JPH06197769A

JPH06197769A - 生物体の検出方法

Info

Publication number: JPH06197769A
Application number: JP5255754A
Authority: JP
Inventors: Werner Zolg; ツォルクベルナー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-10-13
Publication date: 1994-07-19
Anticipated expiration: 2011-05-29
Also published as: NZ248896A; KR970005053B1; ZA937420B; CN1085957A; FI934500A; CA2108247A1; NO933678D0; BR9304214A; CA2108247C; NO315664B1; CN1053472C; KR940009336A; ATE201716T1; US5525463A; EP0592894B1; DK0592894T3; JP2502035B2; EP0592894A1; NO933678L; AU4891993A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、細菌、真菌及び原生動物を含む病
原性生物と非病原性生物の検出及び識別のための標的と
してのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；EC 1.1
5.1.1 ）遺伝子系の利用に関する。【構成】特に、配列番号１の配列（Z205）を含む第一
のプライマーと配列番号２の配列（Z212）を含む第二の
プライマーとから成るプライマー対とポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を使ってＳＯＤをコードする遺伝子の一
部を増幅しそして変性せしめることにより得られる、一
本鎖核酸配列（標的配列）にハイブリダイズすることが
できるオリゴヌクレオチドが記載される。【効果】該オリゴヌクレオチドは、細菌（例えばマイ
コバクテリア）、真菌及び原生動物を含む病原性生物と
非病原性生物のＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列を増幅
及び検出するためにプライマーとプローブの形で用いる
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細菌、真菌および原生動物を含
む病原性生物と非病原性生物の検出および識別のための
標的としてのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；
EC 1.15.1.1 ）遺伝子系の使用に関する。別の観点で
は、本発明はＳＯＤ遺伝子ファミリーに由来するオリゴ
ヌクレオチドに関する。

【０００２】より詳しくは、本発明は、プライマー配列
として次の配列： 5'-AGC TTC ACC ACA GCA AGC ACC A-3' （配列番号１；
Z205）を含む第一のプライマーとプライマー配列として次の配
列： 5'-TCG G/TCC CAG TTC ACG ACA/G TTC CA-3'（配列番号
２；Z212）を含む第二のプライマーとから成る一対のプライマーと
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使ってスーパーオキ
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子の一部
を増幅しそして変性させることにより得られる、一本鎖
核酸配列（標的配列）にハイブリダイズすることができ
るオリゴヌクレオチドに関する。

【０００３】それらのオリゴヌクレオチドは、ＳＯＤ遺
伝子、特に細菌、真菌および原生動物を含む病原性生物
のＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列を増幅および検出す
るためにプライマーとプローブの形で使用することがで
きる。本発明に係るプライマーとプローブは、非病原性
生物のＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列を増幅および検
出するためにも用いることができる。

【０００４】本発明の目的は、上述のオリゴヌクレオチ
ド；それらのオリゴヌクレオチドに基づいたプライマー
とプローブ；ＳＯＤ遺伝子由来の標的配列の増幅および
検出のため並びに原核生物により引き起こされる感染の
診断のための試薬とキット；並びに上述の目的のための
前記オリゴヌクレオチドの利用である。

【０００５】ＳＯＤは、次式のような分子酸素と過酸化
水素を与える遊離のスーパーオキシド（Ｏ₂ ^-）の不均
化反応を触媒する酵素である。２Ｏ₂ ^- ＋２Ｈ⁺→ Ｏ₂ ＋ H₂O₂

【０００６】生じた過酸化水素は次いでカタラーゼまた
はペルオキシダーゼによってH₂O に変換される。スーパ
ーオキシド（Ｏ₂ ^-）は好気呼吸の毒性副産物であ
り、過酸化物（Ｏ₂ ^2-）と反応するとタンパク質、脂質
および核酸に損傷を引き起こす。スーパーオキシドジス
ムターゼ（ＳＯＤ）酵素は、スーパーオキシドを分子酸
素と過酸化物へ変換することによってラジカルの毒性作
用を中和する。

【０００７】「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣ
Ｒ」なる用語は、１または複数の特定の核酸配列を増幅
させる方法を言い、この方法では(1) 増幅すべき配列の
末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマーを試験試
料中の一本鎖核酸にアニールせしめ、(2) アニールした
プライマーの３′末端を核酸ポリメラーゼによって延長
し、プライマーがアニールされた核酸に配列相補的であ
る核酸鎖を構築し、(3)生じた二本鎖核酸を変性させて
二つの一本鎖核酸にし、そして(4) プライマーによって
限定される配列を容易に同定および測定できる量を生ぜ
しめるのに十分な時間、プライマーアニーリング、プラ
イマー伸長および生成物の変性の工程を繰り返す。

【０００８】連続的なアニーリリング、伸長および変性
段階の実質的制御は、反応容器の温度を通常は反復循環
方式において変化させることにより果たされる。アニー
リングと伸長は最適には37℃〜80℃の温度範囲で起こり
（正確な値はプライマーの濃度と配列に依存する）、一
方変性は80℃〜100 ℃の範囲の温度を必要とする（正確
な値は標的配列と濃度に依存する）。

【０００９】「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２個
以上のデオキシリボヌクレオチドから成る一本鎖核酸、
例えばプライマー、プローブ、検出しようとする核酸断
片および核酸対照を指す。オリゴヌクレオチドの正確な
サイズは、多数の要因とオリゴヌクレオチドの最終的機
能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは任意の
適当な方法、例えば適切な配列のクローニングと制限、
並びにNarangら、Meth. Enzymol. 68, 90-99 (1979)の
ホスホトリエステル法；Brown ら、Meth. Enzymol. 6
8, 109-151 (1979)のホスホジエステル法；Beaucage
ら、Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)のジエチ
ルホスホルアミダイト法；および米国特許第4,458,066
号明細書に記載された固体支持体法のような方法による
直接化学合成により調製することができる。

【００１０】「プライマー」なる用語は、核酸鎖に相補
的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件
下で、即ち種々のヌクレオシド三リン酸と重合用試薬
（例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在
下で適当な緩衝液中で適当な温度において、ＤＮＡ合成
の開始点として働くことができる、天然または合成のい
ずれかのオリゴヌクレオチドを指す。

【００１１】プライマーの適切な長さはプライマーの意
図する用途に依存するが、典型的には15〜40ヌクレオチ
ドの範囲である。短いプライマー分子は、鋳型と十分に
安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低温を必
要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必
要はないが、鋳型とハイブリダイズし且つ選ばれた反応
条件下でＤＮＡ合成を開始させる働きをするのに十分な
程相補的でなければならない。

【００１２】「プライマー」なる用語は、特に増幅しよ
うとする標的領域の一端または両端に関する情報に幾ら
かの曖昧さがある場合、複数のプライマーを指すことが
ある。保存領域が集団中に有意なレベルの多形性を示す
ならば、そのような配列を増幅するであろうプライマー
の混合物を調製することができ、またはミスマッチ配列
さえも増幅するようにプライマーを設計することができ
る。

【００１３】プライマーは、所望であれば、放射分析、
分光学的、光化学的、生物学的、免疫化学的または化学
的手段により検出可能な標識を含めることにより、標識
することができる。例えば、有用な標識としては、
³²Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ELISA におい
て汎用されるような）、ビオチンまたはハプテン、およ
び、抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能である
タンパク質が挙げられる。標識は、固体支持体上へのプ
ライマーまたはプライマー伸長生成物（例えば増幅され
たＤＮＡ）の固定化を促進するようにプライマーを「捕
捉する」ためにも用いることができる。

【００１４】「プローブ」なる用語は、標的配列の一部
に相補的なハイブリダイズ配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを指し、これは標識物質で標識されてもよくまた
は固体支持体上に取り付けられてもよい。プローブと核
酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出するのに
使われる方法に依存して、プローブはハイブリダイズ領
域の他に追加の特徴を含むことができる。例えば、ドッ
トブロット方式では、プローブは典型的には標識され
る。

【００１５】後述する「逆」ドットブロット方式のよう
にプローブが最初に固定化される場合、プローブは照射
（この技術はＰＣＴ特許公報第89/11548号においてより
詳細に記載されている）によりナイロン支持体に固定さ
せることができる長鎖のポリｄＴも含むことができる。
プローブの適切な長さはプローブの意図する用途に依存
するが、典型的には15〜40ヌクレオチドの範囲である。
短いプローブ分子は一般的に、標的と十分に安定なハイ
ブリッド複合体を形成するのにより低温を必要とする。
プローブは標的の正確な配列を反映する必要はないが、
標的配列とハイブリダイズするのに十分な程相補的でな
ければならない。

【００１６】本発明のプローブは、オリゴヌクレオチド
を合成するための上述の技術を使って合成しそして標識
することができる。例えば、プローブを³²Ｐ−ＡＴＰお
よびキナーゼと共にインキュベートすることにより５′
末端で標識することができる。プローブの適当な非放射
性標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であ
る。この標識を含むプローブの調製および検出方法は米
国特許第4,914,210 号および同第4,962,02号明細書中に
記載されている。

【００１７】そのような標識プローブの使用法に関する
追加の情報については、例えば米国特許第4,789,630 号
明細書；Saiki ら、N. Eng. J. Med. 319, 537-541 (19
88)；およびBugawan ら、Bio/Technology 6, 943-947
(1988) を参照のこと。有用な色原体としては赤色ロイ
コ色素と３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）が挙げられる。Helmuth, PCR Protocols, Sa
n Diego, California,Academic Press, Inc., 1990, 11
9-128は、ＰＣＲ生成物の非同位体検出方法を記載して
いる。

【００１８】本発明に係る好ましいオリゴヌクレオチド
は、細菌、真菌および原生動物のような異なる生物のＳ
ＯＤ遺伝子間で実質的に保存されている標的配列の領域
にハイブリダイズすることができるもの（万能プライマ
ー）または特定の属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子間
で実質的に保存されている標的配列の領域にハイブリダ
イズすることができるもの（属特異的オリゴヌクレオチ
ド）、および特定の属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子
間の識別を可能にする程度に可変的である標的配列の領
域にハイブリダイズすることができるもの（種特異的オ
リゴヌクレオチド）である。

【００１９】プライマー配列として配列番号３の配列
（Z261、表１７参照）を含む第一のプライマーとプライ
マー配列として配列番号２の配列（Z212）を含む第二の
プライマーとから成る一対のプライマーとポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を使ってスーパーオキシドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子の一部を増幅しそし
て変性させることにより得られる、一本鎖核酸配列（標
的配列）にハイブリダイズすることができるオリゴヌク
レオチドが好ましい。

【００２０】それらのうち、マイコバクテリア属に属す
る異なる種のＳＯＤ遺伝子間で実質的に保存されている
標的配列の領域にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチド（属特異的オリゴヌクレオチド）、およ
びマイコバクテリア属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子
間の識別を可能にする程度に可変的である標的領域にハ
イブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（種
特異的オリゴヌクレオチド）が更に一層好ましい。

【００２１】上述したように、本発明のオリゴヌクレオ
チドは、細菌、真菌および原生動物を含む病原性生物並
びに非病原性生物のＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列を
増幅および検出するためにプライマーとプローブの形に
おいて用いることができる。好ましい観点によれば、特
定の属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子の一部の増幅を
可能にするプライマー対を使って、標的配列をＰＣＲに
より増幅せしめる。次いで増幅された核酸を属特異的プ
ローブと混合し、そしてハイブリダイゼーションが起こ
るかどうかを検出することにより属の検出を行い、一方
で増幅された核酸と種特異的プローブとのハイブリダイ
ゼーションのパターンを決定することにより種の同定を
行う。

【００２２】特に好ましい態様では、本発明は、マイコ
バクテリア種、好ましくは病原性マイコバクテリア種の
ＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列を増幅しそして検出す
るためにプライマーとプローブの形において用いること
ができるオリゴヌクレオチドに関する。標的核酸は、マ
イコバクテリア属に属する異なるマイコバクテリア種の
ＳＯＤ遺伝子の一部の増幅を可能にする一対のプライマ
ーを使って、ＰＣＲにより増幅される。

【００２３】好ましくは、このプライマー対は、プライ
マー配列として配列番号３の配列（Z261）に実質的に相
同である配列を含んで成る第一のプライマーと、プライ
マー配列として配列番号２の配列（Z212）に実質的に相
同である配列を含んで成る第二のプライマーとから成
る。より好ましくは、前記プライマー対は、プライマー
配列として配列番号３の配列（Z261）を含んで成る第一
のプライマーと、プライマー配列として配列番号２の配
列（Z212）を含んで成る第二のプライマーとから成る。

【００２４】次いで、増幅された核酸を、ハイブリダイ
ズ配列として配列番号４のオリゴヌクレオチド配列を含
んで成る属特異的プローブ、好ましくはハイブリダイズ
配列としてZ310-Z317 のオリゴヌクレオチド配列を含ん
で成るプローブのプール（表１８）と混合し、そしてハ
イブリダイゼーションが起こるかどうかを検出すること
により、属の検出を行うことができる。種の同定は、マ
イコバクテリア属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子間の
識別を可能にする程度に可変的である標的配列の領域に
ハイブリダイズすることができる種特異的プローブへの
増幅された核酸のハイブリダイゼーションパターンを決
定することにより、行うことができる。

【００２５】本発明に従って使用することができる好ま
しい種特異的プローブは、Ｍ．インラセルラーレ（M. i
ntracellulare ）については配列：5'-CCT TCG GAT CCT
TCGACC GGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3' （Z303，配列
番号13）；Ｍ．ツベルクローシスについては配列：5'-G
CT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3'（Z336，配列番
号17）および 5'-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CC
G CTG CTG CTG C-3'（Z302，配列番号22）および 5'-AG
T CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3'（Z337，配列番号2
3）；Ｍ．フォーチュイタム（M. fortuitum）について
は 5'-ACG ACA GCCTGG GCG ATC GGC T-3'（Z369，配列
番号21）；Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae ）については
5'-TCT GGG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3'（Z336，配
列番号15）；

【００２６】Ｍ．ゼノピ（M. xenopi ）については 5'-
TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAGGCC CTC GCG TTC A-
3'（Z309，配列番号18）；Ｍ．スクロフラセウム（M. s
crofulaceum ）については 5'-TGA CAC ACT CGG CAG CA
G GCT GCT CAC CTT CCA GCTT-3'（Z306，配列番号2
0）；Ｍ．シミエ（M. simiae ）については 5'-GTC CCC
GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3'（Z30
4，配列番号16）；Ｍ．カンサシイ（M. kansasii ）に
ついては 5'-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3'（Z34
0，配列番号19）；そしてＭ．アビウム（M. avium）／
Ｍ．ブルネンセ（M. brunense ）については 5'-GTC CT
T CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGCC-3'（Z30
1，配列番号14）に実質的に相補的である配列をハイブ
リダイズ配列として含有するプローブである。

【００２７】プライマーZ205とZ212を使って得られるア
ンプリコンの配列中の他の領域を使って種特異的プロー
ブを設計することもできる。本発明により提供される病
原性生物により引き起こされる感染の診断のための方法
は、存在するのであれば標的配列を増幅せしめ、もしあ
れば、プローブハイブリダイゼーションアッセイを使っ
てアンプリコンを検出しそして同定する段階を含んで成
る。

【００２８】本発明の最も重要な観点は、ＳＯＤをコー
ドする遺伝子の一部の増幅である。本発明を実施する者
は、ポリメラーゼ連鎖反応が好ましい増幅方法であるけ
れども、試料中の標的配列の増幅は任意の既知の方法、
例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅および自
己維持配列複製、並びにここに列挙されない他の方法に
より、達成することができることを認識すべきである。
前記方法の各々は、１または複数の適切なプローブへの
核酸ハイブリダイゼーションにより標的配列を検出する
ことができるように十分な増幅を提供する。

【００２９】ＰＣＲ法は当業界において公知である（米
国特許第4,683,195 号；同第4,683,202 号および同第4,
965,188 号明細書を参照のこと）けれども、ＰＣＲ法に
なじみのない者への本発明の明瞭且つ十分な理解のため
に幾つかの一般的なＰＣＲ情報を下記に提供する。

【００３０】試料中の標的核酸配列をＰＣＲにより増幅
せしめるためには、該配列が増幅系の成分に近づきやす
くなければならない。一般に、この近づきやすさは試料
から核酸を単離することによって保証される。生物学的
試料から核酸を抽出する様々な技術が当業界で公知であ
る。例えば、Higuchi ら、PCR Technology (Erlich編,
Stockton Press, New York, 1989) に記載された技術を
参照のこと。あるいは、試料がかなり容易に崩壊され得
る場合には、ＰＣＲ技法による増幅前に核酸を精製する
必要はなく、即ち、試料が細胞、特に末梢血リンパ球ま
たは羊膜細胞から成る場合は、単に高張緩衝液中に細胞
を懸濁することによって細胞内成分の溶解および分散を
達成することができる。

【００３１】ＰＣＲの各サイクルは、プライマー伸長に
より形成された核酸二本鎖の分離を含んで成る。ＰＣＲ
法の好ましい実施態様では、鎖分離は、二本鎖の変性を
引き起こすがポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさ
ないような十分に高い温度で且つ効果的な時間の間反応
液を加熱することにより達成される（米国特許第4,965,
188 号明細書を参照のこと）。

【００３２】典型的な熱変性は、数秒から数分に及ぶ時
間約80℃〜105 ℃の温度を必要とする。しかしながら、
鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む任意
の適当な変性方法により達成することができる。例え
ば、ヘリカーゼ、またはヘリカーゼ活性を示すことがで
きる酵素によって鎖分離を誘導することができる。例え
ば、酵素RecAはATP の存在下でヘリカーゼ活性を有す
る。ヘリカーゼによる鎖分離に適当な反応条件は当業界
で公知である。Kuhn Hoffman-Berling, CSH-Quantitati
ve Biology 43:63-67 (1978) 、および Radding, Ann.
Rev. Genetics 16:405-436 (1982) を参照のこと。

【００３３】たとえどんな方法で鎖分離が達成されて
も、一度鎖が分離されれば、ＰＣＲの次の段階は、分離
された鎖を標的配列に隣接するプライマーとハイブリダ
イズせしめることを含む。次いで該プライマーを伸長し
て標的鎖の相補的コピーを形成させる。好結果のＰＣＲ
増幅のために、プライマーは、各プライマーが二本鎖配
列に沿ってハイブリダイズする位置が、一方のプライマ
ーから合成される伸長生成物がその鋳型（相補鎖）から
分離された時に他方のプライマーの伸長のための鋳型と
して働くような位置であるように、設計される。次いで
変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクル
を、所望の量の増幅核酸を得るのに必要な回数だけ繰り
返す。

【００３４】ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性伸
長は、適当な塩、金属カチオンおよびpH緩衝系から成る
反応媒質中で適当量のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸（通常はdATP, dGTP, dCTPおよびdTTP；後述のＵＮＧ
断種系が組み込まれる場合にはdTTPの代わりにまたはdT
TPに加えてdUTPが使われる）の存在下で重合剤により触
媒される。適当な重合剤は、鋳型依存性ＤＮＡ合成を触
媒することが知られている酵素である。

【００３５】ＤＮＡ鋳型との使用に適当な重合剤として
は、Ｅ．コリ（E. coli ）ＤＮＡポリメラーゼＩまたは
該酵素のクレノウ断片、Ｔ₄ＤＮＡポリメラーゼ、およ
びサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）か
ら単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるTaq ＤＮ
Ａポリメラーゼが挙げられる。最後の酵素は核酸の増幅
と配列決定に広く使われている。Taq ＤＮＡポリメラー
ゼを使用する時の反応条件は当業界で既知であり、Gelf
and, PCR Technology (1989), 前掲中に記載されてい
る。他の耐熱性ポリメラーゼも適当であろう。

【００３６】ＰＣＲ法は、各段階の後で新たな試薬を添
加する段階方式において、または全試薬を同時に添加す
る方式において、または一定数の段階の後で新たなもし
くは別の試薬を添加する部分的段階方式において、実施
することができる。例えば、鎖分離が熱により誘導され
そしてポリメラーゼが感熱性であるならば、鎖分離のラ
ウンド毎の後にポリメラーゼを添加しなければならな
い。しかしながら、例えば変性にヘリカーゼを使用する
場合または伸長に耐熱性ポリメラーゼを使用する場合に
は、全試薬を最初に添加することができ、あるいはま
た、試薬のモル比が反応にとって重要である場合には、
それらの試薬が合成反応により消耗された時に定期的に
試薬を補充することができる。

【００３７】当業者は、最も普通にはＰＣＲ法が耐熱性
酵素を使った自動化法として実施されることを知ってい
るだろう。この方法では、反応混合物の温度が変性域、
プライマーアニーリング域および反応域を通して循環さ
れる。耐熱性酵素との使用に合わせて特別に改造された
機械が商業的に入手可能である。

【００３８】当業者はまた、前の反応からの増幅された
核酸によるＰＣＲの汚染の問題に気づくだろう。この問
題を削減する方法は、前の反応からくる増幅されたＤＮ
Ａの酵素的分解を許容することである。ＰＣＲ増幅をdT
TPの代わりにdUTPの存在下で実施する。生じた二本鎖ウ
ラシル含有生成物をウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮ
Ｇ）による分解にかける。通常のチミジン含有ＤＮＡは
このＵＮＧにより分解されない。

【００３９】増幅を開始する前に増幅反応混合物にＵＮ
Ｇを添加することは、標的として働くかもしれない全て
のウラシル含有ＤＮＡを分解する。ウラシル含有ＤＮＡ
の唯一の源は前の反応の増幅生成物であるため、この方
法は反応混合物を効果的に断種（増殖不能化）し、前の
反応からの汚染の問題（持ち越し）を削除する。ＵＮＧ
は熱により一時的に不活性になるので、増幅操作中の変
性段階がＵＮＧを不活性化する働きもする。従って、新
しい増幅生成物はウラシルを含んでいるけれども、ＵＮ
Ｇ不含有環境中で形成されるので分解されない。

【００４０】本発明の方法の好結果の実施における本発
明の別の重要な観点は、プローブハイブリダイゼーショ
ンである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、検
出および同定しようとする生物のＳＯＤ遺伝子の特定セ
グメントと特異的にハイブリダイズし、属特異的プロー
ブの場合には異なる生物からの配列との、そして種特異
的プローブの場合には同じ属の別の種からの配列との十
分な不安定性ミスマッチを有する。

【００４１】本発明のプローブは、該プローブが試料中
に存在する配列に結合するかどうかを決定することによ
り試料中に核酸配列が存在するかどうかを決定するため
に用いることができる。プローブと試料中の核酸配列と
の間で形成されたハイブリッドを検出する本発明の目的
に適当なアッセイ方法は当業界において既知である。例
えば、ドットブロット方式を使ったサザンブロッティン
グと液体ハイブリダイゼーションにより検出を行うこと
ができる。

【００４２】ドットブロット方式では、未標識の増幅さ
れた試料を固体支持体、例えば膜に結合せしめ、その膜
を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識プローブ
と共にインキュベートし、ハイブリダイズしなかったプ
ローブを洗浄により除去し、結合したプローブの存在に
ついてフィルターをモニタリングする。少数のプローブ
を使って多数の試料を分析する時、例えば属特異的プロ
ーブを使って特定の属の核酸の存在について試料をスク
リーニングする場合、ドットブロット方式が非常に有用
である。

【００４３】多数の異なるプローブを使用する予定の時
には別法が非常に有用である。この方法は、増幅された
配列が標識を含みプローブが固体支持体に結合される
「逆」ドットブロット方式である。この方式では、未標
識のプローブを膜に結合せしめ、そして適当なハイブリ
ダイゼーション条件下で標識された試料に暴露する。次
いで適当な条件下での洗浄によりハイブリダイズしなか
った標識試料を除去し、そして結合した配列の存在につ
いてフィルターをモニタリングする。種の決定は各増幅
試料に対して多数の種特異的プローブに使用を必要とす
るため、この段階での好ましい試験方式は逆ドットブロ
ット方式である。

【００４４】あるいは、複数のプローブハイブリダイゼ
ーション部位またはウエルを有する検出方法を使用する
ことが望ましいかもしれない。例えば、大規模の臨床応
用においてはマイクロタイタープレートのような固体支
持体が特に有用である。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡまたは
固体支持体のハイブリダイゼーション／捕捉方法は既知
である。それらの方法の一態様では、ＰＣＲ反応での増
幅の最中に増幅された標的ＤＮＡを標識する（例えばビ
オチンで）。

【００４５】マイクロタイタープレートに予め結合され
ている標的特異的オリゴヌクレオチド捕捉プローブへの
ＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーションにより、標識さ
れたＤＮＡを特異的に捕捉する。結合した生成物を、使
用した標識の型に応じて適当に検出する。例えば、標識
としてビオチンを使った場合、アビジン−ＨＲＰ複合体
を添加し、そして(a) 過酸化水素基質とＯ−フェニレン
ジアミン（ＯＰＤ）色原体または(b) 過酸化水素基質と
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）色原体と反応せしめ
る。比色測定シグナルが生成し、ＰＣＲ増幅されたＤＮ
Ａの定量的検出に備える。

【００４６】実験室で実施する時、マイクロタイタープ
レートアッセイを使った検出方法を広範な標的に対して
標準化することができる。使用するプローブの長さを考
慮に入れて最大の特異性を保証するために、適当なハイ
ブリダイゼーションおよび緊縮条件を個々に決定するこ
とが必要かもしれない。

【００４７】別の適当なアッセイ系では、ＰＣＲ増幅工
程の最中に標識プローブが添加される。各合成段階の間
に標的ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブは、プライ
マー伸長を触媒するのに使われるポリメラーゼの５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。次い
で該プローブからの分解生成物が検出される。かくして
分解生成物の存在は、プローブと標的ＤＮＡとのハイブ
リダイゼーションが起こったことを示す。

【００４８】本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）、特にマイコバクテリア種のＳＯＤをコード
する遺伝子の一部を増幅するための試薬セット、並びに
マイコバクテリア種を検出するためおよびマイコバクテ
リア属に属する異なる種間を識別するための試薬セット
に関する。

【００４９】増幅用の試薬セットは、本発明のプライマ
ー、即ち、一対の万能プライマーおよび／または特定の
属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝子の一部の増幅に適当
な一対のプライマー、特にマイコバクテリア種のＳＯＤ
遺伝子の一部の増幅に適当な一対のプライマーを含んで
成る。それらは所望により、ＤＮＡポリメラーゼ、例え
ば上述のＤＮＡポリメラーゼのうちの１つ、および／ま
たは上述のヌクレオシド三リン酸基質、および／または
適当なＰＣＲ用緩衝液も含むことができる。上記成分に
加えて、該試薬セットは本発明に従って増幅を実施する
ための取扱説明書を含んでもよい。

【００５０】マイコバクテリア種を検出するための試薬
セットは、本発明に係る１または複数の属特異的プロー
ブ、特に属特異的プローブのプールを含んで成る。或る
場合には、該プローブが適当な支持体膜に固定されてい
てもよい。このキットの他の任意成分としては、例え
ば、標識するためそして／または標識を検出するために
用いる手段（例えば標識がビオチンである場合、アビジ
ン−酵素接合体と酵素基質と色原体）、および適当なハ
イブリダイゼーション反応用緩衝液が挙げられる。上記
成分に加えて、該試薬セットは本発明に従った検出方法
を実施するための取扱説明書を含んでもよい。

【００５１】マイコバクテリア属に属する異なる種間を
識別するための試薬セットは、１または複数の本発明の
種特異的プローブを含んで成る。或る場合には、該プロ
ーブが適当な支持体膜に固定されていてもよい。このキ
ットの他の任意成分としては、例えば、標識するためそ
して／または標識を検出するために用いる手段（例えば
標識がビオチンである場合、アビジン−酵素接合体と酵
素基質と色原体）、および適当なハイブリダイゼーショ
ン反応用緩衝液が挙げられる。上記成分に加えて、該試
薬セットは本発明に従った識別方法を実施するための取
扱説明書を含んでもよい。

【００５２】マイコバクテリア種を検出するためおよび
マイコバクテリア属に属する異なる種間を識別するため
の試薬セットは、増幅用の試薬セットについて上述した
１または複数の成分を更に含んでもよい。

【００５３】本発明の他の実施態様では、増幅、検出お
よび識別用の試薬セットは、正および／または負の対照
を含むこともできる。好ましくは、正の対照は、試料中
の所望の標的核酸を増幅するのに使ったのと同じプライ
マー対を使って増幅可能である核酸配列を含む。標的
（存在することもあり存在しないこともある）と正の対
照の両方が同じプライマー対を使用する正の対照の使用
方法は当業者に知られている。好ましくは、正の対照
は、生成物ＤＮＡが標的のサイズと容易に識別可能であ
る異なるサイズのものであるようにデザインされるか、
または当業者に既知の方法（突然変異／制限部位）で変
更される。

【００５４】次の実施例は本発明をより詳細に記載する
ためのものである。それらは例示のためだけであって本
発明の範囲を何ら制限するためのものではない。

【００５５】実施例１：プライマーZ205とZ212を用いた
マイコバクテリアのＳＯＤ配列の増幅それらのプライマーは、MilliGen/Biosearch Cyclone P
lus Synthesizer 上で50ヌクレオチドまでの配列用のＤ
ＮＡ合成キット（Millipore GmbH, Eschborn FRG）を使
って合成した。25％ NH₄OHを用いてカートリッジからオ
リゴヌクレオチドを溶出させ、真空乾燥し、更に精製せ
ずに20μＭの最終濃度に溶解させた。

【００５６】第Ｉａ表に列挙したマイコバクテリア種お
よび第IIａ表に列挙した非マイコバクテリア種の予備精
製した染色体ＤＮＡ約１ngを、次の循環プロフィールを
使ったＰＣＲによりThermocycler 480 (Perkin Elmer)
中で増幅せしめた：98℃で５分間加熱し（初期変性）、
55℃に冷却した後で５ＵのTaq ポリメラーゼ（PerkinEl
mer AG, Kusnacht, Switzerland）を添加し、そして94
℃で30秒間（変性）、37〜55℃で30秒間（アニーリン
グ）、72℃で30秒間（伸長）を35回循環させ、そして72
℃で10分間維持する。

【００５７】標準的ＰＣＲ反応液は次のものから成っ
た：10μl の10×緩衝液（100mM Tris, 室温でpH 8.3 ;
500mM KCl ; 15mM MgCl₂; 0.015 ％ゼラチン）、16μ
l のデオキシリボヌクレオチド混合物（dATP, dGTP, dC
TPおよびdTTPを各1.25μモル）、５μl のプライマーZ2
05（20μＭ）、５μl のプライマーZ212（20μＭ）、10
μl の増幅すべきＤＮＡ、および53μl のH₂O 。増幅さ
れた混合物 10 μl を１％アガロースゲル上に負荷し、
そしてサイズ標準として123 bpと1 kbのリーダー（Beth
esda Research Laboratories, Gaithersburg）を使って
200 Ｖで分離した。適当な分離の後、ゲルを臭化エチジ
ウムで染色し、写真撮影した。更なる実験の詳細につい
ては、Molecular Cloning, 1989, J. Sambrook, E.F. F
ritsch, T.Maniatis 編, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press を参照のこと。

【００５８】結果を第Ｉａ表と第IIａ表にまとめた。
“＋”は目に見えるアンプリコンが得られたことを示
す。プライマー対Z205とZ212を使って37℃のアニーリン
グ温度において、試験した27の異なるマイコバクテリア
種（第Ｉａ表に記載）からの全てのＤＮＡ調製物と106
の非マイコバクテリア種（第IIａ表に記載）からの全て
のＤＮＡ調製物が染色ゲル上に目に見えるアンプリコン
を与えた。最も優勢なもの（そしてほとんどの場合唯一
目に見える断片）は、Ｍ．ツベルクローシス（M. tuber
culosis ）配列の領域 188〜678 に及ぶ489 bpのＭ．ツ
ベルクローシスからの予測アンプリコンと同時に移動す
るＤＮＡ断片であった。従って、プライマー対Z205とZ2
12を万能プライマーとみなすことができる。

【００５９】実施例２：プライマーZ205とZ212を使って
得られた選ばれた細菌からのアンプリコンのクローニン
グおよび配列決定下記に挙げる９つのマイコバクテリア種と４つの非マイ
コバクテリア種のＭ．ツベルクローシス（M. tuberculo
sis ）のＳＯＤ遺伝子中の188 〜666 位に相当する領域
を、プライマー対Z205とZ212を使って増幅せしめた。続
いて下記のようにアンプリコンをクローニングしそして
配列決定した。

【００６０】Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis
）（ATCC 1400 ）；Ｍ．アビウム（M.avium）（ATCC 2
5291）；Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare
）（ATCC 43223）；Ｍ．スクロフラセウム（M. scrofu
laceum ）（ATCC 19981）；Ｍ．カンサシイ（M. kansas
ii ）（ATCC 43224）；Ｍ．フォーチュイタム（M. fort
uitum）（ATCC 6841 ）；Ｍ．シミエ（M. simiae ）（A
TCC 25275）；

【００６１】Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae ）（DSM 610
）；Ｍ．ゼノピ（M. xenopi ）（ATCC 19250）；コリ
ネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphte
riae）（ATCC 11913）；コリネバクテリウム・シュード
ジフテリチクム（Corynebacterium pseudodiphteriticu
m ）（RC 181）；ノカルジア・アステロイデス（Nocard
ia asteroides ）（ATCC 43005）；およびアクチノマイ
セス・ビスコサス（Actinomyces viscosus）（ATCC 159
87）。

【００６２】手順の詳細は前に引用した実験マニュア
ル："Molecular Cloning" に見つけることができる。上
記に列挙した13の生物体からの約１ngの染色体ＤＮＡを
実施例１に記載の如く増幅せしめた。切れた可能性のあ
るＰＣＲアンプリコンの末端を４種のデオキシヌクレオ
チド（dNTP）とクレノウポリメラーゼを使ってフィルイ
ンした。反応液を希釈しそしてその溶液を製造業者の教
示に従ってQuiagen tip5 (Diagen, Dusseldolf, FRG)
に通すことにより、取り込まれなかったプライマーとdN
TPをアンプリコンから分離した。

【００６３】溶出させ沈澱させたＤＮＡを溶解し、５′
末端標識キット（Boehringer Mannheim GmbH, Mannhei
m, FRG ）を使ってリン酸化した。フィルインしそして
リン酸化したアンプリコンをNuSieve GTG アガロース
（FMC, BioProducts Europe, Vallensbaek Strand, Den
mark）上での電気泳動により分離し、Ｍ．ツベルクロー
シス（M. tuberculosis ）の489 bp断片と同時移動する
アンプリコンを切り出した。ゲル切片からＤＮＡを回収
し、上記と同様にQuiagen tip 5 を使って精製した。沈
澱後に得られたペレットを溶解し、定量し、そして連結
に使った。

【００６４】プラスミド pUC 19 をSmaIで完全消化し、
フェノール抽出し、沈澱させそして溶解させた後、子牛
胸腺アルカリホスファターゼを使ってリン酸化した。ベ
クターＤＮＡを再びフェノール抽出し、沈澱させ、約１
ng／μl に希釈した。ベクターＤＮＡとベクター調製に
使った全ての酵素はBoehringer Mannheim (Mannheim,FR
G) から入手した。

【００６５】消化し脱リン酸したベクターＤＮＡを、１
ＵのＴ４リガーゼを使って22℃にて18時間、精製ＳＯＤ
アンプリコンに連結せしめた。製造元の教示に従って２
〜５μl のリカーゼ混合物を用いてDH5aコンピテント細
胞（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,
USA ）を形質転換せしめ、そしてX-gal, IPTG およびア
ンピシリンを有するＬＢ寒天上に塗抹した（詳細につい
ては"Molecular Cloning" を参照のこと）。

【００６６】13のクローニングしたアンプリコンの各形
質転換から、10個の組換え体（無色）コロニーを取り、
マイクロタイタープレートのウエル中に懸濁した200 μ
l のＬＢブロス中で増殖させた。煮沸−凍結法を使って
粗ＤＮＡの調製を行い、そのＤＮＡ溶液を更に精製する
ことなく、pUC 配列決定用プライマーと逆配列決定用プ
ライマー（Boehringer Mannheim; Mannheim, FRG）を使
ったＰＣＲにより増幅せしめた。

【００６７】592 bpの期待の挿入断片サイズ（多重クロ
ーニング部位に由来する103 bpとＳＯＤアンプリコンか
らの489 bp）を有するプラスミドを含有する13の異なる
増幅物の各々からの２つのウエルを更なる配列決定に使
用した。上記に挙げた13の異なる生物体の各々からの２
つの独立クローンからの組換えプラスミドＤＮＡをQuia
gen "Plasmid" maxiキット（Diagen, Dusseldorf, FRG
）を使って精製し、そして製造元により与えられた教
示に従って³⁵ＳとpUC 配列決定キットを用いてジデオキ
シ法により配列決定した。

【００６８】配列決定に使用したプライマーの位置を図
１に示す。pUC 19の多重クローニング部位中でアニーリ
ングする２つのプライマー（pUC 正とpUC 逆）の他は、
クローニングに使ったのと同じ２つのプライマー（Z205
とZ212）を配列決定反応に使った。全てのマイクロバク
テリア種とノカルジア・アステロイデス（Nocardia ast
eroides ）には、２つの追加の正プライマー（Z256とZ2
43）と１つの逆プライマー（Z244）を使った。この方策
は、いずれか１回の反応から読み取ることができるわず
か約150 bpによる配列決定用ゲルの完全な重複読み取り
を可能にした。

【００６９】残りの共生細菌からのＳＯＤアンプリコン
の配列決定に特異的なプライマー〔Ｃ．ジフテリエ（C.
diphteriae ）用のZ257とZ245、Ｃ．シュードジフテリ
チクム（C. pseudodiphteriticum）用のZ258とZ247、そ
してＡ．ビスコサス（A. viscosus ）用のZ246〕の位置
も図１に示す。ＳＯＤ遺伝子内の全ての配列決定用プラ
イマーの配列を第III 表に与える。プライマーZ212は２
個のゆらぎ塩基を含むので、13種の各々から２つの独立
クローンを配列決定することを保証することが可能であ
った。

【００７０】９つのマイコバクテリア種と４つの非マイ
コバクテリア種から誘導した26個のクローンから合計2
9.1 kb を読んだ。共通配列を第IV表〜第XVI 表に示
す。

【００７１】実施例３：マイコバクテリア特異的ＰＣＲ
プライマーを決定するためのＳＯＤ配列の比較第IV表〜第XVI 表に示される各々のＳＯＤ配列を、マイ
コバクテリア属のメンバー内の顕著な相同性領域および
非マイコバクテリア種からの対応領域と比較した時の顕
著な異質性領域を同定するために互いに比較できるよう
に整列させた。整列にはＧＣＧプログラム〔Genetics C
omputer Group 配列分析ソフトウエア、7.1 バージョ
ン、Dervereux ら、NAR 12, 387-395 (1984) ; GAP-Ali
gnment〕を使った。

【００７２】こうして、27種のマイコバクテリア属の全
てに特異的なプライマーを誘導することができ、このプ
ライマーは保存領域にアニーリングするプライマーによ
り隣接されたそれらのＳＯＤコード配列の一部の増幅を
可能にするだろう。マイコバクテリア属内のそれらの保
存領域は、配列決定された４つの非マイコバクテリア種
の対応領域と比較すると多数のミスマッチを示す。従っ
て、それらの基準により選択されたプライマーは、おそ
らく非マイコバクテリア種の増幅を防ぐだろう。

【００７３】選択されたプライマー配列（Z261とZ212）
は、27種のマイコバクテリア（第Ｉａ表）の全てを増幅
するが93の非マイコバクテリア標的ＤＮＡ（第IIａ表）
は１つも増幅しない能力について試験した幾つかの組合
せのうちの一つであった。２つのプライマーのうちの一
方（Z212）を使ってマイコバクテリアＤＮＡと非マイコ
バクテリアＤＮＡの両方を増幅せしめた。Z212の配列
は、Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis ）のＳＯ
Ｄ遺伝子中の677 〜655 位に相当する。

【００７４】従ってマイコバクテリア種と非マイコバク
テリア種からのＤＮＡの差別的増幅は、対のプライマー
Z261（Ｍ．ツベルクローシスのＳＯＤ遺伝子中の245 〜
269位）にかかっている。Z261の配列を、配列決定され
たマイコバクテリア属の９つの種と選択された４つの非
マイコバクテリア種の中のミスマッチと一緒に第XVII表
に示す。２つのゆらぎ塩基（249 位と264 位）の導入に
よって、配列決定された９つのマイコバクテリア種との
最大２つのミスマッチが残る。該プライマーの３′末端
のところの最後の５ヌクレオチドは、配列決定された９
種のマイコバクテリアの全てに保存されている。

【００７５】実施例４：属特異的プライマーZ261とZ212
を用いた増幅Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis ）からのＤＮ
Ａを使うと、プライマー対Z261/Z212 を用いて得られた
アンプリコンは長さ434 bpである。Ｍ．ツベルクローシ
ス（M. tuberculosis ）、Ｍ．イントラセルラーレ（M.
intracellulare ）、Ｃ．ジフテリエ（C. diphteria
e）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroid
es ）からのＤＮＡおよびヒトＤＮＡをそれぞれの試験
ＤＮＡとして使って、実施例１に記載のＰＣＲ標準条件
を用いて、属特異的増幅のためのアニーリング温度を最
適化した。

【００７６】次の温度を評価した：37℃；45℃；50℃；
55℃；58℃；60℃；64℃；67℃および70℃。非マイコバ
クテリアＤＮＡでは非緊縮温度（37℃と45℃）において
認められたアンプリコンは、より高いアニーリング温度
（＞58℃）では消失しはじめる。ヒトＤＮＡでは64℃に
おいて一連の断片をまだ検出することができたが、該断
片は67℃では存在しない。プライマー対Z261とZ212を用
いる時60℃か67℃のいずれかを使った。目に見えるアン
プリコンの量は60℃の方が多かったが、67℃の方が明ら
かに一層差別的な温度であった。

【００７７】最適マグネシウム濃度は1.5 mMであること
がわかった。従って、属特異的プライマー（Z261とZ21
2）のための最終的循環プロトコールは次のようであっ
た：98℃で５分間加熱し、55℃に冷却し、１μl のTaq
(5U)を添加し、そして94℃、60℃または67℃、72℃で各
々30秒ずつ35サイクル増幅せしめ、次いで72℃で10分間
インキュベートする。

【００７８】結果を第Ｉａ表と第IIａ表に示す。“＋”
は目に見えるアンプリコンが得られたことを示し、そし
て“−”は全くまたはごくわずかしかアンプリコンが得
られなかったことを示す。67℃のアニーリング温度を使
ってゲル電気泳動により確認すると、27のマイコバクテ
リア種の全てが属特異的プライマーZ261とZ212を用いて
増幅された（第Ｉａ表）。しかしながら、Ｍ．ガジウム
（M. gadium ）、Ｍ．マリナム（M. marinum）および
Ｍ．ヘモフィルム（M. haemophilum）を使った時にゲル
上に得られたシグナルは、他の24種のシグナルと比較す
ると弱かった。サイクル時間を１分に増やした後では、
問題の上記３種についても目に見えるシグナルが得られ
た。

【００７９】アガロースゲル上の検出可能なシグナルの
不在により判断すると、プライマーZ261とZ212は 106の
非マイコバクテリア種のうちの102 を増幅しなかった
（第IIａ表）。正確な量の増幅可能材料をＰＣＲ反応に
導入したということを保証するために、平行してプライ
マー対Z205とZ212を用いて全てのＤＮＡを試験した（陽
性であることがわかった）。

【００８０】４つの細菌種、即ちエドワージエラ・タル
ダ（Edwadsiella tarda ）、エウィンゲラ・アメリカー
ナ（Ewingella americana ）、クレブシエラ・ニューモ
ニエ（Klebsiella pneumoniae ）およびサルモネラ・ホ
ウテネ（Salmonella hautena）は、使用したＰＣＲ条件
下でゲル上に弱いシグナルを与えた。しかしながら、そ
れらの４種からのアンプリコンのいずれも、マイコバク
テリアＤＮＡを使って得られたアンプリコンにサイズと
強度が正確には一致しなかった。

【００８１】実施例５：属特異的プローブの選択属特異的プローブZ261とZ212を使って９種のマイコバク
テリアＤＮＡと４種の非マイコバクテリアＤＮＡを増幅
せしめることにより得られた配列（第IV表〜第XVI 表）
を整列し、マイコバクテリア内の最大相同性領域と非マ
イコバクテリア種の中の最大異質性領域について分析し
た。最終的に選択された属特異的プローブは、Ｍ．ツベ
ルクローシス（M. tuberculosis ）配列中の382 〜421
位にわたる。配列決定された非マイコバクテリア種中に
存在するミスマッチと一緒に共通配列を第XVIII 表に示
す。

【００８２】ノカルジア・アステロイデス（Nocardia a
steroides ）中には２個だけのミスマッチが存在する
が、このＤＮＡは属特異的ＰＣＲプライマーZ261とZ212
を用いると11個のミスマッチが存在するために記載の条
件下で増幅することはできない。合計14個のゆらぎ塩基
を導入して９つの配列決定されたマイコバクテリア種
（第XVIII 表）内の全てのミスマッチをカバーする代わ
りに、本発明者らは属特異的オリゴ体の各々を別々に合
成し、個々のプローブが等モル量で存在する８つのオリ
ゴヌクレオチドのプール（Ｍ．イントラセルラーレと
Ｍ．ゼノピは一緒のグループに分類される）を得ること
に決めた。

【００８３】属特異的プローブのプールを構成するオリ
ゴ体の配列を第XVIII 表に示す。プローブZ310はＭ．ツ
ベルクローシス（M. tuberculosis ）を検出し、Z311は
Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare ）とＭ．
ゼノピ（M. xenopi ）の両方を検出し、Z312はＭ．アビ
ウム（M. avium）を、Z313はＭ．ゴルドネ（M. gordona
e ）を、Z314はＭ．フォーチュイタム（M. fortuitum）
を、Z315はＭ．スクロフラセウム（M. scrofulaceum ）
を、Z316はＭ．シミエ（M. simiae ）を、そしてZ317は
Ｍ．カンサシイ（M. kansasii ）を検出する。

【００８４】実施例９：属特異的プローブとのハイブリ
ダイゼーション属特異的プローブのプール（第XVIII 表）を次のように
して標識した：80ピコモルの８つのプローブ（Z310-Z31
7 ）の等モル混合物を、５′標識キットの供給元（Boeh
ringer Mannheim, Mannheim, FRG）により与えられた教
示に従って、100 γCiの³²Ｐ−γＡＴＰ（10 mCi/ml ;
5000 Ci/ミリモル）を使って約３×10⁷／μg の比活性
に５′末端標識した。取り込まれなかった標識をBiospi
n 6 カラム（BioRad, Richmond, USA ）を使って除去し
た。

【００８５】27のマイコバクテリア種（第Ｉａ表）と10
6 の非マイコバクテリア種（第IIａ表）から属特異的プ
ライマーZ261とZ212を用いて得られたアルカリ変性ＰＣ
Ｒ混合物 20 μl を100 μl のＴＥ緩衝液で希釈し、そ
して予め湿らせた固体支持体（"Gene Screen plus"フィ
ルター；Du Pont de NemouRs, Bad Homburg, FRG）上に
96ウエルマニホールド（Schleicher & Schuell, Dasse
l, FRG ）を使ってスポットした。

【００８６】このフィルターをStratagene UV-リンカー
（Stratagene, La Jolla, USA ）中で架橋し、５mlの予
備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，10mMリン
酸ナトリウム pH 6.8, 1mM EDTA pH 8.0, 1% SDS, 100
μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ）の入った50 ml のFalcon
試験管中で予備ハイブリダイズせしめた。予備ハイブリ
ダイゼーションは、回転式ハイブリダイゼーションオー
ブン中で60℃にて60分間実施した。

【００８７】予備ハイブリダイゼーション液を捨て、５
mlのハイブリダイゼーション溶液（３Ｍテトラメチルア
ンモニウムクロリド, 10mMリン酸ナトリウム pH 6.8, 1
mM EDTA pH 7.6, 0.5% SDS, 100 μg/mlの変性サケ精子
ＤＮＡおよび 5-8×10⁶cpmの標識された属特異的プロ
ーブ）により置き換えた。緩衝液の調製の詳細は、上記
で引用した"Molecular Cloning" 概論中に見つけること
ができる。ハイブリダイゼーションは65℃にて 3〜16時
間実施した。フィルターを予熱された（70℃）２×ＳＳ
Ｃ／0.2 ％ＳＤＳ中で70℃にて４×15分間洗浄した後、
映像強化膜を使って−70℃にて１〜２時間オートラジオ
グラフ処理した。

【００８８】その結果を第Ｉａ表と第IIａ表に示す。
“＋”はハイブリダイゼーションシグナルが得られたこ
とを示し、そして“−”は全くハイブリダイゼーション
シグナルが得られなかったことを示す。属特異的プロー
ブのプール（Z310〜Z317）を使って27種のマイコバクテ
リア（第Ｉａ表）の全てを探査した。このプールは９つ
の配列決定されたマイコバクテリア種（第IV〜XII 表）
の全て、詳しくは、Ｍ．ツベルクローシス（M. tubercu
losis ）、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセ
ルラーレ（M. intracellulare ）、Ｍ．フォーチュイタ
ム（M. fortuitum）、Ｍ．スクロフラセウム（M. scrof
ulaceum ）、

【００８９】Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae ）、Ｍ．シミ
エ（M. simiae ）、Ｍ．ゼノピ（M.xenopi ）および
Ｍ．カンサシイ（M. kansasii ）を認識した。加えて、
次の13種の配列決定されていないマイコバクテリア種も
属特異的プローブのプールにより認識される：Ｍ．アフ
リカヌム（M. africanum）、Ｍ．アカプルセンシス（M.
acapulcensis ）、Ｍ．ボビス（M. bovis）、Ｍ．ブル
ネンセ（M. brunense ）、Ｍ．ケローネ（M. chelonai
）、Ｍ．フラベッセンス（M. flavescens ）、Ｍ．マ
リナム（M. marinum）、Ｍ．ガストリ（M. gastri ）、
Ｍ．テラエ（M. terrae ）、

【００９０】Ｍ．トリビアーレ（M. triviale ）、Ｍ．
ノンクロマチカム（M. nonchromaticum ）、Ｍ．オボエ
ンセ（M. oboense）およびＭ．スメグマチス（M. smegm
atis）（第Ｉａ表中“＋”により示される）。Ｍ．ヘモ
フィルム（M. haemophilum）、Ｍ．ガジウム（M. gadiu
m ）、Ｍ．シュルガイ（M. szlugai）およびＭ．フレイ
（M. phlei）に関しては記載のハイブリダイゼーション
条件下でより弱いシグナルが得られた（第Ｉａ表中
“（＋）”により示される）。Ｍ．ロデンシエ（M.rhod
ensiae ）では全くシグナルが得られなかった（第Ｉａ
表中“（−）により示される）。

【００９１】第IIａ表に列挙した非マイコバクテリア種
（ゲル上に目に見えない）およびゲル上に目に見える弱
いシグナルを与えた４種（実施例７参照）から属特異的
プライマーZ261とZ212を使って得られたアンプリコンは
いずれも、属特異的プローブのプール（Z310〜Z317）を
使うと検出されなかった。その結果は第IIａ表に要約さ
れる。

【００９２】実施例７：種特異的プローブの同定属特異的プライマーZ261とZ212を用いて９種のマイコバ
クテリアＤＮＡを増幅せしめることにより得られたアン
プリコンの配列（第IV〜XII 表）を実施例３に記載の如
く整列し、そして残りのマイコバクテリア配列と比較し
た時の顕著な異質性領域について１つずつ分析した。こ
うして、種特異的配列を同定し実験的に分析することが
できた。

【００９３】数字的に最大数のミスマッチを示した領域
（使用した整列プログラムにおける最大の異質性）は、
結局常に最も差別的なハイブリダイゼーション結果をも
たらす領域であるわけではないとわかった。その他の配
列と比較した時の１配列のミスマッチの数が、整列に用
いる基準に依存することも注目すべきである。種特異的
プローブに与えられる位置は、それらが誘導される配列
（第IV〜XII 表）を参考にしており、異なる整列プログ
ラムにおいてそれらに帰された数ではない。

【００９４】実施例７．１：Ｍ．ツベルクローシス特異
的プローブ次の配列（第IV表）を有する３領域を選択した： Z302 : 5'-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG
CTG CTG C-3'（配列番号22；550-586 位）； Z336 : 5'-GCT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3'
（配列番号17；561-586 位）；および Z337 : 5'-AGT CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3'（配列番
号23；633-654 位）。

【００９５】実施例６に記載の如くZ302, Z336およびZ3
37を標識し、そしてZ261とZ212を使って得られた28のマ
イコバクテリアアンプリコン（26の異なる種）が固定化
されたフィルターに対してハイブリダイズせしめた。ハ
イブリダイゼーション温度はZ302については70℃であ
り、残りの２つのプローブについては60℃であった。ハ
イブリダイゼーションは 1〜16時間行い、洗浄温度はZ3
02については80℃、Z337については65℃、そしてZ336に
ついては60℃であった。フィルムを１〜３時間露光し
た。

【００９６】長さ37ヌクレオチドであるプローブZ302
は、使用した条件下で、Ｍ．ツベルクローシスと、Ｍ．
ボビス、Ｍ．ボビスＢＣＧおよびＭ．アフリカヌムを有
する「マクロクラスター」（Bergey's Manual of Deter
minative Bacteriology, 1974,第８版, Waverly Press
Inc, Baltimore, R.E. Buchanon & N.E. Gibbons編）に
併合される類縁物のみを認識した。第Ｉｂ表に列挙され
た残りの23のマイコバクテリア種も第IIｂ表に列挙され
た106 の非マイコバクテリア種も、Z302により認識され
なかった。

【００９７】プローブZ336は、元のプローブZ302の３′
末端上の最後の26ヌクレオチドを表す。端が切り取られ
たプローブZ336は、記載の変更条件下でＭ．ツベルクロ
ーシス、Ｍ．ボビス、Ｍ．ボビスＢＣＧおよびＭ．アフ
リカヌムのみにハイブリダイズした。第Ｉｂ表に列挙さ
れた残りの23のマイコバクテリア種とも、第IIｂ表に列
挙された106 の非マイコバクテリア種のいずれとも、全
く交差反応が認められない。

【００９８】ＳＯＤ遺伝子の配列決定部分の末端の方に
位置するZ337（22ヌクレオチドのプローブ）は、Ｍ．ツ
ベルクローシス−Ｍ．ボビス−Ｍ．アフリカヌム複合体
に特異的であり、第Ｉｂ表に列挙された残りの23のマイ
コバクテリア種とも、第IIｂ表に列挙された106 の非マ
イコバクテリア種のいずれとも交差反応しない。３つの
プローブZ302, Z336およびZ337の特異性は同等である
が、洗浄温度が低いためにプローブZ336とZ337が好まし
いプローブである。

【００９９】実施例７．２：Ｍ．アビウム−Ｍ．ブルネ
ンセ特異的プローブ次の配列を有する領域423-459 （第Ｖ表）を選択した： Z301： 5'-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG
CGC CGC C-3'（配列番号14；423-459 位）。

【０１００】実施例６に記載の如くZ301を標識し、そし
てZ261とZ212を使って得られたマイコバクテリアのアン
プリコンが固定化されたフィルターに対してハイブリダ
イズせしめた。ハイブリダイゼーションは70℃の温度で
1 〜16時間行い、洗浄温度は80℃であった。フィルムを
３時間露光した。Ｍ．アビウム（M. avium）−Ｍ．ブル
ネンセ（M. brunense ）特異的プローブであるZ301を使
って、Ｍ．アビウムからのアンプリコンとＭ．ブルネン
セからのアンプリコン（ｎ＝６；同じ株のＤＮＡ調製物
から誘導されたアンプリコン）が認識された。

【０１０１】Ｍ．ブルネンセについての配列データは入
手できないので、この種のための合理的なプローブ設計
はできなかった。この点で、Ｍ．ブルネンセの原株が実
際にＭ．アビウムのアンプリコンで汚染されていること
を完全に除外することはできない。Ｍ．ブルネンセの新
株が増殖され、増幅されそして配列決定されるまで、Z3
01はＭ．アビウムとＭ．ブルネンセの両方を認識するプ
ローブとして記載される。Z301は第Ｉｂ表に列挙された
他のマイコバクテリア種のいずれも認識しなかった。ま
た第IIｂ表に列挙された試験した非マイコバクテリア種
のいずれもＭ．アビウム−Ｍ．ブルネンセ特異的プロー
ブと交差反応しなかった。

【０１０２】実施例７．３：Ｍ．イントラセルラーレ特
異的プローブ次の配列を有する領域416-452 （第VI表）を選択した： Z303： 5'-CCT TCG GAT CCT TCG ACC GGT TCC GCG CGC
AGT TCA G-3'（配列番号13）。

【０１０３】実施例６に記載の如くZ303を標識し、そし
てZ261とZ212を使って得られた28種のマイコバクテリア
アンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィルタ
ーに対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼー
ションは60℃の温度で16時間行い、洗浄温度は70℃であ
った。フィルムを３時間、６時間および16時間露光し
た。Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare ）用
に選択された種特異的プローブの特異性の例は図２に示
され（16時間露光）、その結果は第Ｉｂ表に要約され
る。

【０１０４】フィルター上のＤＮＡの整列は次のようで
あった：Ａ２Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis ）（臨床分離株 1400 ）Ａ３Ｍ．ツベルクローシス 27294 Ａ４Ｍ．アビウム（M. avium） 25291 Ａ５Ｍ．フォーチュイタム（M. fortuitum） 6841 Ａ６Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae ） DSM 610 Ａ７Ｍ．カンサシイ（M. kansasii ） DSM 43224 Ａ８Ｍ．スクロフラセウム（M. scrofulaceum ） 19981 Ａ９Ｍ．シミエ（M. simiae ） 25275 Ａ10 Ｍ．ゼノピ（M. xenopi ） 19250 Ａ11 Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare ）DSM 43223

【０１０５】Ｂ２Ｍ．アカプルセンシス（M. acapulcensis ） 14473 Ｂ３Ｍ．アフリカヌム（M. africanum） 25420 Ｂ４Ｍ．ボビスＢＣＧ（M. bovis BCG） 1401 Ｂ５Ｍ．ボビス（M. bovis） 19210 Ｂ６Ｍ．ブルネンセ（M. brunense ） 23434 Ｂ７Ｍ．ケローネ（M. chelonai ） 35752 Ｂ８Ｍ．フラベッセンス（M. flavescens ） DSM 43219 Ｂ９Ｍ．ガストリ（M. gastri ） 15754 Ｂ10 Ｍ．スメグマチス（M. smegmatis） 14468 Ｂ11 Ｍ．テラエ（M. terrae ） 15755

【０１０６】Ｃ２Ｍ．トリビアーレ（M. triviale ） 23292 Ｃ３Ｍ．マリナム（M. marinum） 927 Ｃ４Ｍ．ヘモフィルム（M. haemophilum） 29548 Ｃ５Ｍ．ノンクロモジェニカム（M. nonchromaticum ） 19530 Ｃ６Ｍ．オブエンセ（M. obuense） 27023 Ｃ７Ｍ．フレイ（M. phlei） DSM 750 Ｃ８Ｍ．ロデシエ（M. rhodesiae） 27024 Ｃ９Ｍ．シュルガイ（M. szlugai） 35799 Ｃ10 Ｍ．ガジウム（M. gadium ） 27726 Ｈ₂Ｏ

【０１０７】試験した106 種の非マイコバクテリア生物
はいずれも、マイコバクテリア種について上述したのと
同じ条件下で反応しなかった。

【０１０８】実施例７．４：Ｍ．スクロフラセウム特異
的プローブ次の配列を有する領域 501-537（第VII 表）を選択し
た： Z306： 5'-TGA CAC ACT CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT
CCA GCT T-3'（配列番号20）。

【０１０９】実施例６に記載の如くZ306を標識し、そし
てZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリアア
ンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィルター
に対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーシ
ョンは70℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は80℃で
あり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光し
た。Z306はＭ．スクロフラセウム（M. scrofulaceum ）
ＤＮＡにのみハイブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された
他のマイコバクテリアのいずれにもハイブリダイズしな
かった。第IIｂ表に列挙された試験した106 の非マイコ
バクテリアＤＮＡはいずれもＭ．スクロフラセウム特異
的プローブと交差反応しなかった。

【０１１０】実施例７．５：Ｍ．カンサシイ特異的プロ
ーブ次の配列を有する領域 546-567（第VIII表）を選択し
た： Z340： 5'-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3' （配列
番号19）。

【０１１１】実施例６に記載の如くZ306を標識し、そし
てZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリアア
ンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィルター
に対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーシ
ョンは60℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は65℃で
あり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光し
た。Z340はＭ．カンサシイ（M. kansasii ）ＤＮＡにの
みハイブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された他のマイコ
バクテリアのいずれにもハイブリダイズしなかった。第
IIｂ表に列挙された試験した106 の非マイコバクテリア
ＤＮＡはいずれもＭ．カンサシイ特異的プローブと交差
反応しなかった。

【０１１２】実施例７．６：Ｍ．フォーチュイタム特異
的プローブ次の配列を有する領域 500-521（第IX表）を選択した： Z369： 5'-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3' （配列
番号21）。

【０１１３】実施例６に記載の如くZ369を末端標識し、
そしてZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリ
アアンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィル
ターに対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼ
ーションは60℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は70
℃であり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光
した。Z369はＭ．フォーチュイタム（M. fortuitum）Ｄ
ＮＡにのみハイブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された他
のマイコバクテリアのいずれにもハイブリダイズしなか
った。第IIｂ表に列挙された試験した106 の非マイコバ
クテリアＤＮＡはいずれもＭ．フォーチュイタム特異的
プローブと交差反応しなかった。

【０１１４】実施例７．７：Ｍ．シミエ特異的プローブ次の配列を有する領域 360-396（第Ｘ表）を選択した： Z304： 5'-GTC CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG
AGA TCT C-3'（配列番号16）。

【０１１５】実施例６に記載の如くZ304を末端標識し、
そしてZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリ
アアンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィル
ターに対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼ
ーションは70℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は80
℃であり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光
した。Z304はＭ．シミエ（M. simiae ）ＤＮＡにのみハ
イブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された他のマイコバク
テリアのいずれにもハイブリダイズしなかった。第IIｂ
表に列挙された試験した106 の非マイコバクテリアＤＮ
ＡはいずれもＭ．シミエ特異的プローブと交差反応しな
かった。

【０１１６】実施例７．８：Ｍ．ゴルドネ特異的プロー
ブ次の配列を有する領域 507-531（第XI表）を選択した： Z366： 5'-TCT GGG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3'
（配列番号15）。

【０１１７】実施例６に記載の如くZ366を末端標識し、
そしてZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリ
アアンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィル
ターに対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼ
ーションは60℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は70
℃であり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光
した。Z366はＭ．ゴルドネ（M. gordonae ）ＤＮＡにの
みハイブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された他のマイコ
バクテリアのいずれにもハイブリダイズしなかった。第
IIｂ表に列挙された試験した106 の非マイコバクテリア
ＤＮＡはいずれもＭ．ゴルドネ特異的プローブと交差反
応しなかった。

【０１１８】実施例７．９：Ｍ．ゼノピ特異的プローブ次の配列を有する領域 280-316（第XII 表）を選択し
た： Z309： 5'-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC
GCG TTC A-3'（配列番号18）。

【０１１９】実施例６に記載の如くZ309を末端標識し、
そしてZ261とZ212を使って得られた28のマイコバクテリ
アアンプリコン（26の異なる種）が固定化されたフィル
ターに対してハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼ
ーションは70℃の温度で1 〜16時間行い、洗浄温度は80
℃であり、フィルムを３時間、６時間および16時間露光
した。Z309はＭ．ゼノピ（M. xenopi ）ＤＮＡにのみハ
イブリダイズし、第Ｉｂ表に列挙された他のマイコバク
テリアのいずれにもハイブリダイズしなかった。第IIｂ
表に列挙された試験した106 の非マイコバクテリアＤＮ
ＡはいずれもＭ．ゼノピ特異的プローブと交差反応しな
かった。

【０１２０】表の説明：第Ｉａ表：マイコバクテリア種、それらの起源、万能プ
ライマーZ205とZ212を用いた増幅、属特異的プライマー
Z261とZ212を用いた増幅、および属特異的プローブのプ
ール（Z310〜Z317）とのハイブリダイゼーション。第Ｉｂ表：マイコバクテリア種、それらの起源、種特異
的プローブZ301（Ｍ．アビウム／Ｍ．ブルネンセ）；Z3
37, Z336およびZ302（Ｍ．ツベルクローシス）；Z303
（Ｍ．イントラセルラーレ）；Z304（Ｍ．シミエ）；Z3
40（Ｍ．カンサシイ）；Z306（Ｍ．スクロフラセウ
ム）；Z366（Ｍ．ゴルドネ）；Z369（Ｍ．フォーチュイ
タム）；並びにZ309（Ｍ．ゼノピ）とのハイブリダイゼ
ーション。

【０１２１】第IIａ表：非マイコバクテリア種、それら
の起源、万能プライマーZ205とZ212を用いた増幅、属特
異的プライマーZ261とZ212を用いた増幅、および属特異
的プローブのプール（Z310〜Z317）とのハイブリダイゼ
ーション。第IIｂ表：非マイコバクテリア種、それらの起源、およ
び第Ｉｂ表について上記に記載した種特異的プローブと
のハイブリダイゼーション。

【０１２２】第III 表：pUC 19中でのクローニングの後
にプライマーZ205とZ211を使って得られたアンプリコン
の配列決定において使用されるプライマーの配列。第IV表：Ｍ．ツベルクローシスのＳＯＤ遺伝子の一部で
あるプライマーZ205とZ212を使って得られたアンプリコ
ンのＤＮＡ配列。第Ｖ表：Ｍ．アビウムのＳＯＤ遺伝子の一部であるプラ
イマーZ205とZ212を使って得られたアンプリコンのＤＮ
Ａ配列。

【０１２３】第VI表：Ｍ．イントラセルラーレのＳＯＤ
遺伝子の一部であるプライマーZ205とZ212を使って得ら
れたアンプリコンのＤＮＡ配列。第VII 表：Ｍ．スクロフラセウムのＳＯＤ遺伝子の一部
であるプライマーZ205とZ212を使って得られたアンプリ
コンのＤＮＡ配列。第VIII表：Ｍ．カンサシイのＳＯＤ遺伝子の一部である
プライマーZ205とZ212を使って得られたアンプリコンの
ＤＮＡ配列。

【０１２４】第IX表：Ｍ．フォーチュイタムのＳＯＤ遺
伝子の一部であるプライマーZ205とZ212を使って得られ
たアンプリコンのＤＮＡ配列。第Ｘ表：Ｍ．シミエのＳＯＤ遺伝子の一部であるプライ
マーZ205とZ212を使って得られたアンプリコンのＤＮＡ
配列。第XI表：Ｍ．ゴルドネのＳＯＤ遺伝子の一部であるプラ
イマーZ205とZ212を使って得られたアンプリコンのＤＮ
Ａ配列。

【０１２５】第XII 表：Ｍ．ゼノピのＳＯＤ遺伝子の一
部であるプライマーZ205とZ212を使って得られたアンプ
リコンのＤＮＡ配列。第XIII表：コリネバクテリウム・ジフテリエのＳＯＤ遺
伝子の一部であるプライマーZ205とZ212を使って得られ
たアンプリコンのＤＮＡ配列。第XIV 表：コリネバクテリウム・シュードジフテリチク
ムのＳＯＤ遺伝子の一部であるプライマーZ205とZ212を
使って得られたアンプリコンのＤＮＡ配列。

【０１２６】第XV表：ノカルジア・アステロイデスのＳ
ＯＤ遺伝子の一部であるプライマーZ205とZ212を使って
得られたアンプリコンのＤＮＡ配列。第XVI 表：アクチノマイセス・ビスコサスのＳＯＤ遺伝
子の一部であるプライマーZ205とZ212を使って得られた
アンプリコンのＤＮＡ配列。第XVII表：共通プライマーZ261の配列、マイコバクテリ
ア属の９つの配列決定された種、４つの配列決定された
非マイコバクテリア生物並びにＥ．コリおよびヒトのＳ
ＯＤ遺伝子に由来する対応部分配列の中のミスマッチ。

【０１２７】第XVIII 表：マイコバクテリア用の属特異
的プローブの共通配列、４つの配列決定された非マイコ
バクテリア生物並びにＥ．コリおよびヒトのＳＯＤ遺伝
子に由来する対応部分配列の中のミスマッチ。属特異的
プールを構成する個々のオリゴヌクレオチドの配列も記
載される。

【０１２８】

【表１】

【０１２９】

【表２】

【０１３０】

【表３】

【０１３１】

【表４】

【０１３２】

【表５】

【０１３３】

【表６】

【０１３４】

【表７】

【０１３５】

【表８】

【０１３６】

【表９】

【０１３７】

【表１０】

【０１３８】

【表１１】

【０１３９】

【表１２】

【０１４０】

【表１３】

【０１４１】

【表１４】

【０１４２】

【表１５】

【０１４３】

【表１６】

【０１４４】

【表１７】

【０１４５】

【表１８】

【０１４６】

【表１９】

【０１４７】

【表２０】

【０１４８】

【表２１】

【０１４９】

【表２２】

【０１５０】

【表２３】

【０１５１】

【表２４】

【０１５２】

【表２５】

【０１５３】

【表２６】

【０１５４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CA 22

【０１５５】配列番号：２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 TCGKCCCAGT TCACGACRTT CCA 23

【０１５６】配列番号：３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 CCAARCTCGA AGAGGCGCGS GCCAA 25

【０１５７】配列番号：４配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMYG 37

【０１５８】配列番号：５配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCCA CCGGCGAACT CGCCGCAGCC ATCGCCG 37

【０１５９】配列番号：６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CCGGCGAATT GGCCGCCGCS ATCGACG 37

【０１６０】配列番号：７配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCCA CCGGTGAGCT GGCCGCCGCG ATCGACG 37

【０１６１】配列番号：８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CCGGTGACCT GGCCGCCGCG ATCGACG 37

【０１６２】配列番号：９配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CGGGCGATCT GGCCGCGGCG ATCGACG 37

【０１６３】配列番号：１０配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CCGGAGAACT GGCCGCCGCG ATCGATG 37

【０１６４】配列番号：１１配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CCGGAGATCT CGCCGCCGCC ATCGACG 37

【０１６５】配列番号：１２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GACAAGCCGA CCGGCGAACT CGCCGCGGCC ATCGACG 37

【０１６６】配列番号：１３配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 CCTTCGGATC CTTCGACCGG TTCCGCGCGC AGTTCAG 37

【０１６７】配列番号：１４配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GTCCTTCGAC AAGTTCCGAG CGCAATTCAG CGCCGCC 37

【０１６８】配列番号：１５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 TCTGGGCGGC CGGTTGCTCA CCTTT 25

【０１６９】配列番号：１６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GTCCCCGAAC GGCGGAGACA AGCCGACCGG AGATCTC 37

【０１７０】配列番号：１７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GCTAGGCATT GTTCCGCTGC TGCTGC 26

【０１７１】配列番号：１８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 TCCGCGATCG TCGGGCATGA GAAGGCCCTC GCGTTCA 37

【０１７２】配列番号：１９配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 CCAGACGAAC TTTCCACTCG GA 22

【０１７３】配列番号：２０配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 TGACACACTC GGCAGCAGGC TGCTCACCTT CCAGCTT 37

【０１７４】配列番号：２１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT 22

【０１７５】配列番号：２２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 ACGAACTTCC CGCTAGGCAT TGTTCCGCTG CTGCTGC 37

【０１７６】配列番号：２３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 AGTCGACTTT GCCAAGGCGT TT 22

【０１７７】配列番号：２４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 CACWCSATCT GGTGGAAGAA CCT 23

【０１７８】配列番号：２５配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 ACGGYGGYGA CAAGCCGACC GG 22

【０１７９】配列番号：２６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GTCTGSTGGT CGTARASCTG GA 22

【０１８０】配列番号：２７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GGATTTGGCT TTCAACTTGG G 21

【０１８１】配列番号：２８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GGCGAGCCAA CCGGCGCTTT GG 22

【０１８２】配列番号：２９配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GAAGAACCTG AGCCTTAACG GT 22

【０１８３】配列番号：３０配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GAGCCAACCG GTGAGCTAGC C 21

【０１８４】配列番号：３１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GAAGAACCTC TCCCCCAACG GC 22

【０１８５】配列番号：３２配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・スベルスローシ
ス／ＳＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTAAAGGG CGCCAATGAC 50 GCCGTCGCCA AACTCGAAGA GGCGCGCGCC AAGGAAGATC ACTCAGCGAT 100 CTTGCTGAAC GAAAAGAATC TAGCTTTCAA CCTCGCCGGC CACGTCAATC 150 ACACCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCTA ACGGTGGTGA CAAGCCCACC 200 GGCGAACTCG CCGCAGCCAT CGCCGACGCG TTCGGTTCGT TCGACAAGTT 250 CCGTGCGCAG TTCCACGCGG CCGCTACCAC CGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGCACTGGG CTGGGACACA CTCGGCAACA AGCTGCTGAT ATTCCAGGTT 350 TACGACCACC AGACGAACTT CCCGCTAGGC ATTGTTCCGC TGCTGCTGCT 400 CGACATGTGG GAACACGCCT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAAGTCG 450 ACTTTGCCAA GGCGTTTTGG AACGTCGTGA ACTGGGCCGA T 491

【０１８６】配列番号：３３配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・アビウム／ＳＯ
Ｄ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTGAACGAC 50 GCTCTTGCCA AGCTCGAAGA GGCCCGCGCC AACGAGGACC ACGCTGCGAT 100 CTTCCTGAAC GAAAAGAACC TCGCCTTCCA CCTGGGCGGC CACGTCAACC 150 ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG ACGGCGGTGA CAAGCCCACC 200 GGTGAGCTGG CCGCCGCGAT CGACGACGCG TTCGGGTCCT TCGACAAGTT 250 CCGAGCGCAA TTCAGCGCCG CCGCCAACGG CCTGCAGGGC TCCGGCTGGG 300 CGGTGCTGGG CTATGACACC CTGGGCAGCC GGTTGCTGAC CTTCCAGCTC 350 TACGACCAGC GGGCCAACGT CCCGCTGGGC ATCATCCCGC TTCTGCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCGT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG 450 ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGCCGA T 491

【０１８７】配列番号：３４配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・イントラセルニ
ーレ／ＳＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTGAACGAC 50 GCTCTGTCCA AGCTCGAAGA GGCCCGTGCC AACGAAGATC ACGCTGCGAT 100 CTTCCTGAAC GAAAAGAACC TGGCCTTTCA CCTGGGCGGC CACGTCAACC 150 ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG ACGGCGGCGA CAAGCCGACC 200 GGCGAATTGG CCGCCGCGAT CGACGACGCC TTCGGATCCT TCGACCGGTT 250 CCGCGCGCAG TTCAGCGCGG CCGCCAACGG CCTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGTGCTGGG CTACGACACC CTCGGCAACC GGCTGCTGAC CTTCCAGCTC 350 TACGACCAGC AGGCCAACGT GCCGCTGGGC ATCATTCCGC TGCTGCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCTT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG 450 ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【０１８８】配列番号：３５配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・スクロフラセウ
ム／ＳＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACGT ACGTCAAGGG CGTGAACGAC 50 GCCGTCGCCA AACTCCAAGA GGCACGCGCC AATGACGACC ACGCCGCGAT 100 CTTCCTGAAC GAAAAGAACC TGGCGTTCCA CCTCGGCGGC CACGTGAACC 150 ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTCTCGCCGG ACGGCGGCGA CAAGCCGACC 200 GGAGAACTGG CCGCCGCGAT CGATGACGCG TTCGGATCGT TCGACAAATT 250 CCGCGCCCAG TTCAGTGCGG CCGCCAACGG CCTGCAGGGT TCGGGCTGGG 300 CGGTGCTGGG CTATGACACA CTCGGCAGCA GGCTGCTCAC CTTCCAGCTT 350 TACGACCAGC AGGCCAACGT CCCGCTCGGC ATCATTCCGC TGCTGCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCCT TTTACTTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG 450 ACTACGTCAA GGCCTTCTGG AATGTCGTGA ACTGGGCCGA G 491

【０１８９】配列番号：３６配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・カンサシイ／Ｓ
ＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAGGG CGCCAACGAT 50 GCGGTCGCCA AACTCGAAGA GGCGCGCGCC AAGGAAGACC ACTCGGCGAT 100 CTTGCTGAAC GAGAAGAACT TGGCCTTCAA CCTCGCCGGC CACGTCAACC 150 ACACGATCTG GTGGAAGAAC CTTTCTCCCA ACGGAGGCGA CAAGCCGACC 200 GGCGAACTCG CCGCGGCCAT CGACGAGGCG TTCGGGTCCT TCGACAAGTT 250 TCGTGCCCAA TTCCACGCCG CCGCCACCAC GGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGCGCTGGG CTGGGACACT CTCGGCAACA AGCTGCTGAT ATTCCAGGTC 350 TACGACCACC AGACGAACTT TCCACTCGGA ATCATTCCGT TACTGCTGCT 400 CGACATGTGG GAACACGCTT TCTACCTCCA GTACAAGAAT GTCAAGGTCG 450 ACTTCGCCAA AGCATTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【０１９０】配列番号：３７配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・フォーチュイタ
ム／ＳＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCGT ACGTCAAGGG CGTCAACGAC 50 GCCGTGGCCA AGCTCGATGA GGCGCGGGCC AACGGTGACC ACGCGGCGAT 100 CTTCCTCAAC GAGAAGAACC TGGCGTTCCA TCTCGGCGGC CACGTGAACC 150 ACTCGATCTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA ACGGTGGTGA CAAGCCGACG 200 GGCGATCTGG CCGCGGCGAT CGACGATCAG TTCGGCTCGT TCGACAAGTT 250 CCAGGCGCAG TTCACCGCCG CCGCCAACGG GCTGCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CCGTGCTCGG CTACGACAGC CTGGGCGATC GGCTGCTGAC CTTCCAGCTC 350 TACGACCAGC AGGCCAACGT GCCGCTCGGC ATCATCCCGC TGCTCCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCCT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG 450 ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AAAGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【０１９１】配列番号：３８配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・シミエ／ＳＯＤ
遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CATGCGACGT ACGTCAAGGG TTTGAACGAC 50 GCCATTGCCA AGCTTGAAGA GGCGCGGGCC AACGACGACC ATGCCGCGAT 100 CTTCTTGAAC GAGAAGAATC TGGCATTCCA CCTCGGTGGC CACGTCAACC 150 ACTCCATCTG GTGGAAAAAC CTGTCCCCGA ACGGCGGAGA CAAGCCGACC 200 GGAGATCTCG CCGCCGCCAT CGACGACGCC TTCGGTTCGT TCGACAAGTT 250 CCGCGCACAG TTCAGCGCCG CCGCCAACGG CTTGCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CGGTACTCGG CTACGACACC CGGGGCGACC GACTGCTGAC CTTCCAGCTT 350 TACGACCAGC AGGCCAACGT CCCGCTGGGC ATCATCCCGC TGCTGCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCCT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCGG 450 ACTACGTCAA GGCGTTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【０１９２】配列番号：３９配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・ゴルドネ／ＳＯ
Ｄ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCACCT ACGTCAAAGG CGTCAACGAC 50 GCGGTCGCCA AGCTGGAAGA AGCGCGCGCC AAAGGCGACC ACTCGGCCAT 100 CTTTTTGAAC GAGAAGAACC TGGCCTTCCA CCTGGGCGGT CACGTCAACC 150 ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCGCCGG ACGGCGGCGA CAAGCCGACC 200 GGTGACCTGG CCGCCGCGAT CGACGACCAG TTCGGCTCGT TCGACAAGTT 250 CCAGGCTCAG TTCAGCGCCG CCGCAAACGG CCTACAGGGC TCGGGCTGGG 300 CGGTGCTCGG CTACGACACT CTGGGCGGCC GGTTGCTCAC CTTTCAGCTC 350 TACGACCAGC AGGCCAATGT CCCGCTCGGT GTCATTCCGC TGTTGCAGGT 400 CGACATGTGG GAGCACGCCT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGGCCG 450 ACTACGTCAA GGCCTTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA C 491

【０１９３】配列番号：４０配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ミコバクテリウム・ゼノピ／ＳＯＤ
遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCGACGT ACGTCAAAGG CGCCAACGAC 50 GCGCTCGCCA AGCTGGAGGA GGCGCGCGCC AAAGACGATC ATTCCGCGAT 100 CGTCGGGCAT GAGAAGGCCC TCGCGTTCAA CCTGGCCGGC CATGTCAATC 150 ACTGCCTGTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA ACGGCGGTGA CAAGCCGACC 200 GGCGAATTGG CCGCCGCCAT CGACGACGCG TTCGGCTCGT TCGACAAGTT 250 CCGCGCCCAG TTCACCGCGG CCGCCACGAC CGTGCAGGGG TCGGGCTGGG 300 CGGCACTCGG CTGGGACAGC CTGGGTGGCA AGCTCCTGGT GTTCCAGGTC 350 TACGACCACC AGTCCAACTT CCCGCTCGGG ATCGTCCCCC TGCTGGTGCT 400 CGACATGTGG GAGCACGCCT TCTACCTGCA GTACAAGAAT GTCAAGGCTG 450 ACTTCGCCAA AGCATTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGCCGA T 491

【０１９４】配列番号：４１配列の長さ：４９５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：コリネバクテリウム・ジフテリエ／
ＳＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCTAACT ACGTGAACGG TGCAAATACT 50 GCTCTTGAGA AGCTGCAAAA GGCTCGCGAG AACGGTGAGA TCGGTGCTGT 100 TGTCACCGCT TTGTCCAAGG ATTTGGCTTT CAACTTGGGT GGCCACACCA 150 ACCACTCCAT CTTCTGGAAG AACCTCTCCC CTAACGGTGG CGGCGAGCCA 200 ACCGGCGCTT TGGCTGAGGC AATTGCCAAG GAGTTCGGTT CTTTTGAGAA 250 GTTCAAGGAT CACTTCTCTG CTGCGGCTCT TGGTCTGCAG GGTTCCGGCT 300 GGGCTGTTCT CGGCTACGAT CACATCGGTG GCCGTCTGGT TATCGAGCAG 350 CTCACTGACC AGCAGGGCAA CATCTCCGCT AACCTGACCC CACTTCTTAT 400 GCTCGATATG TGGGAGCACG CTTTCTACCT TCAGTACAAG AACGTGAAGG 450 CTGACTACGT CAAGGCTGTG TGGAACGTCG TGAACTGGGA CGATG 495

【０１９５】配列番号：４２配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：Ｃ．シュードジフテリアチクム／Ｓ
ＯＤ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACAACACTT ACGTGCAGGG TGCTAACGCA 50 GCTTTGGACG CTCTGGAAGA AGAGCGCAAC GGCGAAGCCA ACCCAGACCG 100 CATCCGTGCG CTGTCCAAGA ACTTGGCTTT CCAACCTGGC CACACCAACC 150 ACTCCATCTT CTGGAAGAAC CTGAGCCCTA ACGGTGGCGG CGAGCCAACC 200 GGTGAGCTAG CAGAGGCTAT CGACCGCGAC TTTGGTTCCT TCGAGAAGTT 250 CAAGGCGCAC TTCTCCGCAG CAGCACTCGG CCTGCAGGGT TCCGGCTGGG 300 CCGTGCTGGG TTACGACCAC ATTGCTGGTC GCCTGCTCGT TGAGCAGCTG 350 ACCGACCAGC AGGGCAACAC TTCCGTGAAC TTCACCCCAC TGCTGATGCT 400 GGATATGTGG GAGCACGCTT TCTACCTGCA GTACAAGAAC GTCAAGCCTG 450 ATTACGTCAA GGCTGTCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【０１９６】配列番号：４３配列の長さ：４９０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：ノカルジア・アステロイデム／ＳＯ
Ｄ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCCT ACGTCGCCGG TGCCAACACG 50 GCACTGGAGA AGCTGGAAGC CGCCCGTGAG GCCGGCGATC ACAGCGCGAT 100 CTTCCTGCAC GAGAAGAACC TCGCGTTCCA CCTCGGCGGA CACGTCAACC 150 ACTCCATCTG GTGGAAGAAC CTGTCCCCCA ACGGTGGCGA CAAGCCGGTC 200 GGCGAGCTGG CCGCGGCCAT CGACGACCAG TTCGGTTCGT TCGACAAGTT 250 CCGCGCGCAG TTCACCGCCG CGCCAACGGC CTGCAGGGCT CGGGCTGGGC 300 GGTGCTCGGT TACGACACCC TCGGCCAGAA GCTGCTGACC TTCCAGCTCT 350 ACGACCAGCA GGCCAACGTG CCGCTGGGCA TCATCCCGCT GCTCCAAGTC 400 GACATGTGGG AGCACGCCTT CTACCTGCAG TACAAGAACG TCAAGGCCGA 450 CTACGTGACC GCGTTGTGGA ACGTCGTGCA CTGGGCCGAT 490

【０１９７】配列番号：４４配列の長さ：４９１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ由来：（Ａ）生物：アクチノミセス・ビスコサス／ＳＯ
Ｄ遺伝子配列 AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CACGCCGCCT ACGTCGCTGG CGCCAACGCC 50 GCCCTGGAGG CCCTCGCCGC CGCCCGCGAG GACGGCGACC TGGGTGCGAT 100 CAACCTGTGG GAGAAGAACC TCGCCTTCAA CCTGGGCGGC CACACCAACC 150 ACTCCGTGTT CTGGAAGAAC CTCTCCCCCA ACGGCGGCGG CCAGCCCGAG 200 GGCGAGCTCG CCGAGGCCAT CAAGGACTCC TTCGGCTCCT TCGAGAAGTT 250 CCAGGCGCAG TTCACCGCCA CCGCCCTGGG CATCCAGGGC TCGGGCTGGG 300 CCGTGCTCGC CTACGACTCA ATCTCCGGCA AGCTGCTGAT CTTCCAGCTC 350 TTCGACCAGC AGGCCAACGT GCCCGTGGGC ACGACCCCGC TGTTCATGGT 400 GGACATGTGG GAGCACGCAT TCTACCTCGA CTACCTCAAC GTCAAGGCCG 450 ACTACGTCAA GGCCATCTGG AACGTCGTGA ACTGGGACGA T 491

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＳＯＤ遺伝子中の配列決定用プライマ
ーの位置を示す。

【図２】図２は、属特異的プライマーZ261とZ212を使っ
て得られた固定化アンプリコンを使ってＭ．イントラセ
ルラーレ特異的プローブであるZ303に対してハイブリダ
イズさせたドットブロットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:32）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細菌、真菌および原生動物を含む病原性
生物と非病原性生物との識別のための標的として使用さ
れるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子
系。
【請求項２】マイコバクテリア種の検出および識別の
ための標的として使用されるＳＯＤ遺伝子系。
【請求項３】プライマー配列として配列番号１の配列
（Z205）を含む第一のプライマーとプライマー配列とし
て配列番号２の配列（Z212）を含む第二のプライマーと
から成る一対のプライマーとポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を使ってスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）をコードする遺伝子の一部を増幅しそして変性させ
ることにより得られる、一本鎖核酸配列（標的配列）に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】細菌、真菌および原生動物を含む病原性
生物のＳＯＤ遺伝子に由来する標的配列にハイブリダイ
ズすることができる、請求項３に記載のオリゴヌクレオ
チド。
【請求項５】特定の属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝
子間で実質的に保存されている標的配列の一領域にハイ
ブリダイズすることができる、請求項３または４に記載
のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】特定の属に属する異なる種のＳＯＤ遺伝
子間の識別を可能にする程度に可変的である標的配列の
一領域にハイブリダイズすることができる、請求項３ま
たは４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】プライマー配列として配列番号３の配列
（Z261）を含む第一のプライマーとプライマー配列とし
て配列番号２の配列（Z212）を含む第二のプライマーと
から成る一対のプライマーとポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を使ってマイコバクテリア種のスーパーオキシド
ジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする遺伝子の一部を増
幅しそして変性させることにより得られる、一本鎖核酸
配列（標的配列）にハイブリダイズすることができる請
求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】マイコバクテリア属に属する異なる種の
ＳＯＤ遺伝子間で実質的に保存されている標的配列の一
領域にハイブリダイズすることができる、請求項７に記
載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】次の配列： 5'-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3' （配
列番号４）（ここで、記号ＨはＴ，ＣまたはＡを表し、記号ＭはＡ
またはＣを表し、記号ＮはＡ，Ｃ，ＧまたはＴを表し、
記号ＳはＣまたはＧを表し、記号ＶはＡ，ＣまたはＧを
表し、そして記号ＹはＣまたはＴを表す）またはそれに
相補的な配列を有する、請求項８に記載のオリゴヌクレ
オチド。
【請求項１０】配列番号５（Z310）、配列番号６（Z3
11）、配列番号７（Z312）、配列番号８（Z313）、配列
番号９（Z314）、配列番号10（Z315）、配列番号11（Z3
16）および配列番号12（Z317）の配列並びにそれらに相
補的な配列から成る群から選ばれる、請求項９に記載の
オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】マイコバクテリア属に属する異なる種
のＳＯＤ遺伝子間の識別を可能にする程度に可変的であ
る標的配列の一領域にハイブリダイズすることができ
る、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】Ｍ．イントラセルラーレ（M. intrace
llulare ）種のＳＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリ
ダイズすることができる、請求項１１に記載のオリゴヌ
クレオチド。
【請求項１３】配列番号13（Z303）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項１１に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項１４】Ｍ．アビウム（M. avium）およびＭ．
ブルネンセ（M. brunense ）種のＳＯＤ遺伝子の種特異
的領域にハイブリダイズすることができる、請求項１１
に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】配列番号14（Z301）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項１４に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項１６】Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae ）種のＳ
ＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリダイズすることが
できる、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】配列番号15（Z366）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項１６に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項１８】Ｍ．シミエ（M. simiae ）種のＳＯＤ
遺伝子の種特異的領域にハイブリダイズすることができ
る、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】配列番号16（Z304）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項１８に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２０】Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculo
sis ）種のＳＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリダイ
ズすることができる、請求項１１に記載のオリゴヌクレ
オチド。
【請求項２１】配列番号17（Z336）、配列番号23（Z3
37）もしくは配列番号22（Z302）の配列またはそれに相
補的な配列を含有する、請求項２０に記載のオリゴヌク
レオチド。
【請求項２２】Ｍ．ゼノピ（M. xenopi ）種のＳＯＤ
遺伝子の種特異的領域にハイブリダイズすることができ
る、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】配列番号18（Z309）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項２２に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２４】Ｍ．カンサシイ（M. kansasii ）種の
ＳＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリダイズすること
ができる、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】配列番号19（Z340）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項２４に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２６】Ｍ．スクロフラセウム（M. scrofulac
eum ）種のＳＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリダイ
ズすることができる、請求項１１に記載のオリゴヌクレ
オチド。
【請求項２７】配列番号20（Z306）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項２６に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２８】Ｍ．フォーチュイタム（M. fortuitu
m）種のＳＯＤ遺伝子の種特異的領域にハイブリダイズ
することができる、請求項１１に記載のオリゴヌクレオ
チド。
【請求項２９】配列番号21（Z369）の配列またはそれ
に相補的な配列を含有する、請求項２８に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項３０】ハイブリダイズ配列として請求項７〜
１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含ん
で成るプローブ。
【請求項３１】ハイブリダイズ配列として請求項１０
に記載のオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブのプ
ール。
【請求項３２】ハイブリダイズ配列として請求項１１
〜２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含
んで成るプローブ。
【請求項３３】プライマー配列として配列Z205に実質
的に相同である配列を含んで成るプライマー。
【請求項３４】プライマー配列として配列Z212に実質
的に相同である配列を含んで成るプライマー。
【請求項３５】プライマー配列として配列Z205を含ん
で成る第一のプライマーとプライマー配列として配列Z2
12を含んで成る第二のプライマーとから成るプライマー
対。
【請求項３６】プライマー配列として配列Z261に実質
的に相同である配列を含んで成るプライマー。
【請求項３７】プライマー配列として配列Z261を含ん
で成る第一のプライマーと開始配列として配列Z212を含
んで成る第二のプライマーとから成るプライマー対。
【請求項３８】請求項３３および／または３６に記載
のプライマー並びに請求項３４に記載のプライマーを含
んで成る、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を
コードする遺伝子の一部を増幅させるための試薬セッ
ト。
【請求項３９】請求項３０または３１に記載のプロー
ブを含んで成る、マイコバクテリア種を検出するための
試薬セット。
【請求項４０】請求項３２に記載のプローブを含んで
成る、マイコバクテリア属に属する異なる種間を識別す
るための試薬セット。
【請求項４１】請求項３３および／または３６に記載
のプライマー並びに請求項３４に記載のプライマーを更
に含んで成る、請求項３９または４０に記載の試薬セッ
ト。