FI106804B - Menetelmä mykobakteerien toteamiseksi ja siinä käytettävät SOD-ryhmästä saadut oligonukleotidit - Google Patents

Description

1 106804

Menetelmä mykobakteerien toteamiseksi ja siinä käytettävät SOD-ryhmäs-tä saadut oligonukieotidit

Esillä oleva keksintö liittyy superoksididismutaasi-(SOD; EC 1.15.1.1) 5 geenisysteemin käyttöön mykobakteerien toteamiseksi ja erottamiseksi toisistaan. Keksinnön kohteena on menetelmä mykobakteerien sukuun kuuluvien patogeenisten ja ei-patogeenisten organismien toteamiseksi.

Toisena näkökohtana esillä oleva keksintö koskee SOD-geeni-ryhmästä saatuja oligonukleotidejä. Tarkemmin ottaen se koskee oligonukleoti-10 dejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan yksisäikeiseen nukleiinihapposekvens-siin (kohdesekvenssiin), joka voidaan saada vahvistamalla ja denaturoimalla osa geenistä, joka koodittaa superoksididismutaasia (SOD), käyttäen polymeraasiketjureaktiota ja alukeparia. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 15 (a) vahvistetaan organismin superoksididismutaasi- (SOD-) geenin kohdealue käyttäen alukeparia, joka on spesifinen mykobakteerien suvulle, ja käsittää ensimmäisen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, jonka tunnusnro on 3 (Z261) pohjustavana sekvenssinä ja toisen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, jonka tunnusnro on 2 (Z212) pohjustavana sekvenssinä, 20 (b) saatetaan vahvistettu kohdesekvenssi kosketukseen vähintään yhden oligonukleotidikoettimen kanssa, joka kykenee hybridisoitumaan SOD-geenin kohdealueeseen, ja (c) havaitaan vahvistetun kohdealueen, jos sitä on, ja oligonukleotidikoettimen hybridit.

..r 25 Edellämainittuja oligonukleotidejä voidaan käyttää alukkeiden ja ko- ettimien muodossa SOD-geeneistä saatujen kohdesekvenssien vahvistamiseksi ja toteamiseksi, etenkin patogeenisten organismien SOD-geeneistä. Esillä olevan keksinnön mukaisia alukkeita ja koettimia voidaan samoin käyttää ei-patogeenisten organismien SOD-geeneistä saatujen kohdesekvenssien vah-30 vistamiseksi ja toteamiseksi.

Esillä olevan keksinnön kohteita ovat edellä mainitut oligonukieotidit; näihin oligonukleotideihin perustuvat alukkeet ja koettimet; menetelmät, rea-genssit ja pakkaukset SOD-geeneistä saatujen kohdesekvenssien vahvistamiseksi ja toteamiseksi sekä tartuntojen diagnosoimiseksi, joita ovat aiheuttaneet 35 mykobakteerit; ja mainittujen oligonukleotidien käyttö edellä mainittuihin tarkoituksiin.

• · C.

2 1068G4 SOD on entsyymi, joka katalysoi vapaan superoksidin (02) dismu-taatiota, jolloin muodostuu molekulaarista happea ja vetyperoksidia seuraavasti: 2 02- + 2 H+ -> 02 + H202 5

Katalaasit tai peroksidaasit muuttavat sitten saadun peroksidin H20:ksi. Superoksidi (02) on aerobisen hengityksen myrkyllinen sivutuote, joka reagoi peroksidin (022') kanssa aiheuttaen vaurioita proteiineille, lipideille ja nukleiinihapoille. Entsyymi superoksididismutaasi (SOD) vaikuttaa radikaalien 10 myrkyllisiä vaikutuksia vastustavasti muuttaessaan superoksidin moiekulaari-seksi hapeksi ja peroksidiksi.

Ilmaisu "polymeraasiketjureaktio" tai "PCR" viittaa menetelmään yhden tai useamman spesifisen nukleiinihapposekvenssin vahvistamiseksi, jolloin (1) oligonukleotidialukkeita, jotka määrittävät vahvistettavien sekvenssien päät, 15 juotetaan yksisäikeisiin nukleiinihappoihin testinäytteessä, (2) nukleiinihappopo-lymeraasi laajentaa juotettujen alukkeiden 3'-päitä luoden nukleiinihapposäi-keen, joka on sekvenssiltään komplementaarinen nukleiinihappoon nähden, johon alukkeet juotettiin, (3) saatu kaksisäikeinen nukleiinihappo denaturoidaan, jolloin saadaan kaksi yksisäikeistä nukleiinihappoa, ja (4) alukkeen juotto-, aluk-20 keen laajennus- ja tuotteen denaturointimenetelmät toistetaan riittävän moneen kertaan helposti identifioitavien ja mitattavien määrien alukkeiden määrittelemiä sekvenssejä muodostamiseksi. Käytännössä sekvenssien juottamis-, laajennus-ja denaturointivaiheita kontrolloidaan vaihtelemalla reaktioastian lämpötilaa normaalisti toistuvalla syklisellä tavalla. Juottaminen ja laajentaminen tapahtuvat 25 optimaalisesti 37 - 80 °C:en lämpötila-alueella (jolloin tarkka arvo riippuu aluke-pitoisuuksista ja -sekvensseistä), kun taas denaturointi edellyttää lämpötiloja alueella 80-100 °C (tarkka arvo riippuu kohdesekvenssistä ja -pitoisuudesta).

Ilmaisu "oligonukleotidi" viittaa yksisäikeiseen nukleiinihappoon, joka koostuu kahdesta tai useammasta deoksiribonukleotidistä, kuten alukkeet, koet-30 timet, todettavat nukleiinihappofragmentit ja nukleiinihappoverrokit. Oligonukleo-tidin tarkka koko riippuu monista tekijöistä ja oligonukleotidin lopullisesta funktiosta tai käytöstä. Oligonukleotidejä voidaan valmistaa millä tahansa sopivalla menetelmällä, mukaan lukien esimerkiksi tarkoituksenmukaisten sekvenssien kloonaus ja restriktioentsyymeillä pilkkominen ja suora kemiallinen synteesi jol-35 lain menetelmällä kuten Narangin et aL fosfotriesterimenetelmä, Meth.Enzvmol. 68 (1979) 90 - 99; Brownin et aL fosfodiesterimenetelmä, Meth.Enzvmol. 68 3 106804 (1979) 109-151; Beaucagen et at dietyylifosforamidiittimenetelmä, Tetrahedron Lett. 22 (1981) 1859 - 1862; ja kiinteätukimenetelmä, jota kuvataan US-patenttijulkaisussa nro 4 458 066.

Ilmaisu "aluke” viittaa oligonukleotidiin, joka on luonnollinen tai syn-5 teettinen, ja joka kykenee toimimaan DNA-synteesin lähtökohtana olosuhteissa, joissa nukleiinihapposäikeelle komplementaarisen alukelaajennustuotteen synteesi indusoituu, eli kun läsnä on erilaisia nukleosiditrifosfaatteja ja polymeri-sointiaine (esim. DNA-polymeraasi tai käänteiskopioijaentsyymi) tarkoituksenmukaisessa puskurissa ja sopivassa lämpötilassa. Alukkeen tarkoituksenmukai-10 nen pituus riippuu alukkeen aiotusta käytöstä mutta on tyypillisesti 15-40 nukleotidiä. Lyhyet alukemolekyylit yleensä edellyttävät alhaisempia lämpötiloja muodostaakseen riittävän stabiileja hybridikomplekseja templaatin kanssa. Alukkeen ei tarvitse heijastaa templaatin tarkkaa sekvenssiä, mutta sen on oltava riittävän komplementaarinen hybridisoituakseen templaattiin ja toimiakseen 15 DNA-synteesin käynnistämiseksi valituissa reaktio-olosuhteissa.

Ilmaisu "aluke” voi viitata useampaan kuin yhteen alukkeeseen, etenkin tapauksessa, jossa on jonkin asteista epäselvyyttä vahvistettavan kohdealueen yhtä tai kumpaakin päätä koskevassa informaatiossa. Jos säilyvä alue osoittaa populaatiossa merkittäviä polymorfismitasoja, voidaan valmistaa aluke-20 seoksia, jotka vahvistavat tällaisia sekvenssejä, tai alukkeet voidaan suunnitella vahvistamaan jopa epäyhteensopivia sekvenssejä. Aluke voidaan haluttaessa leimata sisällyttämällä siihen leima, joka voidaan todeta radiometrisin, spektros-kopisin, fotokemiallisin, biokemiallisin, immunokemiallisin tai kemiallisin keinoin. Käyttökelpoisia leimoja ovat esimerkiksi 32P, fluoresoivat värit, elektronitiheät 25 reagenssit, entsyymit (joita tavanomaisesti käytetään ELISA-määrityksissä), bio-tiini tai hapteenit ja proteiinit, joille on saatavana vastaseerumia tai monoklonaa-lisia vasta-aineita. Leimaa voidaan myös käyttää alukkeen "sieppaamiseksi" joko alukkeen tai alukelaajennustuotteen, kuten vahvistetun DNA:n, immobilisoin-nin kiinteään tukeen helpottamiseksi.

30 Ilmaisu "koetin" viittaa oligonukleotidiin, joka sisältää hybridisoituvan sekvenssin, joka on komplementaarinen osaan kohdesekvenssistä ja joka voi- • · * daan leimata merkillä tai kiinnittää kiinteään tukeen. Riippuen määritysmenetelmistä, joita käytetään koettimien ja nukleiinihapposekvenssien välille muodostuneiden hybridien toteamiseksi, koettimet voivat sisältää hybridisoituvan alueen 35 lisäksi lisäpiirteitä. Esimerkiksi piste-blot-muodossa koettimet on tyypillisesti leimattu. Jos koetin ensin immobilisoidaan, kuten alla kuvatussa "käänteis"-dot- • r v • V .

4 106804 blot-muodossa, koetin voi myös sisältää pitkiä jaksoja poly-dT:tä, joka voidaan kiinnittää nylon-tuelle säteilyttämällä, jota tekniikkaa kuvataan yksityiskohtaisemmin PCT-patenttijulkaisussa nro 89/11548. Koettimen likimääräinen pituus on riippuvainen koettimen aiotusta käytöstä, mutta on tyypillisesti 15-40 nu-5 kleotidiä. Lyhyet koetinmolekyylit edellyttävät yleensä alhaisempia lämpötiloja muodostaakeen riittävän stabiileja hybridikomplekseja kohteen kanssa. Koettimen ei tarvitse heijastaa templaatin tarkkaa sekvenssiä, mutta sen on oltava riittävän komplementaarinen hybridisoituakseen kohdesekvenssiin.

Esillä olevan keksinnön mukaiset koettimet voidaan syntetisoida ja 10 leimata käyttäen edellä oligonukleotidien syntetisoimiseksi kuvattuja tekniikoita. Esimerkiksi koetin voidaan leimata 5-päässä 32P:llä inkuboimalla koetinta 32P-ATP:n ja kinaasin kanssa. Sopiva ei-radioaktiivinen leima koettimille on piparjuu-riperoksidaasi (HRP). Menetelmiä tämän leiman sisältävien koettimien valmistamiseksi ja toteamiseksi kuvataan US-patenttijulkaisuissa nro 4 914 210 ja 15 496 202. Lisäinformaatioksi tällaisten leimattujen koettimien käytöstä katso US- patenttijulkaisu nro 4 789 630; Saiki et ajL, N.Ena.J.Med. 319 (1988) 537 - 541; ja Bugawan et af, Bio/Technoloav 6 (1988) 943 - 947. Käyttökelpoisia kromo-geenejä ovat punainen leukoväri ja S.S'.S.S’-tetrametyylibentsidiini (TMB). Hel-muth, "PCR Protocols", Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornia, 1990, ss. 20 119- 128, kuvaa menettelyjä PCR-tuotteiden ei-isotooppiseksi toteamiseksi.

Esillä olevan keksinnön mukaisia oligonukleotidejä ovat oligonukleo-tidit, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdesekvenssialueeseen, joka on oleellisesti säilyvä eri mykobakteerien SOD-geenien joukossa, tai oleellisesti säilyvä nimenomaiseen sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien joukossa (sukuspesi-25 fiset oligonukleotidit), ja oligonukleotidit, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdesekvenssialueeseen, joka on vaihtuva siinä määrin, että differentiaatio nimenomaiseen sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien joukossa mahdollistuu (lajispesifiset oligonukleotidit).

Edullisia ovat oligonukleotidit, jotka kykenevät hybridisoitumaan yksi-30 säikeiseen nukleiinihapposekvenssiin (kohdesekvenssiin), joka voidaan saada vahvistamalla osaa geenistä, joka koodittaa mykobakteerilajin superoksididis-mutaasia (SOD), käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) ja alukeparia, josta ensimmäinenaluke sisältää sekvenssin sekv. tunnusnro 3 (Z261, vrt. taulukko 17) pohjustavana sekvenssinä ja toinen aluke sisältää sekvenssin sekv. tun-35 nusnro 2 (Z212) edeltä pohjustavana sekvenssinä. Näistä oligonukleotidit, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdesekvenssialueeseen, joka on oleellisesti säi- • t e •. b 5 1068.04 lyvä mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien joukossa (sukuspesifiset oligonukleotidit, ja oligonukleotidit, jotka kykenevät hybridisoitu-maan kohdesekvenssialueeseen, joka on vaihtuva siinä määrin, että differenti-aatio mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien joukossa mah-5 dollistuu (lajispesifiset oligonukleotidit), ovat vielä edullisempia.

Kuten edellä mainittiin, esillä olevan keksinnön mukaisia oligonukleo-tidejä voidaan käyttää alukkeiden ja koettimien muodossa kohdesekvenssien vahvistamiseksi ja toteamiseksi, jotka on saatu patogeenisten organismien ja ei-patogeenisten organismien SOD-geeneistä. Edullisessa näkökohdassa kohde-10 nukleiinihappoa vahvistetaan PCR:llä käyttäen alukeparia, joka mahdollistaa osan nimenomaiseen sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geeneistä vahvistuksen. Suku voidaan sitten todeta sekoittamalla vahvistettu nukleiinihappo sukuspesifi-siin koettimiin ja toteamalla, tapahtuuko hybridisaatiota, kun taas laji-identifiointi suoritetaan määrittämällä vahvistetun nukleiinihapon hybridisaatiokuvio lajispe-15 sifisiin koettimiin.

Tässä suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee oligonukleoti-dejä, joita voidaan käyttää alukkeiden ja koettimien muodossa kohdesekvenssien vahvistamiseksi ja toteamiseksi, jotka on saatu mykobakteerilajin, edullisesti patogeenisen mykobakteerilajin, SOD-geeneistä. Kohdenukleiinihappoa vah-20 vistetaan PCR:llä käyttäen alukeparia, joka mahdollistaa osan mykobakteerisu-kuun kuuluvien eri mykobakteerilajien SOD-geeneistä vahvistuksen. Edullisesti alukepari koostuu ensimmäisestä alukkeesta, joka käsittää pohjustavana sekvenssinä sekvenssin, joka on oleellisesti homologinen sekvenssiin sekv. tun-nusnro 3 (Z261) nähden, ja toisesta alukkeesta, joka käsittää pohjustavana sek-25 venssinä sekvenssin, joka on oleellisesti homologinen sekvenssiin sekv. tunnusnro 2 (Z212) nähden. Edullisemmin alukepari koostuu ensimmäisestä alukkeesta, joka käsittää sekvenssin sekv. tunnusnro 3 (Z261), ja toisesta alukkeesta, joka käsittää sekvenssin sekv. tunnusnro 2 (Z212), pohjustavana sekvenssinä.

30 Suku voidaan sitten todeta sekoittamalla vahvistettua nukleiinihappoa sukuspesifisiin koettimiin, jotka käsittävät oligonukleotidisekvenssin sekv. tun- . · · < nusnro 4 hybridisoituvana sekvenssinä, edullisesti koetinpooliin, joka käsittää oligonukleotidisekvenssit Z310 - Z317 hybridisoituvina sekvensseinä (taulukko 18), ja toteamalla, tapahtuuko hybridisaatiota. Laji voidaan tunnistaa määrittä-35 mällä vahvistetun nukleiinihapon hybridisaatiokuvio lajispesifisiin koettimiin, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdesekvenssialueeseen, joka on vaihtuva siinä • i t

·< V

6 106804 määrin, että mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien differenti-aatio mahdollistuu.

Edullisia lajispesifisiä koettimia, joita voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaan, ovat koettimet, jotka sisältävät hybrisoituvana sekvenssinä 5 sekvenssin, joka on oleellisesti homologinen seuraaviin sekvensseihin nähden: 5-CCT TCG GAT CCT TCG ACC CGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3' (Z303, sekv. tunnusnro 13) M. intracellularelle: 5-GCT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3' (Z336, sekv. tunnusnro 17) ja 5’-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG CTG CTG-3' (Z302, sekv. tunnusnro 22) ja 5'-AGT CGA 1 o CTT TGC CAA GGC GTT T-3’ (Z337, sekv. tunnusnro 23) M, tuberculosisille: 5'-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3' (Z369, sekv. tunnusnro 21) M. for-tuitumille: 5'-TCT GGG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3' (Z366, sekv. tunnusnro 15) M, aordonaelle: 5'-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC GCG TTC A-3' (Z309, sekv. tunnusnro 18) M. xenopille: 5-TGA CAC ACT 15 CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT CCA GCT T-3' (Z306, sekv. tunnusnro (20) M, scrofulaceumille: 5'-GCT CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3' (Z304, sekv. tunnusnro 16) M. simiaelle: 5-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3' (Z340, sekv. tunnusnro 19) Mi kansasiille; ja 5-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGC C-3’ (Z301, sekv. 20 tunnusnro 14) Mi aviumille/M. brunenselle.

Muita alueita amplikonien sekvensseissä, jotka voidaan saada aluk-keilla Z205 ja Z212, voidaan myös käyttää lajispesifisten koettimien suunnittelemiseksi ja rakentamiseksi.

Menetelmät, jotka esillä oleva keksintö antaa käyttöön patogeenisten 25 organismien aiheuttamien tartuntojen diagnosoimiseksi, käsittävät vaiheet, joissa mahdollisesti läsnä olevaa kohdesekvenssiä vahvistetaan ja todetaan ja identifioidaan amplikoni, mikäli sellainen on läsnä, koetinhybridisaatiomäärityk-sillä.

Esillä olevan keksinnön tärkeä näkökohta on osan SOD:tä kooditta-30 vasta geenistä vahvistaminen. Esillä olevaa keksintöä käyttävien tulisi huomata, että vaikka polymeraasiketjureaktio on edullinen vahvistusmenetelmä, kohde-sekvenssien näytteessä vahvistaminen voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten ligaasiketjureaktiolla (LCR), kopiointivahvistuksella ja itsensä ylläpitävällä sekvenssireplikaatiolla sekä muilla, tässä ei mainituilla me-35 netelmillä, joista kukin tuottaa riittävän vahvistuksen, jotta kohdesekvenssi voi- • ( c

• L

7 106804 daan todeta nukleiinihappohybridisaatiolla yhteen tai useampaan tarkoituksenmukaiseen koettimeen.

Vaikka PCR-menetelmä on alalla hyvin tunnettu (katso US-patenttijulkaisut nrot 4 683 195; 4 683 202 ja 4 965 188), jonkin verran yleistä 5 PCR-informaatiota esitetään alla selvyyden vuoksi sekä keksinnön tekemiseksi täysin ymmärrettäväksi niille, joille PCR-menetelmä ei ole tuttu.

Kohdenukleiinihapposekvenssin näytteessä vahvistamiseksi PCR:llä sekvenssin on oltava saatavilla vahvistussysteemin komponenteille. Yleensä ottaen tämä saatavuus varmistetaan eristämällä nukleiinihapot näytteestä. Alalla 10 tunnetaan erilaisia tekniikoita nukleiinihappojen uuttamiseksi biologisista näytteistä. Esimerkiksi katso tekniikat, joita kuvataan kiijassa Higuchi et aL, "PCR Technology", Erlich, toim., Stockton Press, New York, 1989. Vaihtoehtoisesti jos näyte on suhteellisen helposti rikottavissa, nukleiinihappoa ei tarvitse puhdistaa ennen vahvistamista PCR-tekniikalla, eli jos näyte koostuu soluista, etenkin ää-15 reisveri-imusoluista tai aminiosyyteistä, solunsisäisten rakenneosien lyysi ja dis-pergointi voidaan suorittaa pelkästään liettämällä solut hypotooniseen puskuriin.

Kukin PCR-kierros käsittää alukelaajennuksella muodostetun nukleii-nihappodupleksin erotuksen. PCR-menetelmän edullisessa suoritusmuodossa säikeet erotetaan kuumentamalla reaktioseos riittävän korkeaan lämpötilaan te-20 hokkaan pituiseksi ajaksi dupleksin denaturoitumisen saamiseksi, mutta ei siten, että aiheutuisi polymeraasin irreversiibeli denaturoituminen (katso US-patenttijulkaisu nro 4 965 188). Tyypillisessä lämpödenaturoinnissa käytetään lämpötiloja noin 80- 105 °C sekunneista minuutteihin vaihtelevan ajan. Säikeet voidaan kuitenkin erottaa millä tahansa sopivalla denaturointimenetelmällä mu-25 kaan lukien fysikaaliset, kemialliset tai entsymaattiset keinot. Säie-erotus voidaan indusoida helikaasilla, esimerkiksi, tai entsyymillä, joka kykenee osoittamaan helikaasiaktiivisuutta. Esimerkiksi entsyymillä RecA on helikaasiaktiivi-suutta ATP:n läsnä ollessa. Säie-erotukseen helikaaseilla sopivat reaktio-olosuhteet ovat alalla tunnettuja; vrt. Kuhn Hoffman-Berling, CSH-Quantitative 30 Bioloav 43 (1978) 63-67; ja Radding, Ann.Rev.Genetics 16 (1982) 405 - 436.

Riippumatta siitä, miten säikeet erotetaan, sitten kun säikeet on erotettu, seuraava vaihe PCR:ssä käsittää kuitenkin erotettujen säikeiden hybridi-saation alukkeisiin, jotka sivuavat kohdesekvenssiä. Alukkeita laajennetaan sitten komplementaaristen kopioiden kohdesäikeistä muodostamiseksi. Menestyk-35 sekästä PCR-vahvistamista silmällä pitäen alukkeet suunnitellaan ja rakennetaan siten, että asema, jossa kukin aluke hybridisoituu dupleksisekvenssiin, on • r i' • i «.

8 106804 sellainen, että yhdestä alukkeesta syntetisoitu laajennustuote erotettuna templaatista (komplementistä) toimii templaattina toisen alukkeen laajennukselle. Denaturointi-, hybridisaatio- ja laajennuskierroksia toistetaan niin monta kertaa kuin on tarpeen halutun määrän vahvistettua nukleiinihappoa saamiseksi.

5 Alukkeisen templaattiriippuvaista laajennusta PCRissä katalysoi po- lymeroiva aine, kun läsnä ovat riittävät määrät deoksiribonukleosiditrifosfaatteja (tavallisesti dATP, dGTP, dCTP ja dTTP; dUTP:tä käytetään dTTP:n asemesta tai lisäksi, jos mukaan sisältyy alla kuvattu UNG-sterilisointisysteemi) reaktioym-päristössä, joka käsittää tarkoituksenmukaisia suoloja, metallikationeja ja pH-10 puskurointisysteemin. Sopivia polymeroivia aineita ovat entsyymit, joiden tiedetään katalysoivan templaattiriippuvaista DNA-synteesiä. Esimerkkejä polyme-raaseista, jotka sopivat käytettäviksi DNA-templaatin kanssa, ovat E. colin DNA-polymeraasi-l tai tuon entsyymin Klenow-fragmentti, T4-DNA-polymeraasi ja Taq-DNA-polymeraasi, lämpöstabiili DNA-polymeraasi, joka on eristetty Ther-15 mus aauaticuksesta. Viimemainittua entsyymiä käytetään laajalti nukleiinihappojen vahvistamisessa ja sekventoinnissa. Reaktio-olosuhteet Taq-DNA-polymeraasien käytölle ovat alalla tunnettuja ja niitä kuvataan Gelfandin kirjassa "PCR Technology", 1989, suma. Muutkin lämpöstabiilit polymeraasit voivat olla sopivia.

20 PCR-menetelmä voidaan suorittaa vaiheittaisella tavalla, jolloin kun kin vaiheen jälkeen lisätään uusia reagensseja, tai tavalla, jossa kaikki reagens-sit lisätään samanaikaisesti, tai osittain vaiheittaisella tavalla, jossa tuoreita tai erilaisia reagensseja lisätään tietyn lukumäärän vaiheita jälkeen. Esimerkiksi jos säie-erotus indusoidaan lämmöllä ja polymeraasi on herkkä lämmölle, polyme-25 raasia on lisättävä kunkin säie-erotuskierroksen jälkeen. Kuitenkin jos esimerkiksi helikaasia käytetään denaturoinnissa tai jos laajennuksessa käytetään lämpöstabiilia polymeraasia, kaikki reagenssit voidaan lisätä aluksi, tai vaihtoehtoisesti jos reagenssien moolisuhteilla on merkitystä reaktiolle, reagensseja voidaan täydentää ajoittain niiden kuluessa synteesireaktioon.

30 Alan taitajat tietävät, että PCR-menetelmä suoritetaan tavallisimmin automatisoituna menetelmänä käyttäen lämmön suhteen stabiilia entsyymiä. Tässä menetelmässä reaktioseoksen lämpötilaa kierrätetään denaturointialu-eella, alukkeen juottoalueella ja reaktioalueella. Laite (lämpökierrätin), joka on nimenomaisesti kehitetty käytettäväksi lämmön suhteen stabiilin entsyymin 35 kanssa, voidaan hankkia kaupallisesti.

9 106804

Alan taitajat tietävät myös ongelmasta, jonka aiheuttaa PCR:n kontaminoituminen vahvistetulla nukleiinihapolla edeltävistä reaktioista. Menetelmät tämän ongelman pienentämiseksi mahdollistavat mahdollisen vahvistetun DNA:n edeltävistä reaktioista entsymaattisen pilkkomisen. PCR-vahvistaminen 5 suoritetaan dTTP:n asemesta dUTP:n läsnä ollessa. Saatu kaksoissäikeinen urasiilia sisältävä tuote pilkotaan urasiili-N-glykosylaasilla (UNQ), kun taas UNG ei pilko normaalia, tymiiniä sisältävää DNA:ta. Lisäämällä UNG:tä vahvistusre-aktioseokseen ennen vahvistuksen aloittamista pilkotaan kaikki urasiilia sisältävä DNA, joka saattaisi toimia kohteena. Koska urasiilia sisältävän DNA:n ainoa 10 lähde on vahvistustuote edeltävästä reaktiosta, tämä menetelmä steriloi tehokkaasti reaktioseoksen eliminoiden kontaminaation edeltävistä reaktioista (siirtymisen) ongelman. Lämpö inaktivoi UNG:n tilapäisesti, joten vahvistusmenettelyn denaturointivaiheet toimivat myös UNG:n inaktivoimiseksi. Tämän vuoksi uusia vahvistustuotteita, jotka tosin sisältävät urasiilia, muodostuu 15 UNG:stä vapaassa ympäristössä ja ne eivät tule pilkotuiksi.

Esillä olevan keksinnön toinen tärkeä näkökohta esillä olevien menetelmien menestyksekkäässä suorittamisessa on koetinhybridisaatio. Esillä olevan keksinnön mukaiset oligonukleotidikoettimet hybridisoituvat spesifisesti johonkin tiettyyn segmenttiin todettavan ja identifioitavan organismin SOD-20 geenissä ja niissä on riittävät destabiloivat epäyhteensopivuudet sekvensseihin erilaisista organismeista nähden sukuspesifisten koettimien tapauksessa ja saman suvun muihin lajeihin nähden lajispesifisten koettimien tapauksessa.

Keksinnön mukaisia koettimia voidaan käyttää sen määrittämiseksi, esiintyykö nukleiinihappoja näytteessä, määrittämällä, sitoutuvatko koettimet 25 näytteen sisältämiin sekvensseihin. Alalla tunnetaan sopivia määritysmenetelmiä esillä olevan keksinnön tarkoituksiin koettimien ja nukleiinihapposekvenssi-en näytteessä välille muodostuneiden hybridien toteamiseksi. Esimerkiksi de-tektointi voidaan suorittaa Southern blot -määrityksellä ja nestehybridisaatiolla käyttäen piste-blot-muotoa. Piste-blot-muodossa ei-leimattu vahvistettu näyte 30 sidotaan kiinteään tukeen, kuten membraaniin, membraania inkuboidaan leimatun koettimen kanssa sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa, hybridisoitumatta jäänyt koetin poistetaan pesemällä ja suodattimesta tarkastetaan sitoutuneen näytteen läsnäolo. Analysoitaessa monilukuista määrää näytteitä vain muutamalla koettimella, kuten on asianlaita seulottaessa näytteistä jonkin nimenomai-35 sen suvun nukleiinihapon läsnäoloa käyttäen sukuspesifisiä koettimia, piste-blot-muoto on varsin käyttökelpoinen.

• f c

•. L

ίο 106804

Vaihtoehtoinen menetelmä on varsin käyttökelpoinen, kun on määrä käyttää suuria lukumääriä erilaisia koettimia. Tämä menetelmä on "käänteinen" piste-blot-määritys, jossa vahvistettu sekvenssi sisältää leiman, ja koetin on sidottu kiinteään tukeen. Tässä muodossa ei-leimatut koettimet sidotaan mem-5 braaniin ja ne altistetaan leimatulle näytteelle tarkoituksenmukaisissa hybridi-saatio-olosuhteissa. Sitten hybridisoitumatta jäänyt leimattu näyte poistetaan pesemällä sopivissa olosuhteissa, minkä jälkeen suodattimesta tarkastetaan sitoutuneiden sekvenssien läsnäolo. Koska lajinmääritys edellyttää monien lajispesifisten koettimien käyttöä kutakin vahvistettua näytettä kohden, käänteinen 1 o piste-blot-muoto on edullinen testimuoto tälle vaiheelle.

Vaihtoehtoisesti voi olla toivottaa käyttää detektointimenetelmää, jossa on monilukuinen määrä koetin hybrid isaatiokohtia tai -kuoppia. Esimerkiksi kiinteä tuki kuten mikrotiitterilevy on erityisen käyttökelpoinen esillä olevien menetelmien kliinisissä käyttösovellutuksissa suuressa mittakaavassa. Menetelmiä 15 PCR:llä vahvistetun DNA.n hybridisoimiseksi/sieppaamiseksi kiinteisiin tukiin tunnetaan. Noiden menetelmien yhdessä suoritusmuodossa vahvistettu kohde-DNA leimataan (esim. biotiinilla) vahvistuksen PCR-reaktiossa aikana. Leimattu DNA tulee spesifisesti siepatuksi hybridisoimalla PCR-tuote kohdespesifiseen oligonukleotidisieppauskoettimeen, joka on sidottu mikrotiitterilevykuoppaan. 20 Sitoutunut tuote todetaan sopivalla tavalla käytetyn leimatyypin mukaan. Esimerkiksi jos biotiinia käytetään leimana, avidiini-HRP-kompleksia lisätään ja suoritetaan reaktio joko (a) vetyperoksidisubstraatin ja O-fenyleenidiamiini- (OPD-) kromogeenin kanssa tai (b) vetyperoksidisubstraatin ja tetrametyylibentsidiinik-romogeenin (TMB) kanssa. Kolorimetrinen signaali muodostuu mahdollistaen 25 PCR:llä vahvistetun DNA:n kvantitatiivisen detektoinnin.

Laboratorioissa käytettyinä mikrotiitterilevymäärityksiä käyttävät de-tektointimenettelyt voidaan standardoida laajalle valikoimalle kohteita. Voi olla tarpeen määrittää yksilöllisesti tarkoituksenmukaiset hybridisaatio- ja anka-ruusolosuhteet maksimaalisen spesifisyyden varmistamiseksi ottaen huomioon 30 käytettyjen koettimien pituus.

Toisessa sopivassa määrityssysteemissä leimattu koetin lisätään PCR-vahvistamismenetelmän aikana. Mikä tahansa koetin, joka hybridisoituu kohde-DNA:han kunkin synteesivaiheen aikana, tulee pilkotuksi alukelaajennuk-sen katalysoimiseksi käytetyn polymeraasin 5'®3'-eksonukleaasiaktiivisuuden 35 vaikutuksesta. Koettimen pilkkomistuote todetaan sitten. Täten pilkkomistuot- • O f 11 106804 teen läsnäolo osoittaa, että koettimen ja kohde-DNA:n välinen hybridisaatio on tapahtunut.

Esillä oleva keksintö koskee myös reagenssisarjoja osan superoksi-didismutaasia (SOD), etenkin SOD:tä mykobakteerilajista, koodittavasta gee-5 nistä vahvistamiseksi sekä reagenssisarjoja mykobakteerilajin toteamiseksi sekä mykobakteerisukuun kuuluvien eri lajien erottamiseksi toisistaan.

Vahvistamisreagenssisarjat käsittävät esillä olevan keksinnön mukaisia alukkeita, eli parin yleisaiukkeita ja/tai parin alukkeita, jotka sopivat osan SOD-geeneistä vahvistamiseksi nimenomaiseen sukuun kuuluvista eri lajeista, 10 etenkin parin alukkeita, jotka sopivat osan mykobakteerilajien SOD-geeneistä vahvistukseen. Ne voivat samoin mahdollisesti sisältää DNA-polymeraasin, esim. jonkin edellä mainituista DNA-polymeraaseista, ja/tai edellä mainittuja substraattinukleosiditrifosfaatteja ja/tai sopivia puskureita PCR:lle. Edeltävien ainesosien lisäksi reagenssisarjat voivat niinikään sisältää ohjeita esillä olevan 15 keksinnön mukaisen vahvistuksen suorittamiseksi.

Reagenssisarjat mykobakteerilajin toteamiseksi käsittävät yhden tai useamman sukuspesifisen koettimen, etenkin poolin esillä olevan keksinnön mukaisia sukuspesifisiä koettimia. Joissakin tapauksissa koettimet on voi kiinnittää tarkoituksenmukaiselle tukimembraanille. Muita mahdollisia ainesosia 20 pakkaukseen ovat esimerkiksi leimaamiseksi ja/tai leiman toteamiseksi käytetyt keinot (esimerkiksi avidiinientsyymikonjugaatti ja entsyymisubstraatti ja kromo-geeni, jos leimana on biotiini) ja tarkoituksenmukaiset puskurit hybridisaatiore-aktioihin. Edeltävien ainesosien lisäksi reagenssisarjat voivat myös sisältää ohjeita esillä olevan keksinnön mukaisten toteamismenetelmien suorittamiseksi.

25 Reagenssisarjat mykobakteerisukuun kuuluvien eri lajien erottami seksi toisistaan käsittävät yhden tai useamman, esillä olevan keksinnön mukaisen lajispesifisen koettimen. Joissakin tapauksissa koettimet on voitu kiinnittää tarkoituksenmukaiseen tukimembraaniin. Muita pakkauksen mahdollisia ainesosia ovat esimerkiksi leimaamiseksi ja/tai leiman toteamiseksi käytety keinot 30 (esimerkiksi avidiinientsyymikonjugaatti ja entsyymisubstraatti ja kromogeeni, jos leimana on biotiini) ja tarkoituksenmukaiset puskurit hybridisaatioreaktioihin. Edeltävien ainesosien lisäksi reagenssisarjat voivat samoin sisältää ohjeita esillä olevan keksinnön mukaisten erotusmenetelmien suorittamiseksi.

Reagenssisarjat mykobakteerilajin toteamiseksi sekä mykobakteeri-35 sukuun kuuluvien eri lajien erottamiseksi toisistaan voivat lisäksi niinikään sisäl- 1 I t • ·. I.

12 106804 tää yhtä tai useampaa ainesosaa, jotka mainittiin edellä vahvistamisreagenssi-sarjoille.

Esillä olevan keksinnön seuraavassa suoritusmuodossa reagenssi-sarjat vahvistukseen, toteamiseen ja erotukseen voivat myös sisältää positiivisia 5 ja/tai negatiivisia verrokkeja. Edullisesti positiivinen verrokki sisältää nukleiini-happosekvenssin, joka voidaan vahvistaa käyttäen samaa alukeparia kuin jota käytetään haluttujen kohdenukleiinihappojen testinäytteessä vahvistamiseksi. Alan taitajat tuntevat menetelmiä positiivisen verrokin käyttämiseksi, joiden mukaan sekä kohde, jota saattaa olla läsnä tai olla olematta läsnä, ja positiivinen 10 verrokki käyttävät samaa alukeparia. Edullisesti positiivinen verrokki on suunniteltu ja rakennettu siten, että tuote-DNA edustaa helposti erotettavaa, selkeästi eri kokoa kuin kohde tai on modifioitu alan taitajien tuntemilla tavoilla (mutaatiot/restriktiokeskukset).

Seuraavien esimerkkien on tarkoitus kuvata esillä olevaa keksintöä 15 yksityiskohtaisemmin. Ne esitetään vain havainnollistaviin tarkoituksiin eivätkä ne rajoita keksinnön kattavuutta millään tavalla.

Esimerkki 1: Mykobakteeri-SOD-sekvenssien vahvistaminen alukkeilla Z205ja Z212

Alukkeet syntetisoitiin MilliGen/Biosearch Cyclone Plus -syntetisaat-20 torilla käyttäen DNA-syntetisointipakkausta aina 50 nukleotidin sekvensseille (Millipore GmbH, Eschborn, Saksa). Oligonukleotidit eluoitiin panoksista 25-%:isella NH4OH-liuoksella, ne kuivattiin tyhjössä ja liuotettiin enempää puhdistamatta loppupitoisuuteen 20 mM.

Noin 1 ng aiemmin puhdistettua kromosomi-DNA:ta mykobakteerila-25 jeista, jotka mainitaan taulukossa 1a, ja ei-mykobakteerilajeista, jotka mainitaan taulukossa 2a, vahvistettiin PCR:llä käyttäen seuraavaa kierrätysohjelmaa Thermocycler 480 -laitteessa (Perkin Elmer): 5 minuutin kuumennus 98 °C:ssa (alustava denaturointi), jäähdytys 55 °C:seen, minkä jälkeen 5 U:n Taq-poly-meraasia (Perkin Elmer AG, Kuesnacht, Sveitsi) lisäys ja kierrätys 35 kertaan 30 30 sekunnin ajan 94 °C:ssa (denaturointi), 30 sekunnin ajan 37 - 55 °C:ssa (juottaminen), 30 sekunnin ajan 72°C:ssa (laajennus) ja pito 10 minuutin ajan 72 °C:ssa.

Standardi-PCR-reaktio koostui seuraavista: 10 μΙ 10X puskuria (100 mM Tris, pH = 8,3 huoneenlämpötilassa; 500 mM KCI; 15 mM MgCI2; 0,015 % 35 gelatiinia), 16 ml deoksiribonukleotidiseosta (1,25 μπιοΙ kutakin dATP:tä; dGTP:tä; dCTP:tä; dTTP:tä), 5 μΙ aluketta Z205 (20 mM), 5 μΙ aluketta Z212 (20 • 1 < •. - 13 106804 μΜ), 10 μΙ vahvistettavaa DNA:ta ja 53 μΙ H20:ta. 10 μΙ vahvistettuja seoksia panostettiin 1-%:isiin agaroosigeeleihin ja erotettiin käyttäen 200 V:n jännitettä sekä 123 ep:n ja 1 ke:n "tikapuita" kokostandardeina (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg). Sopivan erotuksen jälkeen geelit värjättiin etidiumbromi-5 dilla ja niistä otettiin valokuva. Kokeellisten lisäyksityiskohtien osalta katso: "Molecular Cloning", J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (toim.); Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Tulokset on koottu taulukoihin 1a ja 2a;"+" merkitsee, että saatiin näkyvä amplikoni. Käytettäessä alukeparia 7205 ja Z212 37 °C:n juottolämpötilas-10 sa kaikista DNA-valmisteista 27 erilaisesta testatusta Mvcobacteriumlaiista (mainitaan taulukossa 1a) ja kaikista 106 ei-mykobakteerilajista, jotka mainitaan taulukossa 2a, saatiin näkyvät amplikonit värjättyihin geeleihin. Hallitsevin (ja useimmissa tapauksissa ainoa näkyvä fragmentti) oli DNA-fragmentti, joka ko-migroitui yhdessä 489 ep:n ennustetun amplikonin Mi tuberculosisista kanssa, 15 joka kattaa alueen 188 - 678 tuberculosis -sekvenssissä. Tämän vuoksi alukeparia Z205 ja Z212 voidaan pitää yleisalukkeina.

Esimerkki 2: Aiukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien valituista bakteereista kloonaus ja sekeventointi

Aluetta, joka vastaa asemia 188 - 666 M, tuberculosis -SOD-20 geenissä alla mainituissa 9 mykobakteerilajissa ja 4 ei-mykobakteerilajissa, vahvistettiin käyttäen alukeparia Z205 ja Z212. Sitten amplikonit kloonattiin ja sek-ventoitiin kuten kuvataan seuraavassa: M. tuberculosis (ATCC 1400); Mi. avium (ATCC 25291); Mi intracel-lulare (DSM 43223); M,, scrofulaceum (ATCC 19981); Mi kansasii (DSM 43224); 'j 25 Mi fortuitum (ATCC 6841); Mi simiae (ATCC 25275); Mi aordonae (DSM 610);

Mi xenopi (ATCC 19250); Corvnebacterium diphteriae (ATCC 11913); Corvne-bacterium pseudodiphteriticum (RC 181); Nocandia asteroides (ATCC 43005); ja Actinomyces viscosus (ATCC 15987).

Yksityiskohtia menettelyistä voidaan löytää "Molecular Cloning" 30 -nimisestä laboratoriokäsikirjasta, johon edellä viitataan. Noin 1 ng kromosoni-DNAita 13:sta edellä mainitusta organismista vahvistettiin kuten kuvattiin esimerkissä 1. PCR-amplikonien mahdollisesti repaleiset päät täytettiin käyttäen neljää deoksinukleotidia (dNTP) ja Klenow-polymeraasia. Ei-sisällytetyiksi tulleet alukkeet ja dNTP:t erotettiin amplikoneista laimentamalla reaktioseosta ja käyt-35 tämällä liuos Quiagen-kärjen 5 läpi noudattaen valmistajan (Diagen, Duessel-dorf, Saksa) ohjeita. Eluoitu ja saostettu DNA liuotettiin ja fosforyloitiin käyttäen * ·.

14 106804 5-pääleimauspakkausta (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Saksa). Täytetyt ja kinaasikäsitellyt amplikonit erotettiin elektroforeettisesti NuSieve CTG -agaroosissa (FMC, BioProducts Europe, Vallensbaek Strand, Tanska) ja irti leikattiin amplikonit, jotka komigroituivat yhdessä 489 ep:n M tuberculosis 5 -fragmentin kanssa. DNA otettiin talteen geeliviipaleista ja sitä puhdistettiin käyttäen Quiagen-kärkeä 5 edellä kuvatun mukaisesti. Seostamalla saatu pelletti liuotettiin ja kvantitoitiin, minkä jälkeen sitä käytettiin ligatointiin.

Plasmidi pUC 19 pilkottiin täydellisesti Smalillä, sitä uutettiin fenolilla, se saostettiin ja liuotettiin, minkä jälkeen se defosforyloitiin käyttäen vasikan ka-10 teenkorvan alkalista fosfataasia. Vektori-DNA:ta uutettiin jälleen fenolilla, se saostettiin ja laimennettiin pitoisuudeksi noin 1 ng/μΙ. Vektori-DNAja kaikki vektorin valmistuksessa käytetyt entsyymit olivat valmistajalta Boehringer Mannheim (Mannheim, Saksa).

Pilkottua, defosforyloitua vektori-DNA:ta ligatoitiin puhdistettuihin 15 SOD-amplikoneihin 18 tunnin ajan 22°C:ssa käyttäen 1 U T4-ligaasia. Trans-formoitumiskelpoisia DH5a-soluja (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA) transformoitiin 2-5 piillä ligaasiseosta noudattaen valmistajan ohjeita, minkä jälkeen ne maljoitettiin LB-kasvualustaan, joka sisälsi X-gal:ia, IPTGitä ja ampisilliiniä (yksityiskohtien osalta katso "Molecular Cloning"-20 käsikirja).

13 kloonatun amplikonin kustakin transformoinnista 10 (väritöntä) yh-distelmä-DNA-pesäkettä noukittiin talteen ja niitä kasvatettiin 200 piissä LB-lientä, jota oli jaettu mikrotiitterilevykuoppiin. Valmistettiin raaka-DNAita käyttäen keitto-jäädytysmenetelmää ja tarkoituksenmukaisia eriä DNA-liuoksesta vahvis-25 tettiin enempää puhdistamatta PCRillä käyttäen pUC-sekventointi- ja käänteis-sekventointialukkeita (Boehringer Mannheim; Mannheim, saksa). Kustakin 13 erilaisesta vahvistuksesta kahden kuopan sisältöä, jotka sisälsivät plasmideja, joissa oli odotettu inserttikoko 592 ep (jolloin 103 ep oli peräisin monikloonaus-keskuksesta ja 489 ep SOD-amplikonista), käytettiin jatkosekventoinnissa. Yh-30 distelmä-DNA-plasmidi-DNA:ta 2 riippumattomasta kloonista kustakin 13 erilaisesta edellä mainitusta organismista puhdistettiin käyttäen Quiagen "Plasmid" -maksipakkausta (Diagen, Duesseldorf, Saksa) ja ne sekventointiin dideoksime-netelmällä käyttäen pUC-sekventointipakkausta ja S35:tä noudattaen valmistajan (Boehringer Mannheim, Mannheim, Saksa) antamia ohjeita.

35 Sekventoinnissa käytettyjen alukkeiden asema esitetään kuviossa 1.

Kahden alukkeen ohella, jotka liittyvät pUC19:n monikloonauskeskukseen (pUC- • < l • l <.

15 106804 eteenpäin ja pUC-taaksepäin), samaa kahta aluketta kuin käytettiin kloonaukseen (Z205 ja Z212) käytettiin sekventointireaktioissa. Kaikille mykobakteerila-jeille ja Nocardia asteroidesille käytettiin lisäksi kahta eteenpäin-aluketta (Z256 ja Z243) ja yhtä taaksepäin-aluketta (Z244). Tämä strategia mahdollisti sekven-5 tointigeelien täydellisen limittyvän luennan, jolloin vain noin 150 ep oli luettava mistä tahansa yhdestä reaktiosta. Niiden alukkeiden asemat, jotka ovat spesifisiä SOD-amplikonien sekventoinnille lopuista kommensaalisista bakteereista (Z257 ja Z245 C diphteriaelle. Z258 ja Z247 C. pseudodiphteriticumille ja Z246 A. viscosukselle). mainitaan samoin kuviossa 1. Kaikkien sekventointialukkeiden 10 SOD-geenissä sekvenssit esitetään taulukossa 3. Koska aluke Z212 sisältää 2 horjuvaa emästä, oli mahdollista varmistaa, että kaksi itsenäistä kloonia sek-ventoitiin kustakin 13 lajista.

Kaikkiaan 29,1 ke luettiin 9 mykobakteeri- ja 4 ei-mykobakteerilajista saaduista 26 kloonista. Konsensussekvenssit esitetään taulukoissa 4-16.

15 Esimerkki 3: SOD-sekvenssien vertailu Mycobacteriumilie spesi fisten PCR-alukkeiden määrittämiseksi

Kaikki taulukoissa 4-16 esitetyt SOD-sekvenssit asetettiin rinnan niiden vertailun toisiinsa mahdollistamiseksi alueiden identifioimiseksi, joilla oli erityistä homologiaa mykobakteerisukuisten jäsenien välillä ja erityistä hetero-20 geenisyyttä verrattuna vastaaviin alueisiin ei-mykobakteerilajeista. Rinnanaset-telussa käytettiin GCG-ohjelmaa [Genetics Computer Group Sequence Analysis -ohjelma, versio 7.1, Dervereux et aL, NAR 12 (1984) 387- 395; GAP-rinnanasettelu].

Tällä tavalla voitiin saada kaikille 27 mykobakteerisukuiselle lajille r 25 spesifisiä alukkeita, jotka mahdollistaisivat sen osan niiden SOD-koodisek-vensseistä vahvistuksen, jota sivuavat alukkeet, jotka liittyvät säilyviin alueisiin. Nämä säilyvät alueet Mvcobacterium-suvun piirissä osoittavat lukuisia epäyh-teensopivuuksia verrattuna vastaaviin alueisiin 4 sekventoidussa ei-mykobak-teerilajissa. Tämä vuoksi näillä kriteereillä valitut alukkeet todennäköisimmin 30 estäisivät ei-mykobakteerilajien vahvistuksen.

Valitut alukesekvenssit (Z261 ja Z212) olivat yksi useista yhdistelmistä, joita testattiin niiden kyvyn suhteen vahvistaa kaikkia 27 mykobakteerilajia (taulukko 1a), mutta ei mitään 93 ei-mykobakteerikohde-DNA:sta (taulukko 2a). Yhtä kahdesta alukkeesta (Z212) käytettiin sekä mykobakteeri- että ei-myko-35 bakteeri-DNA-sekvenssien vahvistamiseksi. Z212:n sekvenssi vastaa asemia 677 - 655 M. tuberculosisin SOD-geenissä. DNA:n mykobakteeri- ja ei-myko- * c ie 106804 bakteerilajeista diskriminoiva vahvistus on tämän vuoksi vasta-alukkeen Z261 (asemat 245 - 269 M. tuberculosisin SOD-geenissä) varassa. Z261:n sekvenssi sekä epäyhteensopivuudet 9 sekventoidussa Mvcobacterium-suvun lajissa ja 4 valitussa ei-mykobakteerilajissa esitetään taulukossa 17. Sisällyttämällä mukaan 5 kaksi horjuvaa emästä (asemat 249 ja 264) maksimissaan 2 epäyhteensopi-vuutta jää 9 sekventoituun mykobakteerilajiin. Viimeiset 5 nukleotidiä alukkeen 3-päässä ovat säilyviä kaikissa 9 sekventoidussa Mvcobacterium-lajissa.

Esimerkki 4: Vahvistaminen sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212 10 Käytettäessä M, tuberculosis -DNA:ta alukeparilla Z261/Z212 saadut amplikonit ovat 434 ep:n pituisia. Juottamislämpötila sukuspesifiselle vahvistukselle optimoitiin käyttäen DNA:ta M, tuberculosisisista. M intracellularesta. CT diphteriaestä. Nocardia asteroidesistä ja ihmis-DNA:ta edustavina testi-DNA-sekvensseinä käyttäen esimerkissä 1 kuvattuja PCR-standardiolosuhteita. Seu-15 raavat lämpötilat arvioitiin: 37 °C; 45 °C; 50 °C; 55 °C; 58 °C; 60 °C; 64 °C; 67 °C ja 70 °C; ei-mykobakteeri-DNA:lla epäankarissa lämpötiloissa (37 °C ja 45 °C) tavatut amplikonit alkavat hävitä korkeammissa juottamislämpötiloissa (> 58 °C). 64 °C:ssa ihmis-DNA:lla voidaan yhä havaita sarja fragmentteja, joita ei esiinny 67 °C:ssa. Joko 60 tai 67 °C käytettiin alukeparin Z261 ja 2212 kanssa. Ampli-20 konien näkyvä määrä oli korkeampi 60 °C:ssa, joskin 67 °C oli selvästi diskrimi-noivampi lämpötila. Optimaaliseksi magnesiumpitoisuudeksi todettiin 1,5 mM. Tämän vuoksi lopullinen kierrätysohjelma sukuspesifisille alukkeille (Z261 ja Z212) oli seuraava: 5 minuutin kuumennus 98 °C:ssa, jäähdytys 55°C:seen, 1 μΙ:η Taq-liuosta (5 U) lisäys ja 35 kierroksen vahvistus, kukin kierros 30 sekun-25 tia, 94 °C, 60 tai 67 °C, 72 °C, sekä 10 minuutin inkubointi 72 °C:ssa.

Tulokset on koottu taulukoihin 1a ja 2a; "+" merkitsee, että näkyviä amplikoneja saatiin, ja merkitsee, että amplikoneja ei saatu lainkaan tai saatiin hyvin vähän. Kaikkia 27 mykobakteerilajia vahvistettiin sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212, mistä varmistuttiin geelielektroforeettisesti käyttäen 67 °C:n 30 juottamislämpötilaa (taulukko 1a). Kuitenkin signaalit, jotka saatiin geeleihin Mi qadiumilla. M. marinumilla ja Mi haemophilumilla. olivat heikkoja verrattuina muiden 24 lajin signaaleihin. Kun kierrätysaika nostettiin 1 minuutiksi, näkyviä signaaleja saatiin myös kyseisille 3 lajille.

Alukkeet Z261 ja Z212 eivät vahvistaneet 102:ta 106 ei-mykobak-35 teerilajista (taulukko 2a), mikä pääteltiin näkyvien signaalien puuttumisesta aga-roosigeeleistä. Sen varmistamiseksi, että sopiva määrä vahvistettavaa materi- 106804 17 aalia sisällytettiin PCR-reaktioon, kaikkia DNA-sekvenssejä testattiin (todeten ne positiivisiksi) rinnan alukeparin Z205 ja Z212 kanssa. Neljä bakteerilajia antoi heikot signaalit geeleihin käytetyissä PCR-olosuhteissa, jolloin nämä olivat Ed-wadsiella tarda. Ewinaella americana. Klebsiella pneumoniae ja Salmonella 5 hautena. Kuitenkaan mikään amplikoneista näistä 4 lajista ei vastannut tarkalleen kooltaan ja intensiteetiltään mykobakteeri-DNA:l!a saatuja amplikoneja. Esimerkki 5: Sukuspesifisten koettimien valinta Sekvenssit, jotka saatiin vahvistamalla 9 mykobakteeri- ja 4 ei-myko-bakteeri-DNA:ta sukuspesifisiliä alukkeilla Z261 ja Z212 (taulukot 4-16), astet-10 tiin rinnan, ja analysoitiin alueet, joilla oli maksimaalinen homologia mykobaktee-rilajeissa ja maksimaalinen heterogeenisyys ei-mykobakteerilajeissa. Lopulta valittu sukuspesifinen koetin kattaa asemat 382 - 421 M tuberculosis -sekvenssissä. Yhteinen sekvenssi esitetään taulukossa 18 yhdessä epäyhteenso-pivuuksien kanssa, jotka esiintyvät sekventoiduissa ei-mykobakteerilajeissa. 15 Vain 2 epäyhteensopivuutta esiintyy Nocardia asteroidesissa. mutta tämä DNA ei vahvistu kuvatuissa olosuhteissa sukuspesifisiliä PCR-alukkeilla Z261 ja Z212, mikä johtuu läsnä olevista 11 epäyhteensopivuudesta. Sen sijaan, että olisimme sisällyttäneet mukaan kaikkiaan 14 hotjuvaa emästä kaikkien epäyh-teensopivuuksien kattamiseksi 9 sekventoidussa mykobakteerilajissa (taulukko 20 18), valitsimme kunkin sukuspesifisen oligonukleotidin erillisen synteesin, joka johti 8 oligonukleotidin pooliin (M: intracellulare ja Ml xenopi on ryhmitetty yhteen), jossa kutakin yksittäistä koetinta on läsnä ekvimolaariset määrät. Koettimien sukuspesifisen poolin muodostavien oligonukleotidien sekvenssit esitetään taulukossa 19. Koetin Z310 toteaa M tuberculosisin. Z311 toteaa sekä M intra-25 cellularen että M xenopin. Z312 toteaa M aviumin. Z313 M aordonaen. Z314 M. fortuitumin. Z315 M. scrofulaceumin. Z316 M. simiaen ia Z317 M. kansasiin. Esimerki 6: Hybridisaatio sukuspesifisiliä koettimilla Koettimien sukuspesifinen pooli (taulukko 19) leimattiin seuraavasti: 80 pmol 8 koettimen (Z310 - Z317) ekvimolaarista seosta leimattiin 5'-päässä 30 spesifiseen aktiivisuuteen noin 3 x 1074ig käyttäen 100 gamma-Ci 32P-gamma-ATP:tä (10 mCi/ml; 5 000 Ci/mmol) noudattaen 5'-leimauspakkauksen valmistajan (Boehringer Mannheim, Mannheim, Saksa) ohjeita. Ei-sisällytetyksi tullut leima poistettiin käyttäen Biospin 6 -kolonnia (BioRad, Richmond, USA). 20 μΙ alkalilla denaturoituja PCR-seoksia, jotka oli saatu sukuspesifisiliä alukkeilla 35 Z261 ja Z212 27 mykobakteerilajista (taulukko 1a) ja 106 ei-mykobakteerilajista (taulukko 2a), laimennettiin 100 phlla TE-puskuria ja täplitettiin esikastelluille 18 10C804

kiinteille tuille ("Gene Screen plus" -suodattimet; Du Pont de Nemours, Bad Homburg, Saksa) käyttäen 96-kuoppaista manifoldia (Schleicher & Schuell; Dassel, Saksa). Suodattimet ristikytkettiin Stratagene UV-liittäjässä (Stratagene, La Jolla, USA) ja esihybridoitiin 50 ml:n Falcon-putkessa, joka sisälsi 5 ml esihy-5 bridisaatioliuosta (6 X SSC, 10 mM natriumfosfaatti, pH 6,8, 1 mM EDTA, pH

8,0, 1 % SDS:ää, denaturoitua lohensperma-DNA:ta, 100 pg/ml). Esihybridisaa-tio suoritettiin 60 °C:ssa 60 minuuttia kestävänä pyörivässä hybridisaatiouunis-sa. Esihybridisaationeste heitettiin pois ja korvattiin 5 ml:lla hybridisaatioliuosta (3 M tetrametyyliammoniumkloridi, 10 mM natriumfosfaatti, pH 6,8,1 mM EDTA, 10 pH 7,6, 0,5 % SDS:ää, denaturoitua lohensperma-DNA:ta, 100 pg/ml, ja 5 - 8 x 106 tuiketta/min leimattuja sukuspesifisiä koettimia. Yksityiskohtia puskurin valmistuksesta voidaan löytää käsikirjasta "Molecular Clonig", johon edellä on viitattu. Hybridisaatio suoritettiin 3-16 tuntia kestävänä 65 °C:ssa. Suodattimia pestiin 4x15 minuutin ajan esilämmitetyllä (70 °C) 2 X SSC-liuoksella, joka si-15 sälsi 0,2 % SDS:ää, 70 °C:ssa, minkä jälkeen niitä autoradiokuvattiin 1-2 tunnin ajan -70 °C:ssa käyttäen vahvistussuotimia.

Tulokset on koottu taulukoihin 1a ja 2a; "+" merkitsee, että hybridi-saatiosignaali saatiin ja merkitsee, ettei hybridisaatiosignaalia saatu. Koetti-mien (Z310 - Z317) sukuspesifistä poolia käytettiin kaikkien 27 mykobakteerilajin 20 (taulukko 1a) seulomiseksi. Pooli tunnisti kaikki 9 sekventoitua mykobakteerilajia (taulukot 4-12, spesifisesti: M,, tuberculosis. M. avium. M. intracellulare. M. for-tuitum. M. scrofulaceum. M. gordonae, M. simiae. M. xenopi ja Mi kansasii. Lisäksi seuraavat 13 ei-sekventoitua mykobakteerilajia tunnistetaan sukuspesifi-nen koetinpoolilla: M. africanum, M. acapulcensis. M. bovis. M. brunense. M.

• 25 chelonai. M. flavescens. M. marinum. M. aastri. M. terrae. M. triviale. M.

nonchromaticum. M. oboense ja M. smeqmatis (merkitty "+":|ia taulukossa 1a). Heikompia signaaleja kuvatuissa hybridisaatio-olosuhteissa saatiin seuraavilla: M. haemophilum. M. aadium. Mi szluaai ja Mi βΜ [merkitty "(+)":lla taulukossa 1a]. Mitään signaalia ei saatu M. rhodensiaellä Tmerkittv ”(-)":lla taulukossa 1a].

30 Mitään amplikoneista, jotka saatiin sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja ♦ ♦ Z212 taulukossa 2a luetelluista ei-mykobakteerilajeista (jotka eivät olleet näkyviä geeleissä) sekä 4 lajista, jotka antoivat heikkoja signaaleja geeleissä (katso esimerkki 7), ei todettu sukuspesifisten koettimien (Z310 - Z317) poolilla. Tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 2a.

19 106804

Esimerkki 7: Lajispesifisten koettimien tunnistus 9 mykobakteeri-DNA:ta sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212 vahvistamalla saatujen amplikonien sekvenssit (taulukot 4-12) asetettiin rinnan kuten kuvataan esimerkissä 3 ja kustakin mykobakteerisekvenssistä analysoitiin 5 yksitellen erityisen heterogeenisyyden alueet verrattuna loppuihin mykobakteeri-sekvensseihin. Tällä tavalla lasispesifisiä sekvenssejä voitiin identifioida ja analysoida kokeellisesti. Osoittautui, että alueet, jotka numeerisesti osoittivat korkeimpia lukumääriä epäyhteensopivuuksia (maksimaalinen heterogeenisyys käytetyssä rinnanasetusohjelmassa), eivät aina olleet alueita, joista saatiin disk-10 riminoivimmat hybridisaatiotulokset. Huomattavaa on samoin, että epäyhteen-sopivuuksien lukumäärä yhdessä sekvenssissä verrattuna muihin riippuu rinna-nasetteluissa käytetyistä kriteereistä. Lajispesifisille koettimille annetut asemat viittaavat sekvensseihin, joista ne on saatu (taulukot 4 -12), eikä niille erilaisissa rinnanasetusohjelmissa annettuihin numeroihin.

15 Esimerkki 7.1: M. tuberculosis -spesifinen koetin

Valittiin 3 aluetta, joiden sekvenssit olivat seuraavat (taulukko 4): Z302: 5-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG CTG CTG C-3' (sekv. tunnusnro 22; asema 550 - 586); Z336: 5-GCT AGG CATTGT TCC GCT GCT GCT GC-3' (sekv. tun-20 nusnro 17; asema 561 - 586); ja Z337: 5-AGT CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3’ (sekv. tunnusnro 23; asema 633 - 654).

Z302, Z336 ja Z337 leimattiin ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodattimiin, joihin oli immobilisoitu 28 Z261 :llä ja Z212:lla saatua myko->: ’ 25 bakteeriamplikonia (26 eri lajia). Hybridisaatiolämpötila oli 70 °C Z302:lle ja 60 °C lopuille kahdelle koettimelle. Hybridisaatio suoritettiin 1-16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 80 °C Z302:lle, 65 °C Z337:lle ja 60 °C Z336:lle. Filmejä kehitettiin 1 - 3 tunnin ajan.

Koetin Z302, joka on 37 nukleotidin mittainen, tunnisti käytetyissä 30 olosuhteissa vain M. tuberculosisin ja likeiset sukulaiset, jotka oli yhdistetty "makrorykelmäksi" ["Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", 8. painos, R.E. Buchanon ja N.E. Gibbons (toim.), Waverly Press Inc., Baltimore, 1974] M bovisin. M. bovis BCG:n ja ML africanumin kanssa. Z302 ei tunnistanut loppuja taulukossa 1b mainittuja 23 mykobakteerilajia eikä mitään taulukossa 2b luetel-35 luista 106 ei-mykobakteerilajista.

20 106804

Koetin Z336 edustaa viimeisiä 26 nukleotidiä alkuperäisen koettimen Z302 3'-päässä. Typistetty koetin Z336 hybridisoitui kuvatuissa modifioiduissa olosuhteissa vain Mr tuberculosisiin. Mr hovisiin. M. bovis BCG:hen ja Mr africa-numiin. Ristireaktiota ei havaita loppujen taulukossa 1b mainittujen 23 myko-5 bakteerilajin kanssa eikä minkään taulukossa 2b luetelluista 106 ei-mykobak-teerilajista kanssa.

Z337 (22 nukleotidin koetin), joka on sijoitettu sekventoidun osan SOD-geenistä loppupäähän, on spesifinen Mr tuberculosis-M. bovis-M. africa-num-komoleksille eikä ristireagoi loppujen taulukossa 1b mainittujen 23 myko-10 bakteerilajin kanssa, eikä minkään taulukossa 2b luetelluista ei-mykobak-teerilajeista kanssa.

Vaikka kolmen koettimien Z302, Z336 ja Z337 spesifisyydet ovat verrattavia, koettimet Z336 ja Z337 ovat edullisia alhaisemman pesulämpötilan johdosta.

15 Esimerkki 7.2: M. avium-M. bmnense-spesifinen koetin

Valittiin alue 423 - 459 (taulukko 5), jonka sekvenssi on seuraava: Z301: 5-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGC C-3' (sekv. tunnusnro 14; asemat 423 - 459) Z301 leimattiin ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodatti-20 meen, johon oli immobilisoitu Z261:llä ja Z212:lla saatuja mykobakteeriampliko-neja. Hybridisaatio suoritettiin 1-16 tuntia kestävänä 70 °C:n lämpötilassa Z301 :lle, pesulämpötila oli 80 °C Z301:lle. Filmejä kehitettiin 3 tunnin ajan. M. avium-M. brunense-spesifisellä koettimella Z301 amplikonit Mr aviumista tunnistettiin yhdessä amplikonien Mr brunensesta kanssa (n = 6; amplikonit saatu : : 25 samasta varasto-DNA-valmisteesta). Mr brunenselle ei ole käytettävissä sek- ventointitietoja, jolloin järkevä koettimen suunnittelu tälle lajille ei ollut mahdollista. Tässä vaiheessa ei voida täysin sulkea pois mahdollisuutta, että Mr bru-nense -varasto oli itse asiassa kontaminoitunut Mr avium -amplikoneilla. Kunnes uusia Mr brunense -varastoja kasvatetaan, vahvistetaan ja sekventoidaan, 30 Z301 :tä kuvataan koettimena, joka tunnistaa sekä Mr aviumin että Mr brunen- ·· sen. Z301 ei tunnistanut mitään muista taulukossa 1b mainituista mykobaktee- rilajeista. Jälleen mikään testatuista taulukossa 2b luetelluista ei-mykobakteeri-DNA-sekvensseistä ei ristireagoinut Mr avium-M. brunense-spesifisen koettimen kanssa.

21 106804

Esimerkki 7.3: M. intracellulare -spesifinen koetin

Valittiin alue 416 - 452 (taulukko 6), jonka sekvenssi on seuraava: Z303: 5 -CCT TCG GAT CCT TCG ACC GGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3' (sekv. tunnusnro 13) 5 Z303 leimattiin päästä ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodattimeen, johon oli immobilisoitu Z261:llä ja Z212:lla saadut 28 mykobak-teeriamplikonia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 60 °C:ssa 16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 70 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Esimerkki Mi intracellularelle valitun lajispesifisen koettimen spesifisyy-10 destä esitetään kuviossa 2 (16 tunnin kehitys) ja tuloksista on koottu yhteenveto taulukkoon 1b.

DNA-järjestys suodattimena oli seuraava: A 2 Mi tuberculosis (kliininen isolaatti 1400) A3 tuberculosis 27294 15 A 4 M. avium 25291 A 5 M. fortuitum 6841 A 6 M. aordonae DSM610 A 7 Mj. kansasii DSM 43224 A 8 M. scrofulaceum 19981 20 A 9 M. simiae 25275 A10 M. xenopi 19250 A 11 Mj intracellulare DSM 43223 B2 M. acapulcensis 14473 A 25 B3 M. africanum 25420 B 4 M. bovis BCG 1401 B5 M. bovis 19210 B 6 Mi brunense 23434 B7 M. chelonai 35752 30 B8 M. flavescens DSM 43219 ... B9 M. qastri 15754 B10 M. smeamatis 14468 B11 M. terrae 15775 22 106804 C 2 M. triviale 23292 C 3 Mi marinum 927 C4 M. haemophilum 29548 C5 M. nonchromoaenicum 19530 5 C6 M. obuense 27023 C 7 MiEblei DSM750 C 8 Mi rhodesiae 27024 C 9 Mi szulqai 35799 C10 M. qadium 27726

10 HzO

Mikään testatuista 106 ei-mykobakteeriorganismilajista ei reagoinut samoissa olosuhteissa kuin kuvattiin edellä mykobakteerilajeille.

Esimerkki 7.4: M. scrofulaceum -spesifinen koetin 15 Valittiin alue 501 - 537 (taulukko 7), jonka sekvenssi on seuraava: Z306: 5-TGA CAC ACT CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT CCA GCT T-3' (sekv. tunnusnro 20) Z306 leimattiin ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodatti-meen, johon oli immobilisoitu 28 Z261 :llä ja Z212:lla saatua mykobakteeriampli-20 konia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 70°C:n lämpötilassa 1-16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 80 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Z306 hybridoitui vain Mi scrofulaceum -DNA:han, mutta ei mihinkään muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, taulukossa 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut Mi scrofula->· 25 ceum-spesifisen koettimen kanssa.

Esimerkki 7.5: M. kansasii -spesifinen koetin

Valittiin alue 546 - 567 (taulukko 8), jonka sekvenssi on seuraava: Z340: 5-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3' (sekv. tunnusnro 19) 30 Z340 leimattiin ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodatti- ·· meen, johon oli immobilisoitu 28 Z261:llä ja Z212:lla saatua mykobakteeriampli- konia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 60 °C:n lämpötilassa 1-16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 65 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Z340 hybridoitui vain Mi kansasii -DNA:han, mutta ei mihinkään 35 muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, taulu- 106804 23 kossa 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut Mi kansasii -spesifisen koettimen kanssa.

Esimerkki 7.6: M. fortuitum -spesifinen koetin

Valittiin alue 500 - 521 (taulukko 9), jonka sekvenssi on seuraava: 5 Z369: 5-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3' (sekv. tunnusnro 21) Z369 leimattiin päästä ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodattimeen, johon oli immobilisoitu 28 Z261:llä ja Z212:lla saatua mykobak-teeriamplikonia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 60 °C:n lämpötilassa 1-16 10 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 70 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Z369 hybridoitui vain M,, fortuitum -DNA:han, mutta ei mihinkään muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, taulukossa 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut M. fortuitum -spesifisen koettimen kanssa.

15 Esimerkki 7.7: M. simiae -spesifinen koetin

Valittiin alue 360 - 396 (taulukko 10), jonka sekvenssi on seuraava: Z304: 5-GTC CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3' (sekv. tunnusnro 16) Z304 leimattiin ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodatti-20 meen, johon oli immobilisoitu 28 Z261:llä ja Z212:lla saatua mykobakteeriampli-konia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 70 °C:n lämpötilassa 1 -16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 80 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Z304 hybridoitui vain M. simiae -DNAihan, mutta ei mihinkään muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, taulukossa 25 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut M, simiae -spesifisen koettimen kanssa.

Esimerkki 7.8: M. gordonae -spesifinen koetin

Valittiin alue 507 - 531 (taulukko 11), jonka sekvenssi on seuraava: Z366: 5-TCT GGG CGG CCG GTT GCT CAC CTT T-3' (sekv. tun- 30 nusnro15) Z366 leimattiin päästä ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodattimeen, johon oli immobilisoitu 28 Z261 :llä ja Z212:lla saatua mykobak-teeriamplikonia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 60 °C:n lämpötilassa 1-16 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 70 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin 35 ja 16 tunnin ajan. Z366 hybridoitui vain M aordonae -DNA:han, mutta ei mihinkään muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, 106804 24 taulukossa 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut M. qordonae -spesifisen koettimen kanssa.

Esimerkki 7.9: M. xenopi -spesifinen koetin

Valittiin alue 280 - 316 (taulukko 12), jonka sekvenssi on seuraava:

5 Z309: 5-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC GCG

TTC A-3' (sekv. tunnusnro 18) Z309 leimattiin päästä ja hybridoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 6 suodattimeen, johon oli immobilisoitu 28 Z261:llä ja Z212:lla saatua mykobak-teeriamplikonia (26 eri lajia). Hybridisaatio suoritettiin 70 °C:n lämpötilassa 1-16 10 tuntia kestävänä, pesulämpötila oli 80 °C ja filmejä kehitettiin 3 tunnin, 6 tunnin ja 16 tunnin ajan. Z309 hybridoitui vain M. xenopi -DNA:han. mutta ei mihinkään muuhun taulukossa 1b lueteltuun mykobakteeriin. Mikään 106 testatusta, taulukossa 2b mainitusta ei-mykobakteeri-DNA:sta ei ristireagoinut Ml xenopi -spesifisen koettimen kanssa.

15 Suppea kuvaus kuvioista:

Kuvio 1: Sekventointialukkeiden asemat SOD-geenissä.

Kuvio 2: Piste-blot-määritys immobilisoiduista amplikoneista, jotka on saatu sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212, hybridoituina koettimeen Z303, joka on spesifinen Ml intracellularelle.

20 Luettelo taulukoista:

Taulukko 1a: Mykobakteerilajit, niiden alkuperä, vahvistaminen yleisalukkeilla Z205 ja Z212, vahvistaminen sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212 ja hybridisaatio sukuspesifiseen, koettimien Z310 - Z317 muodostamaan pooliin.

25 Taulukko 1b: Mykobakteerilajit, niiden alkuperä ja hybridisaatio lajis pesifisiin koettimiin Z301 (Ml avium/M. brunense); Z337, Z336 ja Z302 (Ml tu^ berculpsjs); Z303 (ML. intracellulare^: Z304 (Ml sirnjae); Z340 (Mi kansasji); Z306 (Ml scrofulaceum): Z366 (M. ggrdgnae); Z369 (Ml fortuitum): ja Z309 (Ml xen-SB!)· 30 Taulukko 2a: Ei-mykobakteerilajit, niiden alkuperä, vahvistaminen yleisalukkeilla Z205 ja Z212, vahvistaminen sukuspesifisillä alukkeilla Z261 ja Z212 ja hybridisaatio sukuspesifiseen koetinpooliin (Z310 - Z317).

Taulukko 2b: Ei-mykobakteerilajit, niiden alkuperä ja hybridisaatio edellä taulukossa 1 b mainittuihin lajispesifisiin koettimiin.

35 Taulukko 3: Alukkeiden sekvenssit, joita käytettiin sekventoitaessa alukkeilla Z205 ja Z212 saadut amplikonit kloonauksen pUC-19:ään jälkeen.

106804 25

Taulukko 4: Alukkeilla Z205 ja 2212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa M. tuberculosisin SOD-geeniä.

Taulukko 5: Alukkeilla Z205 ja 2212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa M,, aviumin SOD-geeniä.

5 Taulukko 6: Alukkeilla Z205 ja 2212 saatujen amplikonien DNA- sekvenssi, joka on osa M. intracellularen SOD-geeniä.

Taulukko 7: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa M, scrofulaceumin SOD-geeniä.

Taulukko 8: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-1 o sekvenssi, joka on osa ML kansasiin SOD-geeniä.

Taulukko 9: Alukkeilla 2205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa ML fortuitumin SOD-geeniä.

Taulukko 10: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa M. simiaen SOD-geeniä.

15 Taulukko 11: Alukkeilla Z205 ja 2212 saatujen amplikonien DNA- sekvenssi, joka on osa M, aordonaen SOD-geeniä.

Taulukko 12: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa Ml. xenopin SOD-geeniä.

Taulukko 13: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-20 sekvenssi, joka on osa Corvnebacterium diphteriaen SOD-geeniä.

Taulukko 14: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa Corvnebacterium pseudodiphteriticumin SOD-geeniä.

Taulukko 15: Alukkeilla Z205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA-sekvenssi, joka on osa Nocardia asteroidesin SOD-geeniä.

25 Taulukko 16: Alukkeilla 2205 ja Z212 saatujen amplikonien DNA- sekvenssi, joka on osa Actinomyces viscosusin SOD-geeniä.

Taulukko 17: Konsensusalukkeen Z261 sekvenssi ja epäyhteensopi-vuudet 9 sekventoidussa mykobakteerisukuisessa lajissa, 4 sekventoidussa ei-mykobakteeriorganismissa sekä vastaava, E. colin ja ihmisen SOD-geenistä 30 saatu osasekvenssi.

·· Taulukko 18: Sukuspesifisen koettimen mykobakteereille konsensus- sekvenssi, epäyhteensopivuudet 4 sekventoidussa ei-mykobakteeriorganis-missa sekä vastaava osa E. colin ja ihmisen SOD-geenistä saadusta sekvenssistä. Yksittäisten oligonukleotidien, joista sukuspesifinen pooli koostuu, sek-35 venssit on myös mainittu.

Taulukko 1a 26 106804

Mykobakteeri_ATCC Z205/Z212» Z261/Z2122> Z310-Z3173> M. acapulcensis 14473 + + + M. africanum 25420 + + + M. avium 25291 + + + M. bovis 19210 + + + M. bovis BCG *** 1401 + + + M. brunense 23434 + + + M. chelonae 35752 + + + M. flavescens DSM43219* + + + 10 M. fortuitum 6841 + + + M. gadium 27726 + + (+) M. gastri 15754 + + + M. gordonae DSM610* + + + M. haemophilum 29548 + + (+) M. intracellulare DSM 43223* + + + M. kansasii DSM43224* + + + •J5 M. marinum 927 + + + M. nonchromogenicum 19530 + + + M. obuense 27023 + + + M. phlei DSM750* + + (+) M. rhodesiae 27024 + + M. scrofulaceum 19981 + + + M. simiae 25275 + + + M. smegmatis 14468 + + + M. szulgai 35799 + + (+) M. terrae 15755 + + + M. triviale 23292 + + + M. tuberculosis ** 1400 + + + M. tuberculosis 27294 + + + M. xenopi 19250 + + + 25 1) Vahvistaminen yleisalukeparilla Z205/Z212 2) Vahvistaminen sukuspesifisellä alukeparilla Z261/Z212 3) Hybridisaatio sukuspesifisten alukkeiden Z310 - Z317 pooliin 30 *** Serum- und Impfinstitut, Bern, Sveitsi ** Kliininen isolaatti * DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Saksa) 27

Taulukko 1b 106804

Mykobakteeri ATCC Hybridisaatio lajispesifisiin koettimiin

_ABC DE F G H I

5 M. acapulcensis 14473 - - ......

M. africanum 25420 - +.......

M. avium 25291 +.......

M. bovis 19210 - +.....- M. bovis BCG *** 1401 - +.......

M. brunense 23434 +........

M. chelonai 35752 - - 0 M. flavescens DSM43219*.........

M. fortuitum 6841 - + - M. gadium 27726 .........

M. gastri 15754 .........

M. gordonae DSM610*......+ - - M. haemophilum 29548 - - - - - - - - M. intracellulare DSM43223* - - M. kansasii DSM43224* - - - + - - 15 M. marinum 927 - - -.....

M. nonchromogenicum 19530 - - - - - M. obuense 27023 - - -.....

M. phlei DSM750* - -......- M. rhodesiae 27024 - - - - - - M. scrofulaceum 19981 - - . - - - + - - - M. simiae 25275 - - + - -- 20 M. smegmatis 14468 - - -.....

M. szulgai 35799 - - - - - - M. terrae 15755 .........

M. triviale 23292 -........

M. tuberculosis ** 1400 + -.....

M. tuberculosis 27294 + - - - - M. xenopi 19250 - - - - + 25 A: j\A avium -koetin Z301; B: MTB-koettimet Z337/Z336/Z302 C: M. intracellulare -koetin Z303; D: kl· simiae -koetin Z304; E. M,, kansasii -koetin Z340; F: M, scrofulaceum -koetin Z306; G: M aordonae -koetin Z366; H: M, 30 fortuitum -koetin Z369; I: M xenopi -koetin Z309 *** Serum- und Impfinstitut, Bern, Sveitsi ** Kliininen isolaatti * DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Saksa) 106804 5 28

Taulukko 2a

Ei-mykobakteeri- ATCC Z205/Z212 U Z26LZ212 2) Z310-Z3173> organismit

Acinetobacter calcoaceticus 17945 + A. calcoaceticus 23055 +

Acinetobacter lwoffii 15309 + - -

Actinomyces bovis DSM43014** + --

Actinomyces israelii 12102 +-.

Actinomyces meyeri 35568 +--

Actinomyces odontolyticus 17929 +

Actinomyces viscosus 15987 +--

Aeromonas hydrophila 7966 + -

Agrobact. tumefaciens 23308 +--

Alcaligenes faecalis 8750 +--

Arthrobacter globiformis DSM20124** + .-

Aspergillus flavus RKI**** +--

Aspergillus fumigatus RKI**** + -- 15 Bacillus cereus 27348 +--

Bacillus fragilis RKI**** + - -

Bacillus subtilis 6633 +--

Bacteroides hetaitaomicron RKI**** +--

Bifidobacteriiun dentium DSM20084** +--

Bordatella parapertussis DSM4922** +-.

Branhamella catarrhalis 8176 +-- 20 Brevibact. epidermidis DSM20660** +--

Campylobacter jejuni 33560 +--

Campylobacter pylori * + - -

Candida albicans 10231 +-- > Candida glabrata RKI**** +--

Citrobacter diversus DSM4570** +

Citrobacter freundii 8090 +--

Clostridium difficile RKI**** +--

Corynebact. diphteriae 11913 +

Corynebacter flavescens 10340 +

Corynebact. minutissimum 23348 +-- C. pseudodiphtheriticum RC181*** + C. pseudogenitalium 33035 +--

Corynebacter striatum 6940 +-- 1 Corynebacter variabilis 15753 + 30 Corynebacter xerosis 373 + E. coli 25922 +

Edwardsiella tarda 15947 + (+)

Enterococcus avium 14025 +

Enterococcus durans 19432 +--

Taulukko 2a (jatkuu) 29 106804

Ei-mykobakteeri- ATCC Z20&Z212 » Z261/Z2122> Z310 - Z317 3> organismit 5

Enterococcus faecalis 19433 +

Enterobacter cloacae 13047 + - -

Ewingella americana DSM4580** + (+)

Flavobacterium odoratum 4651 +

Haemophilus influenzae 9333 + --

Klebsiella pneumoniae 13883 + (+)

Lactobacillus acidophilus DSM20079** +

Leishmania mexicana RKI**** + - -

Micrococcus luteus RC9346*** + - -

Neisseria lactamica 23970 + - -

Neisseria sicca 9913 + --

Nocardia argentinensis 31306 + - -

Nocardia asteroides 43005 + - -

Nocardia brevicatena 15333 + - 15 Peptostreptococcus anaerobius RKI**** + - -

Peptostreptococcus asaccharolyticus RKI**** +

Plesiomonas shigelloides 14029 + - -

Plsasmodium falciparum 3D7 RC*** + - - 20 Prevotella livia RKI**** + - -

Prevotella intermedia RKI**** + - -

Propionbacterium acnes DSM1897** + - -

Proteus mirabilis 12453 +

Proteus vulgaris 6380 + -

Pseudomonas acidovorans RC15858*** + - -

Pseudomonas aeruginosa 10145 +-- 25 Pseudomonas alcaligenes 14909 +-- ·♦, Pseudomonas fluorescens 13525 +--

Pseudomonas putida 12633 +--

Pseudomonas putrefaciens DSM50426** +--Rhodococcus equi 6939 +--

Rhodococcus sputi 29627 +--

Saccharomyces cerevisiae RKI**** +--

Salmonella bongori RC5951*** +-- 30 Salmonella hautenea RC5507*** + (+)

Salmonella salamae RC5554*** +--

Salmonella typhimurium 13311 + - -

Serratia marcescens 8100 +--

Shigella sonnei 11060 +

• l_ C

Taulukko 2a (jatkuu) 106804

Ei-mykobakteeri- ATCC Z205/Z212« Z261/Z2122> Ζ310-Ζ3Γ7® organismit 5 -

Staphylococcus aureus 29213 +

Staphylococcus capitis 27840 + --

Staphylococcus cohnii 29974 + --

Staphylococcus epidermidis 12228 +-- S. haemolyticus 29970 +--

Staphylococcus hominis 27844 +-- 10 S. saprophyticus 15305 +--

Staphylococcus simulans 27848 +

Staphylococcus wameri 27838 +--

Staphylococcus xylosus 29971 +--

Streptococcus agalactiae 13813 +

Streptococcus constellatus 27823 +--

Streptococcus equi 33398 +--

Streptococcus group A RC17A4*** +

Streptococcus mitis 33399 +--

Streptococcus morbillorum 27824 +--

Streptococcus mutans 25175 +

Streptococcus pneumoniae 6301 +--

Streptococcus pneumoniae 6303 +--

Streptococcus pyogenes 19615 +--

Streptococcus salivarius 7073 +-- 20 Streptococcus sanguis 10556 +--

Trypanosoma cruzei RKI**** +--

Veillonella dispar DSM20735** +--

Vibrio alginolyticus DSM2171** +--

Yersinia enterocolitica 9610 +-- Y. pseudotuberculosis 907 +-- 25 1 · · 1) Vahvistaminen yleisalukeparilla Z205/Z212 2) Vahvistaminen sukuspesifisellä alukeparilla Z261/Z212 3) Hybridisaatio sukuspesifisten alukkeiden Z310 - 30 Z317 pooliin * Kliininen isolaatti ** DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Saksa) *** RC (Roche-kokoelma) 35 **** RKI (Robert Koch Institute, Berliini, Saksa) • • L I.

Taulukko 2b 31 106804

Ei-mykobakteeri- ATCC Hybridisaatio lajispesifisiin koettimiin

organismit_ABC DE FG HI

5 Acinetobact. calc. 17945 .........

A. calcoaceticus 23055 .........

Acinetobacter lwoffii 15309 .........

Actinomyces bovi DSM43014**.........

Actinomyces israelii 12102 .........

Actinomyces meyeri 35568 .........

Actinomyces odont. 17929 .........

10 Actinomyces viscosus 15987 .........

Aeromonas hydrophila 7966 ... -.....

Agrobact. tumefaciens 23308 .........

Alcaligenes faecalis 8750 .........

Arthrobact. globiformis DSM20124**.........

Aspergillus flavus RKI****.........

Aspergillus fumigatus RKI****.........

1,- Bacillus cereus 27348 .........

Bacillus fragilis RKI****.......--

Bacillus subtilis 6633 .........

Bacteroides hetaitaomicron RKI****.........

Bifidobact. dentium DSM20084**.........

Bordatella parapert. DSM4922**.........

Branhamella catarrh. 8176 .........

20 Brevibact. epidermidis DSM20660**.........

Campylobacter jejuni 33560 .........

Campylobacter pylori * .........

Candida albicans 10231 .........

Candida glabrata RKI****.........

Citrobacter diversus DSM4570**.........

Citrobacter freundii 8090 .........

25 Clostridium difficile RKI****.........

***" Corynebact. diphteriae 11913 .........

Corynebact. flavescens 10340 .........

Corynebact. minutiss. 23348 -........

C. pseudodipht. RC181***.........

C. pseudogenitalium 33035 - -.......

Corynebacter striatum 6940 .........

2Q Corynebacter variabilis 15753 .........

Corynebacter xerosis 373 .........

E. coli 25922 ........-

Edwardsiella tarda 15947 .........

Enterococcus avium 14025 .........

• .. V.

Taulukko 2b (jatkuu) 106804

Ei-mykobakteeri- ATCC Hybridisaatio lajispesifisiin koettimiin

organismit_ABC DE FG HI

5 Enterococcus durans 19432 .........

Enterococcus faecalis 19433 .........

Enterobacter cloacae 13047 .........

Ewingella americana DSM4580**.........

Flavobact. odoratum 4651 ... -.....

Haemophilus infl. 9333 ... ......

Klebsiella pneumoniae 13883 .........

Lactobacillus acidoph. DSM20079**.........

Leishmania mexicana RKI****.........

Micrococcus luteus RC9346***.........

Neisseria lactamica 23970 .........

Neisseria sicca 9913 .........

Nocardia argent. 31306 .........

Nocardia asteroides 43005 .........

Nocardia brevicatena 15333 .........

15 Peptostreptococcus anaerobius RKI****.........

Peptostreptococcus asaccharolyticus RKI****.........

Plesiomonas shigell. 14029 .........

Plasmodium falciparum 3D7 RC*** ... .. . . ..

20 Prevotella livia RKI****.........

Prevotella intermedia RKI****.........

Propionbact. acnes DSM1897**.........

Proteus mirabilis 12453 .........

Proteus vulgaris 6380 .........

Pseudom. acidovorans RC15858***.........

Pseudom. aeruginosa 10145 .........

2 g Pseudom. alcaligenes 14909 .........

Pseudom. fluorescens 13525 .........

Pseudomonas putida 12633 .........

Pseudom. putrefac. DSM50426**.........

Rhodococcus equi 6939 .........

Rhodococcus sputi 29627 .........

Saccharomyces cervisiae RKI****.........

30 Salmonella bongori RC5951*** ... .. .. ..

Salmonella hautenea RC5507***.........

Salmonella salamae RC5554***.........

Salmonella typh. 13311 .........

*

Taulukko 2b (jatkuu) 33 106804

Ei-mykobakteeri- ATCC Hybridisaatio lajispesifisiin koettimiin

organismit_ABC DE FG HI

5 Serratia marcescens 8100 .........-

Shigella sonnei 11060 ....... -

Staphylococcus aureus 29213 .........

Staphylococcus capitis 27840 .........

Staphylococcus cohnii 29974 ... .. .. ..

S. epidermidis 12228 ... .. .. ..

S. haemolyticus 29970 .........

10 S. hominis 27844 .........

S. saprophyticus 15305 .........

S. simulans 27848 .........

S. warned 27838 .........

Staph, xylosus 29971 .........

Streptococcus agalact. 13813 .........

Streptococcus constel. 27823 ......- - - . ς Streptococcus equi 33398 .........

Streptococcus group A RC17A4***.........

Streptococcus xnitis 33399 .........

Streptococcus morbil. 27824 .........

Streptococcus mutans 25175 .........

Streptococcus pneum. 6301 ......- - -

Streptococcus pneum. 6303 .........

Streptococcus pyogenes 19615 .........

20 Streptococcus saliv. 7073 ...... . - -

Streptococcus sanguis 10556 .........

Trypanosoma Cruzei RKI****...... . - -

Veillonella dispar DSM20735**.........

Vibrio alginolyticus DSM2171**.........

Yersinia enterocolitica 9610 .....- - - - Y. pseudotuberculosis 907 ..

25 A: avium -koetin Z301; B: MTB-koettimet Z337/- Z336/Z302 C: intracellulare -koetin Z303; D: It simiae -koetin Z304; E. kansasli -koetin Z340; F: scrofula- ceum -koetin Z306; G: gordonae -koetin Z366; H: for- 30 tuitum -koetin Z369; I: it xenopi -koetin Z309 * Kliininen isolaatti ** DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Saksa) *** RC (Roche-kokoelma) 35 ****.RKI (Robert Koch Institute, Berliini, Saksa) 106804

Taulukko 3

Sekventointialukkeet

Sekv.

tunnus- ° Kaikki mykobakteerit nro Asema N. asteroides Z205: 5'-AGC TTC ACC ACA GCA AGC ACC A-3' 1 188-209 Z256: 5'-CAC ATC TGG TGG AAG AAC CT-3’ 24 337-359 Z243: 5-ACG g£g G^G ACA AGC CGA CCG G-3' 25 368 - 389 P p p 10 Z244: 5’-gtc tgc tgg tcg taa acc tgg a-3’ 26 551-539 Z212: 5'-TCG ®CC CAG TTC ACG ACg TTC CA-3’ 2 678-655 C. diphteriae Z205; Ks· edellä Z257: 5-GGA TTT GGC TTT CAA CTT GGG-3' 27 306-326 15 Z245: 5’-GGC GAG CCA ACC GGC GCT TTG G-3’ 28 376 - 397 Z212: Ks. edellä C. pseudo-diphtheriticum Z258: 5-gaa gaa cct gag cct taa CGG t-3' 29 351-372 Z247: 5'-GAG. CCA ACC GGT GAG CTA Gee-3' 30 379-399 Z212- Ks. edellä 20

A. viscosuB

Z246: 5-gaa gaa cct CTC CCC CAA CGG C-3' 31 351-372 Z244: Ks. edellä Z212: Ks. edellä 35 106804

Taulukko 4

Mycobacterium tuberculosis -SOD-geeni superoksidi-dismutaasille 5 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCACCTACG TAAAGGGCGC CAATGACGCC GTCGCCAAAC 251 TCGAAGAGGC GCGCGCCAAG GAAGATCACT CAGCGATCTT GCTGAACGAA 10 301 AAGAATCTAG CTTTCAACCT CGCCGGCCAC GTCAATCACA CCATCTGGTG

351 GAAGAACCTG TCGCCTAACG GTGGTGACAA GCCCACCGGC GAACTCGCCG 401 CAGCCATCGC CGACGCGTTC GGTTCGTTCG ACAAGTTCCG TGCGCAGTTC 451 CACGCGGCCG CTACCACCGT GCAGGGGTCG GGCTGGGCGG CACTGGGCTG 501 GGACACACTC GGCAACAAGC TGCTGATATT CCAGGTTTAC GACCACCAGA 551 CGAACTTCCC GCTAGGCATT GTTCCGCTGC TGCTGCTCGA CATGTGGGAA 15 601 CACGCCTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAAGTCGACT TTGCCAAGGC

651 GTTTTGGAAC GTCGTGAACT GGGCCGAT......................

701 ..................................................

751 ........................................

Taulukko 5 20 Mycobacterium avium -SOD-geeni superoksididismu- taasille 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

__ 151 .....................................AGC TTCACCACAG

25

201 CAAGCACCAC GCCACCTACG TCAAAGGCGT GAACGACGCT CTTGCCAAGC 251 TCGAAGAGGC CCGCGCCAAC GAGGACCACG CTGCGATCTT CCTGAACGAA 301 AAGAACCTCG CCTTCCACCT GGGCGGCCAC GTCAACCACT CGATCTGGTG 351 GAAGAACCTG TCGCCGGACG GCGGTGACAA GCCCACCGGT GAGCTGGCCG 401 CCGCGATCGA CGACGCGTTC GGGTCCTTCG ACAAGTTCCG AGCGCAATTC 3Q 451 AGCGCCGCCG CCAACGGCCT GCAGGGCTCC GGCTGGGCGG TGCTGGGCTA 501 TGACACCCTG GGCAGCCGGT TGCTGACCTT CCAGCTCTAC GACCAGCGGG

551 CCAACGTCCC GCTGGGCATC ATCCCGCTTC TGCAGGTCGA CATGTGGGAG

601 CACGCGTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCGGACT ACGTCAAGGC

651 GTTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGCCGAT......................

701 ........................................ ..........

751 .......................................

35 .

«Cl

• L V

Taulukko 6 36 . 10 6 8 0 4

Mycobacterium lntracellulare -SOD-geenl superoksi-didismutaasille 1 ..................................................

5 51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCACCTACG TCAAAGGCGT GAACGACGCT CTGTCCAAGC 251 TCGAAGAGGC CCGTGCCAAC GAAGATCACG CTGCGATCTT CCTGAACGAA 301 AAGAACCTGG CCTTTCACCT GGGCGGCCAC GTCAACCACT CCATCTGGTG 10 351 GAAGAACCTG TCGCCGGACG GCGGCGACAA GCCGACCGGC GAATTGGCCG

401 CCGCGATCGA CGACGCCTTC GGATCCTTCG ACCGGTTCCG CGCGCAGTTC 451 AGCGCGGCCG CCAACGGCCT GCAGGGGTCG GGCTGGGCGG TGCTGGGCTA 501 CGACACCCTC GGCAACCGGC TGCTGACCTT CCAGCTCTAC GACCAGCAGG 551 CCAACGTGCC GCTGGGCATC ATTCCGCTGC TGCAGGTCGA CATGTGGGAG 601 CACGCTTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCGGACT ACGTCAAGGC

15 651 GTTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAT.......................

701 ...................................................

751 ........................................

Taulukko 7 20 Mycobacterium scrofulaceum -SOD-geenl superoksidi- dismutaasille 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

25 151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCACGTACG TCAAGGGCGT GAACGACGCC GTCGCCAAAC 251 TCCAAGAGGC ACGCGCCAAT GACGACCACG CCGCGATCTT CCTGAACGAA 301 AAGAACCTGG CGTTCCACCT CGGCGGCCAC GTGAACCACT CGATCTGGTG 351 GAAGAACCTC TCGCCGGACG GCGGCGACAA GCCGACCGGA GAACTGGCCG 401 CCGCGATCGA TGACGCGTTC GGATCGTTCG ACAAATTCCG CGCCCAGTTC 30 451 AGTGCGGCCG CCAACGGCCT GCAGGGTTCG GGCTGGGCGG TGCTGGGCTA

501 TGACACACTC GGCAGCAGGC TGCTCACCTT CCAGCTTTAC GACCAGCAGG 551 CCAACGTCCC GCTCGGCATC ATTCCGCTGC TGCAGGTCGA CATGTGGGAG 601 CACGCCTTTT·ACTTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCCGACT ACGTCAAGGC

651 CTTCTGGAAT GTCGTGAACT GGGCCGAG......................

701 .................... ..............................

35 751 ......:.................................

37 - 106804

Taulukko 8

Mycobacterium kansasi! -SOD-geeni superoksididis-mutaasille 1 ..................................................

5 51 ..................................................

101 .............................. ....................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCACCTACG TCAAGGGCGC CAACGATGCG GTCGCCAAAC

251 TCGAAGAGGC GCGCGCCAAG GAAGACCACT CGGCGATCTT GCTGAACGAG

301 AAGAACTTGG CCTTCAACCT CGCCGGCCAC GTCAACCACA CGATCTGGTG

10 351 GAAGAACCTT TCTCCCAACG GAGGCGACAA GCCGACCGGC GAACTCGCCG

401 CGGCCATCGA CGAGGCGTTC GGGTCCTTCG ACAAGTTTCG TGCCCAATTC

451 CACGCCGCCG CCACCACGGT GCAGGGGTCG GGCTGGGCGG CGCTGGGCTG

501 GGACACTCTC GGCAACAAGC TGCTGATATT CCAGGTCTAC GACCÄCCAGA

551 CGAACTTTCC ACTCGGAATC ATTCCGTTAC TGCTGCTCGA CATGTGGGAA

601 CACGCTTTCT ACCTCCAGTA CAAGAATGTC AAGGTCGACT TCGCCAAAGC

15 651 ATTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAT......................

701 .................................!................

751 ........................................

Taulukko 9

Mycobacterium fortuitum -SOD-geeni superoksididis-20 mutaasille 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

151 ............... . .....................AGC TTCACCACAG

25 201 CAAGCACCAC GCCGCGTACG TCAAGGGCGT CAACGACGCC GTGGCCAAGC

**· 251 TCGATGAGGC GCGGGCCAAC GGTGACCACG CGGCGATCTT CCTCAACGAG

301 AAGAACCTGG CGTTCCATCT CGGCGGCCAC GTGAACCACT CGATCTGGTG

351 GAAGAACCTG TCCCCCAACG GTGGTGACAA GCCGACGGGC GATCTGGCCG

401 CGGCGATCGA CGATCAGTTC GGCTCGTTCG ACAAGTTCCA GGCGCAGTTC

451 ACCGCCGCCG CCAACGGGCT GCAGGGCTCG GGCTGGGCCG TGCTCGGCTA

30 501 CGACAGCCTG GGCGATCGGC TGCTGACCTT CCAGCTCTAC GACCAGCAGG

551 CCAACGTGCC GCTCGGCATC ATCCCGCTGC TCCAGGTCGA CATGTGGGAG

601 CACGCCTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCCGACT ACGTCAAGGC

651 GTTCTGGAAA GTCGTGAACT GGGACGAT......................

701 ..................................................

751 ........................................

• · 35

Taulukko 10 38 106804

Mycobacterium simiae -SOD-geeni superoksididismu-taasille 1 ..................................................

5 51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAT GCGACGTACG TCAAGGGTTT GAACGACGCC ATTGCCAAGC

251 TTGAAGAGGC GCGGGCCAAC GACGACCATG CCGCGATCTT CTTGAACGAG

301 AAGAATCTGG CATTCCACCT CGGTGGCCAC GTCAACCACT CCATCTGGTG

10 351 GAAAAACCTG TCCCCGAACG GCGGAGACAA GCCGACCGGA GATCTCGCCG

401 CCGCCATCGA CGACGCCTTC GGTTCGTTCG ACAAGTTCCG CGCACAGTTC 451 AGCGCCGCCG CCAACGGCTT GCAGGGCTCG GGCTGGGCGG TACTCGGCTA 501 CGACACCCGG GGCGACCGAC TGCTGACCTT CCAGCTTTAC GACCAGCAGG 551 CCAACGTCCC GCTGGGCATC ATCCCGCTGC TGCAGGTCGA CATGTGGGAG 601 CACGCCTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCGGACT ACGTCAAGGC

15 651 GTTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAT......................

701 ..................................................

751 ........................................

Taulukko 11

Mycobacterium gordonae -SOD-geeni superoksididis-20 mutaasille 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCACCTACG TCAAAGGCGT CAACGACGCG GTCGCCAAGC

.·, 251 TGGAAGAAGC GCGCGCCAAA GGCGACCACT CGGCCATCTT TTTGAACGAG

301 AAGAACCTGG CCTTCCACCT GGGCGGTCAC GTCAACCACT CCATCTGGTG

351 GAAGAACCTG TCGCCGGACG GCGGCGACAA GCCGACCGGT GACCTGGCCG

401 CCGCGATCGA CGACCAGTTC GGCTCGTTCG ACAAGTTCCA GGCTCAGTTC

451 AGCGCCGCCG CAAACGGCCT ACAGGGCTCG GGCTGGGCGG TGCTCGGCTA

501 CGACACTCTG GGCGGCCGGT TGCTCACCTT TCAGCTCTAC GACCAGCAGG

30

551 CCAATGTCCC GCTCGGTGTC ATTCCGCTGT TGCAGGTCGA CATGTGGGAG

601 CACGCCTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGGCCGACT ACGTCAAGGC

651 CTTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAC......................

701 ..................................................

751 ........................................

» «

• « V

39 106804

Taulukko 12

Mycobacterium xenopi -SOD-geeni superoksididismu-taasille 1 ..................................................

5 51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCGACGTACG TCAAAGGCGC CAACGACGCG CTCGCCAAGC 251 TGGAGGAGGC GCGCGCCAAA GACGATCATT CCGCGATCGT CGGGCATGAG 301 AAGGCCCTCG CGTTCAACCT GGCCGGCCAT GTCAATCACT GCCTGTGGTG 10 351 GAAGAACCTG TCCCCCAACG GCGGTGACAA GCCGACCGGC GAATTGGCCG

401 CCGCCATCGA CGACGCGTTC GGCTCGTTCG ACAAGTTCCG CGCCCAGTTC 451 ACCGCGGCCG CCACGACCGT GCAGGGGTCG GGCTGGGCGG CACTCGGCTG 501 GGACAGCCTG GGTGGCAAGC TCCTGGTGTT CCAGGTCTAC GACCACCAGT 551 CCAACTTCCC GCTCGGGATC GTCCCCCTGC TGGTGCTCGA CATGTGGGAG 601 CACGCCTTCT ACCTGCAGTA CAAGAATGTC AAGGCTGACT TCGCCAAAGC

25 651 ATTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGCCGAT......................

701 ..................................................

751 ........................................

Taulukko 13

Corynebacterium dlphteriae -SOD-geeni superoksidi-20 dismutaasille 1 ..................................................

51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCTAACTACG TGAACGGTGC AAATACTGCT CTTGAGAAGC .. 25 251 TGCAAAAGGC TCGCGAGAAC GGTGAGATCG GTGCTGTTGT CACCGCTTTG

301 TCCAAGGATT TGGCTTTCAA CTTGGGTGGC CACACCAACC ACTCCATCTT 351 CTGGAAGAAC CTCTCCCCTA ACGGTGGCGG CGAGCCAACC GGCGCTTTGG 401 CTGAGGCAAT TGCCAAGGAG TTCGGTTCTT TTGAGAAGTT CAAGGATCAC 451 TTCTCTGCTG CGGCTCTTGG TCTGCAGGGT TCCGGCTGGG CTGTTCTCGG 501 CTACGATCAC ATCGGTGGCC GTCTGGTTAT CGAGCAGCTC ACTGACCAGC 30 551 AGGGCAACAT CTCCGCTAAC CTGACCCCAC TTCTTATGCT CGATATGTGG

601 GAGCACGCTT TCTACCTTCA GTACAAGAAC GTGAAGGCTG ACTACGTCAA

651 GGCTGTGTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA TG..................

701 ..................................................

751 ........................................

• _ v 40 106804

Taulukko 14 C. pseudodiphterlticum -SOD-geeni superoksididismu-taasille 1 ..................................................

5 51 ..................................................

101 ..................................................

151 .................... .................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC AACACTTACG TGCAGGGTGC TAACGCAGCT TTGGACGCTC 251 TGGAAGAAGA GCGCAACGGC GAAGCCAACC CAGACCGCAT CCGTGCGCTG 301 TCCAAGAACT TGGCTTTCCA ACCTGGCCAC ACCAACCACT CCATCTTCTG 10 351 GAAGAACCTG AGCCCTAACG GTGGCGGCGA GCCAACCGGT GAGCTAGCAG

401 AGGCTATCGA CCGCGACTTT GGTTCCTTCG AGAAGTTCAA GGCGCACTTC 451 TCCGCAGCAG CACTCGGCCT GCAGGGTTCC GGCTGGGCCG TGCTGGGTTA 501 CGACCACATT GCTGGTCGCC TGCTCGTTGA GCAGCTGACC GACCAGCAGG 551 GCAACACTTC CGTGAACTTC ACCCCACTGC TGATGCTGGA TATGTGGGAG 601 CACGCTTTCT ACCTGCAGTA CAAGAACGTC AAGCCTGATT ACGTCAAGGC

15 651 TGTCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAT......................

701 ........................................

Taulukko 15

Nocardia asteroides -SOD-geenl superoksldldismu-taasille 20 i 51 ..................................................

101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCGCCTACG TCGCCGGTGC CAACACGGCA CTGGAGAAGC 251 TGGAAGCCGC CCGTGAGGCC GGCGATCACA GCGCGATCTT CCTGCACGAG 25 301 AAGAACCTCG CGTTCCACCT CGGCGGACAC GTCAACCACT CCATCTGGTG

351 GAAGAACCTG TCCCCCAACG GTGGCGACAA GCCGGTCGGC GAGCTGGCCG 401 CGGCCATCGA CGACCAGTTC GGTTCGTTCG ACAAGTTCCG CGCGCAGTTC 451 ACCGCCGCGC CAACGGCCTG CAGGGCTCGG GCTGGGCGGT GCTCGGTTAC 501 GACACCCTCG GCCAGAAGCT GCTGACCTTC CAGCTCTACG ACCAGCAGGC 551 CAACGTGCCG CTGGGCATCA TCCCGCTGCT CCAAGTCGAC ATGTGGGAGC 30 601 ACGCCTTCTA CCTGCAGTAC AAGAACGTCA AGGCCGACTA CGTGACCGCG

651 TTGTGGAACG TCGTGCACTG GGCCGAT........................

701 .......... .........................................

751 ........................................

• 4.

41 106804

Taulukko 16

Actinomyces viscosus -SOD-geeni superoksididismu-taasille 5 si :::::::::: :::::::::: :::::::::: :::::::::: :::::::::: 101 ..................................................

151 .....................................AGC TTCACCACAG

201 CAAGCACCAC GCCGCCTACG TCGCTGGCGC CAACGCCGCC CTGGAGGCCC 251 TCGCCGCCGC CCGCGAGGAC GGCGACCTGG GTGCGATCAA CCTGTGGGAG 10 301 AAGAACCTCG CCTTCAACCT GGGCGGCCAC ACCAACCACT CCGTGTTCTG

351 GAAGAACCTC TCCCCCAACG GCGGCGGCCA GCCCGAGGGC GAGCTCGCCG

401 AGGCCATCAA GGACTCCTTC GGCTCCTTCG AGAAGTTCCA GGCGCAGTTC

451 ACCGCCACCG CCCTGGGCAT CCAGGGCTCG GGCTGGGCCG TGCTCGCCTA

501 CGACTCAATC TCCGGCAAGC TGCTGATCTT CCAGCTCTTC GACCAGCAGG

551 CCAACGTGCC CGTGGGCACG ACCCCGCTGT TCATGGTGGA CATGTGGGAG

601 CACGCATTCT ACCTCGACTA CCTCAACGTC AAGGCCGACT ACGTCAAGGC

651 CATCTGGAAC GTCGTGAACT GGGACGAT......................

701 ..................................................

751 ........................................

··< Φ '

Taulukko 17

Epäyhteensopivuusanalyysi PCR-alukkeelle Z261 (X = epäyhteensoplvuukslen lukumäärä) 42 106804

Z261 5'-CCA AqC TCG AAG AGG CGC GqG CCA A-3 * X

M. avium 5' -................C........-3 ' 1 M. fortuitum 5'-..........τ· .............-3‘ 1 M. gordonae 5'-.......G.....A...........-3' 2 M. intrac. 5’-................C. .T.....-3' 2 M. kansasii 5'-.........................”3 ' 0 10 M. scroful. 5'-........C......A.........-3' 2 M. simiae 5' -.......τ.................-3 ' 1 M. tuberculosis 5 ’ -........................."3 ' 0 M. xenopi 5'-.......G. .G..............-3' 2 A. viscosus 51-AGG CC. ... CC. CC. .C. ... AGG .-3' 13 C. diphth. 5·-AG.....GC ..A ... .T. ... AG. .-31 8 15 C. PS. dipht. 5'-A.G CT. .G.....A. A.. ..A A.G G-3 ’ 11

Nocardia 5‘-AG. ... .G. ... CC. .c. .T. agg c-3' 11

Human * 5‘-GG. ... ATT ..A G. A .TG A.T GA. G-3 ‘ 15 E. coli ** 5' -AA. GC. .GC C.. .AT TTG C.A A.C T-3 ' 17

* Otettu sekvenssistä AC M123267/** otettu sek-20 venssistä AC X03951; EMBL Data Bank, Heidelberg, Saksa, ja GenBank, Los Alamos, USA

• · · · 43 106804

Taulukko 18

Konsensussekvenssl: 5 5 1 -GAC AAG CCC ACG GGT GAG CTG GCC GCG GCC ATC GAT G-3 1

GCCTTC AG CC

AC C

A

A. V1SC0SUS 5 ’ - .G. C.....GA..........A.......A.G .-3' C. diphth. 5' -.G. GGC GA. C.A AC. .G. GCT TTG . .T .A. GCA AT. .-3' C. PS. dipht. 5'-.G. G.. ..A...........A . .A .A. . .T......C-3 ' N. asteroides 5’-...... ... gt..........................-3· E. coli 51 -AC. .CC .T. CA..........AAA.....T ... ..A C-3'

Human 5*-.tg ... gt. tg. ... ag. a.t aaa .g. ct. .ct ..a .-3·

Yksittäiset oligonukleotidit, jotka muodostavat 15 sukuspesifisten koettimien poolin: Z310 M. tuberc. 5'-gac aag ccc acc ggc gaa ctc gcc gca gcc atc gcc g-3' Z311 M. intrac. 5'-gac aag ccg acc ggc gaa ttg gcc gcc gcg atc gac g-3· M. xenopi c Z312 M. avium 51 -gac aag ccc acc ggt gag ctg gcc gcc gcg atc gac g-3 · 20 Z313 M. gord. 5 · -gac aag ccg acc ggt gac ctg gcc gcc gcg atc gac g-3 Z314 M. fort. 5’-gac aag ccg acg ggc gat ctg gcc gcg gcg atc gac g-3· Z315 M. scroful. 5·-gac aag ccg acc gga gaa ctg gcc gcc gcg atc gat g-3· Z316 M. simiae 5*-gac aag ccg acc gga gat ctc gcc gcc gcc atc gac g-3· Z317 M. kans. 5 · -gac aag ccg acc ggc gaa ctc gcc gcg gcc atc gac g-3 .»· · 44 106804 SEQUENCE LISTING RAN 4095/095 (1) GENERAL INFORMATION: 5 (i) APPLICANT:

(A) NAME: F.Hoffmann-La Roche AG

(B) STREET: Grenzacherstr. 124 (C) CITY: Basel 10 (D) STATE: Basel City (E) COUNTRY: Switzerland (F) POSTAL CODE (ZIP): 4002 (G) TELEPHONE: 061 688 27 08 (H) TELEFAX: 061 688 13 95 15 (ii) TITLE OF INVENTION: Oligonucleotides derived from the SOD Gene Family (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 44 20 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

25 (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: EP 92810780.4 (B) FILING DATE: 13-OCT-1992 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 35 (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 40 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: I AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CA 22 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 50 (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single . (D) TOPOLOGY: linear • « 55 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: TCGKCCCAGT TCACGACRTT CCA 23 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 45 (A) LENGTH: 25 base pairs 106804 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: ocher nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: 10 CCAARCTCGA AGAGGCGCG3 GCCAA 25 (2) INFORMATION TOR SEQ ID NO: 4: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: 25 GACAAGCCSA CS6GHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMYG 3« (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: SO (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 85 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: 40 GACAAGCCCA CCGGCGAACT QGCCGCAGCC ATCGCCG 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: '1 45 <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 50 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO: 6: 65 GACAAGCCGA CCGGCGAATT GGCCGCCGCS ATCGACG 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: 60 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 46 1 0 6 8 0 4 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: 5 GACAAGCCCA CCGGTGAGCT GGCCGCCGCG ATCGACG 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: 10 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 15 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: 20 GACAAGCCGA CCGGTGACCT GGCCGCCGCG ATCGACG 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: 25 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 30 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: 35 GACAAGCCGA CGGGCGATCT GGCCGCGGCG ATCGACG 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: 40 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid *·* (C) STRANDEDNESS: single 45 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10: 50 GACAAGCCGA CCGGAGAACT GGCCGCCGCG ATCGATG ' 37 ;· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: 55 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 60 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11: 47 1 ρ c ft n 4 GACAAGCCGA CCGGAGATCT CGCCGCCGCC ATCGACG 1 U U O U *t 37 S (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) type: nucleic acid 10 (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: linear (11) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 15 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: GACAAGCCGA CCGGCGAACT CGCCGCGGCC ATCGACG 37 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 25 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 30 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: CCTTCGGATC CTTCGACCGG TTCCGCGCGC AGTTCAG 37 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 40 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid a 46 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14: GTCCTTCQAC AAGTTCCGAG CGCAATTCAG CGCCGCC 37 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 25 base pairs '·: (B) TYPE: nucleic acid 55 (C) STRANDEDNESS: single (D) topology: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid SO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:

TCTGGGCGGC CGGTTGCTCA CCTTT 2S

48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16: 106804 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs 5 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16: GTCCCCGAAC GGCGGAGACA AGCCGACCGG AGATCTC 37 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 25 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17: GCTAGGCATT GTTCCGCTGC TGCTGC 26 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs 35 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 40 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18: TCCGCGATCG TCGGGCATGA GAAGGCCCTC GCGTTCA 37 • * 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs 50 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ,.· (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 55 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19: CCAGACGAAC TTTCCACTCG GA 22 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20: 1 SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs 49

(B) TYPE: nucleic acid Λ Π£Q Π A

(C) STRANDEDNESS: single IUUOU*t (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20: TGACACACTC GGCAGCAGGC TGCTCACCTT CCAGCTT 37 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 15 (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21: ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT 22 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 30 (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 35 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22: ACGAACTTCC CGCTAGGCAT TGTTCCGCTG CTGCTGC 37 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23: ··' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *45 (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 50 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23: ;·· AGTCGACTTT GCCAAGGCGT TT 22 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 60 (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ·" (D) TOPOLOGY: linear 50 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid 106804 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24: 5 CACWCSATCT GGTGGAAGAA CCT 23 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25: 10 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25: 20 ACGGYGGYGA CAAGCCGACC GG 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26: 25 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 30 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26: 35 GTCTGSTGGT CGTARASCTG GA 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27: 40 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 45 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27: 50 GGATTTGGCT TTCAACTTGG G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28: • · • 55 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 60 (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28: 51 ·\06804 GGCGAGCCAA CCGGCGCTTT GG 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 10 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29: 15 GAAGAACCTG AGCCTTAACG GT 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30: 20 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 25 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30: 30 GAGCCAACCG GTGAGCTAGC C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 31: 35 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 40 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31: 45 GAAGAACCTC TCCCCCAACG GC 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 32: 50 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ... CC) STRANDEDNESS: single 55 (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: 60 (A) ORGANISM: Mycobacterium tuberculosis/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32: ---L AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTAAAGGG CGCCAATGAC GCCGTCGCCA 60 52 106804 AACTCGAAGA GGCGCGCGCC AAGGAAGATC ACTCAGCGAT CTTGCTGAAC GAAAAGAATC 120 TAGCTTTCAA CCTCGCCGGC CACGTCAATC ACACCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCTA 180 5 ACGGTGGTGA CAAGCCCACC GGCGAACTCG CCGCAGCCAT CGCCGACGCG TTCGGTTCGT 240 TCGACAAGTT CCGTGCGCAG TTCCACGCGG CCGCTACCAC CGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 10 CGGCACTGGG CTGGGACACA CTCGGCAACA AGCTGCTGAT ATTCCAGGTT TACGACCACC 360 AGACGAACTT CCCGCTAGGC ATTGTTCCGC TGCTGCTGCT CGACATGTGG GAACACGCCT 420 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAAGTCG ACTTTGCCAA GGCGTTTTGG AACGTCGTGA 480 15 ACTGGGCCGA T 491 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 33: 20 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 25 (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: 30 (A) ORGANISM: Mycobacterium avium/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 33: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTGAACGAC GCTCTTGCCA 60 35 AGCTCGAAGA GGCCCGCGCC AACGAGGACC ACGCTGCGAT CTTCCTGAAC GAAAAGAACC 120 TCGCCTTCCA CCTGGGCGGC CACGTCAACC ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG 180 40 ACGGCGGTGA CAAGCCCACC GGTGAGCTGG CCGCCGCGAT CGACGACGCG TTCGGGTCCT 240 TCGACAAGTT CCGAGCGCAA TTCAGCGCCG CCGCCAACGG CCTGCAGGGC TCCGGCTGGG 300 ·* CGGTGCTGGG CTATGACACC CTGGGCAGCC GGTTGCTGAC CTTCCAGCTC TACGACCAGC 360 45 GGGCCAACGT CCCGCTGGGC ATCATCCCGC TTCTGCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCGT 420 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA 480 50 ACTGGGCCGA T 491 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 34: • · > 55 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 60 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium intracellulare/SOD gene 53 106804 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTGAACGAC GCTCTGTCCA 60 5 AGCTCGAAGA GGCCCGTGCC AACGAAGATC ACGCTGCGAT CTTCCTGAAC GAAAAGAACC 120 TGGCCTTTCA CCTGGGCGGC CACGTCAACC ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG 180 10 ACGGCGGCGA CAAGCCGACC GGCGAATTGG CCGCCGCGAT CGACGACGCC TTCGGATCCT 240 TCGACCGGTT CCGCGCGCAG TTCAGCGCGG CCGCCAACGG CCTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGTGCTGGG CTACGACACC CTCGGCAACC GGCTGCTGAC CTTCCAGCTC TACGACCAGC 360 15 AGGCCAACGT GCCGCTGGGC ATCATTCCGC TGCTGCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCTT 420 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA 480 20 ACTGGGACGA T 491 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 35: 25 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 30 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (vi) ORIGINAL SOURCE: (B) STRAIN: Mycobacterium scrofulaceum/SOD gene 35 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACGT ACGTCAAGGG CGTGAACGAC GCCGTCGCCA 60 40 AACTCCAAGA GGCACGCGCC AATGACGACC ACGCCGCGAT CTTCCTGAAC GAAAAGAACC 120 TGGCGTTCCA CCTCGGCGGC CACGTGAACC ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTCTCGCCGG 180 ·* ACGGCGGCGA CAAGCCGACC GGAGAACTGG CCGCCGCGAT CGATGACGCG TTCGGATCGT 240 45 TCGACAAATT CCGCGCCCAG TTCAGTGCGG CCGCCAACGG CCTGCAGGGT TCGGGCTGGG 300 CGGTGCTGGG CTATGACACA CTCGGCAGCA GGCTGCTCAC CTTCCAGCTT TACGACCAGC 360 50 AGGCCAACGT CCCGCTCGGC ATCATTCCGC TGCTGCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCCT 420 TTTACTTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG ACTACGTCAA GGCCTTCTGG AATGTCGTGA 480 ]·· ACTGGGCCGA G 491 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 60 (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 54 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA 106804 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium kansasii/SOD gene 5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 36: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAGGG CGCCAACGAT GCGGTCGCCA '60 10 AACTCGAAGA GGCGCGCGCC AAGGAAGACC ACTCGGCGAT CTTGCTGAAC GAGAAGAACT 120 TGGCCTTCAA CCTCGCCGGC CACGTCAACC ACACGATCTG GTGGAAGAAC CTTTCTCCCA 180 ACGGAGGCGA CAAGCCGACC GGCGAACTCG CCGCGGCCAT CGACGAGGCG TTCGGGTCCT 240 15 TCGACAAGTT TCGTGCCCAA TTCCACGCCG CCGCCACCAC GGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGCGCTGGG CTGGGACACT CTCGGCAACA AGCTGCTGAT ATTCCAGGTC TACGACCACC 360 20 AGACGAACTT TCCACTCGGA ATCATTCCGT TACTGCTGCT CGACATGTGG GAACACGCTT 420 TCTACCTCCA GTACAAGAAT GTCAAGGTCG ACTTCGCCAA AGCATTCTGG AACGTCGTGA 480 ACTGGGACGA T 491 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 30 (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

35 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium fortuitum/SOD gene 40 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 37: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCGT ACGTCAAGGG CGTCAACGAC GCCGTGGCCA 60 i AGCTCGATGA GGCGCGGGCC AACGGTGACC ACGCGGCGAT CTTCCTCAAC GAGAAGAACC 120 45 TGGCGTTCCA TCTCGGCGGC CACGTGAACC ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA 180 ACGGTGGTGA CAAGCCGACG GGCGATCTGG CCGCGGCGAT CGACGATCAG TTCGGCTCGT 240 50 TCGACAAGTT CCAGGCGCAG TTCACCGCCG CCGCCAACGG GCTGCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CCGTGCTCGG CTACGACAGC CTGGGCGATC GGCTGCTGAC CTTCCAGCTC TACGACCAGC 360 • '*· AGGCCAACGT GCCGCTCGGC ATCATCCCGC TGCTCCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCCT 420 55 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AAAGTCGTGA 480 ACTGGGACGA T 491 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs 55 (B) TYPE: nucleic acid I U 0 O U *t (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

5 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium simiae/SOD gene 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 38: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CATGCGACGT ACGTCAAGGG TTTGAACGAC GCCATTGCCA 60 AGCTTGAAGA GGCGCGGGCC AACGACGACC ATGCCGCGAT CTTCTTGAAC GAGAAGAATC 120 15 TGGCATTCCA CCTCGGTGGC CACGTCAACC ACTCCATCTG GTGGAAAAAC CTGTCCCCGA 180 ACGGCGGAGA CAAGCCGACC GGAGATCTCG CCGCCGCCAT CGACGACGCC TTCGGTTCGT 240 20 TCGACAAGTT CCGCGCACAG TTCAGCGCCG CCGCCAACGG CTTGCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CGGTACTCGG CTACGACACC CGGGGCGACC GACTGCTGAC CTTCCAGCTT TACGACCAGC 360 AGGCCAACGT CCCGCTGGGC ATCATCCCGC TGCTGCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCCT 420 25 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA 480 ACTGGGACGA T 491 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 39: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs 35 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA 40 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium gordonae/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 39: 45 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTCAACGAC GCGGTCGCCA 60 AGCTGGAAGA AGCGCGCGCC AAAGGCGACC ACTCGGCCAT CTTTTTGAAC GAGAAGAACC 120 50 TGGCCTTCCA CCTGGGCGGT CACGTCAACC ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG 180 ACGGCGGCGA CAAGCCGACC GGTGACCTGG CCGCCGCGAT CGACGACCAG TTCGGCTCGT 240 • · TCGACAAGTT CCAGGCTCAG TTCAGCGCCG CCGCAAACGG CCTACAGGGC TCGGGCTGGG 300 55 CGGTGCTCGG CTACGACACT CTGGGCGGCC GGTTGCTCAC CTTTCAGCTC TACGACCAGC 360 AGGCCAATGT CCCGCTCGGT GTCATTCCGC TGTTGCAGGT CGACATGTGG GAGCACGCCT 420 60 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG ACTACGTCAA GGCCTTCTGG AACGTCGTGA 480 ACTGGGACGA C 491 • · · 56 1 0 6 8 0 4 .

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs 5 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

10 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Mycobacterium xenopi/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 40: 15 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCGACGT ACGTCAAAGG CGCCAACGAC GCGCTCGCCA 60 AGCTGGAGGA GGCGCGCGCC AAAGACGATC ATTCCGCGAT CGTCGGGCAT GAGAAGGCCC 120 20 TCGCGTTCAA CCTGGCCGGC CATGTCAATC ACTGCCTGTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA 180 ACGGCGGTGA CAAGCCGACC GGCGAATTGG CCGCCGCCAT CGACGACGCG TTCGGCTCGT 240 TCGACAAGTT CCGCGCCCAG TTCACCGCGG CCGCCACGAC CGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 25 CGGCACTCGG CTGGGACAGC CTGGGTGGCA AGCTCCTGGT GTTCCAGGTC TACGACCACC 360 AGTCCAACTT CCCGCTCGGG ATCGTCCCCC TGCTGGTGCT CGACATGTGG GAGCACGCCT 420 30 TCTACCTGCA GTACAAGAAT GTCAAGGCTG ACTTCGCCAA AGCATTCTGG AACGTCGTGA 480 ACTGGGCCGA T 491 1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 495 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 40 <C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

45 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Corynebacterium diphteriae/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 41: 50 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCTAACT ACGTGAACGG TGCAAATACT GCTCTTGAGA 60 AGCTGCAAAA GGCTCGCGAG AACGGTGAGA TCGGTGCTGT TGTCACCGCT TTGTCCAAGG 120 • · ATTTGGCTTT CAACTTGGGT GGCCACACCA ACCACTCCAT CTTCTGGAAG AACCTCTCCC 180 55 CTAACGGTGG CGGCGAGCCA ACCGGCGCTT TGGCTGAGGC AATTGCCAAG GAGTTCGGTT 240 CTTTTGAGAA GTTCAAGGAT CACTTCTCTG CTGCGGCTCT TGGTCTGCAG GGTTCCGGCT 300 60 GGGCTGTTCT CGGCTACGAT CACATCGGTG GCCGTCTGGT TATCGAGCAG CTCACTGACC 360 AGCAGGGCAA CATCTCCGCT AACCTGACCC CACTTCTTAT GCTCGATATG TGGGAGCACG 420 « · 1 CTTTCTACCT TCAGTACAAG AACGTGAAGG CTGACTACGT CAAGGCTGTG TGGAACGTCG 480 57 106804 TGAACTGGGA CGATG 495 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 42: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 10 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

15 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: C. pseudodiphteriticum/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 42: 20 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACAACACTT ACGTGCAGGG TGCTAACGCA GCTTTGGACG 60 CTCTGGAAGA AGAGCGCAAC GGCGAAGCCA ACCCAGACCG CATCCGTGCG CTGTCCAAGA 120 ACTTGGCTTT CCAACCTGGC CACACCAACC ACTCCATCTT CTGGAAGAAC CTGAGCCCTA 180 25 ACGGTGGCGG CGAGCCAACC GGTGAGCTAG CAGAGGCTAT CGACCGCGAC TTTGGTTCCT 240 TCGAGAAGTT CAAGGCGCAC TTCTCCGCAG CAGCACTCGG CCTGCAGGGT TCCGGCTGGG 300 30 CCGTGCTGGG TTACGACCAC ATTGCTGGTC GCCTGCTCGT TGAGCAGCTG ACCGACCAGC 360 AGGGCAACAC TTCCGTGAAC TTCACCCCAC TGCTGATGCT GGATATGTGG GAGCACGCTT 420 TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGCCTG ATTACGTCAA GGCTGTCTGG AACGTCGTGA 480 35 ACTGGGACGA T 491 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 43: 40 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 490 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 45 (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: 50 (A) ORGANISM: Nocardia asteroides/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 43: • · AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCCT ACGTCGCCGG TGCCAACACG GCACTGGAGA 50 55 AGCTGGAAGC CGCCCGTGAG GCCGGCGATC ACAGCGCGAT CTTCCTGCAC GAGAAGAACC 120 TCGCGTTCCA CCTCGGCGGA CACGTCAACC ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA 180 60 ACGGTGGCGA CAAGCCGGTC GGCGAGCTGG CCGCGGCCAT CGACGACCAG TTCGGTTCGT 240 TCGACAAGTT CCGCGCGCAG TTCACCGCCG CGCCAACGGC CTGCAGGGCT CGGGCTGGGC 300 • ♦ t.

GGTGCTCGGT TACGACACCC TCGGCCAGAA GCTGCTGACC TTCCAGCTCT ACGACCAGCA 360 58 1 0 6 8 0 4 GGCCAACGTG CCGCTGGGCA TCATCCCGCT GCTCCAAGTC GACATGTGGG AGCACGCCTT 420 CTACCTGCAG TACAAGAACG TCAAGGCCGA CTACGTGACC GCGTTGTGGA ACGTCGTGCA 480 5 CTGGGCCGAT 490 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 44: 10 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 491 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 15 (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE: 20 (A) ORGANISM: Actinomyces viscosus/SOD gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 44: AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCCT ACGTCGCTGG CGCCAACGCC GCCCTGGAGG 60 25 CCCTCGCCGC CGCCCGCGAG GACGGCGACC TGGGTGCGAT CAACCTGTGG GAGAAGAACC 120 TCGCCTTCAA CCTGGGCGGC CACACCAACC ACTCCGTGTT CTGGAAGAAC CTCTCCCCCA 180 30 ACGGCGGCGG CCAGCCCGAG GGCGAGCTCG CCGAGGCCAT CAAGGACTCC TTCGGCTCCT 240 TCGAGAAGTT CCAGGCGCAG TTCACCGCCA CCGCCCTGGG CATCCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CCGTGCTCGC CTACGACTCA ATCTCCGGCA AGCTGCTGAT CTTCCAGCTC TTCGACCAGC 360 35 AGGCCAACGT GCCCGTGGGC ACGACCCCGC TGTTCATGGT GGACATGTGG GAGCACGCAT 420 TCTACCTCGA CTACCTCAAC GTCAAGGCCG ACTACGTCAA GGCCATCTGG AACGTCGTGA 480 40 ACTGGGACGA T 491 • 1 • · t ·

Claims (57)

59 106804

1. Menetelmä mykobakteerien sukuun kuuluvien patogeenisten ja ei-patogeenisten organismien toteamiseksi, tunnettu siitä, että 5 (a) vahvistetaan organismin superoksididismutaasi- (SOD-) geenin kohdealue käyttäen alukeparia, joka on spesifinen mykobakteerien suvulle, ja käsittää ensimmäisen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, jonka tunnusnro on 3 (Z261) pohjustavana sekvenssinä ja toisen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, jonka tunnusnro on 2 (Z212) pohjustavana sekvenssinä, 10 (b) saatetaan vahvistettu kohdesekvenssi kosketukseen vähintään yhden oligonukleotidikoettimen kanssa, joka kykenee hybridisoitumaan SOD-geenin kohdealueeseen, ja (c) havaitaan vahvistetun kohdealueen, jos sitä on, ja oligonukleotidikoettimen hybridit.

2. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdealue vahvistetaan polymeraasiketjureaktiolla (PCR).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidikoetin kykenee hybridisoitumaan kohdesekvenssin alueeseen, joka on oleellisen säilyvä mykobakteerien sukuun kuuluvien eri la- 20 jien SOD-geeneissä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koetin sisältää hybridisoituvana sekvenssinä sekvenssin, jonka tunnusnro on 4 tai mainittuun nähden komplementaarisen sekvenssin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, * 25 että koetin sisältää hybridisoituvana sekvenssinä sekvenssin, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat sekvenssit, joiden tunnusnrort ovat 5 (Z310); 6 (Z311); 7 (Z312); 8 (Z313); 9 (Z314); 10 (Z315); 11 (Z316); 12 (Z317), mukaan lukien johonkin mainituista nähden komplementaarinen sekvenssi.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että oligonukleotidikoetin kykenee hybridoitumaan kohdesekvenssin alu- • · eeseen, joka on vaihtuva siinä määrin, että se mahdollistaa mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien erottamisen toisistaan.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin M. intracellulare SOD-geenin lajispe- 35 sifiseen alueeseen ankarissa hybridisaatio-olosuhteissa. 1 2« 4 2 . 106804

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 13 (Z303), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että koetin kykenee hybridoitumaan lajin M. avium ja M. brunense SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen ankarissa hybridisaatio-olosuhteissa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 14 (Z301), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Mi aordonae SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 15 (Z366), tai sii- 15 hen nähden komplementaarinen sekvenssi.

13. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Mi simiae SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 16 (Z304), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Mi tuberculosis SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen. • 25

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 17 (Z336), 23 (Z337) tai 22 (Z302), tai näihin nähden komplementaarinen sekvenssi.

17. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Mi xenopi SOD-geenin lajispesifi- 30 seen alueeseen. • «

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 18 (Z309), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

19. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 35 tä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Mi kansasii SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen. ·· < 61 106804

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 19 (Z340), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

21. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Ml scrofulaceum SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 20 (Z306), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

23. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että koetin kykenee hybridoitumaan lajin Ml fortuitum SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koettimeen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 21 (Z369), tai sii- 15 hen nähden komplementaarinen sekvenssi.

25. Oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan yksisäikeiseen nukleiinihapposekvenssiin (kohdesekvenssiin), joka voidaan saada vahvistamalla ja denaturoimalla osa geenistä, joka koodittaa my-kobakteerilajin superoksididismutaasia (SOD), käyttäen polymeraasiketjureak- 20 tiota (PCR) ja alukeparia, jonka ensimmäinen aluke sisältää sekvenssin, jonka tunnusnro on 3 (Z261) pohjustavana sekvenssinä ja jonka toinen aluke sisältää sekvenssin, jonka tunnusnro on 2 (Z212) pohjustavana sekvenssinä.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan kohdesekvenssin alueeseen, joka on * 25 oleellisesti säilyvä mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geeneis- sä.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että sen sekvenssi on 30 5-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3' « · (sekv. tunnusnro 4) jossa merkki H on T, C tai A, merkki M on A tai C, merkki N on A, C, G tai T, merkki S on C tai G, merkki V on A, C tai G ja merkki Y on C tai T, tai mainit- 35 tuun nähden komplementaarinen sekvenssi. • · l 62 106804

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se valitaan ryhmästä, jonka muodostavat sekvenssit, joiden tun-nusnro:t ovat 5 (Z310); 6 (Z311); 7 (Z312); 8 (Z313); 9 (Z314); 10 (Z315); 11 (Z316); ja 12 (Z317), mukaan lukien johonkin mainittuun nähden komplemen- 5 taarinen sekvenssi.

29. Patenttivaatimuksen 25 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan kohdesekvenssin alueeseen, joka on vaihtuva siinä määrin, että se mahdollistaa mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien SOD-geenien erottamisen toisistaan.

30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi intracellulare SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 13 (Z303), tai siihen 15 nähden komplementaarinen sekvenssi.

32. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi avium ja JM. brunense SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen oligonukleotidi, tunnettu 20 siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 14 (Z301), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

34. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin ML aordonae SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen. : 25

35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 15 (Z366), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

36. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi simiae SOD-geenin lajispesifi- 30 seen alueeseen.

37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 16 (Z304), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

38. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu 35 siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi tuberculosis SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen. • · 63 106804

39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 17 (Z336), 23 (Z337) tai 22 (Z302), tai näihin nähden komplementaarinen sekvenssi.

40. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu 5 siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi xenooi SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 18 (Z309), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

42. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi kansasii SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

43. Patenttivaatimuksen 42 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 19 (Z340), tai siihen 15 nähden komplementaarinen sekvenssi.

44. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin Mi scrofulaceum SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen.

45. Patenttivaatimuksen 44 mukainen oligonukleotidi, tunnettu 20 siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 20 (Z306), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

46. Patenttivaatimuksen 29 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se kykenee hybridoitumaan lajin M, fortuitum SOD-geenin lajispesifiseen alueeseen. - 25

47. Patenttivaatimuksen 46 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy sekvenssi, jonka tunnusnro on 21 (Z369), tai siihen nähden komplementaarinen sekvenssi.

48. Koetin, tunnettu siitä, että se käsittää hybridoituvana sekvenssinä jonkin patenttivaatimuksen 25 - 28 mukaisen oligonukleotidin.

49. Koetinpooli, tunnettu siitä, että se käsittää hybridoituvina sekvensseinä patenttivaatimuksen 28 mukaisia oligonukleotidejä.

50. Koetin, tunnettu siitä, että se käsittää hybridoituvana sekvenssinä jonkin patenttivaatimuksen 29 - 47 mukaisen oligonukleotidin.

51. Aluke, tunnettu siitä, että se käsittää pohjustavana sek- 35 venssinä sekvenssin, joka on oleellisesti homologinen sekvenssiin Z212 nähden. j ♦# 64 106804

52. Aluke, tunnettu siitä, että se käsittää pohjustavana sekvenssinä sekvenssin, joka on oleellisesti homologinen sekvenssiin Z261 nähden.

53. Alukepari, tunnettu siitä, että sen ensimmäinen aluke kä-5 sittää sekvenssin Z261 pohjustavana sekvenssinä ja sen toinen aluke sisältää sekvenssin Z212 pohjustavana sekvenssinä.

54. Reagenssisarja osan superoksididismutaasia (SOD) koodatavasta geenistä vahvistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 51 ja 52 mukaisen alukkeen.

55. Reagenssisarja mykobakteerilajien toteamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 48 tai 49 mukaisen koettimen.

56. Reagenssisarja mykobakteerien sukuun kuuluvien eri lajien erottamiseksi toisistaan, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 50 mukaisen koettimen.

57. Patenttivaatimuksen 55 tai 56 mukainen reagenssisarja, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen patenttivaatimuksen 51 ja 52 mukaisen alukkeen. » ·« « 65 106804