BRPI0609044B1 - Método e kit de ensaio para a determinação de atividade de timidina cinase em uma amostra biológica, uso de método e/ou de kit de ensaio, método para uso em diagnóstico, monitoramento e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, e, método para uso em triagem de compostos - Google Patents

Abstract

método e kit de ensaio para a determinação de atividade de timidina cinase em uma amostra biológica, uso de método e/ou de kit de ensaio, método para uso em diagnóstico, monitoração e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, e, método para uso em triagem de compostos. são descritos um método e um kit de ensaio para a determinação da atividade de timidina cinase (tk) em uma amostra biológica, tal como sangue, soro, plasma, fluido cérebro-espinhal (csf), fluido pleural, ascite, tecidos, células e seus extratos. o método compreende contatar com a amostra biológica, em um tampão, uma mistura reacional básica compreendendo: gabarito e/ou iniciador ligado em superficie sólida, um desoxinucleosídeo modificado, tal como bromo-desóxiuridina, iodo- desóxiuridina, fluoro-desóxiuridina ou vinil-desóxiuridina como um substrato enzima cinase, um doador de fosfato, uma enzima polimerizadora de nucleosídeo, e uma fonte de enzima destituída de atividade de tk, tal como um extrato de levedura. após a incubação é determinada a quantidade de desoxinucleosídeo modificado que tem sido incorporado no gabarito e/ou iniciador ligado em superficie sólida, e a atividade de tk presente na amostra biológica é diretamente proporcional à quantidade de desoxinucleosídeo modificado incorporado. o método e o kit de ensaio são úteis em diagnóstico, prognóstico, monitoração de progressão de doença e efeitos de tratamento de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tal como câncer, e na triagem de compostos, e.g. novos candidatos de droga, afetando vias enzimáticas, que podem obstruir a formação de timidina fosfatos ou interferir com a síntese de ácido nucleico.

Description

“MÉTODO E KIT DE ENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE TIMIDINA CINASE EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, USO DE MÉTODO E/OU DE KIT DE ENSAIO, MÉTODO PARA USO EM DIAGNÓSTICO, MONITORAMENTO E/OU PROGNÓSTICO DE DOENÇAS OU DISTÚRBIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR, E, MÉTODO PARA USO EM TRIAGEM DE COMPOSTOS” [001] A presente invenção refere-se a um método não-radioativo e a um kit para determinação de atividade de timidina cinase (TK) em amostras biológicas. A invenção é útil em diagnóstico, monitoração e prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tais como câncer e certas infecções virais, e na triagem de compostos, e.g. novos candidatos de droga, afetando as vias enzimáticas que podem obstruir a formação de timidina monofosfato e/ou interferir com a síntese de ácido nucleico após fosforilação.

Fundamentos [002] Antes da divisão celular, o DNA transportando a informação genética tem que se duplicar por uma DNA-polimerase. Isto requer dentre outros componentes necessários a presença de quantidades grandes de substratos, i.e. a presença de todos os quatro desoxirribonucleotídeos, e.g. desoxiTimidina Tri-Fosfato (TTP, Fig. 2C). TTP é sintetizada de novo de acordo com a via ilustrada em Fig. 1. Em adição, mamíferos e muitas outras espécies codificam a TK, que exclusivamente é expressada em estágio de ciclo celular G1-S e recupera Timidina (T, Fig. 2A) para dentro do metabolismo por sua fosforilação para Timidina Mono-Fosfato (TMP, Fig.2B) (Fig. 1) (1, revisão). Determinação de T radioativa incorporada no DNA de células em cultura tem sido assim tradicionalmente usada como uma medição da velocidade da divisão celular. A atividade de TK em soro ou plasma de humano de indivíduos saudáveis e pacientes afetados com várias doenças de tumor foi mostrada durante os anos 1980 (2, 3).

Ausência de atividade de TK no fluido espinhal foi verificada em indivíduos saudáveis, enquanto que vários níveis foram encontrados em pacientes com tumores cerebrais (4). Desde então análise de TK tem se tornado comum em medicina clínica, especialmente em conexão com malignidades sanguíneas diferentes (5 - 10).

[003] Há dois genes celulares codificadores de TK, TK1 sendo a forma maior em divisão celular é liberada para dentro do soro como s-TK. Esta é a forma sobrexpressada no soro em tecido de tumor e é medida usando a maioria dos ensaios correntes incluindo o ensaio de acordo com a invenção. A forma TK2 existe puramente na mitocôndria. Além de estar localizada na mitocôndria TK2 também possui um espectro de substrato e parâmetros cinéticos diferentes dos de TK1 (1).

[004] A radioatividade incluída no procedimento no ensaio laborioso de TK de soro (s-TK) até agora comercialmente disponível tem impedido sua disseminação e seu uso em medicina clínica (2). Estando diretamente correlacionada com o grau de divisão de célula de tumor in vivo, s-TK é um complemento para muitos marcadores de tumor que meramente indicam a presença de tumor por sobrexpressão de antígenos fetais ou produtos especificamente produzidos pela célula diferenciada. Por exemplo, antígeno específico de próstata (PSA) é um marcador precoce de quantidades excessivas de células de próstata, e as elevações do nível de antígeno são detectadas bem antes da elevação da atividade de TK. Contudo, quando o tumor inicia a diferenciar e começa a crescer mais rapidamente, antígeno, PSA (Calicreína 3) desaparece enquanto que é verificada a atividade aumentada de s-TK (11). Assim, em adição ao seu uso para monitorar replicação de célula de tumor em pacientes, com ou sem terapia, a atividade de s-TK e a alteração de sua cinética também escolhe um paciente com relação a uma necessidade de mudança em tratamento terapêutico. A importância de um dado nível de s-TK para resultado de paciente varia entre tipos de tumor diferentes e relaciona-se naturalmente com ambos o tipo de terapia instalada, a idade do paciente e outros fatores que tornam a s-TK um marcador importante para incluir em modelos multivariados para uso em medicina clínica (12).

[005] Como mencionado, na arte anterior, a TK tem sido detectada quer por sua atividade quer por procedimentos de detecção da presença física da proteína TK1 (tamanho expressado de gene de 24 kd) (13). Os últimos procedimentos captam a enzima tanto ativa quanto inativa. Assim, estes ensaios de detecção de proteína correlacionam-se insatisfatoriamente com a atividade de s-TK. Não é um fenômeno surpreendente que TK1 seja apenas ativa nos estágios G1 a S do ciclo celular, i.e. na divisão celular, enquanto que a proteína TK1, ou seus produtos de degradação, podem ter uma meia-vida diferente. Assim, será discursado aqui apenas o estado da técnica de medição de atividade de TK.

[006] Em geral, todos os ensaios de atividade de TK consistem de uma incubação da amostra a ser analisada com T ou um seu análogo, na presença de um doador de fosfato (e.g. Adenosina Tri-Fosfato, ATP) e Mg2+ (ou Mn2+). Depois a quantidade de produto, i.e. TMP ou qualquer análogo de T monoFosfato é determinada como segue: A) Nos ensaios de atividade de TK inicialmente descritos, timidina (T) marcada com 3H foi usada como substrato. TMP foi ligado em papel de filtro carregado com Di-Etil-Amino-Etil (DEAE), que foi subseqüentemente lavado com o objetivo de remover o substrato T não usado. Após secagem do papel de filtro a radioatividade de 3H foi medida em um contador-beta. Contudo, testes ainda radioativos são desenvolvidos os quais indicam o interesse persistente no uso de s-TK como um marcador para proliferação celular (14). B) Em ensaio comercialmente disponível Prolifigen®TK-REA (DiaSorin S.p.A. Saluggia, Itália), Iodo-desóxiUridina radioativa (125IdU) é usada como substrato para. O produto Mono-Fosforilado; Iodo-desóxiUridina Mono-Fosfato (125IdUMP), é separado por ligação dele em Hidróxido de Alumínio (Al(OHÇ) auto-sedimentante que é subseqüentemente lavado com o objetivo de remover 125IdU não usada. A radioatividade de 125I ligada em pó de Al(OH)3 é subseqüentemente contada em um contador-gama (2, 3). C) Os ensaios não radioativos de TK recentemente publicados (15, 16) descrevem uma tecnologia similar para quantificar a atividade de TK1. Nestes ensaios quer Azido-Timidina (AZT, Fig. 2D) quer Bromo-desóxiUridina (BrdU, Fig. 2A) foi usada como substrato, e o MonoFosfato respectivamente formado (AZTMP ou BrdUMP Fig. 2B) foi quantificado por análise da capacidade da solução de reação de competir com a ligação de AZTMP ou BrdUMP marcado com enzima em um anticorpo anti-AZTMP ou anti-BrdUMP imobilizado no fundo de cavidades em uma placa de microtítulo de 96 cavidades (i.e. detecção por ELISA competitivo).

[007] Embora evite radioatividade, o ensaio não-radioativo até agora conhecido não parece ser suficientemente eficiente para analisar amostras biológicas contendo níveis baixos de TK, porque mede a redução de um traçador de ligação, que requer que quantidades altas de produto de TK estejam presentes na amostra analisada (15, 16). Isto impede a resolução boa da atividade de TK na faixa normal, que pode diferir mais do que o triplo entre os indivíduos jovens e velhos, e particularmente quando o ensaio de TK é usado em amostras biológicas destituídas de níveis de referência mensuráveis, tais como fluidos espinhal, pleural, ascite e outros fluidos corporais.

[008] Recentemente uma nova linhagem de célula hospedeira recombinante foi descrita utilizando a atividade complementar de TMPK, NdK sozinha ou em combinação com TK no qual o gene de TMPK, NdK ou de TK foi deletado. A invenção é direcionada à criação de uma linhagem de célula recombinante e um kit incluindo a linhagem de célula para triagem de compostos afetando as vias de cinase (17).

Descrição da invenção [009] A presente invenção proporciona um ensaio de Timidina cinase não-radiométrico sensível que podem ser facilmente automatizado, se desejado. O produto de TK é diretamente processado para ser imobilizado sobre uma superfície sólida e o nível de atividade de TK é diretamente quantificado e.g. usando o procedimento de ELISA (18) sem transferência de amostras para medições secundárias.

[010] O novo método quantifica a atividade de Timidina cinase (TK) (ATP: Timidina - 5' fosfotransferase: E.C. 2.7.1.21) em uma amostra biológica, e.g. uma amostra de fluido corporal. O método permite determinação simples, barata, acurada e elevadamente sensível de atividade de TK em uma amostra biológica, e.g. uma amostra de fluido corporal ou tecido ou célula, bem como isozimas de TK recombinantes puras.

[011] Assim, a invenção é direcionada para um método para a determinação de atividade de Timidina cinase (TK) em uma amostra biológica compreendendo as etapas de contatar, em um recipiente contendo um polinucleotídeo de fita única como um iniciador ou gabarito ligado em uma superfície sólida, uma Mistura Reacional Básica, em um tampão, compreendendo os seguintes componentes: um polinucleotídeo de fita única não-ligado como um gabarito e/ou iniciador, um desoxinucleosídeo modificado como um substrato de enzima cinase, um doador de Fosfato, uma enzima polimerizadora de nucleotídeo, e uma fonte de enzima cinase destituída de atividade de TK, com a amostra biológica, incubar a mistura, opcionalmente lavar a mistura incubada para remover os componentes de reação não ligados, determinar a quantidade de desoxinucleosídeo modificado que tem sido incorporado no gabarito e/ou iniciador ligado em superfície sólida, e determinar a atividade de TK presente na amostra biológica a partir da quantidade de desoxinucleosídeo modificado incorporado.

[012] A expressão "destituída de atividade de TK" é intencionada no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexadas para significar que há quantidade tão baixa de atividade de TK, se houver, presente que ela não interferirá no desempenho do método da invenção.

[013] Adicionalmente, deve ser entendido que a atividade de TK é proporcional à quantidade de nucleosídeo modificado incorporado.

[014] Em uma modalidade presentemente preferida a mistura incubada é lavada e a determinação da quantidade de desoxinucleosídeo modificado incorporado é realizada pela adição na mistura incubada de uma molécula de afinidade marcada com afinidade pelo desoxinucleosídeo modificado e determinação da quantidade de desoxinucleosídeo modificado que tem sido incorporado pela determinação da quantidade de molécula de afinidade marcada ligada com o auxílio do marcador.

[015] Em uma modalidade do método da invenção a fonte de enzima cinase é selecionada do grupo consistindo de um extrato de linhagem de célula de mamífero destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula fúngica destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula bacteriana destituído de atividade de TK, uma combinação de TMPK e Nucleosídeo di-Fosfato cinases (NdK) dos extratos de célula de mamífero, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula fúngica, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula bacteriana purificados, uma combinação de TMPK recombinante de mamífero e NdK recombinante de mamífero, uma combinação de TMPK recombinante fúngica e NdK recombinante fúngica, e uma combinação de TMPK recombinante bacteriana e NdK recombinante bacteriana. Deve ser entendido que as cinases podem provir de fontes diferentes nas combinações acima. Preferivelmente, a fonte de enzima é um extrato de célula de levedura, tal como um extrato de Saccharomyces cerevisiae.

[016] Em outra modalidade o nucleosídeo modificado incorporado é derivado de um is desoxinucleosídeo correspondentemente modificado.

[017] Em ainda outra modalidade, o substrato de enzima desoxinucleosídeo modificado cinase é selecionado do grupo consistindo de Bromo-desoxiUridina, Iodo-desoxiUridina, Fluoro-desoxiUridina e Vinil-desoxiTimidina, e é preferivelmente Bromo-desoxiUridina.

[018] Em uma modalidade preferida a superfície sólida é uma superfície plástica, e.g. uma placa plástica de microtítulo. Contudo, a superfície sólida pode ser de outro material sobre o qual moléculas de afinidade podem ser fixadas, tais como glóbulos de plástico, glóbulos magnéticos, e superfícies de agarose ou de sílica tais como pastilhas ou glóbulos.

[019] Em ainda outra modalidade o polinucleotídeo de fita única ligado em superfície sólida é ligado via sua extremidade 5’ ou imobilizado usando imidazol em placas ativadas.

[020] Preferivelmente a amostra biológica analisada pelo método da invenção é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma, Fluido Cérebro-Espinhal (CSF) (4), fluido pleural, ascite, tecidos, células e seus extratos. Amostras de tecido e de célula referem-se às amostras de extrato nuclear ou citosólico.

[021] A invenção também é direcionada a um kit de ensaio para determinação de atividade de Timidina cinase (TK) em uma amostra biológica compreendendo, em vários recipientes separados, um polinucleotídeo de fita única ligada em superfície sólida como um gabarito e/ou iniciador, um polinucleotídeo de fita única não-ligado como um gabarito e/ou iniciador, um desoxinucleosídeo modificado como um substrato de enzima cinase, um doador de Fosfato, uma enzima polimerizadora de nucleotídeo, e uma fonte de enzima cinase destituída de Timidina cinase (TK) e um tampão.

[022] Em uma modalidade preferida do kit de ensaio da invenção, o kit compreende TK de referência para padronização do ensaio. Exemplos de uma referência adequada são soro de um mamífero possuindo uma doença de tumor, e as células em crescimento suspensas em soro de animal.

[023] Em uma modalidade adicionalmente preferida do kit de ensaio da invenção, o kit compreende adicionalmente uma ou várias placas de microtítulo contendo em uma ou várias cavidades polinucleotídeo de fita única ligado em superfície (18).

[024] Em outra modalidade do kit de ensaio, o kit adicionalmente compreende uma molécula de afinidade marcada com afinidade por um desoxinucleosídeo modificado, preferivelmente um conjugado de afinidade marcado com enzima, tal como um anticorpo marcado com fosfatase alcalina ou com peroxidase de rábano.

[025] Também em uma modalidade de kit de ensaio da invenção a fonte de enzima cinase é selecionada do grupo consistindo de um extrato de linhagem de célula de mamífero destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula fúngica destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula bacteriana destituído de atividade de TK, uma combinação de timidilato cinase (TMPK) e Nucleosídeo di-Fosfato cinases (NdK) de extratos de célula de mamífero purificados, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula fúngica purificados, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula bacteriana purificados, uma combinação de TMPK recombinante de mamífero e NdK recombinante de mamífero, uma combinação de TMPK recombinante fúngica e NdK recombinante fúngica, e uma combinação de TMPK recombinante bacteriana e NdK recombinante bacteriana. Deve ser entendido que as cinases podem provir de fontes diferentes nas combinações acima. Preferivelmente, a fonte de enzima é um extrato de célula de levedura, tal como um extrato de Saccharomyces cerevisiae.

[026] A invenção é direcionada adicionalmente ao uso do método e/ou do kit de ensaio em diagnóstico, monitoração e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tais como câncer ou certas infecções virais, em mamíferos, especialmente humanos.

[027] A invenção é direcionada adicionalmente ao uso do método e/ou do kit de ensaio da invenção na triagem de compostos, e.g. novos candidatos de droga, que afetam as vias enzimáticas, que podem obstruir a formação de Timidina Fosfatos.

[028] Os dois últimos aspectos mencionados da invenção podem ser formulados em uma maneira alternativa, a saber como um método para uso em diagnóstico , monitoração e prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tais como câncer ou certas infecções virais, em mamíferos, especialmente humanos, compreendendo o método de acordo com a invenção e/ou o kit de ensaio de acordo com a invenção, e um método para uso na triagem de compostos, e.g. novos candidatos de droga, que afetam as vias enzimáticas , que podem obstruir a formação de Timidina Fosfatos ou que interferem com a síntese de ácidos nucleicos compreendendo o método de acordo com a invenção e/ou o kit de ensaio de acordo com a invenção.

[029] Uma característica importante do método da invenção é que a determinação de atividade de TK em uma amostra de fluido corporal é alcançada pela utilização de um extrato celular destituído de atividade de TK. Isto em combinação com uma imunodetecção em fase sólida preferida de incorporação de BrdUMP suplanta o problema relacionado com o método radioativo corrente (Prolifigen® TK-REA, DiaSorin S.p.a. Saluggia, Itália) (2, 3) e com os métodos não-radioativos descritos (15, 16). A presente invenção não apenas proporciona um método não-radiativo e um kit para a detecção de atividade de TK em soro, mas também o método é simples de realizar, robusto e proporciona um método analiticamente útil para propósitos de diagnóstico.

[030] Para as etapas de fosforilação ocorrerem no método há um requerimento absoluto de que um doador de Fosfato esteja presente na Mistura Reacional Básica em um tampão. Como doadores de Fosfato vários nucleotídeo tri-Fosfatos podem ser usados, especialmente ATP. Preferivelmente a escolha é um nucleotídeo que não se tornará incorporado na cadeia de crescimento do sistema de iniciador/gabarito sobre a superfície sólida. É particularmente preferido o uso de um ribo-tri-Fosfato nucleotídeo como doador de Fosfato.

[031] Em uma modalidade da invenção é proporcionado um método para a determinação de atividade de TK em uma amostra biológica pelo contato, em um tampão, da amostra com uma Mistura Reacional Básica, contendo um polinucleotídeo de fita única ligado em uma superfície sólida como um gabarito e/ou iniciador, um polinucleotídeo de fita única não-ligado como um gabarito e/ou iniciador, e um extrato celular a destituído de atividade de TK de modo que a amostra biológica proporcione a única fonte para a TK. A atividade de TK na amostra biológica é então determinada pela determinação da quantidade de nucleosídeo modificado que tem sido incorporado pela(s) polimerase(s) no ácido nucleico de fita dupla recém-sintetizado ligado na superfície sólida, e.g. incorporação em fase sólida dirigida por polimerase de BrdUMP que é substancialmente detectada pelo uso de um conjugado de anticorpo-enzima contra BrdU incorporada.

[032] Em uma modalidade preferida o extrato, destituído de atividade de TK, é derivado de um extrato de células eucarióticas. Em uma modalidade ainda mais preferida o extrato é derivado de extratos de células de mamífero. Em uma modalidade adicionalmente preferida o extrato, destituído de atividade de TK, é derivado de extrato de célula de mamífero e.g. usando, mas não limitado à, purificação de afinidade. Em outra modalidade preferida o extrato, destituído de atividade de TK é construído pela combinação de enzimas recombinantes TMPK (Timidilato cinase; EC 2.7.4.9; ATP:dTMP fosfotransferase) e NdK (EC 2.7.4.6; Nucleosídeo diFosfato (NDP) cinases) de células recombinantes, exemplificadas mas não limitadas a, genes de NdK e de TMPK de levedura clonada expressados em uma cepa hospedeira bacteriana adequada tal como Escherichia coli. Em ainda outra modalidade preferida o extrato é derivado de um fungo. Em uma modalidade particularmente preferida o extrato de célula, destituído de atividade de TK, é derivado de levedura de padaria, Saccharomyces cerevisiae.

[033] A presente invenção revela que a atividade de TK, que está presente em uma amostra biológica, pode ser detectada e determinada pelo uso de um extrato celular destituído de atividade de TK como uma fonte de enzima cinase combinada com uma incorporação dirigida por polimerase de um nucleosídeo modificado.

[034] A determinação da quantidade de nucleosídeo modificado incorporado pode ser feita em numerosas maneiras diferentes, tais como por detecção da modificação do nucleosídeo, e.g. Br em BrdUMP. A invenção é ilustrada pelo uso de um método imunológico, a saber Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA).

[035] Assim, um conjugado de afinidade marcado com enzima é usado para a determinação do nucleosídeo modificado incorporado, que está relacionado com o nível de proliferação celular na amostra biológica.

Exemplos de moléculas de afinidade incluem anticorpos, tais como anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ligantes em antígeno.

[036] A presente invenção é ilustrada pelo uso do nucleosídeo modificado presentemente preferido, BrdU, e de um anticorpo direcionado contra BrdU, mas vários outros nucleosídeos modificados são conhecidos na arte, que podem ser tornar fosforilados pela TK e assim podem ser usados no método da presente invenção. Estes incluem, mas não são limitados a; Vinil-desoxiTimidina, FdU e IdU (Fig. 2A). De fato os dois nucleosídeos modificados mencionados por último têm sido usados no método da invenção e dão resultados comparáveis com BrdU embora requeiram tempos de incubação mais longos, provavelmente devido à falta de um anticorpo monoclonal ideal porque o conjugado de anticorpo anti-BrdU disponível também foi usado nestes experimentos.

[037] Em uma modalidade preferida a polimerase, usada para a incorporação de BrdUMP na configuração de gabarito iniciador de superfície sólida, é DNA polimerase direcionada por RNA (DNA polimerase dependente de gabarito de RNA = Transcriptase Reversa) (RT) e o gabarito de ácido nucleico ligado em superfície sólida é poli-rA (ácido polirriboadenílico). Em outra modalidade igualmente preferida a polimerase é uma DNA polimerase direcionada por DNA e o gabarito de ácido nucleico ligado em superfície sólida é um oligo-dA e o iniciador é um oligo-dT mais curto complementar ao iniciador. Em uma modalidade adicional a polimerase é qualquer polimerase conhecida na arte e o gabarito ligado em fase sólida é um DNA variável com e sem uma região homopolimérica, e o iniciador mais curto é complementar quer a uma região variável quer à parte homopolimérica do gabarito. Dependendo de como o ácido nucleico é ligado na superfície, quer o gabarito quer o iniciador é ligado na superfície. Uma condição é que não haja duas fitas de ácido ribonucleico formando o sistema de gabarito de iniciador inicial.

[038] Numerosas DNA polimerases direcionadas por DNA modificadas e nativas são conhecidas na arte; estas são exemplificadas por, mas não são limitadas a, DNA polimerase alfa eucariótica de várias fontes, DNA polimerase I de Escherichia coli, fragmento de Klenow modificado de DNA polimerase I de Escherichia coli, Fago T4 polimerase nativa ou modificada, Taq polimerase de Thermophilus aquaticus nativa ou modificada, Vent polimerase de Thermococcus litoralis e Pfu polimerase de Pneumococcus furiousus.

[039] Várias DNA polimerases direcionadas por ENA nativas e modificadas, (Transcriptase Reversa = RT) (EC: 2.7.7.49) são conhecidas na arte; estas são exemplificadas por, mas não são limitadas a, RT do Vírus do Mosaico da Alfafa (AMV-RT), RT do Vírus de Leucemia Murina de Moloney (M-MuLV-RT), Vírus da Imunodeficiência de Símio (SIV RT) e Vírus da Imunodeficiência de Humano (HIV), que são exemplos típicos deste tipo de polimerases.

[040] O comprimento do gabarito é preferivelmente 30 a 300 nucleotídeos de comprimento e o iniciador é preferivelmente 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Métodos para ligação covalente de proteínas na superfície sólida de placas plásticas de poliestireno de microtítulo de 96 cavidades são bem conhecidos na arte. Ligação na superfície de poliestireno pode ser facilitada pelo uso de Imidazol, que é por meio deste aqui incluído como um exemplo, mas não limitante, desta tecnologia. Uso de superfície ativada de 1-Etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDCC) para copular iniciadores de oligonucleotídeo modificado em amina-5’ é bem conhecido na arte usando foto-copulação.

[041] Muitos métodos diferentes para empregar tecnologias para medição de biomoléculas presentes em uma amostra, usando tecnologia de Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) são bem conhecidos na arte. Em uma modalidade preferida um anticorpo monoclonal direcionado contra o hapteno BrdU, é conjugado na enzima Fosfatase Alcanila, (AP) (Fosfatase Alcalina: Ortofosfórico-monoéster fosfo-hidrolase (alcalina ótima), EC 3.1.3.1.). Contudo, qualquer outra enzima conhecida na arte anterior como sendo útil para o procedimento de ELISA pode ser usada na presente invenção, tal como uma enzima conjugada no anticorpo anti-BrdU, e.g. peroxidase de rábano. (Peróxido de Hidrogênio Óxido-redutase EC 1.11.1.7) (HRP). Em outra abordagem, qualquer cromatóforo, fluoróforo, luminóforo que é conhecido na arte pode ser conjugado no anticorpo traçador, e.g. o anticorpo anti-BrdU.

[042] Vários substratos adequados para AP ou HRP são bem conhecidos na arte. Clivagem do substrato para-Nitro Fenil Fosfato (pNPP) por AP muda a cor do substrato de incolor para amarela. A absorbância pode ser lida em comprimento de onda de 405 nm usando um espectrofotômetro. Substratos de AP quimioluminescentes incluem, mas não são limitados a, derivados de adamantil-1,2-dioxetano (e.g. substratos AMPPD, CSPD, CDP, e CDP-Star todos comercializados por Tropix (Bedford, MA, US)), que emitem uma luz brilhante no estado de equilíbrio a 477 nm sob desfosforilação por AP e subseqüente decomposição da molécula restante. Um exemplo de, mas não uma limitação aos, substratos fluorescentes para AP é 4-Metil-Umbeliferil-Fosfato (4-MUP). Após desfosforilação de MUP, a Metil-Umbeliferila (MU) restante é excitada em comprimento de onda de 370 nm. A fluorescência emitida é detectada a 430 nm usando um fluorômetro.

Descrição dos desenhos: [043] Figuras para o ensaio de atividade de TK por ELISA em superfície sólida.

[044] Figura 1. Vias diferentes de produção de TTP em célula de mamífero. *Vias: I. via de Novo, II. via de salvamento. *Enzimas Relevantes: l.Timidina cinase (TK), 2. Timidilato sintase (TS), 3. ribonucleotídeo redutase (RR), 4. Timidilato cinase (dTMPK), 5 desoxirribonucleosídeo monoFosfato cinase (dNMPK), 6. nucleosídeo diFosfato cinase (NDPK), 7. Transferase Terminal (TT), 8. DNA polimerase dependente de RNA (RT), 9. DNA polimerase dependente de DNA (DNA Pol) *Fatores regulatórios importantes: A. inibição de retro-alimentação, B. desfosforilação pela enzima Desoxiuridina-trifosfatase (dUTPase) [045] Figura 2. Modificação para Timidina nucleosídeos e análogos de Nucleotídeo A. Nucleosídeos B. Nucleotídeo Mono-Fosfatos C. Nucleotídeo Tri-Fosfatos D. AzidoTimidina [046] Figura 3. Capacidade de diferentes concentrações de extrato de levedura junta com RT, para detectar várias concentrações de BrdUMP.

[047] Figura 4. Capacidade de medição de S-TK do ensaio de acordo com a invenção (A405), usando incubação de extrato de 2d e duas quantidades diferentes de cada soro, 5 e 1 microlitro, respectivamente, e correlação com o Prolifigen®TK-REA (TK U).

Abreviações 4-MUP 4-Metil-Umbeliferil-Fosfato Al(OH)3 Hidróxido de Alumínio AMPPD Adamantil-1,2-dioxetano-aril-Fosfato AP Fosfatase Alcalina: EC 3.1.3.1; Ortofosfórico-monoéster fosfo-hidrolase (alcalina ótima) ATP Adenosina-5'-Tri-Fosfato AZT 3'-azido-3'-desoxiTimidina BrdU Bromo-desoxiUridina BrdUMP Bromo-desoxiUridina Mono-Fosfato BrdUTP Bromo-desoxiUridina Tri-Fosfato CSF Fluido Cérebro-Espinhal DEAE Di-Etil-Amino-Etila DTT Ditiotreitol EDCC 1-Etil-3-(3-dimetil-amino-propil)carbodiimida EDTA Ácido Etileno-diamino-teraacético EGTA Ácido Etileno-glicol-bis[beta-amino-etil-éter]-N,N,N'N"- tetraacético ELISA Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima FdU Fluoro-desoxiUridina HIV Vírus da Imunodeficiência de Humano HRP Peróxido de hidrogênio óxido-redutase EC 1.11.1.7 IdU Iodo-desoxiUridina NdK Nucleosídeo di-Fosfato cinases: EC 2.7.4.6 pNPP para-Nitro-Fenil-Fosfato PSA Antígeno Específico de Próstata RT Transcriptase Reversa; DNA-polimerase direcionada por RNA: EC:2.7.7.49 SIV RT Transcriptase reversa de vírus da imunodeficiência de símio TK Timidina cinase: E.C. 2.7.1.21; ATP: Timidina -5'- fosfotransferase TMPK Timidilato cinase: EC 2.7.4.9; ATP:dTMP fosfotransferase TMP desoxiTimidina Mono-Fosfato TTP desoxiTimidina Tri-Fosfato dUTP 2'-desoxiUridina 5'-Tri-Fosfato Exemplo 1: Preparação de extratos de cinase a partir da levedura Saccharomyces cerevisiae que complementa atividade de TK

[048] Extrato de levedo contendo atividade de cinase complementar/recuperadora foi preparado em colaboração com o centro de competência Uppsala Yeast Resource (www.yeastlab.vbiol.slu.se). Resumidamente;

Preparação de extratos de célula de levedura.

[049] 200 mL de meio-Gal (extrato de levedura 1%;

BactoTMYeast Extract. DIFCO; peptona 2%, BactoTMPeptone, BD; galactose 2% (Sigma) e Ágar 2% (B actoTMAgar; DIFCO) foram inoculados com cepa fresca G116 de Saccharomyces cerevisiae (genótipo: MATa ura3-52 his3 leu2::pLEU-lexAop6). Células de levedura foram crescidas durante a noite a 30oC e permitidas alcançarem uma densidade de OD600 nm de aproximadamente 1,2. Células foram a seguir colhidas por centrifugação a 230XG for 5 min a 4oC, usando quatro tubos de polipropileno com tampa rosqueada de 50 mL Falcon™. As pelotas foram cada uma ressuspensas e lavadas em 40 mL de água MilliQTTM estéril gelada e de novo centrifugadas a 230XG por 5 min at 4oC. Água MilliQTM foi decantada e descartada. Células foram a seguir ressuspensas em água MilliQTTM restante por pipetação. Cada suspensão de levedura nos tubos de polipropileno com tampa rosqueada de 50 mL FalconTM (aproximadamente 0,8 g por microtubo de 2,2 mL, Sarstedt (número de catálogo: 72.694.006) foi transferida para um microtubo de tampa rosqueada de 2,2 mL, que foi pesado antes da adição de suspensão de levedura, e centrifugado a 230XG por 2 min em uma sala fria (8oC). Água restante foi decantada e descartada. Pelotas restantes foram pesadas (aproximadamente 0,4 g por microtubo de 2,2 mL). O peso foi marcado sobre o lado externo do microtubo de 2,2 mL. Células foram subseqüentemente armazenadas a -80oC antes da preparação dos extratos complementares.

Preparação de extratos de levedura complementares.

[050] As pelotas de célula de levedura foram deixadas a 25-28oC até ficarem completamente descongeladas (entre 15 e 20 min) e então foram mantidas em um banho de gelo antes do procedimento de preparação de extrato de levedura. Todo o trabalho subseqüente foi realizado em uma ambiente de sala fria (8oC). Em cada microtubo de 2,2 mL contendo 0,4 g de pelota de célula de levedura foi adicionado aproximadamente 0,5 volume de pelota de tampão 3X Breaking, ajustado usando o indicador de superfície de volume de microtubo (tampão 1X Breaking veja Tabela 1). A seguir 1 mL de glóbulos de Zircônio foi adicionado (diâmetro médio de glóbulo de 1 mm; Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Box 788, OK 74005, USA). A seguir os tubos foram completamente cheios (quase transbordando) com tampão 1X Breaking (tampão 3XBreaking = tampão Breaking diluído três vezes com água MilliQTM) e cuidadosa e hermeticamente fechados. Tubos foram instalados em uma máquina batedeira Mini-BeadBeater-8TM (Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Box 788, OK 74005, USA). A agitação na máquina batedeira de glóbulos da suspensão de células de levedura foi realizada 5X por 1 min em cada agitação com esfriamento sobre banho de gelo (0oC) por 1 a 2 min entre as agitações na máquina batedeira. Fragmentos de célula e glóbulos forma subseqüentemente removidos por centrifugação a 10.000XG por 2 min. Sobrenadantes foram transferidos para microtubos novos de 2,2 mL e centrifugados a 10.000XG por 5 min. Sobrenadantes de extrato de levedura contendo enzima foram aliquotados a 10 pL em microtubos de 2,2 mL e subseqüentemente armazenados a -80oC antes do uso.

Tabela 1. Tampão 1X Breaking Ingrediente Tris-Acetato 150 mM

Acetato de Potássio 50 mM

Glicerol 20% v/v EDTA 1 mM

DTT 1mM

Tablete de inibidor de protease completo um tablete para 75 mL-1 (Roche Inc.) Água MilliQTM para o volume requerido Exemplo 2: Capacidade de extrato de levedura preparado para, junto com RT, detectar BrdUMP por meio de fosforilação e incorporação em complexo de gabarito/iniciador de fase sólida.

[051] Neste exemplo foi usada uma Mistura Reacional Básica em tampão contendo os reagentes listados na Tabela 2 Ingrediente Concentração final Tampão Bis-Tris Propano de 20,4 mM pH 7,5 Iniciador OligoNucleotídeo 0,08 pg/mL (odT) Espermidina 0,1 mM

Espermina 0,1 mM

ATP 0,5 mM

MgCl2 10,0 mM

EGTA 0,25 mM

Triton X-100 0,85 % v/v DTT 7,8 mM

SlV RT 10 ng mL-1 Água MilliQTM para o volume requerido [052] A Mistura Reacional Básica em um tampão foi preparada a partir de soluções de estoque de cada componente depois do que 100 pL foram adicionados em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades armazenando poli-rA imobilizado (três placas foram configuradas).

[053] Extratos de levedura foram descongelados a 22-25oC e então deixados sobre um banho de gelo antes do uso. O extrato foi serialmente diluído em etapas de 5 vezes e 25 pL da concentração de topo foram adicionados na fila A enquanto que as seguintes na fila B etc. BrdUMP foi serialmente diluído 10 vezes começando a 1,3 x 10-5 M e terminando a 1,3 x 10-11 M. A concentração de topo corresponde a uma concentração 250X menor do que aquela na preparação descrita do exemplo 1. A concentração mais alta foi adicionada nas cavidades na coluna 1 das placas de 96 cavidades e a concentração seguinte na coluna 2 etc. Também uma coluna sem BrdUMP foi incluída em cada placa, que depois foi coberta e vedada com fita adesiva plástica (Fasson S695, número de catálogo SH 236269, Nunc Denmark). Então todas as três placas foram incubadas a 33oC. A 1a placa foi lavada após 3 h de incubação e então deixada a -20oC. A 2a placa foi lavada após 24 h e deixada a -20oC e a 3a placa foi lavada após 48 h de incubação e deixada a -20oC. As placas foram removidas de -20oC e lavadas por quatro submersões consecutivas em 4X1 L de Tampão de Lavagem de pH 8,6 (Tris-HCl 3 mM, 0,01% de Tween-20, 0,5% de Triton X-100, 0,25% de EtOH CavidiTech AB, Uppsala Suécia). Com o objetivo de visualizar BrdUMP incorporada na face sólida, 100 mL de um traçador (AP, i.e. fosfatase alcalina conjugada em um anticorpo monoclonal anti-BrdUMP, RT product Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Suécia) foram adicionados em cada cavidade e incubados por 90 min a 33oC. As placas foram de novo lavadas por quatro submersões consecutivas em 4X1 L de Tampão de Lavagem de pH 8,6 (Tris-HCl 3 mM, 0,01% de Tween-20, 0,5% de Triton X-100, 0,25% de EtOH CavidiTech AB, Uppsala Suécia). Após lavagem 125 microlitros de uma solução contendo o substrato pNPP a 0.5 mgmL-1, MgCÇ 1 mM em 200 mM de Tris-HCl pH 9,8, foram adicionados em cada cavidade. As placas foram incubadas na temperatura ambiente. A absorbância OD405 foi registrada com uma leitora Syva Micro Trak® EIA sob filtro com um ajuste de comprimento de onda dual em w1=405 e w2=630 nm após 5 min e após intervalos diferentes por até 24 h.

[054] A absorbância após leitura de 5 min foi subtraída de cada absorbância em qualquer instante de tempo de leitura posterior para cada cavidade. As absorbâncias apresentadas foram então plotadas contra a quantidade de extrato de levedura usado contra a concentração de BrdUMP. Da Fig. 3 pode ser visto que o sinal aumentou quando foi usada mais levedura. Concentrações de BrdUMP caíram para 1,3 x 10-11M, foram detectadas, veja Fig. 3.

Exemplo 4: Capacidade do sistema de detecção de BrdUMP apresentado para medir a atividade de s-TK e sua correlação com o ensaio de TK radioativo.

[055] Para este experimento foram selecionados 20 soros diferentes variando de atividade de TK em soro normal (e.g. <5 U) a até atividade de TK muito alta (>800 U) de acordo com Prolifigen® TK-REA (tabletes de número de catálogo 324250/50, Diasorin S.p.A, Saluggia, Itália). A Mistura Reacional Básica em um tampão foi preparada de acordo com a Tabela 2, contudo, em adição BrdU dando uma concentração final de 2,5 x 10-5 M e extrato de levedura foram adicionados em uma concentração 12X menor do que a concentração mais alta dada em Exemplo 2. 125 pL desta Mistura Reacional Básica em um tampão foram adicionados em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades armazenando poli-rA imobilizado.

[056] Soros foram serialmente diluídos em etapas de 5 vezes começando a 1:5 e terminando a 1:625 em Mistura Reacional Básica em um tampão. 25 pL de cada diluição de soro foram adicionados em uma cavidade na placa de microtítulo armazenando a Mistura Reacional Básica em um tampão, i.e. um volume correspondendo a; 5, 1, 0,2, 0,4 pL de cada soro de paciente foi analisado.

[057] A placa foi a seguir vedada com fita adesiva plástica T (Fasson S695, número de catálogo SH 236269, Nunc Denmark) e incubada por 2 d a 33oC. A placa foi lavada por quatro submersões consecutivas em 4X1 L de Tampão de Lavagem de pH 8,6 (Tris-HCl 3 mM, 0,01% de Tween-20, 0,5% de Triton X-100, 0,25% de EtOH CavidiTech AB, Uppsala Suécia). Com o objetivo de visualizar BrdUMP incorporada na face sólida 100 pL de um traçador (AP, i.e. fosfatase alcalina conjugada em um anticorpo monoclonal anti-BrdUMP, RT product Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Suécia) foram adicionados em cada cavidade e incubados por 90 min a 33oC. A placa foi lavada por outras submersões consecutivas em 4X1 L de Tampão de Lavagem de pH 8,6 (Tris-HCl 3 mM, 0,01% de Tween-20, 0,5% de Triton X-100, 0,25% de EtOH CavidiTech AB, Uppsala Suécia). Após a lavagem 125pL de solução contendo o substrato pNPP 0,5 mgmL-1 em 1 mM de MgCl2, 200 mM de Tris-HCl, pH 9,8 foram adicionados em cada cavidade. A placa foi incubada na temperatura ambiente. A Absorbância a OD405 foi registrada com uma leitora Syva Micro Trak® EIA usando filtro com um ajuste de comprimento de onda dual para w1 = 405 e w2 = 630 nm já 5 min após a adição do substrato pNPP e depois em intervalos diferentes por até 24 h.

[058] As absorbâncias após leitura de 5 min foram subtraídas de cada absorbância em qualquer instante de tempo de leitura posterior para cada cavidade. Os valores de A405 foram calculados para A405 por h usando leituras dentro da faixa de leitura para a leitora de ELISA. Os resultados para os soros de paciente usando 1 pL e 5 pL, respectivamente, são ilustrados em Fig. 4 onde as absorbâncias estão relacionadas com a atividade de TK presente nos soros de acordo com o Prolifigen® TK-REA radioativo existente (tabletes de número de catálogo 324250/50, Diasorin S.p.A, Saluggia, Itália). Os resultados mostram uma correlação forte entre o ensaio de acordo com a invenção e o Prolifigen® TK-REA radioativo existente.

Referências 1. Amer, Elias S. J. e Eriksson Staffan. Mammalian Desoxyribonucleoside Cinases. Pharmac.Ther.67(2):155-186. 1995. 2. Gronowitz J.S., Kallander C.F.R. TK-REA patent. A method for determining dTK isoenzyme activity and use thereof. EP94923. Pr. 14.05.1982 SE82030401. Data de depósito de EP de 10.05.1983. 3. Gronowitz J.S., Kallander C.F.R., Diderholm H., Hagberg H. e U. Petterson. Application of an in vitro assay for sorum thymidine kinase: results on viral disease and malignancies in humans. Int.J.Cancer, 33:5-12, 1984. 4. Gronowitz J.S., Kallander C.F.R, Hagberg H. e L. Persson. Desoxithymidine kinase in cerebrospinal fluid: A potential "marker" for brain tumors. Acta Neurochir. 73:1-12, 1984. 5. Doi S, Naito K, Yamada K. Serum desoxithymidine kinase as a progressive marker of hematological malignancy. Nagoya J Med Sci. 1990 Mar; 52(1-4):19-26. 6. Eriksson B., Hagberg H., Glimelius B., Sundstrom C., Gronowitz J.S. e Kallander C.F.R. Sorum thymidine kinase as a prognostic marker in Hodgkin's disease. Acta Radiol.Oncol. 24:167-71, 1985. 7. Hagberg H., Gronowitz J.S., Killander A., Kallander C.F., Simonsson B., Sundstrom C. e G. Oberg. Sorum thymidine kinase in acute leukemia. Brit.J.Cancer 49:537-540, 1984. 8. Morgan M.A.M., Cooper E.H., Bailey C.C., Gronowitz J.S. e C.F.R. Kallander. Sorum desoxithymidine kinase in acute lymphoblastic leukaemia in children. TumourDiagnostik & Therapie 6:155-158, 1985. 9. Rehn S., Gronowitz J.S., Kallander C., Sundstrom C., e B. Glimelius. Desoxithymidine kinase in tumour células and sorum of patients with non-Hodgkin lymphomas. Brit.J. Cancer 71:1099-1105, 1995. 10. Simonsson B., Kallander C.F.R., Brenning G., Killander A. e J.S. Gronowitz. Evaluation of sorum desoxithymidine kinase as a marker in multiple myeloma. Brit.J.Haematol. 61:215-224, 1985. 11. Letocha H., Eklov S., Gronowitz J.S., Norle'n B-J., e S. Nilsson. Desoxithymidine kinase in the staging of prostatic adenocarcinoma. The Prostate, 29:15-19, 1996. 12. Gronowitz J.S., Bergstrom R., Nou E. Pâhlman S., Brodin O., Nilsson S., e C.F.R. Kallander. Clinicai and serological markers of stage and prognosis of small cell lung cancer (SCCL): A multivariate analysis. Cancer, 66:722-32, 1990. 13. Zhang F, Li H, Pendleton AR, Robison JG, Monson KO, Murray BK, O'Neill KL Thymidine kinase 1 immunoassay: a potential marker for breast cancer. Cancer Detect Prey. 2001;25(1):8-15. 14. Seah LH, Ton SH, Cheong SK, Hamidah NH. An in-house assay for sorum desoxithymidine kinase.Malays J Pathol. 1991 Dec;13(2):109-13 15. Ohrvik A, Lindh M, Einarsson R, Grassi J, Eriksson S. Sensitive nonradiometric method for determining Thymidine kinase 1 activity. Clin Chem. 2004 Sep;50(9):1597-606. Epub 2004 Jul 09. 16. Armstrong B. The development of a TK tumor maker system for cancer diagnosis, staging and treatment monitoring. Theses submitted for the degree of doctor of philosophy, University of Ulster., 1991 17. Chaperon. D. New recombinant host cell line comprising a thymidilate kinase gene and/or thymidilate synthase gene that have been functionally complemented by at lest one functional homologue of an other organism, useful in activity testing. WO200411627 Pr. 25.07.2002 US2002398948. Data de depósito de PCT de 24.07.2003. 18. Ekstrand D. H. L., Awad R., Kallander Clas F.R e J. Simon Gronowitz. A Sensitive Assay For Quantification of RT Activity, based on the use of Carrier Bound Template e Non Radioactive Product Detection, with Special Reference to HIV Isolation. Biotechn. Appl. Biochem. (1996) 23, 95- 105.

REIVINDICAÇÕES

Claims (24)

1. Método para a determinação de atividade de timidina cinase (TK) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: contatar com a amostra biológica, em um recipiente contendo um polinucleotídeo de fita única como um iniciador ou gabarito ligado em uma superfície sólida, uma Mistura Reacional Básica, em um tampão, compreendendo os seguintes componentes: um polinucleotídeo de fita única não-ligado como um gabarito e/ou iniciador, um desoxinucleosídeo modificado como um substrato de enzima cinase, um doador de fosfato, uma enzima polimerizadora de nucleotídeo, e uma fonte de enzima cinase destituída de atividade de TK, incubar a mistura, opcionalmente lavar a mistura incubada para remover os componentes de reação não ligados, adicionar a mistura incubada uma molécula de afinidade marcada com afinidade pelo desoxinucleosídeo modificado, determinar a quantidade de desoxinucleosídeo modificado que foi incorporada no gabarito ou iniciador ligado em superfície sólida pela determinação da quantidade de molécula de afinidade marcada ligada, e determinar a atividade de TK presente na amostra biológica a partir da quantidade de desoxinucleosídeo modificado incorporado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura incubada é lavada e no qual a determinação da quantidade de desoxinucleosídeo modificado incorporado é feita pela adição na mistura incubada de uma molécula de afinidade marcada com afinidade pelo desoxinucleosídeo modificado e pela determinação da quantidade de desoxinucleosídeo modificado que foi incorporada pela determinação da quantidade de molécula de afinidade marcada ligada com o auxílio do marcador.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de enzima cinase é selecionada do grupo consistindo de um extrato de linhagem de célula de mamífero destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula fúngica destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula bacteriana destituído de atividade de TK, uma combinação de timidilato cinase (TMPK) e Nucleosídeo di-Fosfato cinases (NdK) de extratos de célula de mamífero purificados, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula fúngica purificados, uma combinação de TMPK e NdK de extratos de célula bacteriana purificados, uma combinação de TMPK recombinante de mamífero e NdK recombinante de mamífero, uma combinação de TMPK recombinante fúngica e NdK recombinante fúngica, e uma combinação de TMPK recombinante bacteriana, NdK recombinante bacteriana, e quaisquer combinações de TMPK e NdK das fontes mencionadas.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fonte de enzima cinase é um extrato de célula de levedura.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a levedura do extrato de célula de levedura é Saccharomyces cerevisiae.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo modificado é derivado de um desoxinucleosídeo correspondentemente modificado.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, caracterizado pelo fato de que o desoxinucleosídeo modificado é selecionado do grupo consistindo de Bromo-desoxiUridina, Iodo-desoxiUridina, Fluoro-desoxiUridina e Vinil-desoxiTimidina.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o desoxinucleosídeo modificado é Bromo-desoxiUridina.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a superfície sólida é uma superfície de plástico.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a superfície plástica é uma placa de microtítulo de plástico.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de fita única ligado em superfície sólida é ligado via sua extremidade 5’ ou imobilizado usando imidazol em placas ativadas.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma, Fluido Cérebro-Espinhal (CSF), fluido pleural, ascite, tecidos, células e seus extratos.

13. Kit de ensaio para a determinação de atividade de timidina cinase (TK) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender em vários recipientes separados: um polinucleotídeo de fita única ligado em superfície sólida como um gabarito e/ou iniciador, um polinucleotídeo de fita única não-ligado como um gabarito e/ou iniciador, um desoxinucleosídeo modificado como um substrato de enzima cinase, um doador de fosfato, uma enzima polimerizadora de nucleotídeo, uma fonte de enzima cinase destituída de atividade de TK, e um tampão.

14. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender TK de referência para padronização do ensaio.

15. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma ou várias placas de microtítulo contendo, em uma ou várias cavidades, polinucleotídeo de fita única ligado em superfície.

16. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma molécula de afinidade marcada com afinidade por um desoxinucleosídeo modificado.

17. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a molécula de afinidade marcada é um conjugado de afinidade marcado com enzima.

18. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o conjugado de afinidade marcado com enzima é um anticorpo marcado com fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano.

19. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fonte de enzima cinase destituída de atividade de TK é selecionada do grupo consistindo de um extrato de linhagem de célula de mamífero destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula fúngica destituído de atividade de TK, um extrato de linhagem de célula bacteriana destituído de atividade de TK, uma combinação de timidilato cinase (TMPK) e Nucleosídeo di-Fosfato cinases (NdK) de extratos de célula de mamífero purificados, uma combinação de timidilato cinase e NdK de extratos de célula fúngica purificados, uma combinação de timidilato cinase e NdK de extratos de célula bacteriana purificados, uma combinação de timidilato cinase recombinante de mamífero e NdK recombinante de mamífero, uma combinação de timidilato cinase recombinante fúngica e NdK de mamífero recombinante fúngica, e uma combinação de timidilato cinase recombinante bacteriana e NdK recombinante bacteriana.

20. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que fonte de enzima cinase é um extrato de célula fúngica.

21. Uso de método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e/ou de kit de ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de ser em diagnóstico, monitoramento e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tal como câncer, em mamíferos, especialmente humanos.

22. Uso de método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e/ou de kit de ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de ser em triagem de compostos, por exemplo, novos candidatos de droga, que afetam as vias enzimáticas, que podem obstruir a formação de timidina fosfatos ou interferir com a síntese de ácido nucleico.

23. Método para uso em diagnóstico, monitoramento e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, tal como câncer, em mamíferos, especialmente humanos, caracterizado pelo fato de compreender o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e/ou o kit de ensaio como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20.

24. Método para uso em triagem de compostos, por exemplo, novos candidatos de drogas, que afetam as vias enzimáticas que podem obstruir a formação de timidina fosfatos ou interferem com a seqüência de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e/ou o kit de ensaio como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20.