NO315664B1

NO315664B1 - Fremgangsmåte for detektering av patogene og ikke-patogene organismer fra slekten Mycobacterium, oligonukleotid, prober, primere samt sett avreagenser

Info

Publication number: NO315664B1
Application number: NO19933678A
Authority: NO
Inventors: Werner Zolg
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-10-12
Publication date: 2003-10-06
Also published as: US5525463A; ES2158854T3; BR9304214A; ZA937420B; EP0592894B1; NO933678D0; DE69330263T2; EP0592894A1; FI934500A; NO933678L; PT592894E; CN1085957A; IL107220A; CA2108247C; CN1053472C; IL107220A0; NZ248896A; CA2108247A1; JP2502035B2; AU4891993A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for detekting av patogene og ikke-patogene organismer fra slekten Mycobacterium, oligonukleotid, prober, primere samt sett av reagenser. Oligonukleotidene er avledet fra SOD-genfamilien og de er i stand til å hybridisere til en enkeltkjedet nukleinsyresekvens (målsekvens) som oppnås ved å forøke og denaturere en del av genet som koder for supe ro ksyd-d is mutas e (SOD) ved bruk av en polymerase-kjedereaksjon (PCR) og et par primere.

Disse oligonukleotidene kan anvendes i form av "primere" og prober for å forøke og påvise målsekvensene som stammer fra SOD-gener, spesielt de fra SOD-gener til patogene organismer som omfatter bakterier, sopp og protozoer. "Primerne" og probene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan også anvendes for å forøke og påvise målsekvensene som er avledet fra SOD-gener til ikke-patogene organismer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for detektering av patogene og ikke-patogene organismer fra slekten Mycobacterium, kjennetegnet ved at den omfatter

(a) amplifisering av en målregion av et superoksyd-dismutase (SOD)-gen til en organisme ved anvendelse av et par primere spesifikke for slekten Mycobacterium som består av en første primer inneholdende sekvensen ifølge sekv. id. no. 3 (Z261) som primingsekvens og en andre primer inneholdende

sekvensen ifølge sekv. id. no. 2 (Z212) som priming-sekvens,

(b) kontakting av amplifisert målsekvens med minst én oligonukleotid probe som har evne til å hybridisere til målregionen av SOD-genet; og (c) detektering av hybrider dannet mellom den amplifiserte målregionen, om noen, og oligonukleotidproben.

Det er videre beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er vesentlig konservert blant SOD-genene til forskjellige arter som hører til slekten Mycobacterium, med sekvensen 5-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3' (sekv. id. no. 4), hvori symbolet H angir en T, C eller A, symbolet M angir en A eller C, symbolet N angir en A, C, G eller T, symbolet S angir en C elter G, symbolet V angir en A, C eller G, og symbolet Y angir en C eller T, eller en sekvens komplementær hertil..

Oppfinnelse vedrører videre oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er vesentlig konservert blant SOD-genene fra forskjellige arter som hører til slekten Mycobacterium, med en sekvens valgt fra gruppen bestående av sekvensene ifølge sekv. id. no. 5 (Z3I0), sekv. id. no. 6 (Z3II), sekv. id. no. 7 (Z3I2), sekv. id. no. 8 (Z3I3), sekv. id. no. 9 (Z3I4), sekv. id. no. 10 (Z3I5), sekv. id. no. II (Z3I6) og sekv. id. no. 12 (Z3I7), og sekvenser komplemen-tære med hver av de foregående sekvensene.

Det er også beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. intracellulare og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 13 (Z303) eller en sekvens komplementær hertil.

Det er videre beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. avium og M. brunense og som inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 14 (Z301) eller en sekvens komplementær hertil.

Oppfinnelsen vedrører videre oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. gordonae og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 15 (Z366) eller en sekvens komplementær hertil.

Det er også beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. simiae og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 16 (Z304) eller en sekvens komplementær hertil.

Oppfinnelsen vedrører videre oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. tuberclosis og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 17 (Z336), sekv. id. no. 23 (Z337) eller sekv. id. no. 22 (Z302) eller en sekvens komplementær hertil.

Det er også beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. xenopi og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 18 (Z309) eller en sekvens komplementær hertil.

Oppfinnelsen vedrører videre oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. kansasii og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 19 (Z340) eller en sekvens komplementær hertil.

Det er også beskrevet oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne tii å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. scrofulaceum og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 20 (Z306) eller en sekvens komplementær hertil.

Oppfinnelsen vedrører også oligonukleotid, kjennetegnet ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. fortuitum og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 21 (Z369) eller en sekvens komplementær hertil.

Oppfinnelsen omfatter videre probe, kjennetegnet ved at den omfatter et oligonukleotid ifølge krav 25 som hybridiserende sekvens.

Det er også beskrevet gruppe-prober, kjennetegnet ved at de omfatter oligonukleotidene ifølge krav 26 som hybridiserende sekvenser.

Oppfinnelsen vedrører også probe, kjennetegnet ved at den omfatter et oligonukleotid ifølge hvilke av kravene 27-35 som hybridiserende sekvens.

Det er også beskrevet primer, kjennetegnet ved at den omfatter som primingsekvens, en sekvens som er vesentlig homolog med sekvensen Z205 eller sekvensen Z212.

Oppfinnelsen vedrører videre primer-par, kjennetegnet ved at den første primeren omfatter sekvensen Z205 som primingsekvens, og den andre primeren inneholder sekvensen Z2I2 som primingsekvens.

Det er også beskrevet primer, kjennetegnet ved at den omfatter som priming-sekvens, en sekvens som er vesentlig homolog med sekvensen Z261.

Oppfinnelsen vedrører videre primer-par, kjennetegnet ved at den første primeren omfatter sekvensen Z261 som primingsekvens, og den andre primeren inneholder sekvensen Z2I2 som primingsekvens.

Det er også beskrevet sett av reagenser for amplifisering av en del av et gen kodende for en superoksyd-dismutase (SOD), kjennetegnet ved at det omfatter en primer ifølge krav 39 og/eller 42 og en primer ifølge krav 40.

Oppfinnelsen omfatter videre sett av reagenser for detektering av en mykobakteriell art, kjennetegnet ved at det omfatter en probe ifølge krav 36 eller 37.

Det er også beskrevet sett av reagenser for differensiering blant forskjellige arter som hører slekten mykobakterier, kjennetegnet ved at det omfatter en probe ifølge krav 38.

SOD er et enzym som katalyserer dismuteringen av fritt superoksyd (02 ) for å gi molekylært oksygen og hydrogenperoksyd som følger:

Det resulterende peroksyd overføres så ved hjelp av katalaser eller peroksydaser til H20. Superoksyd (02") er et giftig sideprodukt av aerob respirasjon og reagerer med peroksyd (02<2>~), slik at proteiner, lipider og nukleinsyrer skades. Enzymet superoksyd-dismutase (SOD) motvirker de giftige virkningene til radikalene ved å overføre superoksyd til molekylært oksygen og peroksyd.

A. Stein et al., 1992, Joum. Clin. Microbiol. 30,2462-2466, beskriver et par primere for amplifisering av en dei av SOD-genet til Coxiella brunetii, som er meget spesifikk for denne arten. I forhold til gjenstanden i foreliggende oppfinnelse, muliggjør primerparet beskrevet av Stein et al., ikke deteksjon av ytterligere Mycobacteria-arter, og derfor tilveiebringer denne publikasjonen ingen metoder for artsspesifikk deteksjon av mykobakterier.. Det blir heller ikke beskrevet foretrukne prober for spesi- og arts-spesifikk deteksjon av mykobakterier.

Y- Zhang et al., 1991, Molec. Microbiol. 5,381 -391, beskriver en genetisk analyse av SOD-genet til Mycobacterium tuberculosis. Denne publikasjonen beskriver ikke nukleinsyreamplifikasjonsmetoder og nyttige primer- og probe-sekvenser for artsspesifikk deteksjon av mykobakterier.

NO Patent nr. 88.5756 beskriver nukleinsyresekvenser nyttige som prober ved diagnostikk av bestemte mykobakterielle arter. Det blir ikke beskrevet primere og prober som muliggjør arts- samt spesi-spesifikk deteksjon av mykobakterier ved en nukleinsyreamplifikasjonsmetoder.

Derfor er det fortsatt et behov for å tilveiebringe forbedrede fremgangsmåter for detektering av mycobacterier som muligjør arts- samt spesi-spesifikk deteksjon og dette er hensikten med foreligende oppfinnelse. For dette formålet er det tilveiebragt nye primer- og probe-sekvenser.

Betegnelsen "polymerasekjede-reaksjon" eller "PCR" angir en fremgangsmåte for å forøke én eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser, hvori (I) oligonukleotid-"primere" som bestemmer endene til sekvensene som skal forøkes, blir bundet til enkelt-kjedet nukleinsyrer i en laboratoireprøve, (2) en nukleinsyrepolymerase forlenger 3-endene til de bundne "primerne" for å lage en nukleinsyrekjede som er komplementær i sekvens til nukleinsyren til hvilken "primerne" ble bundet, (3) den resulterende dobbelt-kjedede nukleinsyren denatureres for å gi to enkelt-kjedede nukleinsyrer, og (4) fremgangsmåtene for å binde "primer", forlengelse av "primer" og denaturering av produkt gjentas tilstrekkelig antall ganger for å lage lett påvisbare og målbare mengder av sekvensene som er definert av "primerne". Praktisk kontroll av den trinnvise binding, forlengelse og denaturering utføres ved å endre temperaturen i reaksjonen, normalt foregår det på en periode-vis repetert måte. Binding og forlengelse opptrer helst i 37oC-80°C-temperaturområde (nøyaktig verdi avhenger av "primer"-konsentrasjoner og sekvenser), mens denaturering krever temperaturer i 80-IOO°C-område (nøyaktig verdi avhenger av målsekvens og konsentrasjon).

Betegnelsen "oligonukleotid" refererer seg til en enkelt-kjedet nukleinsyre som består av to eller flere deoksyribonukleotider, slik som "primere", prober, nuklein-syrefragmenter som skal påvises og nukleinsyrekontroller. Den nøyaktige størrelsen til et oligonukleotid avhenger av mange faktorer, og den endelige funksjonen til eller anvendelse av oligonukleotidet. Oligonukleotider kan fremstiltes ved enhver passende fremgangsmåte, deriblant, f.eks. kloning og restriksjon av passende sekvenser og direkte kjemisk syntese ved hjelp av en fremgangsmåte slik som fosfotriester-fremgangsmåten til Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90-99 (1979); fosfodiester-fremgangsmåten til Brown et al., Meth. Enzymol. 68,109-151 (1979); dietylfosfor-amfditt-fremgangsmåten til Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22,1859-1862 (1981); og fastfase-fremgangsmåten beskrevet i U.S. patentspesifikasjon nr. 4.458.066.

Betegnelsen "primer" angir et oligonukleotid, enten naturlig eller syntetisk, som er i stand til å virke som et startsted for DNA-syntese under betingelser hvor syntese av et "primerMoriengelsesprodukt som er komplementært til en nukleinsyrekjede dannes, dvs. i nærværet av de ulike nukleosidtirfosfatene og en forbindelse for polymerisering (f.eks. en DNA-polymerase eller en reverstranskriptase) i en passende buffer og ved en passende temperatur. Den passende "primer"-lengde avhenger av hensikten med "primeren", men er typisk i områder 15 til 40 nukleotider. Korte "primer"-molekyler krever vanligvis lavere temperaturer for å lage stabile hybridkomplekser med tempiatet. En "primer" må ikke avspeile den nøyaktige sekvensen til tempiatet, men må være tilstrekkelig komplementær slik at den hybridiserer til et templat og starter DNA-syntese under de valgte reaksjonsbetingelsene.

Betegnelsen "primer" kan gjenspeile mer enn én "primer", spesielt i tilfellet

hvor der er en viss usikkerhet i informasjonen med hensyn til én eller begge endene i målområdet som skal forøkes. Hvis et konservert område viser betydelige grader av polymorfisme i en populasjon, kan "primer"-blandinger fremstilles som vil forøke slike

sekvenser, eller "primerne" kan lages for å forøke endog feiltilpassede sekvenser. En "primer" kan merkes, hvis ønskelig, ved å bygge inn en markør som kan påvises ved radiometriske, spektroskopiske, fotokjemiske, biokjemiske, immunokjemiske eller kjemiske hjelpemidler. F.eks. omfatter anvendbare markører ^P, fluorescerende fargestoffer, elektrontette reagenser, enzymer (som vanligvis benyttet i ELISA'er), biotin eller haptener og proteiner mot hvilke antisera eller monoklonale antistoffer er tilgjengelige. En markør kan også benyttes for å "fange" "primeren" for å lette immobiliseringen av enten "primeren" eller et "primerMorlengelsesprodukt, slik som forøket DNA, på fast fase.

Betegnelsen "probe" refererer seg til et oligonukleotid som inneholder en hybridiserende sekvens komplementær til en del av målsekvensen som kan merkes med en markør eller bindes til et fast underlag. Avhengig av målefremgangsmåtene som benyttes for å påvise hybrider dannet mellom prober og nukleinsyresekvenser, kan probene inneholde ytterligere egen-skaper i tillegg til hybridiseringsområdet. I "dot-blot-formatef blir f.eks. probene vanligvis merket. Hvis proben er først immobilisert, som i "revers"-dot-blot-formatet beskrevet nedenfor, kan proben også inneholde lange områder med poly-dT som kan bindes til et nylonunderlag ved hjelp av bestråling, en fremgangsmåte beskrevet i mer detalj i PCT patentpublikasjon no. 89/11548. Den passende lengde av en probe avhenger av den ønskede anvendelse, men varierer vanligvis fra 15 til 40 nukleotider. Korte probemoiekyler krever vanligvis lavere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med målet. En probe må ikke reflektere den nøyaktige sekvensen til tempiatet, men må være tilstrekkelig komplementær slik at den hybridiserer med målsekvensen.

Probene i den foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres og merkes ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for syntese av oligonukleotider. F.eks. kan proben merkes i 5-enden med <32>P ved å inkubere proben med ^P-ATP og kinase. En passende ikke-radioaktiv markør for probene er pepperrot-peroksydase (HRP). Fremgangsmåter for fremstilling og påvisning av probene med denne markør, er beskrevet i U.S. patent-spesifikasjon nr. 4.914.210 og 4.962.02. For ytterligere informasjon når det gjelder anvendelse av slike merkede prober, se U.S. patent-spesifikasjon nr. 4.78.630; Saiki et al., N. Eng. J. Med. 3J9,537-541 (188); og Bugawan et al., Bioflechnology 6, 943-947 (1988). Anvendbare kromogeneromfatter rødt leuko-fargestoff 3,3',5,5-tetrametylbenzidin (TMB). Helmuth, PCR Protocols, San Diego, California, Academic Press, Inc., 1990, pp. 119-128, beskriver fremgangs-

måter for ikke-isotopisk påvisning av PCR-produkter.

Foretrukne oligonukleotider ifølge den foreliggende oppfinnelsen er de som er i stand til å hybridisere til et område i målsekvensen som er i vesentlig grad bevart blant SOD-gener fra forskjellige organismer slik som bakterier, sopp og protozoer (univer-sielle "primere") eller sterkt konservert blant SOD-genene fra ulike arter som tilhører et spesielt genus (genus-spesifikke oligonukleotider), og de som er i stand til å hybridi-sere til et område i målsekvensen som varierer i en grad som tillater differensiering ved bruk av SOD-genene fra ulike arter som tilhører et spesielt genus {spesies-spesifikke oligonukleotider).

Oligonukleotider som er i stand til å hybridisere til en enkeltkjedet nukleinsyresekvens (målsekvens) som kan oppnås ved å forøke en del av et gen som koder for superoksyd-dismutase (SOD) fra mykobakterielle arter ved bruk av en polymerase-kjedereaksjon (PCR) og et par "primere", den første "primeren" inneholder sekvensen til sek. id. no. 3 (Z26I, kf. tabell 17) som startsekvens, og den andre "primeren" inneholder sekvensen sek. id. no. 2 (Z2I2), foretrekkes spesielt som startsekvens. Blant disse foretrekkes endog mer oligo-nukleotider som kan hybridisere til et område i målsekvensen som er i det vesentlige konservert blant SOD-gener fra ulike arter som tilhører mykobakteire-genus (genus-spesifikke oligo-nukleotider), og oligonukleotider som kan hybridisere til et område i målsekvensen som varierer i et omfang som tillater differensiering blant SOD-genene fra ulike arter som tilhører mykobakteire-genus (spesies-spesifikke oligonukleotider).

Som nevnt tidligere kan oligonukleotidene i den foreliggende oppfinnelse benyttes i form av "primere" og prober for å forøke og påvise målsekvensene fra SOD-gener fra patogene organismer som omfatter bakterier, sopp og protozoer og ikke-patogene organismer. I en foretrukket anvendelse blir målnukleinsyren forøket ved PCR, ved bruk av et par "primere" som tillater forøkning av en del av SOD-genene fra de ulike artene som tilhører et spesielt genus. Genus-påvisning kan så utføres ved å blande den forøkte nukleinsyren med genus-spesifikke prober og påvise om hybridi-

sering skjer, mens spesies-identifisering utføres ved å bestemme mønsteret for hybridisering av den forøkede nukleinsyren til spesies-spesifikke prober.

I en spesiell foretrukket utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse oligonukleotider som kan benyttes i form av "primere" og prober for å forøke og påvise målsekvensene som stammer fra SOD-gener i mykobakteirearter, fortrinnsvis fra patogene mykobakteriearter. Målnukleinsyren forøkes ved hjelp av PCR, med bruk av "primere" som tillater forøkning av en del av SOD-genene fra de ulike mykobakteire-artene som tilhører mykobakteiregenus. Fortrinnsvis består "primer"-paret av en første "primer" som omfatter en startsekvens som er i det vesentlige homolog til sekvensen til sek. id. no. 3 (Z26I), og en annen "primer" som har en startsekvens som er i det vesentlige homolog til sekvensen til sek. id. no. 2 (Z2I2). Det er videre ønskelig at "primer"-paret består av en første "primer" som har sekvensen til sek. id. no. 3 (Z26I) og en annen "primer" som har sekvensen til sek. id. no. 2 (Z2I2) som startsekvens.

Genuspåvisning kan utføres ved å blande den forøkede nukleinsyren med genus-spesifikke prober som omfatter en oligonukleotidsekvens fra sek. id. no. 4 som hybridiserings-sekvens, fortrinnsvis en blanding av prober som består av oligo-nukleotidsekvensene til Z3I0-Z3I7 som hybridiserings-sekvenser (tabell 18), og påvisning hvis hybridisering skjer. Spesies-identifisering kan utføres ved å bestemme mønsteret for hybridisering av den forøkte nukleinsyren til spesies-spesifikke prober som er i stand til å hybridisere til et område i målsekvensen som varierer i en grad som tillater differensiering mellom SOD-genene fra ulike arter som tilhører mykobakteire-genus.

Foretrukne spesies-spesifikke prober som kan benyttes ifølge den foreliggende oppfinnelse, er prober som inneholder som hybridiseringssekvens, en sekvens som er i det vesentlige homolog til de følgende sekvensene: 5'-CCT TCG GAT CCT TCG ACC GGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3' (Z303, sek. id. no. 13) for M. intraceilulare;

5'-GCT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3' (Z336, sek. id. no. 17) og 5'-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG CTG CTG C-3' (Z302, sek.

id. no 22) og

5'-AGT CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3' (Z337, sek.id.no.23) for M.tuberculosis; 5'-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3" (Z369, sek.id.no.2l) for M. fortuitum; 5'-TCT GGG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3' (Z366, sek. id. no. 15) for M. gordonae;

5'-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC GCG TTC A-3" (Z309, sek.

id. no. 19) for M xenopi; 5'-TGA CAC ACT CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT CCA GCT T-3' (Z306, sek. id. no. 20) for M. scrofulaceum; 5'-GTC CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3' (Z304, sek. id. no. 16) for M. simiae;

5'-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3" (Z340, sek. id. no. 19) for M. kansasii; og 5'-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGC C-3' (Z30lr sek.

id. no. 14) for M. avium/M.brunense.

Andre områder i sekvensene til amplikonene som kan oppnås med "primerne" Z205 og Z2I2, kan også benyttes for å lage spesies-spesifikke prober.

Fremgangsmåtene som er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse for diagnose av infeksjoner forårsaket av patogene organismer, omfatter trinnene for forøkning av målsekvensen hvis den er tilstede, og påvisning og identifisering av amplikonet (det området som forøkes) hvis det er tilstede, ved hjelp av probehybridiseringsmetoder.

Et viktig område for den foreliggende oppfinnelse er forøkningen av en del av et gen som koder for en SOD. De som utfører den foreliggende oppfinnelsen skulle bemerke at, skjønt polymerasekjedereaksjonen er den foretrukne forøkningsfremgangs-måten, forøkning av målsekvensene i en prøve kan utføres ved enhver kjent frem-gangsmåte, slik som en ligasekjedereaksjon (LCR), transkripsjonsforøkning og selv-understøttet sekvensreplikasjon og andre fremgangsmåter ikke oppført her, hver av disse gir tilstrekkelig forøkning slik at målsekvensen kan påvises ved hjelp av nuklein-syrehybridisering til én eller flere passende prober.

Skjønt PCR-fremgangsmåten er vel kjent i feltet (se U.S. patenspesifikasjon nr. 4.638.195; 4.683.202 og 4.965.188) gis en viss generell PCR-informasjon nedenfor for å gi klarhet og full forståelse av oppfinnelsen til de som ikke er kjent med PCR-fremgangsmåten.

For å øke en målnukleinsyresekvens i en prøve ved hjelp av PCR, må sekvensen være tilgjengelig for komponentene i forøkningssystemet. Vanligvis blir denne tilgjengelighet sikret ved å isolere nukleinsyrene fra prøven. En rekke fremgangs-måter for å ekstrahere nukleinsyrer fra biologiske prøver, er kjent i feltet. F.eks., se de beskrevet i Higuchi et al., PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York, 1989). Alternativt, hvis prøven er rimelig lett å ødelegge, trenger nukleinsyren ikke bli renset før forøkningen ved hjelp av PCR-fremgangsmåten, dvs. hvis prøven består av celler, spesielt perifere bfodlymfocytter eller aminocytter, kan lysts og fordeling av de intracellulære komponentene utføres utelukkende ved å suspendere cellene i hypoton buffer.

Hver omgang med PCR omfatter adskillelse av nukleinsyredupleksen dannet under "primer"-forlengelse. I en foretrukket utførelsesform av PCR-fremgangsmåten, blir kjedeseparering oppnådd ved oppvarming til en tilstrekkelig høy temperatur og i en riktig tid for å gi denaturering av dupleksen, men ikke slik at en irreversibel denaturering av polymerasen skjer (se U.S. patentspesifikasjon nr. 4.965.188). Typisk varmedenaturering omfatter temperaturer som varierer fra ca. 80°C til I05°C i perioder som varierer fra sekunder til minutter. Kjedeadskillelse kan imidlertid utføres ved hjelp av enhver passende denatureringsmetode som omfatter fysiske, kjemiske eller enzymatiske hjelpemidler. Kjedeseparering kan iverksettes ved hjelp av en helikase, f.eks., eller et enzym som er i stand til å vise helikaseaktivitet. F.eks. har enzymet RecA helikaseaktivitet i nærvær av ATP. Reaksjonsbetingelsene som passer for kjedeseparering ved hjelp av helikaser, er kjent i feltet; kfr. Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Bilogy 43, 63-67 (1978) og Radding, Ann. Rev. Genetics \ 6,405-436 (1982).

Uansett hvordan kjedeadskillelse oppnås, omfatter imidlertid når kjedene er adskilt, det neste trinn i PCR hybridisering mellom de adskilte kjedene og "primere" som dekker flanken på målsekvensen. "Primerne" blir så forlenget til å gi komplemen-tære kopier av målkjedene. For vellykket PCR-forøkning blir "primerne" laget slik at området der hver "primer" hybridiserer langs en duplekssekvens for at et ekstensjons-produkt laget fra én "primer" vil, når adskilt fra tempiatet (komplement), tjene som templat for forlengelsen av den andre "primeren". Vekslingen mellom denaturering, hybridisering og forlengelse gjentas så mange ganger som nødvendig for å få den ønskede mengden av forøket nukleinsyre.

Templat-avhengig forlengelse av "primere" i PCR, blir katalysert av en poly-meriseringsforbindelse i nærvær av tilstrekkelige mengder av deoksyribonukleosid-trifosfater (vanligvis dATP, dGTP, dCTP og dTTP; dUTP blir benyttet i stedet for eller i tillegg til dTTP hvis UNG-steriliseringssystemet beskrevet nedenfor, blir fulgt) i en reaksjonsløsning som består av de riktige saltene, metallkationene og pH-buffer-system. Passende polymeriseringsforbindelser er enzymer som er kjent for å katalysere templat-avhengig DNA-syntese. Eksempler på polymeraser som passer til bruk med et DNA-templat, omfatter E. coli-DNA-polymerase I eller Klenow-fragmentet av det enzymet, TrDNA-polymerase og Taq-DNA-polymerase, en varmestabil DNA-polymerase som er isolert fra Themnus aquaticus. Det sistnevnte enzym blir i stor utstrekning benyttet i forøkningen og sekvensering av nukleinsyrer. Reaksjons-betingelser benyttet for bruk av Taq-DNA-polymeraser er vist i feltet og er beskrevet i Gelfand, PCR Technology (1989), supra. Andre varmestabile polymeraser kan også være passende.

PCR-metoden kan utføres på en trinnvis måte hvor nye reagenser tilsettes etter hver trinn, eller på en måte hvor alle reagensene tilsettes samtidig, eller på en delvis trinnvis måte, hvor nye eller ulike reagenser tilsettes etter et gitt antall trinn. F.eks., hvis kjedeadskillelse utføres ved hjelp av varme og polymerasen er varmefølsom, så må polymerasen tilsettes etter hver runde kjedeseparering. Imidlertid, hvis f.eks. en helikase benyttes for denaturering, eller hvis en termostabil polymerase benyttes for forlengelse, så kan alle reagensene bli tilsatt fra start, eller, alternativt, hvis rnolare forhold reagenser er en følge av reaksjonen, kan reagensene erstattes periodevis ettersom de uttømmes i syntesereaksjonen.

De som er erfarne i feltet vil vite at PCR-fremgangsmåten utføres vanligvis som en automatisk fremgangsmåte med et termo-stabilt enzym, i denne fremgangsmåte blir temperaturen i reaksjonsblandingen variert gjennom et område for denaturering, et "primer"-bindingsområde og et reaksjonsområde. En maskin (termocykler) som er spesifikt tilpasset for bruk med et termostabilt enzym, er tilgjengelig kommersielt.

De som er erfarne i feltet vil også være klar over problemet med forurensning av PCR på grunn av forøket nukleinsyre fra tidligere reaksjoner. Fremgangsmåter for å redusere dette problemet tillater enzymdegradering av ethvert forøket DNA fra tidligere reaksjoner. PCR-forøkningen utføres i nærvær av dUTP i stedet for dTTP. Det resulterende dobbelt-kjedede uracil-innholdende produktet, blir så degradert ved hjelp av uracil N-glykosylase (UNG), mens normalt tymin-inne-holdende DNA ikke er degradert av UNG. Tilsetting av UNG til forøkningsreaksjonsblandingen før reaksjonen startes, degraderer alt uracil-inneholdende DNA som kan tjene som mål. Fordi den eneste kilde til uracil-inneholdende DNA er det forøkte produktet av en tidligere reaksjon, steriliserer denne fremgangsmåten effektivt reaksjonsblandingen, og fjerner derved problemet med forurensning fra tidligere reaksjoner (overføring). UNG inaktiveres midlertidig ved hjelp av varme, slik at denatureringstrinnene i forøknings-fremgangsmåten også tjener til å inaktivere UNG. Nye forøkningsprodukter, selv om de innbygger uracil, blir derfor dannet i et UNG-fritt

miljø og blir ikke degradert.

Probehybirdisering er et annet viktig område for den foreliggende oppfinnelse med tanke på vellykket utførelse. Oligonukleotidprobene i den foreliggende oppfinnelse hybridiserer spesifikt med et spesielt område i SOD-genet til en organisme som skai påvises og identifiseres, og har tilstrekkelig destabiliserende feil i forhold til sekvensene fra andre organismer i tilfellet med genus-spesifikke prober, og andre arter fra samme genus, i tilfellet med arts-spesifikke prober.

Probene i oppfinnelsen kan benyttes til å bestemme hvis nukleinsyresekvenser er tilstede i en prøve, ved å bestemme hvis probene binder til sekvensene som er tilstede i prøven. Passende målemetoder for å påvise hybrider mellom probene og nukleinsyresekvensene i en prøve i henhold til den foreliggende oppfinnelse, er kjent i feltet. F.eks. kan påvisning utføres ved hjelp av Southern blotting og væske-hybridisering ved bruk av dot-blot-format. I dot-blot-formatet blir den ikke-merkede forøkte prøven bundet til fast underlag, slik som en membran, membranen inkuberes med en merket probe under passende hybridiseringsbetingelser, den ikke-hybirdiserte proben fjernes ved vask, og filteret undersøkes med tanke på bundet probe. Når mange prøver analyseres med få prober, slik som i tilfellet der prøvene undersøkes med tanke på tilstedeværelse av nukleinsyre fra en bestemt genus ved bruk av genus-spesifikke prober, er dot-blot-formatet ganske nyttig.

En alternativ fremgangsmåte er ganske anvendbar når et stort antall ulike prober benyttes. Denne fremgangsmåte er en "revers"-dot-blot, hvor den forøkte sekvensen inneholder en markør, og proben bindes til det faste underlaget. I dette format blir de ikke-merkede prøvene bundet til membranen og blandet med den merkede prøven under passende hybridiserings-betingelser. Ikke-hybridisert merket prøve blir så fjernet ved vasking under passende betingelser, og filteret blir så undersøkt med tanke på bundne sekvenser. Fordi artsbestemmelse krever anvendelsen av mange arts-spesifikke prober for hver forøket prøve, blir det reverse dot-blot-formatet det foretrukne format for denne undersøkelse.

Alternativt kan det være ønskelig å benytte en påvisningsfremgangsmåte som har mange probehydridiseringsseter eller brønner. F.eks. blir et fast underlag slik som en mikrotiterplate, spesielt nyttig i stor-skala-klinisk anvendelse av de foreliggende fremgangsmåter. Fremgangsmåter for hybridiseringsinnfangning av PCR-forøket DNA eller fast underlag er kjente. I én utførelsesform av de fremgangsmåtene, blir det forøkte mål-DNA merket (f.eks. med biotin) under forøkningen i PCR-reaksjonen. Det merkede DNA blir spesifikt fanget ved hjelp av hybridisering til PCR-produkt med en mål-spesifikk oligonukleotid-innfangingsprobe som har blitt bundet til mikrotiter-platebrønnen. Det bundne produkt blir passende påvist ifølge markørtypen som benyttes. F.eks., hvis biotin blir benyttet som markør, blir avidin-MRP-kompleks tilsatt og blir reagert med enten (a) hydrogenperoksydsubstrat og O-fenylendiamin- (OPD) kromogen eller (b) hydrogenperoksydsubstrat og tetrametylbenzidin-kromogen (TMB). Et målbart farge-signal utvikles og tillater den kvantitative påvisning av det PCR-forøkte DNA.

Ifølge laboratoirepraksis kan påvisningsfremgangsmåter ved bruk av mikrotiter-skål stadardiseres innenfor et vidt område med mål. Det kan være nødvendig å bestemme individuelt de passende hybridiserings- og stringensbetingelsene for å sikre maksimal spesifisitet under hensyntagen til probelengden som benyttes.

I et annet passende målsystem, blir en merket probe tilsatt under PCR-forøkningsprosessen. Enhver probe som hybridiserer til mål-DNA under hvert syntesetrinn, degraderes ved hjelp av 5' til 3'-eksonukleaseaktivitet av polymerasen som benyttes for å katalysere "primer"-forlengelse. Degraderingsproduktet fra proben påvises deretter. Således, tilstede-værelsen av degraderingsproduktet viser at hybridiseringen mellom proben og mål-DNA forekom.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et sett reagenser for å forøke en del av et gen som koder for superoksyddismutase (SOD), spesielt en SOD av en myko-bakterieart, så vel som reagenssett for påvisning av mykobakteriearter og for å differensiere blant ulike arter som tilhører mykobakteiregenus.

Reagensutvalgene for forøkningen omfatter "primerne" ifølge den foreliggende oppfinnelse, dvs. et par universelle "primere" og/eller et par "primere" som passer for forøkning av en del av SOD-genene i ulike arter som tilhører en spesiell genus, spesielt et "primer-par som passer for forøkningen av en del av SOD-genene fra mykobakterieartene. De kan også valgfritt inneholde en DNA-polymerase, dvs. én av de forannevnte DNA-polymerasene, og/eller substratnukleosidtrifosfatene nevnte ovenfor, og/eller de passende bufferne for PCR. I tillegg til de ovenfor nevnte komponentene, kan reagensutvalget også inneholde instruksjoner for å utføre forøkningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Reagensutvalgene for å påvise en mykobakterieart omfatter én eller flere genus-spesifikke prober, spesielt en gruppe genus-spesifikke prober ifølge den foreliggende oppfinnelse. I noen tilfeller kan probene bindes til en passende underiagsmembran. Andre valgfrie komponenter i metoden omfatter, f.eks. hjelpemidler for å merke og/ eller påvise markør (f.eks. et avidin-enzym-konjugat og enzymsubstrat og kromogen, hvis markøren er biotin), og de passende bufferne for hybridiseringsreaksjoner. I tillegg til de ovenfor nevnte komponentene, kan reagensene også inneholde instruksjoner for å utføre påvisningen ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Reagensutvalgene for å skille mellom ulike arter tilhørende mykobakteriegenus, omfatter én eller flere arts-spesifikke prober. I noen tilfeller kan probene bindes til en passende underiagsmembran. Andre valgfrie komponenter i metoden omfatter f.eks. hjelpemidler som benyttes til å merke og/eller påvise markør (f.eks. et avidin-enzymkonjugat og enzymsubstrat og kromogen hvis markøren er biotin), og passende buffere for hybridiseringsreaksjoner. I tillegg tii de ovenfor nevnte komponentene, kan reagenssettet også inneholde instruksjoner for å utføre differensieringsundersøkeisene.

Utvalgene av reagenser for påvisning av mykobakteriearter og for å differensiere mellom ulike arter tilhørende mykobakteriegenus, kan også inneholde én eller flere av komponentene nevnt ovenfor i reagensutvalgene.

Reagensutvalgene for forøkning, påvisning og differensiering kan også inneholde positive og/eller negative kontroller. Fortrinnsvis omfatter en positiv kontroll en nukleinsyresekvens som kan forøkes ved bruk av det samme "primer-par benyttet for å forøke de ønskede målnukleinsyrene i en undersøkelsesprøve. Fremgangsmåter for å anvende en positiv kontroll med bruk av det samme "primer-par, hvor målet kan eller ikke kan være tilstede sammen med den positive kontrollen, er kjent for de som er erfarne i feltet. Fortrinnsvis blir den positive kontrollen laget slik at DNA-produktet er av en størrelse som lett kan adskilles fra målstørrelsen eller det er modifisert på måter kjent for de erfarne i feltet (mutasjoner/restriksjonsseter).

Kort beskrivelse av fi<g>urene:

Fig. I: Lokalisering av sekvens-"primerne" i SOD-genet.

Fig. 2: Dot-blot utført med immobiliserte amplikoner som ble oppnådd med de genus-spesifikke "primerne" Z26I og Z2I2, hybridisert mot proben Z303, spesifikk for M. intracellulare.

De følgende eksemplene er ment å beskrive den foreliggende oppfinnelse i mer detalj.

Eksempel I:

Forøkning av mvkobakterie- SOD- sekvenser med " primerne" Z205 og Z212

"Primerne" ble syntetisert på en MilliGen/Biosearch cyklonpluss syntesemaskin ved bruk av DNA-syntesemetoden for sekvenser på opp til 50 nukleotider (Millipore GmbH, Eschborn FRG). Oligonukleotidene ble eluert fra patronene med 25% NH4OH, tørket i vakuum, og løst opp uten ytterligere opprensning til en endelig konsentrasjon på 20 //M.

Omtrent I ng av tidligere renset kromosomalt DNA fra mykobakterieartene opplistet i tabeil la og ikke-mykobakterie-artene opplistet i tabell 2a, ble forøket ved hjelp av PCR med det følgende repeterte mønster i en Thermocycler 480 (Perkin Eimer). Oppvarming i 5 min. ved 98°C (første denaturering), avkjølt til 55°C før tilsetting av 5 U Taq-polymerase (Perkin Eimer AG, Kusnacht, Sveits), og gjentatt 35 ganger i 30 sek. ved 94°C (denaturering), 30 sek. ved 37-55°C (binding), 30 sek. ved 72°C (forlengelse) og stopp i 10 min. ved 72°C.

En standard PCR-reaksjon besto av: 10 //I I0X buffer (100 mM Tris; pH=8,3 ved romtemperatur; 500 mM KCI; 15 mM MgCI2; 0,015% gelatin), 16 //I deoksyribo-nukleotidblanding (1,25 //mol av dATP; dGTP; dCTP; dTTP), 5 jul "primer Z205 (20 fjM), 5 jj "primer Z2I2 (20 //IM), 10 pl DNA som skal forøkes og 53 //I H20. 10 fj\ av de forøkede blandingene bfe satt på 1% agarosegeler og adskilt ved 200 V, ved bruk av 123 bp og I kb-stige som størrelsesstandarder (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg). Etter passende adskillelse ble gelene farget med etidiumbromid og fotografert. For ytterligere eksperimentelle detaljer se: Molecular Cloning, 1989, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis; (eds.); Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Resultatene er samlet i tabellene la og 2a; en"+" betyr at et synlig forøknings-produkt (amplicon) ble oppnådd. Ved bruk av "primer-paret Z205 og Z2I2 ved en hybridiseringstemperatur på 37°C, ga alle DNA-preparatene fra 27 ulike arter av mykobakterier som ble testet (oppført i tabell la) og alle de 106 ikke-mykobakterie-artene oppført i tabell 2A, synlige forsterkningsprodukter (amplicons) på fargede geler. Det hyppigste (og i de fleste tilfeller det eneste synlige fragmentet) var et DNA-fragment som gikk sammen med det forventede amplikon fra M. tuberculosis på 489 bp som omfattet området 188 til 678 i M. tuberculosis-sekvensen. Derfor kan <n>primer"-paret Z205 og Z2I2 bli ansett som universelle "primere".

Eksempel 2:

Kloning og sekvensering av PCR- produktene ( amplicons) fra utvalgte bakterier ved hielo av " primerne" Z205 oo Z2I2

Området som tilsvarte posisjonene 188 til 666 i SOD-genet fra M. tuberculosis i de 9 mykobakterieartene og i de 4 ikke-mykobakterieartene oppført nedenfor, ble forøket ved bruk av "primer"-paret Z205 og Z2I2. Amplikonene ble deretter klonet og sekvensert som beskrevet heretter: M. tuberculosis (ATCC 1400); M. avium (ATCC 25291); M. intracellulare (DSM 43223); M. scrofulaceum (ATCC 19981); M. kansasii (DSM 43224); M. fortuitum (ATCC 6841); M. simiae (ATCC 25275); M. gordonae (DSM 610); M. xenopi (ATCC 19250); Corynebacterium diphteriae (ATCC 11913); Corynebacterium pseudodiphteriticum (RC 181); Nocardia asteroides (ATCC 43005); og Actinomyces viscosus (ATCC 15987).

Detaljer i fremgangsmåtene kan finnes i den tidligere refererte laboratorie-håndbok: "Molecular Cloning". Omtrent I ng kromosomait DNA fra 13 organismer oppført ovenfor, ble forøket som beskrevet i eksempel I. De mulige ulike endene til PCR-amplikonene ble fylt inn ved bruk av fire deoksynukleotider (dNTP) og Klenow-polymerase. Ikke-inkorporerte "primere" og dNTP'er ble adskilt fra amplikonene ved å fortynne reaksjonen og føre løsningen over i en Quiagen tupp 5, ved å følge instruksjonene til produsenten (Diagen, Dusseldorf, FRG). Det isolerte og uttette DNA ble løst opp og fosforylert ved bruk av en 5'-endemerkingskrtt (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, FRG). De fylt-i og kinaserte amplikonene ble adskilt ved hjelp av elektroforese på NuSieve GTG-agarose (FMC, BioProducts Europe, Vallensbaek Strand, Danmark) og amplikonene som gikk sammen med det 489 bp-fragmentet til M. tuberculosis, ble skåret ut. DNA ble gjenvunnet fra gelbitene og renset ved hjelp av Quiagen-tupp 5 som beskrevet ovenfor. Bunnfallet som ble oppnådd etter utfelling, ble løst opp, mengdebestemt og benyttet for sammenbinding.

Plasmid pUC 19 ble spaltet fullstendig med Smal, fenol-ekstrahert, utfeltog løst opp før det ble defosforylert med kalvetymus-alkalinfosfatase. Vektor-DNA ble igjen fenolekstrahert, utfelt og fortynnet til omtrent I ng///l. Vektor-DNA og alle enzymene som ble benyttet i vektor-fremstillingen, var fra Boehringer Mannheim

(Mannheim, FRG).

u

Det spaltede, defosforylerte vektor-DNA ble bundet til de rensede SOD-amplikonene i 18 timer ved 22°C ved bruk av I U T4-ligase. DH5a-kompetente celler (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA) bie transformert med 2-5 jul av ligaseblandingen etter instruksjoner gitt av produsenten og sådd ut på LB-agar med

X-gal, IPTG og ampicillin (for detaljer se "Molecular Cloning").

Fra hver transformasjon av de 13 klonede amplikonene, ble 10 rekombinante (fargeløse) kolonier plukket og dyrket i 200 jul LB-medium og sådd ut i en brønn i en mikrotiterskål. Et urent DNA-preparat ble laget ved bruk av koke-fryse-fremgangsmåten, og passende fortynninger av DNA-løsningen ble forøket uten videre opprensning ved hjelp av PCR ved bruk av pUC-sekvensering og reverssekvenseirngs-"primere" (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG). To brønner fra hver av de 13 ulike forøkningene som inneholdt plasmider med den forventede innskuddsstørrelsen på 592 bp (103 bp stammer fra det multiple kloningssete og 489 bp fra SOD-amplikonet), ble benyttet for videre sekvensering. Rekombinante plasmid-DNA fra to uavhengigekloner fra hver av de 13 ulike organismene ført opp ovenfor, ble renset ved bruk av Quiagen "plasmid"-maksi-kitt (Diagen, Dusseldorf, FRG) og sekvensert ved hjelp av dideoksy-fremgangsmåten ved bruk av pUC-sekvensanalysen som bruker S<3S> etter instruksjonene gitt av produsenten (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG).

Posisjonen av "primerne" benyttet for sekvensering er vist i fig. I. Ved siden av de to "primerne" som bandt i det multiple kloningssete til pUCI9 (pUC forover og pUC revers), ble de samme to "primerne" som ble anvendt for kloning (Z205 og Z2I2), anvendt i sekvensreaksjonene. For alle myobakteire-artene og Nocardia asteroides, ble to ytterligere forover-"primere" (Z256 og Z243) og én revers-"primer" (Z244) benyttet. Denne strategi tillot perfekt overlappende avlesning av sekvens-gelene med kun omtrent 150 bp som ble lest fra enhver reaksjon. Posisjonene til "primerne" som var spesifikke for sekvenseringen av SOD-amplikonene fra den gjenværende fellesbakterie (Z257 og Z245 for C. diphteriae, Z258 og Z247 for C. pseudodiphteriticum og Z246 for A. viscosus), er også vist i fig. I. Sekvensen til alle sekvens-"primere<D> innenfor SOD-genet, er gitt i tabetl 3. Siden "primer"-Z2l2 inneholder to tilfeldige baser, var det mulig å sikre seg at to uavhengige kloner ble sekvensert fra hver av de 13 artene.

Et total på 29,1 bp ble lest fra de 26 klonene som stammet fra 9 mykobakterie-og 4 ikke-mykobakteriearter. De overensstemmende sekvensene er vist i tabllene 4-16.

Eksempel 3:

Sammenligning av SOD- sekvenser for å bestemme mvkobakterie- spesifikke PCR-" primere"

Hver av SOD-sekvensene vist i tabellene 4-16, ble tilpasset for å tillate sammen-ligning med hverandre for å identifisere områdene med uttalt homologi blant medlemmene til myko-bakteriegenus og uttalt heterogenitet når de ble sammenlignet med de tilsvarende områdene fra ikke-mykobakteriearter. GCG-programmet (Genetics Computer Croup Sequence Analysis software, versjon 7.1, Dervereux et al., NAR 12,387-395 (1984); GAP-Alignment) ble benyttet for jevnførelse.

På denne måte kunne "primere" som var spesifikke for alle de 27 artene til mykobakteiregenus, bli avledet og som tillot forøkning av den delen av deres SOD-kodende sekvenser som var omgitt av "primerne" som bandt til de konserverte områdene. Disse konserverte områdene i mykobakteriegenus viser et antall feiltilpasninger når de sammenlignes med de tilsvarende områdene for de fire sekvenserte ikke-mykobakterieartene. Derfor ville "primere" valgt ut fra disse kriteriene, mest sannsynlig hindre forøkning av ikke-mykobakteriearter.

"Primer"-sekvensene som ble valgt (Z26I og Z2I2), var en av flere kombinasjoner som var testet for deres evne til å forøke i alt 27 arter mykobakterier (tabell la), men ingen av de 93 ikke-mykobakteriemål-DNA'ene (tabell 2a). Én av de to "primerne" (Z2I2) ble benyttet for å forøke både mykobakterie- og ikke-mykobakteire-DNA'ene. Sekvensen til Z2I2 tilsvarer posisjonene 677-655 innenfor SOD-genet til M. tuberculosis. Den diskriminerende forøkning av DNA fra mykobakterie- og ikke-mykobakterie-arter hviler derfor på "motprimeren" Z26I (posisjonene 245-269 i SOD-genet til M. tuberculosis). Sekvensen av Z26I sammen med feiltilpasningene i de 9 sekvenserte artene til mykobakteriegenus og de 4

utvalgte ikke-myko-bakterieartene er vist i tabell 17. Med innføringen av to feilbaser (posisjonene 249 og 264) forefinnes maksimum to feiltilpasninger med de 9 sekvenserte mykobakteireartene. De siste 5 nukleotidene i 3'-enden til "primeren" er konserverte blant alle de 9 sekvenserte mykobakteriene.

Eksempel 4:

Forøkning med aenus- spesifikke " primere" Z26I oa Z2I2

Ved bruk av DNA fra M. tuberculosis, er amplikonene som ble oppnådd med "primer"-paret Z26I/Z2I2,434 bp lange. Bindingstemperaturen for genus-spesifikk forøkning ble optimalisert ved bruk av DNA M. tuberculosis, M. intracellulare, C. diphteriae, Nocardia asteroides og humant DNA som representative undersøkelses-DNA'er ved bruk av PCR-standardbetingelser beskrevet i eksempel I. De følgende temperaturer ble undesøkt: 37°C, 45°C. 50°C, 55°C, 58°C, 60°C, 64°C, 67°C og 70°C; amplikonene sett med ikke-mykobakterie-DNA ved ikke-stringente temperaturer (37°C og 45°C) begynner å forsvinne ved høyere bindingstemperaturer (>58°C). Ved 64°C kan en serie fragmenter fremdeles bli sett med humant DNA som ikke er tilstede ved 67°C. Enten 60 eller 67°C ble benyttet med "primer"-paret Z26I og Z2I2. Den synlige mengde av amplikoner var høyere ved 60°C, skjønt 67°C var en bedre diskriminerende temperatur. Den optimale magneisumkonsentrasjon ble funnet å være 1,5 mM. Derfor var den endelige repeterte protokollen for genus-spesifikke "primere" (Z261 og Z2I2) som følger oppvarm i 5 min. til 98°C, avkjøl til 55°C, tilsett I pl Taq (5U) og forøk i 35 cykluser, 30 sek. hver, 94°C, 60 eller 67°C, 72°C, etterfulgt av en 10 min. inkubasjon ved 72°C.

Resultatene er satt sammen i tabellene la og 2a; en"+" viser at synlige amplikoner ble oppnådd, og en"-" viser at ingen eller meget få amplikoner ble funnet. Alle 27 mykobakterieartene ble forsterket med genus-spesifikke "primere" Z26I og Z2I2 som bekreftet ved gelelektroforese ved bruk av en bindingstemperatur på 67°C (tabell la). Imidlertid, signalene som ble oppnådd fra geler med M. gadium, M. marinum og M. haemophilum, var svake sammenlignet med signalene fra de andre 24 artene. Etter at repitisjonstiden ble øket til I min., ble synlige signaler også oppnådd med disse tre arter.

"Primerne" Z26I og Z2I2 forøket ikke 102 av 106 ikke-mykobakteriearter (tabell 2a) som bedømt ut i fra fravær av synlige signaler på agarosegeler. For å sikre at

den riktige mengde av forsterkbart materiale ble tilsatt PCR-reaksjonen, ble alle DNA'ene undersøkt (og funnet positive) parallelt med "primer"-paret Z205 og Z2I2. Fire bakteriearter ga svake signaler på geler med de PCR-betingelsene som var benyttet, nemlig: Edwadsiella tarda, Ewingella americana, Klebsiella pneumoniae og Salmonella hautena. Imidlertid svarte ingen av amplikonene fra disse fire artene med hensyn til størrelse og intensitet, til amplikonene som ble oppnådd med mykobakterie-DNA.

Eksempel 5:

Utvelgelse av genus- spesifikke prober

Sekvensene som ble oppnådd ved å forøke de 9 mykobakterie- og 4 ikke-mykobakterie-DNA'ene med de genus-spesifikke "primerne" Z26I og Z2I2 (tabellene 4-16), ble sammenstilt og analysert for områder med maksimal homoiogi med mykobakteriene og maksimal heterogenitet overfor ikke-mykobakterie-artene. Den genus-spesifikke proben som tilslutt ble utvlagt, dekker posisjonen 382 til 421 i M. tuberculosis-sekvensen. Den vanlige sekvensen er vist i tabell 18, sammen med feiltilpasningene tilstede i de sekvenserte ikke-myko-bakterieartene. Bare to feiltilpasninger opptrer i Nocardia asteroides, men dette DNA forøkes ikke under betingelsene som er beskrevet for den genus-spesifikke PCR-"primer" Z26I og Z2I2, på grunn av 11 feiltilpasninger. I stedet for å innføre et total på 14 gale baser for å dekke alle feiltilpasningene i de 9 sekvenserte artene fra mykobakterier (tabell 18), valgte vi å syntetisere hver av de genus-spesifikke oligoene hver for seg, hvilket resulterte i en gruppe på 8 oligonukleotider (M. intracellulare og M. xenopi er gruppert sammen), hvor hver av de individuelle probene er tilstede i ekvimolare mengder. Sekvensen til oligoene som utgjorde den genus-spesifikke samling av prober, er vist i tabell 19. Probe Z3I0 påviser M. tuberculosis, Z3II både M. intracellulare og M. xenopi, Z3I2 M. avium, Z3I3 M. gordonae, Z3I4 M. forturtum, Z3I5 M. scrofulaceum, Z3I6 M. simiae og Z3I7 M. kansasii.

Eksempel 6:

Hybridisering med aenus- spesifikke prober

Den genus-spesifikke gruppe av prober (tabell 19) ble merket som følger: (80 pmol av en ekvimolar blanding av de 8 probene (Z3I0-Z3I7) ble merket i 5'-enden til en spesifikk aktivitet på omtrent 3 x l0<7>///g ved bruk av 100 TCi <32>P-r ATP (10 mCi/ml; 5000 Ci/mmol) ved å følge instruksjonene som er gitt av produsenten for 5'-inn-merkningsanalysen (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG). Den ikke-innbyggede markør ble fjernet ved bruk av en Biospin 6 søyle (BioRad, Richmond, USA). 20 pl alkalidenaturert PCR-blandinger som ble oppnådd med de genus-spesifikke "primerne" Z26I og Z2I2 fra de 27 mykobakteireartene (tabell la) og 106 ikke-mykobakteriearter (tabell 2a), ble fortynnet med 100 pl TE-buffer og satt ut på forhånd fuktet fast underlag ("Gene Screen plus"-filtere; Du Pont de Nemours, Bad Homburg, FRG) ved bruk av en 96-brønn-manifold (Schleicher & Schuell, Dassel, FRG). Filterne ble kryssbundet i en Stratagene UV-binder (Stratagene, La Jolla, USA) og forhånds-hybridisert i et 50 ml Falcon-rør som inneholdt 5 ml prehybridiseirngsløsning (6 X SSC, 10 mM natrium-fosfat pH 6,8,1 mM EDTA pH 8,0, 1% SDS, denaturert laksemelke-DNA 100 pg/ml). Forhåndshybridisering ble utført ved 60°C i 60 min. i en roterende hybridiseringsovn. Prehybridiseringsvæsken ble helt av og erstattet av 5 ml hybridiseirngsløsning (3 M tetrametylammoniumklorid, 10 mM natriumfosfat pH 6,8,1 niM EDTA pH 7,6,0,5% SDS, denaturert laksemelke-DNA 100 pg/ml og 5-8 x IO<6> cpm merket genus-spesifikke prober. Detaljer fra bufferfremstilling kan finnes i "Molecular Cloning"-kompendiet som er referert til tidligere. Hybridisering ble utført i 3-16 timer ved 65°C. Filterne ble vasket i 4 x 15' min. i forhåndsoppvarmet (70°C) 2 x SSC/0,2% SDS ved 70°C før autoradiografi i 1-2 timer ved -70°C ved bruk av forsterkningsfiltere.

Resultatene er satt sammen i tabellene la og 2a; en "+" viser at et hybridiseirngs-signal ble oppnådd, og en"-" viser at ikke noe hybridiseringssignal ble oppnådd. Den genus-spesifikke gruppe prober (Z3I0-Z3I7) ble benyttet for å under-søke alle 27 mykobakteireartene (tabell la). Gruppen gjenkjente alle 9 sekvenserte arter mykobakterie (tabellene 4-12), og spesifikt: M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulære, M. fortuitum, M. scofulaceum, M. gordonae, M. simiae, M. xenopi og M. kansasii. I tillegg blir de følgende 13 ikke-sekvenserte arter mykobakterier gjenkjent med den genus-spesifikke probegruppe: M. africanum, M. acapulcensis, M. bovis, M. brunense, M. chelonai, M. flavescens, M. marinum, M. gastri, M. terrae, M. triviale, M. nonchromaticum, M. oboense og M. smegmatis (vist ved"+" i tabell la). Svakere signaler ble oppnådd under de beskrevne hybridiseringsbetingelser med: M. haemophilum, M. gadium, M. szlugai og M. plei (vist ved"(+)" i tabell la). Intet signal ble sett med M. rhodensiae (vist ved"(-)" i tabell la).

Ingen av amplikonene som ble oppnådd med genus-spesifikke "primere" Z26I og Z2I2 fra de ikke-mykobakterieartene oppført i tabell 2a (som ikke var synlig på geler), så vel som de 4 artene som ga svake synlige signaler på geler, se eksempel 7, ble påvist med gruppen av genus-spesifikke prober (Z3I0-Z3I7). Resultatene er oppsummert i tabell 2a.

Eksempel 7:

Identifisering av spesifikke prober

Sekvensene fra amplikonene som ble oppnådd ved å forøke de 9 mykobakterie-DNA'ene med genus-spesifikke "primere" Z26I og Z2I2 (tabellene 4-12), ble sammen-lignet som beskrevet i eksempel 3, og hver av mykobakteriesekvensene ble analysert en etter en for områder med sterk heterogenitet når de ble sammenlignet med de gjenværende mykobakteriesekvensene. På denne måte kunne arts-spesifikke sekvenser bli identifisert og analysert eksperimentelt. Områdene som viste numerisk det høyeste tall feiltilpasninger (maksimal heterogenitet i tilpasningsprogrammet som ble benyttet), viste seg ikke alltid å være områdene som ga de mest diskriminerende hybridiseringsresultatene. Det er også bemerkelsesverdig at antallet feikilpasninger mellom én sekvens sammenlignet med de andre, avhenger av kriteriene som benyttes for sammen-ligninger. Posisjonene gitt for de arts-spesifikke probene refererer seg til sekvensene som de stammer fra

(tabellene 4-12), og ikke til tallene som er gitt dem i de ulike sammenligningspro-g rammene.

Eksempel 7. 1:

M. tuberculosis- spesifikk probe

Tre regioner ble valgt med følgende sekvenser (tabell 4):

Z302, Z336 og Z337 ble merket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot filtere der 28 mykobakterieamplikoner (26 forskjellige arter) laget med Z26I og Z2I2, var festet. Hybridiseringstemperaturen var 70°C for Z302 og 60°C for de andre to probene. Hybridiseringen ble utført i 1-16 timer, vasketemperaturen var 80°C for Z302,65°C for Z337 og 60°C for Z336. Filmene ble utviklet i 1-3 timer.

Proben Z302, som er 37 nukleotider lang, gjenkjente under disse betingelser kun M. tuberculosis og de nære slektninger som var kombinert i et "makroområde"

(macrocluster) (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1974, 8. utgave, Waverly Press Inc., Baltimore, R.E. Buchanon + N.E. Gibbons (eds.)) med M. bovis, M. bovis BCG og M. africanum. De gjenværende 23 mykobakteireartene oppført i tabell Ib, ble ikke gjenkjent av Z302, heller ikke noen av de 106 ikke-mykobakterie-artene oppført i tabell 2b.

Probe Z336 representerer de siste 26 nukleotidene på 3'-enden til den opp-rinnelige proben Z302. Den trunkerte proben Z336 hybridiserte kun til M.tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG og M. africanum under de modifiserte betingelser som er beskrevet. Ingen kryssreaksjon er observert med de gjenværende 23 mykobakterie-artene oppført i tabell lb, heller ikke med noen av de 106 ikke-mykobakterieartene oppført i tabell 2b.

Z337 (en probe på 22 nukleotider) plassert mot enden av den sekvenserte delen av SOD-genet, er spesifkk for M. tuberculosis-M. bovis-M. africanum-komplekset og kryssreagerer ikke med de gjenværende 23 mykobakteireartene oppført i tabell Ib, heller ikke med noen av de 106 ikke-mykobakterieartene oppført i tabell 2b.

Skjønt spesifisiteten til de tre probene Z302, Z336 og Z337 er sammenlignbar, foretrekkes probene Z336 og Z337 på grunn av den lavere vaksetemperaturen.

Eksempel 7. 2:

M. avium- M. brunense- spesifkk probe

Regionen 423-459 (tabell 5) ble valgt med følgende sekvens:

Z30I ble merket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter på hvilket mykobakterieamplikoner som ble oppnådd med Z26I og Z212, var immobiiisert. Hybridisering ble utført i 1-16 timer ved en temperatur på 70°C for Z30I, vasketemperaturen var 80°C for Z30I. Filmene ble utviklet i 3 timer. Med M. avium-M. brunense-spesifikk probe Z30I, ble amplikonene fra M. avium gjenkjent sammen med amplikonene fra M. brunense (n = 6; amplikoner stammet fra det samme utgangs-DNA-preparatet). Det er ikke noe sekvensresultater som er tilgjengelige for M. brunense og det var således ikke mulig å utføre noen rasjonell probekonstruksjon for denne arten. Det kan ikke fullstendig utelukket på dette punkt at stamløsningen av M. brunense faktisk var forurenset med M. avium-amplikoner. Inntil nye stam-løsninger av M. brunense dyrkes opp, blir forøket og sekvensert Z30I beskrevet som en probe som gjenkjenner både M. avium og M. brunense. Z30I gjenkjente ikke noen av de andre mykobakterieartene oppført i tabell Ib. Igjen, ingen av de undersøkte ikke-mykobakterie-DNA'ene oppført i tabell 2 b, kryssreagerte med den M. avium-M. brunense-spesifikke proben.

Eksempel 7. 3:

M. intracellulare- spesifikk probe

Området 416-452 (tabell 6) ble valgt med følgende sekvens:

Z303 ble endemerket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som ble oppnådd med bruk av Z26I og Z2I2. Hybridiseringen ble utført ved 60°C i 16 timer, vasketemperatur var 70°C, og filmene fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. En prøve på spesifisiteten til den arts-spesifikke proben valgt for M. intracellulare, er vist i fig. 2 (16 timers fremkalling), og resultatene er oppsummert i tabell Ib.

Arrangementene av DNA på filteret var som følger:

Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterieartene reagerte under de samme betingelsene som beskrevet ovenfor for mykobakteireartene.

Eksempel 7. 4:

M. scrofulaceum- spesifikk probe

Området 501-537 (tabell 7) ble valgt med den følgende sekvens:

Z306 ble merket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som ble oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 70°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 80°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. Z306 hybridiserte bare til M. scrofulaceum-DNA, men ikke til noen av de andre mykobakteriene ført opp i tabell Ib. Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-DNA'ene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. scrofulaceum-spesifikke proben.

Eksempel 7. 5:

M. kansasii- spesifikk probe

Området 546-567 (tabell 8) ble valgt med den følgende sekvens:

Z340 ble merket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter)som var oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 60°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 65°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. Z340 hybridiserte kun til M. kansasii-DNA, men ikke til noen av de andre mykobakteriene oppført i tabell Ib. Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-DNA'ene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. kansasii-spesifikke proben.

Eksempel 7. 6:

M. fortuitum- soesifikk probe

Området 500-521 (tabell 9) ble valgt med den føglende sekvens:

Z369 var endemerket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som var oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 60°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 70°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. Z369 hybridiserte kun til M. fortuitum-DNA, men ikke til noen av de andre mykobakteriene oppført i tabell Ib. Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-DNAene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. fortuitum-spesifikke proben.

Eksempel 7. 7:

M. simiae- spesifikk probe

Området 360-396 (tabell 10) ble valgt med den følgende sekvens:

Z304 ble merket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6 mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som var oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 70°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 80°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. 2304 hybridiserte kun til M. simiae-DNA, men ikke tii noen av de andre mykobakteriene oppført i tabell Ib. ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-DNA'ene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. simiae-spesifikke proben.

Eksempel 7. 8:

M. gordonae-spesifikk probe

Området 507-531 (tabell II) ble valgt med den følgende sekvens:

Z366 ble endemerket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6, mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som var oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 60°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 70°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. Z366 hybridiserte kun til M. gordonae-DNA, men ikke til noen av de andre mykobakteriene oppført i tabell Ib. Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-DNA'ene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. gordonae-spesifikke proben.

Eksempel 7. 9:

M. xenopi- spesifikk probe

Området 280-316 (tabell 12) ble valgt med den følgende sekvens:

Z309 ble endemerket og hybridisert som beskrevet i eksempel 6, mot et filter der det var festet 28 mykobakterie-amplikoner (fra 26 ulike arter) som var oppnådd med Z26I og Z2I2. Hybridisering ble utført ved en temperatur på 70°C i 1-16 timer, vasketemperaturen var 80°C, og filmene ble fremkalt etter 3 timer, 6 timer og 16 timer. Z309 hybridiserte kun til M. xenopi-DNA, men ikke til noen av de andre mykobakteriene oppført i tabell Ib. Ingen av de 106 undersøkte ikke-mykobakterie-

DNA'ene oppført i tabell 2b, kryssreagerte med den M. xenopi-spesifikke proben.

Liste over tabeller

Tabell la:

Mykobakteriearter, deres opprinnelse, forøkning med de universelle "primerne" Z205 og Z2I2, forøkning med de genus-spesifikke "primerne" Z26I og Z2I2, og hybridisering med den genus-spesifikke probegruppe Z3I0-Z3I7.

Tabell Ib:

Mykobakteriearter, deres opprinnelse og hybridisering med de spesies-spesifikke probene Z30I (M. avium/M. brunense); Z337, Z336 og Z302 (M. tuberculosis); Z303 (M. intracellulare); Z304 (M. simiae); Z340 (M. kansasii); Z306 (M. scrofulaceum); Z366 (M. gordonae); Z369 (M. fortuitum); og Z309 (M. xenopi).

Tabell 2a:

Ikke-mykobakteriearter, deres opprinnelse, forøkning og de universelle "primerne" Z205 og Z2I2, forøkning med de genus-spesifikke "primerne" Z26I og Z2I2, og hybridisering med den genus-spesifikke probegrupper (Z3I0-Z3I7).

Tabell 2b:

Ikke-mykobakteriearter, deres opprinnelse og hybridisering med de spesies-spesifikke probene nevnt ovenfor i tabell Ib.

Tabell 3:

Sekvens til "primerne" benyttet i sekvensering av amplikonene som ble oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2 etter kloning i pUC 19.

Tabell 4:

DNA-sekvens til amplikonene som ble oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. tuberculosis.

Tabell 5:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket

er en del av SOD-genet til M. avium.

Tabell 6:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. intracellulare.

Tabell 7:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. scrofulaceum.

Tabell 8:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. kansasii.

Tabell 9:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet tii M. fortuitum.

Tabell 10:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. simiae.

Tabell II:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. gordonae.

Tabell 12:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til M. xenopi.

Tabell 13:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til Corynebacterium diphteriae.

Tabell 14:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til Corynebacterium

pseudodiphtheriticum.

Tabell 15:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z212, hvilket er en del av SOD-genet til Nocardia asteroides.

Tabell 16:

DNA-sekvens til amplikonene oppnådd med "primerne" Z205 og Z2I2, hvilket er en del av SOD-genet til Actinomyces viscosus.

Tabell 17:

Sekvens til konsensus-"primeren" Z26I og feiltilpasningene i de 9 sekvenserte artene i mykobakteiregenus, de 4 sekvenserte ikke-mykobakteireorganismene, så vel som den tilsvarende delsekvens avledet fra E. coli- og det humane SOD-genet.

Tabell 18:

Overensstemmende felles- (konsensus) sekvens til den genus-spesifikke proben for mykobakterier, feiltilpasningene i de 4 sekvenserte ikke-mykobakterie organismene, så vel som den tilsvarende delen av sekvensen avledet fra E. coli- og det humane SOD-genet. Sekvensen til de individuelle oligonukleotidene som utgjør den genus-spesifikke gruppe, er også oppført.

Claims

1. Fremgangsmåte for detektering av patogene og ikke-patogene organismer fra slekten Mycobacterium, karakterisert ved at den omfatter (a) amplifisering av en målregion av et superoksyd-dismutase (SOD)-gen til en organisme ved anvendelse av et par primere spesifikke for slekten Mycobacterium som består av en første primer inneholdende sekvensen ifølge sekv. id. no. 3 (Z261) som primingsekvens og en andre primer inneholdende sekvensen ifølge sekv. id. no.

2 (Z212) som priming-sekvens, (b) kontakting av amplifisert målsekvens med minst én oligonukleotid probe som har evne til å hybridisere til målregionen av SOD-genet; og (c) detektering av hybrider dannet mellom den amplifiserte målregionen, om noen, og oligonukleotidproben.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at målregionen blir amplifisert ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved atoligo-nukleotidproben har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er vesentlig konservert blant SOD-genene til forskjellige arter innenfor slekten Mycobacterium.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen 5-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY -3' (sekv. id, no. 4) hvori symbolet H angir en T, C eller A, symbolet M angir en A eller C, symbolet N angir en A, C, G eller T, symbolet S angir en C eller G, symbolet V angir en A, C eller G og symbolet Y angir en C eller T, eller en sekvens komplementær hertil som hybridiserende sekvens.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte probe inneholder en sekvens valgt fra gruppen bestående av sekvensene ifølge sekv. id. no. 5 (Z3I0), sekv. id. no. 6 (Z3II), sekv. id. no. 7 (Z3I2), sekv. id. no. 8 (Z3I3), sekv. id. no. 9 (Z3I4), sekv. id. no. 10 (Z3I5), sekv. id. no. II (Z3I6) og sekv. id. no. 12 (Z3I7), og sekvenser komplementære med hver av de foregående sekvenser, som hybridiserende sekvens.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at oligonukleotidproben har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er variabel i en grad som muliggjør differensiering blant SOD-genene til forskjellige arter innenfor slekten Mycobacterium.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet til slekten M. intracellulare.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 13 (Z303) eller en sekvens komplementær hertil.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet til slekten M. avium og M. brunense.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte proble inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 14 (Z301) eller en sekvens komplementær hertil.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har en evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. gordonae.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 15 (Z366) eller en sekvens komplementær hertil.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. simiae.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 16 (Z304) eller en sekvens komplementær hertil.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. tuberculosis.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 17 (Z336), sekv. id. no. 23 (Z337) eller sekv. id. no. 22 (Z302) eller en sekvens komplementær hertil.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. xenopi.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte probe inne-holder sekvensen ifølge sekv. id. no. 18 (Z309) eller en sekvens komplementær hertil.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. kansasii.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 19 (Z340) eller en sekvens komplementær hertil.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. scrofulaceum.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 20 (Z306) eller en sekvens komplementær hertil.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte probe har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. fortuitum.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte probe inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 21 (Z369) eller en sekvens komplementær hertil.

25. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er vesentlig konservert blant SOD-genene til forskjellige arter som hører til siekten Mycobacterium, med sekvensen 5'-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3' (sekv. id. no. 4), hvori symbolet H angir en T, C eller A, symbolet M angir en A eller C, symbolet N angir en A, C, G eller T, symbolet S angir en C eller G, symbolet V angir en A, C eller G, og symbolet Y angir en C eller T, eller en sekvens komplementær hertil.

26. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en region av målsekvensen som er vesentlig konservert blant SOD-genene fra forskjellige arter som hører til slekten Mycobacterium, med en sekvens valgt fra gruppen bestående av sekvensene ifølge sekv. id. no. 5 (Z3I0), sekv. id. no. 6 (Z3II), sekv. id. no. 7 (Z3I2), sekv. id. no. 8 (Z3I3), sekv. id. no. 9 (Z3I4), sekv. id. no. IO (Z3I5), sekv. id. no. II (Z3I6) og sekv. id. no. 12 (Z3I7), og sekvenser komplementære med hver av de foregående sekvensene.

27. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. intracellulare og som inne-holder sekvensen iføige sek. id. no. 13 (Z303) eller en sekvens komplementær hertil.

28. Oligonukleotid, karakterisert ved at det evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra slekten M. avium og M. brunense og som inneholder sekvensen ifølge sekv. id. no. 14 (Z301) eller en sekvens komplementær hertil.

29. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. gordonae og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 15 (Z366) eller en sekvens komplementær hertil.

30. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. simiae og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 16 (Z304) eller en sekvens komplementær hertil.

31. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. tuberclosis og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 17 (Z336), sekv. id. no. 23 (Z337) eller sekv. id. no. 22 (Z302) eller en sekvens komplementær hertil.

32. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. xenopi og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 18 (Z309) eller en sekvens komplementær hertil.

33. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. kansasii og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 19 (Z340) eller en sekvens komplementær hertil.

34. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. scrofulaceum og som inne-holder sekvensen ifølge sek. id. no. 20 (Z306) eller en sekvens komplementær hertil.

35. Oligonukleotid, karakterisert ved at det har evne til å hybridisere til en species-spesifikk region av SOD-genet fra arten M. fortuitum og som inneholder sekvensen ifølge sek. id. no. 21 (Z369) eller en sekvens komplementær hertil.

36. Probe, karakterisert ved at den omfatter et oligonukleotid ifølge krav 25 som hybridiserende sekvens.

37. Gruppe prober, karakterisert ved at de omfatter oligonukleotidene ifølge krav 26 som hybridiserende sekvenser.

38. Probe, karakterisert ved at den omfatter et oligonukleotid ifølge hvilke av kravene 27-35 som hybridiserende sekvens.

39. Primer, karakterisert ved at den omfatter som primingsekvens, en sekvens som er vesentlig homolog med sekvensen Z205.

40. Primer, karakterisert ved at den omfatter som primingsekvens, en sekvens som er vesentlig homolog med sekvensen Z212.

41. Primer-par, karakterisert ved at den første primeren omfatter sekvensen Z205 som primingsekvens, og den andre primeren inneholder sekvensen Z2I2 som primingsekvens.

42. Primer, karakterisert ved at den omfatter som primingsekvens, en sekvens som er vesentlig homolog med sekvensen Z261.

43. Primer-par, karakterisert ved at den første primeren omfatter sekvensen Z261 som primingsekvens, og den andre primeren inneholder sekvensen Z2I2 som primingsekvens.

44. Sett av reagenser for amplifisering av en del av et gen kodende for en superoksyd-dismutase (SOD), karakterisert ved at det omfatter en primer ifølge krav 39 og/eller 42 og en primer ifølge krav 40.

45. Sett av reagenser for detektering av en mykobakteriell art, karakterisert ved at det omfatter en probe ifølge krav 36 eller 37.

46. Sett av reagenser for differensiering blant forskjellige arter som hører slekten mykobakterier, karakterisert ved at det omfatter en probe ifølge krav 38.

47. Sett av reagenser ifølge krav 45 eller 46, karakterisert ved at det videre omfatter en primer ifølge krav 39 og/eller 42 og en primer ifølge krav 40.