KR101275585B1 - 티미딘 키나아제 활성을 결정하는 방법 및 키트 및 그의용도 - Google Patents

티미딘 키나아제 활성을 결정하는 방법 및 키트 및 그의용도 Download PDF

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Abstract

혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액(CSF), 흉수, 복수, 조직, 세포 및 그 추출물과 같은 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 방법 및 분석 키트가 개시된다. 본 발명의 방법은 완충액에서, 고체 표면에 부착된 프라이머 및/또는 주형, 키나아제 효소 기질인 브로모데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 플루오로데옥시우리딘 또는 비닐데옥시티미딘과 같은 변형된 데옥시 뉴클레오시드, 포스페이트 공여체, 뉴클레오티드 중합효소, 및 효모 추출물과 같은, TK 활성이 결여된 키나아제 효소원을 포함하는 기본 반응 혼합물(Basic Reaction Mixture)를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 인큐베이션 후에, 상기 고체 표면에 부착된 프라이머 및/또는 주형으로 결합된 변형된 데옥시 뉴클레오시드의 양이 결정되고 상기 생물학적 시료에 존재하는 TK 활성은 상기 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양에 직접적으로 비례한다. 상기 방법 및 키트는 암과 같은, 세포-증식 장애 또는 질환의 진단, 질병의 진행 및 치료 효과의 예후를 모니터링하고, 티미딘 포스페이트의 형성을 차단하거나 또는 핵산합성을 방해할 수 있는 효소 경로에 영향을 미치는 화합물, 예를 들면, 신규한 약물 후보를 스크리닝하기에 유용하다.
티미딘 키나아제(TK), 세포-증식 장애(질환), 티미딘 포스페이트

Description

티미딘 키나아제 활성을 결정하는 방법 및 키트 및 그의 용도{A method and kit for determination of thymidine kinase activity and use thereof}
본 발명은 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 비-방사성(non-radioactive) 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 암 및 특정한 바이러스 감염과 같은, 세포-증식(cell-proliferation) 장애 또는 질병의 진단, 모니터링 및 예후 및 티미딘 모노포스페이트의 형성을 차단하고 및/또는 인산화 후 핵산의 합성을 방해할 수 있는 효소 경로에 영향을 미치는 화합물, 예를 들면, 신규한 약물 후보의 스크리닝에 유용하다.
세포 분열 전에, 유전 정보를 담고 있는 DNA는 DNA-중합효소에 의해 복제되어야 한다. 이는 다른 필요한 성분들 중에서도, 다량의 기질의 존재, 즉, 4 종의 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시 티미딘 트리-포스페이트(TTP, 도 2C)의 존재를 필요로 한다. TTP는 도 1에 예시된 경로에 따라 신생으로(de novo) 합성된다. 또한, 포유동물 및 다수의 다른 종들은 G1-S 세포 주기 단계에서만 발현되고 티미딘(T, 도 2A)을 티미딘 모노-포스페이트(TMP, 도 2B)로 인산화하는 것에 의해 대사로 재사용하는 TK를 코딩한다(도 1)(1, 검토). 배양 중인 세포의 DNA로 결합(incorporate)된 방사성 T의 결정이 전통적으로 세포 분열 속도의 척도로서 이 용되었다. 1980년대에 건강한 개체 및 다양한 종양 질환을 앓는 환자로부터 유래된 인간 혈장 또는 혈청 내의 TK 활성이 보고되었다(2, 3). 건강한 개체의 경우, 척수액에서 TK 활성의 부재가 관찰되었고, 뇌종양 환자의 경우, 다양한 수준들이 관찰되었다(4). 그 이후, TK 분석은 임상 의학 분야에서, 특히, 상이한 혈액암(blood malignancies)과 연계되어 보다 일반적이 되었다(5-10).
TK를 코딩하는 두 개의 세포 유전자가 존재하며, 세포 분열에서 주요한 형태인 TK1은 혈청 내로 s-TK로 분비된다. 이는 종양 질환에서 혈청에서 과다 발현되는 형태이고 본 발명에 따른 분석을 포함한 대부분의 현행의 분석을 이용하여 측정된다. TK2 형은 미토콘트리아에만 존재한다. 미토콘트리아에 국한되는 것 외에, TK2는 또한 TK1과 상이한 기질 스펙트럼 및 동역학적 파라미터를 갖는다(1).
현재까지 상업적으로 이용 가능한 혈청 TK(s-TK) 분석 절차에 포함된 방사성(radioactivity)은 임상 의학에서 그의 보급 및 이용을 제한했다(2). 생체 내에서 종양 세포 분열의 정도와 직접적으로 상관관계를 갖기 때문에, s-TK는 태아 항원(foetal antigen) 또는 분화된 세포에 의해 특이적으로 생성되는 산물의 과다-발현에 의해 종양의 존재를 표시하는 다수의 종양 마커에 대한 보완물(complement)이다. 예를 들면, 전립선 특이 항원(PSA)은 과다량의 전립선 세포의 조기 마커이고, 항원의 수준 증가는 TK 활성 증가보다 오래 전에 검출된다. 그러나, 종양이 탈-분화(de-differentiate)되기 시작하고 보다 빠르게 성장하기 시작하면, PSA 항원(칼리크레인(Kalllikrein) 3)은 사라지고 반면에 증가된 s-TK 활성이 관찰된다(11). 따라서, 치료를 받거나 또는 치료를 받지 않는 환자에서 종양 세포 복제를 모니터 링하기 위한 용도 외에, s-TK 활성 및 그 동역학의 변화는 치료적 요법의 변화에 대한 필요성의 측면에서 환자를 선별한다. 환자의 결과(outcome)에서 주어진 s-TK 수준의 중요성은 상이한 종양 종류 간에 다르며 적용된 치료법의 종류, 환자의 연령 및 s-TK 마커를 임상 의학에서 유용한 다변량(multivariate) 모델에 포함되는 중요한 마커로 만드는 다양한 인자들과 연관된다(12).
전술된 바와 같이, 종래 기술에서, TK는 그 활성에 의해서 또는 TK1 단백질(24 kd 유전자 발현 크기)의 물리적 존재를 검출하는 절차에 의해 검출되었다(13). 후자의 절차는 활성 효소 및 비활성 효소를 모두 검출한다. 따라서, 이와 같은 단백질-검출 분석은 s-TK 활성과 상관관계가 낮다. TK1은 세포 주기의 G1기 내지 S기, 즉, 세포 분열 시에만 활성이고, 반면에, TK1 단백질, 또는 그의 분해 생성물은 상이한 반감기를 갖기 때문에, 이는 예상치 못한 현상은 아니다. 따라서, TK 활성을 측정하는 첨단 기술만이 본 명세서에서 다루어질 것이다.
일반적으로, 모든 TK 활성 분석은 포스페이트 공여체(phosphate donor)(예를 들면, 아데노신 트리-포스페이트, ATP) 및 Mg2+(또는 Mn2+)의 존재 하에 분석대상 시료와 T 또는 그의 유사체의 인큐베이션(incubation)으로 구성된다. 그 후, 생성물, 즉, TMP 또는 T-유사체 모노포스페이트의 양은 하기와 같이 결정된다:
A) 앞서 기술된 TK 활성 분석에서, 3H-표지된 티미딘(T)을 기질로 이용하였다. TMP는 디-에틸 아미노 에틸(DEAE)-충진된(charged) 여과지에 결합되었고, 상기 여과지는 미사용 T 기질을 제거하기 위해 그 후 세척되었다. 상기 여과지를 건조한 후에, 베타-카운터(beta-counter)로 3H 방사성을 측정하였다. 그러나, s-TK를 세포 증식에 대한 마커로 이용하는 것에 대한 지속적인 관심을 반영하는 방사성 테스트가 여전히 개발되고 있다.(14).
B) 상업적으로 이용가능한 Prolifigen®TK-REA(DiaSorin S.p.A. Saluggia, Italy) 분석에서, 방사성 요오도-데옥시 우리딘(125IdU)을 TK에 대한 기질로 이용한다. 모노-인산화 생성물; 요오도-데옥시 우리딘 모노-포스페이트(125IdUMP)는 스스로 침전하는(self-sedimenting) 수산화알루미늄(Al(OH)3)에 결합시키는 것에 의해 분리하고, 뒤이어 미사용 125IdU를 제거하기 위해 수산화 알루미늄을 세척한다. 그 후, 감마-카운터로 Al(OH)3 분말에 결합된 125IdU 방사성을 측정한다 (2, 3).
C) 최근에 발표된 비-방사성 TK 분석(15, 16)은 TK 활성을 정량하기 위한 유사한 기술을 개시한다. 이 분석들에서, 아지도-티미딘(AZT, 도 2D) 또는 브로모-데옥시 우리딘(BrdU, 도. 2A)이 기질로서 이용되고, 각각으로부터 형성된 모노포스페이트(AZTMP 또는 BrdUMP, 도 2B)를 제2의 96 웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 웰의 바닥에 고정된 항-AZTMP 또는 항-BrdUMP 항체에 대한 효소-표지된 AZTMP 또는 BrdUMP의 결합과 경쟁하는 반응 용액의 능력을 분석하는 것에 의해 정량하였다(즉, 경쟁적 ELISA에 의한 검출).
방사성을 피하기는 하나, 현재까지 알려진 비-방사성 분석은 낮은 수준의 TK 를 포함하는 생물학적 시료를 분석하기에 충분히 효율적으로 보이지 않으며, 이는 분석되는 시료 중에 보다 많은 양의 TK 생성물을 요구하는, 결합된 추적자(tracer)의 감소를 측정하기 때문이다(15, 16). 이는 청년층과 장년층 간에 3배를 초과하는 차이를 가질 수 있는 정상적인 범위에서, 특히, 척수액, 흉수, 복수 및 기타 체액과 같은 측정가능한 기준 수준이 결여된 생물학적 시료에서 TK 분석이 이용되는 경우, TK 활성의 양호한 해상도를 방해한다.
최근에, TMPK, NdK 단독, 또는 TK와 조합된 TMPK, NdK를 보완하는 활성을 이용하는 TMPK, NdK 또는 TK 유전자가 결실된 신규한 재조합 숙주세포주가 개시되었다. 본 발명은 재조합 세포주를 생성하는 방법 및 키나아제 경로에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포주를 포함하는 키트에 관한 것이다(17).
본 발명은 원하는 경우, 용이하게 자동화될 수 있는, 민감한 비-방사정량식(non-radiometric) 티미딘 키나아제 분석을 제공한다. TK 생성물은 고체 기판 상에 고정화되도록 직접 처리되고 TK 활성 수준은 이차 측정을 위한 시료의 이동 없이, 예를 들면, ELISA 절차(18)를 이용하여 직접 정량된다.
상기 신규한 방법은 생물학적 시료, 예를 들면, 체액 시료에서 티미딘 키나아제(TK)(ATP: 티미딘-5'-포스포트랜스퍼라아제: E.C. 2.7.1.21) 활성을 정량한다. 상기 방법은 생물학적 시료, 예를 들면, 체액 또는 조직 또는 세포 시료에서 및 순수한 재조합 TK 동질효소(isozyme)에서 단순하고, 저비용이며, 정확하고, 고도로 민감한 TK 활성의 결정을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 방법으로서, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 고체 표면에 부착된 프라이머 또는 주형으로 포함하는 용기에서, 완충액에 담긴, 주형 및/또는 프라이머인 부착되지 않은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 키나아제 효소 기질인 변형(modified) 데옥시 뉴클레오시드, 포스페이트 공여체(phosphate donor), 뉴클레오티드 중합 효소 및 TK 활성이 결여된 키나아제 효소원(enzyme source)을 포함하는 기본 반응 혼합물(Basic Reaction Mixture)을 상기 생물학적 시료와 접촉시키고, 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계,
부착되지 않은 반응 인큐베이션을 제거하기 위해 상기 인큐베이션된 혼합물을 선택적으로 세척하는 단계,
상기 고체 표면에 부착된 프라이머 또는 주형으로 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양을 결정하는 단계, 및
상기 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양으로부터 상기 생물학적 시료에 존재하는 TK 활성을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 표현 "TK 활성이 결여된(devoid of TK activity)"은 TK 활성이 존재하더라도 그 양이 너무 낮아서 본 발명의 방법의 수행을 방해하지 않을 것이라는 것을 의미하도록 의도된다.
또한, 결정된 TK 활성은 결합된(incorporated) 변형 뉴클레오시드의 양에 비례하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 구체예에서, 인큐베이션된 혼합물은 세척되고 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양의 결정은 상기 인큐베이션된 혼합물에 상기 변형 데옥시 뉴클레오시드에 대해 친화성을 갖는 표지된 친화성 분자를 첨가하고, 상기 표지를 이용하여 부착된 표지된 친화성 물질의 양을 결정하는 것에 의해 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양을 결정하는 단계에 의해 이루어진다.
본 발명의 방법의 일 구체예에서, 상기 키나아제 효소원은 TK 활성이 결여된 포유동물 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 균류(fungal) 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 세균 세포주 추출물, 정제된 포유동물 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제(TMPK) 및 뉴클레오시드 디-포스페이트 키나아제(NdK)의 조합, 정제된 균류 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합, 정제된 세균 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합, 재조합 포유동물 TMPK와 재조합 포유동물 NdK의 조합, 재조합 균류 TMPK와 재조합 균류 NdK의 조합, 및 재조합 세균 TMPK와 재조합 세균 NdK의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 키나아제는 전술된 조합으로 상이한 출처로부터 유래될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 효소원은 효모 세포 추출물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 추출물이다.
또 다른 구체예에서, 결합된 변형 뉴클레오시드는 상응하는 변형 데옥시 뉴클레오시드로부터 유래된다.
또 다른 구체예에서, 변형 데옥시 뉴클레오시드 키나아제 효소 기질은 브로모데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 플루오로데옥시우리딘 및 비닐데옥시티미딘으로부터 선택되고, 바람직하게는 브로모데옥시우리딘이다.
바람직한 구체예에서, 고체 표면은 플라스틱 표면, 예를 들면, 플라스틱 마이크로타이터 플레이트이다. 그러나, 고체 표면은 친화성 분자가 부착될 수 있는 또 다른 재료, 예를 들면, 플라스틱 비드, 자성 비드, 및 칩 또는 비드인 아가로오스 또는 실리카 표면일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 고체 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 그의 5'-말단을 통해 부착되거나 또는 활성화된 플레이트의 이미다졸을 이용하여 고정된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 분석되는 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액(CSF)(4), 흉수, 복수, 조직, 세포 및 그 추출물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 조직 및 세포 시료는 세포질 또는 핵 추출물 시료를 의미한다.
본 발명은 또한 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 분석 키트로서, 수개의 개별 용기에, 프라이머 및/또는 주형인 고체 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및/또는 주형인 부착되지 않은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 키나아제 효소 기질인 변형 데옥시 뉴클레오시드, 포스페이트 공여체, 뉴클레오티드 중합 효소 및 티미딘 키타아제(TK) 활성이 결여된 키나아제 효소원, 및 완충액을 포함하는 분석 키트에 관한 것이다.
본 발명의 분석 키트의 바람직한 구체예에서, 키트는 분석의 표준화를 위한 기준 TK를 포함한다. 적합한 기준의 예들은 종양 질환을 갖는 포유동물로부터 유래한 혈청, 및 동물 혈청에 현탁된 증식 세포이다.
본 발명의 분석 키트의 또 다른 바람직한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 웰 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 마이크로타이터 플레이트를 더 포함한다(18).
본 발명의 키트의 또 다른 구체예에서, 분석 키트는 변형된 데옥시 뉴클레오시드에 대한 친화성을 갖는 표지된 친화성 분자, 바람직하게는 효소 표지된 친화성-컨쥬게이트(enzyme labelled affinity-conjugate), 예를 들면, 알칼리 포스파타아제 또는 양고추냉이 과산화효소(horseraish peroxidase)로 표지된 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 분석 키트의 일 구체예에서, 키나아제 효소원은 TK 활성이 결여된 포유동물 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 균류 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 세균 세포주 추출물, 정제된 포유동물 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제(TMPK) 및 뉴클레오시드 디-포스페이트 키나아제(NdK)의 조합, 정제된 균류 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합, 정제된 세균 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합,재조합 포유동물 TMPK와 재조합 포유동물 NdK의 조합, 재조합 균류 TMPK와 재조합 균류 NdK의 조합, 및 재조합 세균 TMPK와 재조합 세균 NdK의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 키나아제는 전술된 조합으로 상이한 출처로부터 유래될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 효소원은 효모 세포 추출물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비시애의 추출물이다.
본 발명은 또한 포유동물, 특히 인간에서, 암 또는 특정한 바이러스 감염과 같은 세포-증식 장애 또는 질환의 진단, 모니터링 및/또는 예후에서 본 발명의 방법 및/또는 분석 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 티미딘 포스페이트의 형성을 차단할 수 있는, 효소 경로에 영향을 미치는 화합물, 예를 들면, 신규한 약물 후보의 스크리닝에서 본 발명의 방법 및/또는 분석 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 마지막으로 전술된 두 양태는 선택적인 방법으로, 즉, 본 발명에 따른 방법 및/또는 본 발명에 따른 분석 키트를 포함하는, 포유동물, 특히, 인간에서 암 또는 특정한 바이러스 감염과 같은 세포-증식 장애 또는 질환의 진단, 모니터링 및 예후에 유용한 방법, 및 본 발명에 따른 방법 및/또는 본 발명에 따른 분석 키트를 포함하는, 티미딘 포스페이트의 형성을 차단하거나 또는 핵산의 합성을 방해할 수 있는 효소 경로에 영향을 미치는 화합물, 예를 들면, 신규한 약물 후보의 스크리닝에 유용한 방법으로 기재될 수 있다.
본 발명의 방법의 중요한 특징은 체액 시료에서 TK 활성의 결정이 TK 활성이 결여된 세포 추출물을 이용하여 달성된다는 것이다. BrdUMP 결합의 바람직한 고체상 면역검출(solid phase immunodetection)과 조합된 이 특징은 현행의 방사성 방법(Prolifigen® TK-REA, DiaSorin S. p. a. Saluggia, Italy)(2, 3) 및 기재된 비-방사성 방법(15, 16)과 관련된 문제를 모두 극복한다. 본 발명은 혈청 TK 활성을 검출하는 비-방사성 방법 및 키트를 제공할 뿐 아니라, 본 발명은 또한 수행하기가 간단하고 강건하며(robust) 진단 목적을 위해 분석적으로 유용한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 일어나는 인산화 단계를 위해, 완충액에 담긴 기본 반응 혼합물(Basic Reaction Mixture) 내에 포스페이트 공여체가 존재해야 한다는 절대적인 요구가 있다. 포스페이트 공여체로서, 여러 뉴클레오티드 트리-포스페이트, 특히, ATP가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 선택은 고체 표면 상의 프라이머/주형 시스템의 성장하는 사슬로 결합되지 않을 뉴클레오티드이다. 포스페이트 공여체로서 리보-트리-포스페이트 뉴클레오티드를 이용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 완충액 내에서, 시료를 주형 및/또는 프라이머인 고체 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 주형 및/또는 프라이머인 비-부착(non-attached) 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 및 TK 활성이 결여되어 생물학적 시료가 유일한 TK의 출처를 제공하게 하는 세포 추출물을 포함하는 기본 반응 혼합물과 접촉시키는 단계에 의해 생물학적 시료의 TK 활성을 결정하는 방법이 제공된다. 그 후, 생물학적 시료의 TK 활성은 고체 표면에 부착된 새로 합성된 이중 가닥 핵산에 중합효소에 의해 결합된 변형 뉴클레오시드의 양, 예를 들면, 중합효소-주도 고체상 결합(polymerase-directed solid phase incorporation)에 의해 결합되고, 결합된 BrdU에 대한 효소-항체 컨쥬게이트를 이용하여 검출되는 BrdUMP의 양의 결정에 의해 결정된다.
바람직한 구체예에서, TK 활성이 결여된 추출물은 진핵 세포의 추출물로부터 유래한다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 상기 추출물은 포유동물 세포의 추출물로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, TK 활성이 결여된 추출물은 예를 들면, 친화성 정제(affinity purification)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법을 이용하여 정제된 포유동물 세포 추출물로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, TK 활성이 결여된, 추출물은 예를 들면, 대장균과 같은 적합한 세균 숙주에서 발현된 클로닝된 효모 TMPK 및 NdK 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 재조합 세포들로부터 유래된 재조합 효소 TMPK(티미딜레이트 키나아제; EC 2.7.4.9; ATP:dTMP 포스포트랜스퍼라아제) 및 NdK(EC 2.7.4.6; 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 키나아제)를 조합하는 것에 의해 작제된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 추출물은 균류로부터 유래한다. 특히 바람직한 구체예에서, TK 활성이 결여된 세포 추출물은 빵 효모(baker's yeast)인 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래한다.
본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 TK 활성은 변형된 뉴클레오시드의 중합효소 주도 결합과 조합하여, 키나아제 효소원인 TK 활성이 결여된 세포 추출물을 이용하는 것에 의해 검출되고 결정될 수 있다는 것을 개시한다.
결합된 변형 뉴클레오시드의 양의 결정은 다수의 상이한 방법, 예를 들면, 뉴클레오시드의 변형, 예를 들면, BrdUMP에서 Br의 검출에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명은 면역학적 방법, 즉, 효소 결합 면역 분석법(ELISA)의 이용에 의해 예시된다.
따라서, 효소-표지된 친화성 컨쥬게이트가 결합된 변형 뉴클레오시드의 결정을 위해 이용되고, 이는 생물학적 시료에서 세포 증식의 수준과 관계된다. 친화성 분자의 예들은 단일클론 항체와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함한다.
본 발명은 현재 선호되는 변형 뉴클레오시드, BrdU, 및 BrdU에 대한 항체의 이용에 의해 예시되나, TK에 의해 인산화될 수 있고 따라서 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 수 개의 다른 변형된 뉴클레오시드가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 이들은 비닐데옥시티미딘, FdU 및 IdU를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(도 2A). 실제로, 마지막에 전술된 두 개의 변형된 뉴클레오시드는 본 발명의 방법에서 이용되었고 이용가능한 항-BrdU 항체 컨쥬게이트가 이 실험들에서 이미 이용되었기 때문에 이상적인 단일클론 항체의 부재 때문에 보다 긴 인큐베이션 시간을 필요로 하긴 하나, 이들은 BrdU와 유사한 결과를 제공한다.
바람직한 구체예에서, BrdUMP의 고체 표면 프라이머 주형 셋업으로의 결합을 위해 이용된 중합효소는 RNA-의존성 DNA 중합효소(RNA-directed DNA polymerase)(RNA 주형 의존성 DNA 중합효소 = 역전사효소)(RT)이고, 고체 표면에 부착된 핵산 주형은 폴리-rA(폴리리보아데닐 산)이다. 또 다른 동일하게 바람직한 구체예에서, 중합효소는 DNA-의존성 DNA 중합효소이고 고체 표면에 부착된 핵산 주형은 올리고-dA이고 프라이머는 상기 프라이머에 상보적인 보다 짧은 올리고-dT이다. 또 다른 구체예에서, 중합효소는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 임의의 중합효소이고 고체상에 부착된 주형은 호모폴리머(homopolymeric) 영역을 갖거나 또는 갖지 않는 가변(variable) DNA이고, 상기 보다 짧은 프라이머는 상기 주형의 가변 영역 또는 호모폴리머 부분에 상보적이다. 핵산이 표면에 부착하는 방식에 따라, 주형 또는 프라이머가 표면에 부착한다. 하나의 조건(provision)은 최초의 프라이머/주형 시스템을 형성하는 두 개의 리보핵산 가닥들이 있을 수 없다는 것이다.
다수의 원형(native) 및 변형된 DNA 의존성 DNA 중합효소가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다; 이들은 다양한 출처로부터 유래된 진핵세포 DNA 중합효소 알파, 대장균 DNA 중합효소 I, 대장균 DNA 중합효소 I에서 유래된 변형된 클레나우(Klenow) 단편, 원형 또는 변형된 파아지 T4 중합효소, 써모필루스 아쿠아티쿠스(Thermophilus aquaticus)로부터 유래된 원형 또는 변형된 Taq 중합효소, 써모콕쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)로부터 유래된 Vent 중합효소 및 뉴모콕쿠스 푸리오우수스(Pneumococcus furiousus)로부터 유래된 Pfu 중합효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
수 개의 원형 및 변형된 RNA-의존성 DNA 중합효소, (역전사효소 = RT)(EC: 2.7.7.49)가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다; 이들은 이 종류의 중합효소의 전형적인 예들인 알팔파 모자이크 바이러스(alfalfa Mosaic Virus) RT AMV-RT), 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus) RT (M-MuLV- RT), 유인원 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus) (SIV RT) 및 인체 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus) (HIV) RT를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주형의 길이는 바람직하게는 30 내지 300개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이고 프라이머는 바람직하게는 10 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 단백질을 폴리스티렌 플라스틱 96-웰 마이크로웰 플레이트의 고체 표면상에 공유결합에 의해 부착시키는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 폴리스티렌 표면으로의 결합은 이미자졸의 이용에 의해 촉진될 수 있으며, 이는 이 기술의 예로서 본 명세서에 포함되나 한정하지 않는다. 5'-아민 변형 올리고뉴클레오티드 프라이머를 결합(couple)시키기 위한 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCC) 활성화된 표면의 이용은 포토-커플링(photo-coupling)을 이용한 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
효소-결합 면역 측정법(ELISA)을 이용하여 시료에 존재하는 생체-분자(bio-molecule)를 측정하는 기술을 이용하는 다수의 상이한 방법들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 합텐인 BrdU에 대한 단일클론 항체는 효소인 알칼리 포스파타아제(AP)(알칼리 포스파타아제: 오르토포스포릭-모노에스테르 포스포히드롤라아제(알칼리 최적), EC 3.1.3.1.)에 접합(conjugate)된다. 그러나, ELISA 방법에 유용한 종래 기술에서 공지된 임의의 다른 효소, 예를 들면, 항-BrdU 항체에 접합된 효소, 양고추냉이 과산화효소(히드로겐 퍼옥시드 옥시도리덕타아제 EC 1.11.1.7)(HRP)가 본 발명에서 이용될 수 있다. 또 다른 방법에서, 종래 기술에서 공지된 임의의 발색단(chromatophore), 형광발색단(fluorophore), 발광단(luminophore)이 추적자(tracer) 항체, 예를 들면, 항-BrdU 항체에 접합될 수 있다. AP 또는 HRP에 대한 여러 적합한 기질들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
AP에 의한 기질인 파라-니트로 페닐 포스페이트(pNPP)의 절단은 기질의 색을 무색에서 황색으로 변화시킨다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 405 nm 파장에서 판독될 수 있다. 화학발광성(Chemiluminescent) AP 기질은 AP에 의한 탈-인산화 및 뒤이은 잔류 분자의 분해시 477nm에서 정상 상태(steady state)의 작열하는 광을 발산하는 아다만틸 1,2-디옥세탄의 유도체(예를 들면, Tropix (Bedford, MA, US)가 판매중인 AMPPD, CSPD, CDP, 및 CDP-스타 기질)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. AP에 대한 형광성 기질의 비한정적인 예는 4-메틸 움베릴페닐 포스페이트(4-MUP)이다. MUP의 탈인산화 후에, 잔류된 메틸 움베릴페릴(MU)은 370 nm 파장에서 여기된다. 발산된 형광은 형광 광도계를 이용하여 430 nm에서 검출된다.
TK 활성 고체 표면 ELISA 분석에 대한 도면.
도 1. 포유동물 세포에서 TTP 생성의 상이한 경로들.
*경로: I. 신생 대사 경로(de Novo pathway), II. 재사용 대사 경로(salvage pathway).
*관련 효소: 1. 티미딘 키나아제(TK), 2. 티미딜레이트 신타아제(TS), 3. 리보뉴클레오티드 리덕타아제(RR), 4. 티미딜레이트 키나아제(dTMPK), 5. 데옥시 리보뉴클레오시드 모노포스페이트 키나아제(dNMPK), 6. 뉴클레오시드 디포스페이트 키나아제(NDPK), 7. 말단 트랜스퍼라아제(TT), 8. RNA-의존성 DNA 중합효소(RT), 9. DNA 의존성 DNA 중합효소(DNA Pol)
*중요한 조절 인자들: A. 피드백 억제, B. 효소 데옥시우리딘-트리포스파타아제(dUTPase)에 의한 탈인산화
도 2. 티미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체의 변형
A. 뉴클레오시드
R-치환 화합물
CH3 티미딘
I 요오도-데옥시우리딘
Br 브로모데옥시우리딘
F 플루오로-데옥시우리딘
H 데옥시우리딘
B. 뉴클레오티드 모노-포스페이트
R-치환 화합물
CH3 TMP
I IdUMP
Br BrdUMP
F FdUMP
H dUMP
C. 뉴클레오티드 트리-포스페이트
R-치환 화합물
CH3 TTP
I IdUTP
Br BrdUTP
F FdUTP
H dUTP
D. 아지도티미딘
3'-치환 화합물
N3 AZT
도 3. 다양한 BrdUMP 농도를 검출하는, RT와 함께 조합된 상이한 효모 추출물 농도의 능력.
도 4. 2일(2d)의 추출물 인큐베이션 및 각각 5 마이크로리터와 1 마이크로리터의 혈장을 이용한, 본 발명(A405)에 따른 분석의 S-TK 측정 능력 및 Prolifigen? TK-REA (TK U)에 의한 상관관계.
약자
4-MUP 4-메틸 움벨리페릴 포스페이트(4-Methyl Umbelliferyl Phosphate)
Al(OH)3 수산화 알루미늄(Aluminium Hydroxide)
AMPPD 아다만틸 1,2-디옥세탄 아릴 포스페이트
(Adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate)
AP 알칼리 포스파타아제(Alkaline Phosphatase): EC 3.1.3.1;
오르토포스포릭-모노에스테르 포스포히드롤라아제(알칼리 최적)
ATP 아데노신 5'-트리-포스페이트(Adenosine 5'-Tri-Phosphate)
AZT 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(3'-azido-3'-deoxythymidine)
BrdU 브로모데옥시우리딘(BromodeoxyUridine)
BrdUMP 브로모데옥시우리딘 모노-포스페이트
(BromodeoxyUridine Mono-Phosphate)
BrdUTP 브로모데옥시우리딘 트리-포스페이트
(BromodeoxyUridine Tri-Phosphate)
CSF 뇌척수액(Cerebral Spinal Fluid)
DEAE 디-에틸 아미노 에틸(Di-Ethyl Amino Ethyl)
DTT 디티오트레이톨(Dithiothreitol)
EDCC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)
EDTA 에틸렌디아민 테트라아세트산(Ethylenediamineteraacetic acid)
EGTA 에틸렌 글리콜-비스[베타-아미노에틸 에테르]-N,N,N',N'-테트라아세 트산(Ethylene glycol-bis[beta-aminoethyl ether]-N,N,N'N'-tetraacetic acid)
ELISA 효소 결합 면역 측정법(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
FdU 플루오로데옥시 우리딘(Fluorodeoxy Uridine)
HIV 인체 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)
HRP 히드로겐 퍼옥시드 옥시도리덕타아제
(Hydrogen peroxide oxidoreductase) EC 1.11.1.7
IdU 요오도데옥시 우리딘(Iododeoxy Uridine)
NdK 뉴클레오시드 디-포스페이트 키나아제
(Nucleoside di-phosphate kinases): EC 2.7.4.6
pNPP 파라-니트로 페닐 포스페이트(para-Nitro Phenyl Phosphate)
PSA 전립선 특이 항원(Prostate Specific Antigen)
RT 역전사 효소(Reverse Transcriptase);RNA-의존성 DNA-중합 효소
(RNA-directed DNA-polymerase): EC 2.7.7.49
SIV RT 유인원 면역결핍 바이러스 역전사 효소
(Simian immunodeficiency virus reverse trancriptase)
TK 티미딘 키나아제(Thymidine kinase): EC. 2.7.1.21; ATP: 티미딘-5'-포스포트랜스퍼라아제(ATP: thymidine-5'-phosphotransferase)
TMPK 티미딜레이트 키나아제(Thymidylate kinase): EC 2.7.4.9;
ATP:dTMP 포스포트랜스퍼라아제(ATP: dTMP phosphotransferase)
TMP 데옥시티미딘 모노-포스페이트(deoxyThymidine Mono-Phosphate)
TTP 데옥시티미딘 트리-포스페이트(deoxyThymidine Tri-Phosphate)
dUTP 2'-데옥시우리딘 5'-트리-포스페이트
(2'-deoxyUridine 5'-Tri-Phosphate)
실시예 1: TK 활성을 보완하는 효모 사카로마이세스 세레비시애로부터 키나아제 추출물의 제조
보완(complement)/구제(rescue)하는 키나아제 활성을 포함하는 효모 추출물을 웁살라 효모 자원 컴피턴스 센터(Uppsala Yeast Resource competence centre) (www.yeastlab.vbiol.slu.se)와의 협업으로 제조하였다
효모 세포 추출물의 제조
200 mL의 Gal-배지(1% 효모 추출물; Bacto™Yeast Extract. DIFCO; 2% 펩톤, Bacto™Peptone, BD; 2% 갈락토오스(Sigma) 및 2% 아가(Bacto™Agar; DIFCO))에 생생한 사카로마이세스 세레비시애 균주 G116(유전자형: MATa ura3-52 his3 leu2::pLEU-lexAop6)을 접종하였다. 효모 세포를 30℃에서 밤새 배양하여 OD600 nm에서 약 1.2의 밀도에 도달하게 하였다. 그 후, 4개의 50 mL Falcon™ 폴리프로필렌 스크류 캡 튜브를 이용하여, 4℃에서 5분간 230XG로 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 펠릿을 각각 재현탁시키고 40 mL의 멸균된 냉각 MilliQ™수로 세척하고, 다시 4℃에서 5분간 230XG로 원심분리하였다. MilliQ™수를 따라내어 제거하였다. 그 후, 세포들을 피펫팅에 의해 남은 MilliQ™수에 재현탁시켰다. 50 ml Falcon™ 폴리프로필렌 스크류 캡 튜브(2.2 mL 마이크로튜브 당 약 0.8 g, Sarstedt (Cat#: 72.694.006)에 담긴 각각의 효모 현탁액을, 상기 효모 현탁액의 첨가 전에 중량을 측정한 2.2 mL 스크류 캡 튜브로 옮기고 콜드 룸(8℃)에서 2분간 230XG로 원심분리하였다. 남은 물을 따라 내어 제거하였다. 남은 펠릿의 중량을 측정하였다(2.2 mL 마이크로뷰브 당 약 0.4 g). 상기 중량을 2.2 mL 마이크로튜브의 외부에 표시하였다. 그 후, 세포들을 보완용 추출물(complementing extract)의 제조 전에 -80℃에 보관하였다.
보완용 효모 추출물의 제조
효모 세포 펠릿을 완전히 해동될 때까지(15분 내지 20분) 25-28℃에서 인큐베이션하고 효모 추출물 제조 절차 전까지 얼음 수조(ice bath)에 보관하였다. 모든 후속 작업은 콜드 룸(8℃) 설비에서 수행하였다. 0.4 g 효모 세포 펠릿을 담은 2.2 mL 마이크로튜브 각각에 마이크로튜브 용량 표면 지시기(microtube volume surface indicator)(1X 파쇄용 완충액, 표 1 참조)를 이용하여 조정된, 0.5 펠릿 용량(volume)의 3X 파쇄용 완충액을 첨가하였다. 그 후, 1 mL의 지르코늄 비드를 첨가하였다(평균 비드 직경 1 mm; Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Box 788, OK 74005, USA). 튜브에 1X 파쇄용 완충액(3X 파쇄용 완충액 = MilliQ™수로 3배 희석된 파쇄용 완충액)을 완전히 채우고(거의 넘치게 채움) 주의하면서 단단하게 마개를 막았다. 상기 튜브들을 Mini-BeadBeater-8™ 기계(Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Box 788, OK 74005, USA)에 적재하였다. 효모 세포 현탁액의 비드 비팅(bead beating)을 1분씩 5회 수행하고, 각 비팅 사이에 1 내지 2분간 얼음 수조(0℃)에서 냉각시켰다. 그 후, 세포 파편 및 비드를 10000XG로 2분간 원심분리하여 제거하였다. 상층액을 새로운 2.2 mL 마이크로튜브로 옮기고 10000XG로 5분간 원심분리하였다. 효소-함유 효모 추출물 상층액을 2.2 mL 마이크로튜브로 10 ㎕씩 분주하고 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
표 1. 1 X 파쇄 완충액(Breaking buffer)
성분
트리스-아세테이트 15O mM
포타슘 아세테이트 50 mM
글리세롤 20% v/v
EDTA 1 mM
DTT 1 mM
완전한 프로테아제 억제제 정제(Roche Inc.)
(Complete protease inhibitor tablet)		 1 정제당 75 mL-1
MilliQ™ 수 원하는 용량으로 맞춤
실시예 2: 인산화 및 고체상 주형/ 프라이머 복합체로의 결합을 통해 BrdUMP 를 검출하는, RT 와 조합된 제조된 효모 추출물의 능력
본 실험에서, 완충액에 담긴 표 2에 열거된 시약을 포함하는 기본 반응 혼합물(Basic Reaction Mixture)를 이용하였다.
표 2. BrdUMP 분석용 기본 반응 혼합물 및 완충액.
성분 최종 농도
비스-트리스 프로판 완충액 pH 7.5 20.4 mM
올리고뉴클레오티드 프라이머(odT) 0.08 ㎍/ml
스페르미딘(Spermidine) 0.1 mM
스페르민(Spermine) 0.1 mM
ATP 0.5 mM
MgCl2 10.O mM
EGTA 0.25 mM
트리톤 X-100 0.85 % v/v
DTT 7.8 mM
SIV RT lO ng mL-1
MilliQ™ 수 원하는 용량으로 맞춤
완충액에 담긴 기본 반응 혼합물을 각 성분의 스톡 용액으로부터 제조하고, 고정화된 폴리-rA를 갖는 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다(3개의 플레이트를 준비함).
효모 추출물을 22-25℃에서 해동시키고 사용 전까지 얼음 수조에 보관하였다. 추출물을 5배씩 연속적으로 희석하고 25 ㎕의 최고 농도(top concentration)를 A행(row)에 첨가하고 그 다음 농도를 B행에 첨가하는 식으로 준비하였다. BrdUMP를 1.3 x 10-5M에서 개시하여 1.3 x 10-11M에서 종료하도록 10배씩 연속적으로 희석하였다. 최고 농도는 실시예 1에 기재된 제제보다 250X 낮은 농도에 해당한다. 최고 농도를 96-웰 플레이트의 1열(column)에 있는 웰에 첨가하고 다음 농도를 2열에 있는 웰에 첨가하는 식으로 준비하였다. 또한, BrdUMP를 포함하지 않는 열을 각 플레이트에 포함시키고, 그 후에 플라스틱 접착 테이프(Fasson S695, cat. no. SH 236269, Nunc Denmark)를 덮고 밀봉하였다. 그 후, 3 개의 플레이트를 모두 33℃에서 인큐베이션하였다. 제1 플레이트를 인큐베이션 3시간 후에 세척하고 -20℃에 두었다. 제2 플레이트를 인큐베이션 24시간 후에 세척하고 -20℃에 두고, 제3 플레이트를 인큐베이션 48시간 후에 세척하고 -20℃에 두었다. 상기 플레이트들을 -2O℃로부터 꺼내고 4 X 1L의 세척용 완충액(Wash-Buffer) pH 8.6(3 mM Tris-HCI, 0.01 % Tween-20, 0.5% Triton X-100,0.25% EtOH CavidiTech AB, Uppsala Sweden)으로의 4회의 순차적인 침수(submersion)에 의해 세척하였다. 고체 표면으로 결합된 BrdUMP를 시각화하기 위해, 100㎕의 추적자 (AP, 즉, 항-BrdUMP 단일클론 항체에 접합된 알칼리 포스파타아제, RT product Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Sweden)를 각 웰에 첨가하고 33 ℃에서 90분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들을 다시 4 X 1L의 세척용 완충액(Wash-Buffer) pH 8.6(3 mM Tris-HCI, 0.01 % Tween-20, 0.5% Triton X-100,0.25% EtOH CavidiTech AB, Uppsala Sweden)으로의 4회의 순차적인 침수에 의해 세척하였다. 세척 후에, pNPP 기질 0.5 mgmL-1, 200 mM Tris-HCl pH 9.8에 담긴 1 mM MgCl2를 포함하는 용액 125 마이크로리터를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 인큐베이션하였다. OD405에서의 흡광도를 5분 후 및 24시간 이하 동안 상이한 간격 후에 w1=405 및 w2=630 nm로 설정된 이중 파장(dual wavelength)의 필터를 이용하여 Syva Micro Trak® EIA 판독기로 측정하였다.
각 웰에 대해, 5분 후 판독의 흡광도를 보다 나중의 판독 시점에서의 흡광도로부터 차감하였다. 그 후, 흡광도의 결과값(present)의 사용된 효모 추출물의 양 및 BrdUMP 농도에 대한 관계를 도시(plot)하였다. 도 3에 의하면, 신호는 보다 많은 양의 효모 추출물이 이용되면 증가된다는 것을 알 수 있다. 최저 1.3 x 10-11 M 의 BrdUMP 농도를 검출하였다. 도 3 참조.
실시예 4: 준비된 BrdUMP 검출 시스템의 s- TK 활성을 측정하는 능력 및 방사성 TK 분석에 대한 상관관계.
본 실험을 위해, Prolifigen? TK-REA (Cat# 324250/50 tablets, Diasorin S.p.A, Saluggia, Italy)에 따라 정상적인 혈청 TK 활성(예를 들면, <5U)에서 매우 높은 TK 활성(> 800 U) 범위의 20개의 상이한 혈청을 선택하였다. 표 2에 따라 완충액에 담긴 기본 반응 혼합물을 준비했으나, 최종 농도 2.5 x 10-5 M의 BrdU를 첨가하고, 효모 추출물을 실시예 2에 주어진 최고 농도보다 12X 낮은 농도까지 첨가하였다. 완충액에 담긴 상기 기본 반응 혼합물 125 ㎕를 고정화된 폴리-rA를 갖는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
혈청을 완충액에 담긴 기본 반응 혼합물로 1:5부터 1:625까지 5배씩 연속적으로 희석하였다. 각 혈청 희석액 25 ㎕를 완충액에 담긴 기본 반응 혼합물을 담고 있는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고, 즉, 각 환자 혈청의 5, 1, 0.2, 0.04 ㎕에 해당하는 용량을 분석하였다.
그 후, 플레이트를 플라스틱 접착 테이프(Fasson S695, cat. no. SH 236269, Nunc Denmark)로 밀봉하고 33℃에서 2일간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 4 X 1L의 세척용 완충액 pH 8.6(3 mM Tris-HCI, 0.01 % Tween-20, 0.5% Triton X-100,0.25% EtOH CavidiTech AB, Uppsala Sweden)으로의 4회의 순차적인 침수에 의해 세척하였다. 고체 표면으로 결합된 BrdUMP를 시각화하기 위해, 100㎕의 추적자 (AP, 즉, 항-BrdUMP 단일클론 항체에 접합된 알칼리 포스파타아제, RT product Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Sweden)를 각 웰에 첨가하고 33 ℃에서 90분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들을 다시 4 X 1L의 세척용 완충액(Wash-Buffer) pH 8.6(3 mM Tris-HCI, 0.01 % Tween-20, 0.5% Triton X-100,0.25% EtOH CavidiTech AB, Uppsala Sweden)으로의 4회의 순차적인 침수에 의해 세척하였다. 세척 후에, pNPP 기질 0.5 mgmL-1, 200 mM Tris-HCl pH 9.8에 담긴 1 mM MgCl2를 포함하는 용액 125 마이크로리터를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 인큐베이션하였다. OD405에서의 흡광도를 pNPP 기질의 첨가 5분 후 및 24시간 이하의 시간 동안 상이한 간격 후에 w1=405 및 w2=630 nm로 설정된 이중 파장의 필터를 이용하여 Syva Micro Trak? EIA 판독기로 측정하였다.
각 웰에 대해, 5분 후 판독의 흡광도를 보다 나중의 판독 시점에서의 흡광도로부터 차감하였다. ELISA 판독기의 판독 범위 내에 있는 판독값을 이용하여 A405값을 시간당 A405값으로 재환산하였다. 각각 1 ㎕ 및 5 ㎕의 환자 혈청에 대한 결과가 도 4에 도시되며, 상기에서 흡광도는 기존의 방사성 Prolifigen? TK-REA (Cat# 324250/50 tablets, Diasorin S.p.A, Saluggia, Italy)에 따라 혈청 내에 존재하는 TK 활성과 연관되었다. 결과는 본 발명에 따른 분석과 기존의 방사성 Prolifigen? TK-REA 간의 강한 상관관계를 보여준다.
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Claims (24)

  1. 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 방법으로서,
    단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 고체 표면에 부착된 프라이머 또는 주형으로 포함하는 용기에서, 주형 또는 프라이머인 부착되지 않은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 키나아제 효소 기질인 변형 데옥시 뉴클레오시드, 포스페이트 공여체, 뉴클레오티드 중합 효소 및 TK 활성이 결여된 키나아제 효소원(enzyme source)을 포함하는, 완충액에 담긴 기본 반응 혼합물(Basic Reaction Mixture)을 상기 생물학적 시료와 접촉시키고, 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계,
    상기 고체 표면에 부착된 프라이머 또는 주형으로 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양을 결정하는 단계, 및
    상기 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양으로부터 상기 생물학적 시료에 존재하는 TK 활성을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 부착되지 않은 반응 성분을 제거하기 위해 상기 인큐베이션된 혼합물을 세척하는 단계를 더 포함하고, 상기 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양의 결정은 상기 인큐베이션된 혼합물에 상기 변형 데옥시 뉴클레오시드에 대한 친화성을 갖는 표지된 친화성 분자(affinity molecule)를 첨가하고, 상기 표지를 이용하여, 부착된 상기 표지된 친화성 분자의 양을 결정하는 것에 의해 결합된 변형 데옥시 뉴클레오시드의 양을 결정하는 단계에 의해 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 키나아제 효소원은 TK 활성이 결여된 포유동물 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 균류(fungal) 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 세균 세포주 추출물, 정제된 포유동물 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제(TMPK)와 뉴클레오시드 디-포스페이트 키나아제(NdK)의 조합, 정제된 균류 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합, 정제된 세균 세포 추출물로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합, 재조합 포유동물 TMPK와 재조합 포유동물 NdK의 조합, 재조합 균류 TMPK와 재조합 균류 NdK의 조합, 및 재조합 세균 TMPK, 재조합 세균 NdK의 조합, 및 전술된 출처로부터 유래된 TMPK와 NdK의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키나아제 효소원은 효모 세포 추출물인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효모 세포 추출물의 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 데옥시 뉴클레오시드는 브로모데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 플루오로데옥시우리딘 및 비닐데옥시티미딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 변형 데옥시 뉴클레오시드는 브로모데옥시우리딘인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 표면은 플라스틱 표면인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 플라스틱 표면은 플라스틱 마이크로타이터 플레이트(plastic microtiter plate)인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 고체 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 그의 5'-말단을 통해 부착되거나 또는 활성화된 플레이트의 이미다졸을 이용하여 고정화되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액(CSF), 흉수, 복수, 조직, 세포 및 그의 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 여러 개의 개별 용기에
    프라이머 또는 주형인 고체 표면에 부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드,
    프라이머 또는 주형인 부착되지 않은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드,
    키나아제 효소 기질인 변형 데옥시 뉴클레오시드,
    포스페이트 공여체,
    뉴클레오티드 중합 효소,
    TK 활성이 결여된 키나아제 효소원, 및
    완충액을 포함하는, 생물학적 시료에서 티미딘 키나아제(TK) 활성을 결정하는 분석 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 분석의 표준화를 위한 기준(reference) TK를 더 포함하는 것인 분석 키트.
  15. 제13항에 있어서, 하나 이상의 웰에 표면-부착된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 마이크로타이터 플레이트를 더 포함하는 것인 분석 키트.
  16. 제13항에 있어서, 변형 데옥시 뉴클레오시드에 대한 친화성을 갖는 표지된 친화성 분자를 더 포함하는 것인 분석 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표지된 친화성 분자는 효소-표지된 친화성-컨쥬케이 트인 것인 분석 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 효소-표지된 친화성 컨쥬게이트는 알칼리 포스파타아제 또는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항체인 것인 분석 키트.
  19. 제13항에 있어서, 상기 TK 활성이 결여된 키나아제 효소원은 TK 활성이 결여된 포유동물 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 균류 세포주 추출물, TK 활성이 결여된 세균 세포주 추출물, 정제된 포유동물 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제(TMPK)와 뉴클레오시드 디-포스페이트 키나아제(NdK)의 조합, 정제된 균류 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제와 NdK의 조합, 정제된 세균 세포 추출물로부터 유래된 티미딜레이트 키나아제와 NdK의 조합, 재조합 포유동물 티미딜레이트 키나아제와 재조합 포유동물 NdK의 조합, 재조합 균류 티미딜레이트 키나아제와 재조합 균류 NdK의 조합, 및 재조합 세균 티미딜레이트 키나아제와 재조합 세균 NdK의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분석 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 키나아제 효소원은 효모 세포 추출물인 것인 분석 키트.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 암의 진단, 모니터링 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위해 이용되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 티미딘 포스페이트의 형성을 차단하거나 또는 핵산 합성을 방해할 수 있는 화합물의 스크리닝에서 이용되는 것인 방법.
  23. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 진단, 모니터링 또는 예후에서 사용하기 위한 것인 분석 키트.
  24. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 티미딘 포스페이트의 형성을 차단하거나 또는 핵산 합성을 방해할 수 있는 화합물의 스크리닝에서 사용하기 위한 것인 분석 키트.
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