探针杂交。

表3：用于扩增子测序的引物序列，该扩增子在用pUC19克隆后，由引物Z205和Z212得到。

表4：由作为结核分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表5：由作为鸟分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表6：由作为胞内分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表7：由作为瘰疬分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表8：由作为堪萨斯分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表9：由作为偶发分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表10：由作为猿分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表11：由作为戈氏分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表12：由作为蟾分枝杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表13：由作为白喉棒状杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表14：由作为假白喉棒状杆菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表15：由作为星状诺卡氏菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表16：由作为粘性放线菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的扩增子的DNA序列。

表17：一致引物Z261的序列和9种测序的分枝杆菌属中的错配，4个测序的非分枝杆菌生物体以及由大肠杆菌和人SOD基因衍生的相应片段序列。

表18：分枝杆菌的属特异探针的一致序列，4种测序的非分枝杆菌生物体中的错配以及由大肠杆菌和人SOD基因衍生的相应片段序列。也列出了组成属特异探针库的各寡核苷酸序列。

表1a

分枝杆菌属 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-Z317³⁾

阿加普尔分枝杆菌 14473 + + +

非洲分枝杆菌 25420 + + +

鸟分枝杆菌 25291 + + +

牛分枝杆菌 19210 + + +

牛分枝杆菌BCG*** 1401 + + +

布兰分枝杆菌 23434 + + +

龟分枝杆菌 35752 + + +

转黄分枝杆菌 DSM43219* + + +

偶发分枝杆菌 6841 + + +

鳕分枝杆菌 27726 + + (+)

胃分枝杆菌 15754 + + +

戈氏分枝杆菌 DSM610* + + +

嗜血分枝杆菌 29548 + + (+)

胞内分枝杆菌 DSM43223* + + +

堪萨斯分枝杆菌 DSM43224* + + +

海分枝杆菌 927 + + +

无色分枝杆菌 19530 + + +

M.obuense 27023 + + +

草分枝杆菌 DSM750* + + (+)

表1a(续)

分枝杆菌属 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-Z317³⁾

红皮杆菌 27024 + + -

瘰疬分枝杆菌 19981 + + +

猿分枝杆菌 25275 + + +

耻垢分枝杆菌 14468 + + +

M.szulgai 35799 + + (+)

地分枝杆菌 15755 + + +

次要分枝杆菌 23292 + + +

结核分枝杆菌** 1400 + + +

结核分枝杆菌 27294 + + +

蟾分枝杆菌 19250 + + +

1）用通用探针对Z205/Z212扩增

2）用属特异探针对Z261/Z212扩增

3）用属特异探针库Z310/Z317杂交

＊＊＊瑞士伯尔尼血清和疫苗研究所

＊＊临床分离得到

＊DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G ttingen，FRG）

表1b

分枝杆菌属 ATCC 与种特异探针的杂交

A B C D E F G H I

阿加普尔分枝杆菌 14473 - - - - - - - - -

非洲分枝杆菌 25420 - + - - - - - - -

鸟分枝杆菌 25291 + - - - - - - - -

牛分枝杆菌 19210 - + - - - - - - -

牛分枝杆菌BCG*** 1401 - + - - - - - - -

布兰分枝杆菌 23434 + - - - - - - - -

龟分枝杆菌 35752 - - - - - - - - -

转黄分枝杆菌 DSM43219* - - - - - - - - -

偶发分枝杆菌 6841 - - - - - - - + -

鳕分枝杆菌 27726 - - - - - - - - -

胃分枝杆菌 15754 - - - - - - - - -

戈氏分枝杆菌 DSM610* - - - - - - + - -

嗜血分枝杆菌 29548 - - - - - - - - -

胞内分枝杆菌 DSM43223* - - + - - - - - -

堪萨斯分枝杆菌 DSM43224* - - - - + - - - -

海分枝杆菌 927 - - - - - - - - -

无色分枝杆菌 19530 - - - - - - - - -

M.obuense 27023 - - - - - - - - -

草分枝杆菌 DSM750* - - - - - - - - -

红皮杆菌 27024 - - - - - - - - -

瘰疬分枝杆菌 19981 - - - - - + - - -

猿分枝杆菌 25275 - - - + - - - - -

耻垢分枝杆菌 14468 - - - - - - - - -

表1b(续)

分枝杆菌属 ATCC 与种特异探针的杂交

A B C D E F G H I

M.szulgai 35799 - - - - - - - - -

地分枝杆菌 15755 - - - - - - - - -

次要分枝杆菌 23292 - - - - - - - - -

结核分枝杆菌** 1400 - + - - - - - - -

结核分枝杆菌 27294 - + - - - - - - -

蟾分枝杆菌 19250 - - - - - - - - +

A：鸟分枝杆菌探针Z301 F：瘰疬分枝杆菌探针Z306

B：MTB探针Z337/Z336/Z302 G：戈氏分枝杆菌探针Z336

C：胞内分枝杆菌探针Z303 H：偶发分枝杆菌探针Z369

D：猿分枝杆菌探针Z304 I：蟾分枝杆菌探针Z309

E：堪萨斯分枝杆菌探针Z340

＊＊＊瑞士伯尔尼血清和疫苗研究所

＊＊临床分离得到

＊DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G

ttingen，FRG）

表2a

非分枝杆菌生物体 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-317³⁾

乙酸钙不动杆菌 17945 + - -

乙酸钙不动杆菌 23055 + - -

鲁氏不动杆菌 15309 + - -

牛型放线菌 DSM43014** + - -

衣氏放线菌 12102 + - -

放线菌属 35568 + - -

龋齿放线菌 17929 + - -

粘性放线菌 15987 + - -

嗜水气单孢菌 7966 + - -

根癌土壤杆菌 23308 + - -

粪产碱杆菌 8750 + - -

球形节杆菌 DSM20124** + - -

黄曲霉 RKI**** + - -

薰烟色曲霉 RKI**** + - -

蜡样芽孢杆菌 27348 + - -

蕈状芽孢杆菌 RKI**** + - -

枯草芽孢杆菌 6633 + - -

Bacteroides hetaitaomicron RKI**** + - -

齿双歧杆菌 DSM20084** + - -

副百日咳博德特氏菌 DSM4922** + - -

粘膜布兰汉氏球菌 8176 + - -

表皮短杆菌 DSM20660** + - -

空肠弯曲杆菌 33560 + - -

幽门弯曲杆菌 * + - -

表2a(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-317³⁾

白色念珠菌 10231 + - -

假丝酵母菌属 RKI*** + - -

柠檬酸杆菌属 DSM4570** + - -

弗氏柠檬酸菌 8090 + - -

艰难杆菌 RKI**** + - -

白喉棒状杆菌 11913 + - -

浅黄棒状杆菌 10340 + - -

最小棒状杆菌 23348 + - -

假白喉棒状杆菌 RC181*** + - -

棒状杆菌属 33035 + - -

纹带棒状杆菌 6940 + - -

阴道棒状杆菌 15753 + - -

结膜棒状杆菌 373 + - -

大肠杆菌 25922 + - -

迟钝爱德华氏菌 15947 + (+) -

鸟肠球菌 14025 + - -

屎肠球菌 19432 + - -

粪产链球菌 19433 + - -

阴沟肠杆菌 13047 + - -

Ewingella americana DSM4580** + (+) -

Flavobacterium odoratum 4651 + - -

流感嗜血杆菌 9333 + - -

肺炎克雷伯氏菌 13883 + (+) -

嗜酸乳杆菌 DSM20079** + - -

表2a(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-317³⁾

军团菌属 RKI**** + - -

藤黄微球菌 RC9346*** + - -

乳屑奈瑟氏球属 23970 + - -

干燥奈瑟氏球菌 9913 + - -

诺卡氏菌属 31306 + - -

星状诺卡氏菌 43005 + - -

短链诺卡氏菌 15333 + - -

厌氧消化链球菌 RKI**** + - -

不解糖消化链球菌 RKI**** + - -

类志贺志菌 14029 + - -

原质团3D7 RC*** + - -

Prevotella livia RKI**** + - -

Prevotella intermedia RKI**** + - -

痤疮丙酸杆菌 DSM1897** + - -

奇异变形杆菌 12453 + - -

普通变形杆菌 6380 + - -

食酸假单孢菌 RC15858*** + - -

绿肽杆菌 10145 + - -

产碱假单孢菌 14909 + - -

荧光假单孢菌 13525 + - -

恶臭假单孢菌 12633 + - -

腐败假单孢菌 DSM50426** + - -

马假球菌 6939 + - -

假球菌属 29627 + - -

表2a(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-317³⁾

啤酒酵母 RKI**** + - -

鲍氏沙门氏菌 RC5951*** + - -

豪顿沙门氏菌 RC5507*** + (+) -

萨拉姆沙门氏菌 RC5554*** + - -

鼠伤寒沙门氏菌 13311 + - -

粘质沙门氏菌 8100 + - -

宋内志贺氏菌 11060 + - -

金黄色葡萄球菌 29213 + - -

头葡萄球菌 27840 + - -

柯氏葡萄球菌 29974 + - -

表皮葡萄球菌 12228 + - -

溶血葡萄球菌 29970 + - -

人型葡萄球菌 27844 + - -

腐生葡萄球菌 15305 + - -

模拟葡萄球菌 27848 + - -

瓦氏葡萄球菌 27838 + - -

木糖葡萄球菌 29971 + - -

无乳链球菌 13813 + - -

星群链球菌 27823 + - -

马链球菌 33398 + - -

Streptococcus group A RC17A4*** + - -

轻型链球菌 33399 + - -

链球菌属 27824 + - -

变异链球菌 25175 + - -

表2a(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC Z205/Z212¹⁾Z261/Z212²⁾Z310-317³⁾

肺炎链球菌 6301 + - -

肺炎链球菌 6303 + - -

化浓性链球菌 19615 + - -

唾液链球菌 7073 + - -

血链球菌 10556 + - -

脊螺旋体 RKI**** + - -

韦荣氏菌属 DSM20735** + - -

副溶血弧菌 DSM2171** + - -

小肠结肠炎耶氏菌 9610 + - -

假结核耶氏菌 907 + - -

1）用通用引物对Z205/Z212扩增

2）用属特异引物对Z261/Z212扩增

3）与属特异探针库Z310-Z317杂交

＊临床分离得到

＊＊DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G＊ttingen，FRG）

＊＊＊RC（Roche collection）

＊＊＊＊RKI（Robert Koch Institute，Berlin，FRG）

表2b

非分枝杆菌生物体 ATCC 与种特异探针杂交

A B C D E F G H I

乙酸钙不动杆菌 17945 - - - - - - - - -

乙酸钙不动杆菌 23055 - - - - - - - - -

鲁氏不动杆菌 15309 - - - - - - - - -

牛型放线菌 DSM43014** - - - - - - - - -

衣氏放线菌 12102 - - - - - - - - -

放线菌属 35568 - - - - - - - - -

龋齿放线菌 17929 - - - - - - - - -

粘性放线菌 15987 - - - - - - - - -

嗜水气单孢菌 7966 - - - - - - - - -

根癌土壤杆菌 23308 - - - - - - - - -

粪产碱杆菌 8750 - - - - - - - - -

球形节杆菌 DSM20124** - - - - - - - - -

黄曲霉 RKI**** - - - - - - - - -

薰烟色曲霉 RKI**** - - - - - - - - -

蜡祥芽孢杆菌 27348 - - - - - - - - -

蕈状芽孢杆菌 RKI**** - - - - - - - - -

枯草芽孢杆菌 6633 - - - - - - - - -

Bacteroides hetaitaomicron RKI**** - - - - - - - - -

齿双歧杆菌 DSM20084** - - - - - - - - -

副百日咳博德特氏菌 DSM4922** - - - - - - - - -

粘膜布兰汉氏球菌 8176 - - - - - - - - -

表皮短杆菌 DSM20660** - - - - - - - - -

空肠弯曲杆菌 33560 - - - - - - - - -

表2b(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC 与种特异探针杂交

A B C D E F G H I

幽门弯曲杆菌 * - - - - - - - - -

白色念珠菌 10231 - - - - - - - - -

假丝酵母菌属 RKI*** - - - - - - - - -

柠檬酸杆菌属 DSM4570** - - - - - - - - -

弗氏柠檬酸菌 8090 - - - - - - - - -

艰难杆菌 RKI**** - - - - - - - - -

白喉棒状杆菌 11913 - - - - - - - - -

浅黄棒状杆菌 10340 - - - - - - - - -

最小棒状杆菌 23348 - - - - - - - - -

假白喉棒状杆菌 RC181*** - - - - - - - - -

棒状杆菌属 33035 - - - - - - - - -

纹带棒状杆菌 6940 - - - - - - - - -

阴道棒状杆菌 15753 - - - - - - - - -

结膜棒状杆菌 373 - - - - - - - - -

大肠杆菌 25922 - - - - - - - - -

迟钝爱德华氏菌 15947 - - - - - - - - -

鸟肠球菌 14025 - - - - - - - - -

屎肠球菌 19432 - - - - - - - - -

粪链球菌 19433 - - - - - - - - -

阴沟肠杆菌 13047 - - - - - - - - -

Ewingella americana DSM4580** - - - - - - - - -

Flavobacterium odoratum 4651 - - - - - - - - -

流感嗜血杆菌 9333 - - - - - - - - -

表2b(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC 与种特异探针杂交

A B C D E F G H I

肺炎克雷伯氏菌 13883 - - - - - - - - -

嗜酸乳杆菌 DSM20079** - - - - - - - - -

军团菌属 RKI**** - - - - - - - - -

藤黄微球菌 RC9346*** - - - - - - - - -

乳屑奈瑟氏球菌 23970 - - - - - - - - -

干燥奈瑟氏球菌 9913 - - - - - - - - -

诺卡氏菌属 31306 - - - - - - - - -

星状诺卡氏菌 43005 - - - - - - - - -

短链诺卡氏菌 15333 - - - - - - - - -

厌氧消化链球菌 RKI**** - - - - - - - - -

不解糖消化链球菌 RKI**** - - - - - - - - -

类志贺志菌 14029 - - - - - - - - -

原质团3D7 RC*** - - - - - - - - -

Prevotella livia RKI**** - - - - - - - - -

Prevotella intermedia RKI**** - - - - - - - - -

痤疮丙酸杆菌 DSM1897** - - - - - - - - -

奇异变形杆菌 12453 - - - - - - - - -

普通变形杆菌 6380 - - - - - - - - -

食酸假单孢菌 RC15858*** - - - - - - - - -

绿脓杆菌 10145 - - - - - - - - -

产碱假单孢菌 14909 - - - - - - - - -

荧光假单孢菌 13525 - - - - - - - - -

恶臭假单孢菌 12633 - - - - - - - - -

表2b(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC 与种特异探针杂交

A B C D E F G H I

腐败假单孢菌 DSM50426** - - - - - - - - -

马假球菌 6939 - - - - - - - - -

假球菌属 29627 - - - - - - - - -

啤酒酵母 RKI**** - - - - - - - - -

鲍氏沙门氏菌 RC5951*** - - - - - - - - -

豪顿沙门氏菌 RC5507*** - - - - - - - - -

萨拉姆沙门氏菌 RC5554*** - - - - - - - - -

鼠伤寒沙门氏菌 13311 - - - - - - - - -

粘质沙门氏菌 8100 - - - - - - - - -

宋内志贺氏菌 11060 - - - - - - - - -

金黄色葡萄球菌 29213 - - - - - - - - -

头葡萄球菌 27840 - - - - - - - - -

柯氏葡萄球菌 29974 - - - - - - - - -

表皮葡萄球菌 12228 - - - - - - - - -

溶血葡萄球菌 29970 - - - - - - - - -

人型葡萄球菌 27844 - - - - - - - - -

腐生葡萄球菌 15305 - - - - - - - - -

模拟葡萄球菌 27848 - - - - - - - - -

瓦氏葡萄球菌 27838 - - - - - - - - -

木糖葡萄球菌 29971 - - - - - - - - -

无乳链球菌 13813 - - - - - - - - -

星群链球菌 27823 - - - - - - - - -

马链球菌 33398 - - - - - - - - -

表2b(续)

非分枝杆菌生物体 ATCC 与种特异探针杂交

A B C D E F G H I

Streptococcus group A RC17A4*** - - - - - - - - -

轻型链球菌 33399 - - - - - - - - -

链球菌属 27824 - - - - - - - - -

变异链球菌 25175 - - - - - - - - -

肺炎链球菌 6301 - - - - - - - - -

肺炎链球菌 6303 - - - - - - - - -

化浓性链球菌 19615 - - - - - - - - -

唾液链球菌 7073 - - - - - - - - -

血链球菌 10556 - - - - - - - - -

脊螺旋体 RKI**** - - - - - - - - -

韦荣氏菌属 DSM20735** - - - - - - - - -

副溶血弧菌 DSM2171** - - - - - - - - -

小肠结肠炎耶氏菌 9610 - - - - - - - - -

假结核耶氏菌 907 - - - - - - - - -

A：鸟分枝杆菌探针Z301 F：瘰疬分枝杆菌探针Z306

B：MTB探针Z337/Z336/Z302 G：戈氏分枝杆菌探针Z366

C：胞内分枝杆菌探针Z303 H：偶发分枝杆菌探针Z369

D：猿分枝杆菌探针Z304 I：蟾分枝杆菌探针Z309

E：堪萨斯分枝杆菌探针Z340

＊临床分离得到

＊＊DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G ttingen，FRG）

＊＊＊RC（Roche collection）

＊＊＊＊RKI（Robert Koch Institute，Berlin，FRG）

表3

表4

超氧物歧化酶的结核分枝杆菌SOD基因

表5

超氧物歧化酶的鸟分枝杆菌SOD基因

表6

超氧物歧化酶的胞内分枝杆菌SOD基因

表7

超氧物歧化酶的瘰疬分枝杆菌SOD基因

表8

超氧物歧化酶的堪萨斯分枝杆菌SOD基因

表9

超氧物歧化酶的偶发分枝杆菌SOD基因

表10

超氧物歧化酶的猿分枝杆菌SOD基因

表11

超氧物歧化酶的戈氏分枝杆菌SOD基因

表12

超氧物歧化酶的蟾分枝杆菌SOD基因

表13

超氧物歧化酶的白喉棒状杆菌SOD基因

表14

超氧物歧化酶的假白喉棒状杆菌SOD基因

表15

超氧物歧化酶的星状诺卡氏菌SOD基因

表16

超氧物歧化酶的粘性放线菌 SOD基因

表17

PCR引物Z261的错配分析（X＝错配数）

＊取自序列AC M123267/＊＊取自序列AC X03951 EMBL Data Bank，Heidelberg，FRG和GenBank，Los Alamos，USA

表18

序列表

（1）一般信息

（ⅰ）申请人：

（A）姓名：F.Hoffmann-La Roche AG

（B）街道：Grenzacherstr.124

（C）城市：巴塞尔

（D）州：巴塞尔市

（E）国家：瑞士

（F）邮政编码（ZIP）：4002

（G）电话：061 688 27 08

（H）传真：061 688 13 95

（ⅱ）发明题目：由SOD基因族衍生的寡核苷酸类

（ⅲ）序列数目：44

（ⅳ）计算机可读形式：

（A）工具类型：软磁盘

（B）计算机：IBM PC兼容机

（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS

（D）软件：Patent In Release＃1.0，Version＃1.25（EPO）

（ⅵ）在先申请信息

（A）申请号：EP 92810780.4

（B）提交日：1992年10月13日

（2）SEQ ID No：1的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：1：

AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CA

（2）SEQ ID No：2的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：23个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：2：

TCGKCCCAGT TCACGACRTT CCA

（2）SEQ ID No：3的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：25个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：3：

CCAARCTCGA AGAGGCGCGS GCCAA

（2）SEQ ID No：4的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：4：

GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMYG

（2）SEQ ID No：5的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：5：

GACAAGCCCA CCGGCGAACT CGCCGCAGCC ATCGCCG

（2）SEQ ID No：6的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：6：

GACAAGCCGA CCGGCGAATT GGCCGCCGCS ATCGACG

（2）SEQ ID No：7的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：7：

GACAAGCCCA CCGGTGAGCT GGCCGCCGCG ATCGACG

（2）SEQ ID No：8的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：8：

GACAAGCCGA CCGGTGACCT GGCCGCCGCG ATCGACG

（2）SEQ ID No：9的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：9：

GACAAGCCGA CCGGAGATCT GGCCGCGGCG ATCGACG

（2）SEQ ID No：10的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：10：

GACAAGCCGA CCGGAGAACT GGCCGCCGCG ATCGATG

（2）SEQ ID No：11的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：11：

GACAAGCCGA CCGGAGATCT CGCCGCCGCC ATCGACG

（2）SEQ ID No：12的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：12：

GACAAGCCGA CCGGCGAACT CGCCGCGGCC ATCGACG

（2）SEQ ID No：13的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：13：

CCTTCGGATC CTTCGACCGG TTCCGCGCGC AGTTCAG

（2）SEQ ID No：14的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：14：

GTCCTTCGAC AAGTTCCGAG CGCAATTCAG CGCCGCC

（2）SEQ ID No：15的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：25个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：15：

TCTGGGCGGC CGGTTGCTCA CCTTT

（2）SEQ ID No：16的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：16：

GTCCCCGAAC GGCGGAGACA AGCCGACCGG AGATCTC

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：26个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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GCTAGGCATT GTTCCGCTGC TGCTGC

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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TCCGCGATCG TCGGGCATGA GAAGGCCCTC GCGTTCA

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

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（C）链数：单链

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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CCAGACGAAC TTTCCACTCG GA

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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TGACACACTC GGCAGCAGGC TGCTCACCTT CCAGCTT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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ACGAACTTCC CGCTAGGCAT TGTTCCGCTG CTGCTGC

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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AGTCGACTTT GCCAAGGCGT TT

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（A）长度：23个碱基对

（B）类型：核酸

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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CACWCSATCT GGTGGAAGAA CCT

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（A）长度：22个碱基对

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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ACGGYGGYGA CAAGCCGACC GG

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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（A）长度：21个碱基对

（B）类型：核酸

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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GGATTTGGCT TTCAACTTGG G

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

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（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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GAAGAACCTG AGCCTTAACG GT

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（A）长度：21个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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GAGCCAACCG GTGAGCTAGC C

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个碱基对

（B）类型：核酸

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（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：不同的核酸

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GAAGAACCTC TCCCCCAACG GC

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：结核分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：32：

（2）SEQ ID No：33的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：鸟分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：33：

（2）SEQ ID No：34的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：胞内分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：34：

（2）SEQ ID No：35的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（B）菌株：瘰疬分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：35：

（2）SEQ ID No：36的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：堪萨斯分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：36：

（2）SEQ ID No：37的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：偶发分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：37：

（2）SEQ ID No：38的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：猿分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：38：

（2）SEQ ID No：39的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：戈氏分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：39：

（2）SEQ ID No：40的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：蟾分枝杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：40：

（2）SEQ ID No：41的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：495个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：白喉棒状杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：41：

（2）SEQ ID No：42的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：假白喉棒状杆菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：42：

（2）SEQ ID No：43的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：490个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：星状诺卡氏菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：43：

（2）SEQ ID No：44的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：491个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链数：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅵ）最初的来源：

（A）生物体：粘性放线菌/SOD基因

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：44：

Claims

1、超氧物歧化酶(SOD)基因体系作为靶在分化病原及非病原生物体(包括细菌、真菌和原生动物)方面的应用。

2、SOD基因体系作为靶在检测和分化分枝杆菌种方面的应用。

3、能与单链核酸序列（靶序列）杂交的一种寡核苷酸，该靶序列可以使用聚合酶链反应（PCR）和一对引物，通过扩增和变性编码超氧物歧化酶（SOD）的基因片段获得，第一个引物含有序列Seq.Id.No.1（Z205）作为引物序列，第二个引物含有序列Seq.Id.No.2（Z212）作为引物序列。

4、根据权利要求3的一种寡核苷酸，它能与由病原生物体（包括细菌、真菌和原生动物）的SOD基因衍生的靶序列杂交。

5、根据权利要求3或4的一种寡核苷酸，它能与靶序列的一个区域杂交，该靶序列在属于一个特殊属的不同种的SOD基因中基本上得到保留。

6、根据权利要求3或4的一种寡核苷酸，它能与靶序列的一个区域杂交，该靶序列可在一定程度上变化，即允许属于一个特殊属的不同种的SOD基因中的分化。

7、根据权利要求3的一种寡核苷酸，它能与一单链核酸序列（靶序列）杂交，此靶序列可以使用聚合酶链反应（PCR）和一对引物通过扩增和变性编码分枝杆菌种的超氧物歧化酶（SOD）的基因片段获得，第一个引物含有序列Seq.Id.No.3（Z261）作为引物序列，第二个引物含有序列Seq.Id.No.2（Z212）作为引物序列。

8、根据权利要求7的一种寡核苷酸，它能与靶序列的一个区域杂交，此靶序列在属于分枝杆菌属的不同种的SOD基因中基本上得到保留。

9、根据权利要求8的一种寡核苷酸，它具有序列：

5′-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3′（Seq.Id.No.4），其中符号H表示T、C或A，符号M表示A或C，符号N表示A、C、G或T，符号S表示C或G，符号V表示A、C或G，符号Y表示C或T，或一个与其互补的序列。

10、根据权利要求9的一个寡核苷酸，它选自下列一组序列：

Seq.Id.No.5（Z310），Seq.Id.No.6（Z311），Seq.Id.No.7（Z312），Seq.Id.No.8（Z313），Seq.Id.No.9（Z314），Seq.Id.No.10（Z315），Seq.Id.No.11（Z316）and Seq.Id.No.12（Z317）

以及一个与其互补的序列。

11、根据权利要求7的一个寡核苷酸，它能与靶序列的一个区域杂交，此靶序列可在一定程度上变化，即允许在属于一个分枝杆菌属的不同种的SOD基因中的分化。

12、根据权利要求11的一种寡核苷酸，它能与胞内分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

13、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.13（Z303）或一个与其互补的序列。

14、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与鸟分枝杆菌种和布兰分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

15、根据权利要求14的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.14（Z301）或一个与其互补的序列。

16、根据权利要求11的一种寡核苷酸，它能与戈氏分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

17、根据权利要求16的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.15（Z366）或一个与其互补的序列。

18、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与猿分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

19、根据权利要求18的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.16（Z304）或一个与其互补的序列。

20、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与结核分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

21、根据权利要求20的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.17（Z336），Seq.Id.No.23（Z337）或Seq.Id.No.22（Z302）或一个与其互补的序列。

22、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与蟾分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

23、根据权利要求22的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.18（Z309）或一个与其互补的序列。

24、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与堪萨斯分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

25、根据权利要求24的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.19（Z340）或一个与其互补的序列。

26、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与瘰疬分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

27、根据权利要求26的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.ID.No.20（Z306）或一个与其互补的序列。

28、根据权利要求11的一个寡核苷酸，它能与偶发分枝杆菌种的SOD基因的一个种特异区域杂交。

29、根据权利要求28的一个寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.21（Z369）或一个与其互补的序列。

30、一种探针，它包含作为杂交序列的权利要求7-10中任何一项的一种寡核苷酸。

31、一种探针，它包含作为杂交序列的权利要求10的寡核苷酸类。

32、一种探针，它包含作为杂交序列的权利要求11-29中任何一项的一种寡核苷酸。

33、一个引物，它包含作为引物序列的一个序列，该序列基本上与序列Z205同源。

34、一个引物，它包含作为引物序列的一个序列，该序列基本上与序列Z212同源。

35、一对引物，第一个引物包含序列Z205作为引物序列，而第二个引物含有序列Z212作为引物序列。

36、一个引物，它包含作为引物序列的一个序列，该序列基本上与序列Z261同源。

37、一对引物，第一个引物包含序列Z261作为引物序列，而第二个引物含有序列Z212作为引物序列。

38、一套试剂，它用于扩增编码超氧物歧化酶（SOD）的基因片段，它包含权利要求33和/或36的一个引物和权利要求34的一个引物。

39、一套试剂，它用于检测分枝杆菌种，它包含权利要求30或31的一个探针。

40、一套试剂，它用于属于分杆菌属的不同种间的分化，它包含权利要求32的一个探针。

41、权利要求39或40的一套试剂，它进一步包含权利要求33和/或36的一个引物，以及权利要求34的一个引物。