NO341196B1 - Fremgangsmåte og analysesett for bestemmelse av tymidinkinaseaktivitet og anvendelse av disse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ikke-radioaktiv fremgangsmåte og et kitt for å bestemme tymidinkinase (TK)-aktiviteten i biologiske prøver. Oppfinnelsen er nyttig ved diagnostisering, kontroll og prognose av celleprolifereringsforstyrrelser eller -sykdommer, slik som cancer og visse virusinfeksjoner, og ved screening av forbindelser for eksempel nye medikamentkandidater som kan påvirke enzymatiske reaksjonsveier som kan hindre dannelsen av tymidinmonofosfat og/eller interferere med nukleinsyresyntesen etter fosforylering.

Bakgrunn

Før celledeling må DNA som bærer den genetiske informasjonen dupliseres ved en DNA-polymerase. Dette krever i tillegg til andre nødvendige komponenter tilstedeværelse av store mengder substrater, dvs. tilstedeværelse av alle fire deoksyribo-nukleotidene for eksempel deoksytymidin tri-fosfat (TTP, fig. 2C). TTP syntetiserer de novo ifølge reaksjonsveien illustrert i fig. 1.1 tillegg koder pattedyr og mange andre arter en TK som eksklusivt uttrykkes i Gl-S-cellesyklusstadie og bevarer timidi (T, fig. 2A) i metabolismen ved å fosforylere det til tymidin monofosfat (TMP, fig. 2B) (fig. 1) (1). Bestemmelse av inkorporert radioaktivt T i DNA i cellerik kultur har således tradisjonelt vært anvendt som et mål på hastigheten av celledeling. Det ble vist i løpet av 1980-årene (2, 3) at TK-aktivitet i humant plasma eller serum fra friske individer og pasienter ble påvirket av ulike tumorsykdommer. Fravær av TK-aktivitet i spinalvæsken ble funnet hos friske personer, mens ulike nivåer ble funnet hos pasienter med hjerne-tumorer (4). Siden da har TK-analyser blitt mer vanlig i klinisk medisin, spesielt i forbindelse med ulike maligniteter i blod (5-10).

Det finnes to cellulære gener som koder for TK, TK1 som er hovedformen, frigis ved celledeling til serum som s-TK. Dette er formen som overuttrykkes i serum ved tumorsykdommer og måles ved anvendelse av de fleste gjeldende analyser inkludert analysen ifølge oppfinnelsen. TK2-formen eksisterer utelukkende i mitokondriene. Ved siden av å være lokalisert i mitokondriene har TK2 også et ulikt substratspektrum og ulike kinetiske parametere enn TK1 (1).

Radioaktiviteten inkludert i prosedyrene i de hittil eneste kommersielle tilgjengelige og omstendelige serum TK (s-TK)-analyse har hindret dens utbredelse og anvendelse i klinisk medisin (2). Ved den direkte korreleringen mellom graden av tumorcelledeling in vivo er s-TK et tillegg til mange tumormarkører som bare indikerer tumortilstedeværelse ved overekspresjon av føtale antigener eller produkter spesifikt produsert av de differensierte celler. Prostataspesifikt antigen (PSA) er for eksempel en tidlig markør for forhøyede mengder av prostataceller, og økningen av nivået av antigen påvises lenge før TK-aktivitetsøkningen. Når tumoren starter å de-differensiere og starter å vokse raskere forsvinner imidlertid PSA-antigen (Kallikrein 3) mens økning i s-TK-aktiviteten observeres (11). I tillegg til dens anvendelse for å følge tumorcellereplikasjon hos pasienter, med eller uten terapi, vil s-TK-aktiviteten og endring i dens kinetikk også identifisere en pasient med hensyn på behov for endring i terapeutisk behandling. Viktigheten av et gitt s-TK-nivå for pasientens resultat varierer mellom ulike tumortyper og angår naturlig både typen terapi som anvises, alder på pasienten og andre faktorer som gjør s-TK til en viktig markør å inkludere i multivariate modeller for anvendelse innen klinisk medisin (12).

Som nevnt i den kjente teknikk har TK enten blitt påvist ved sin aktivitet eller ved fremgangsmåte som påviser den fysiske tilstedeværelsen av TK1-rutiner (24 kd størrelse på genuttrykket) (13). De sistnevnte fremgangsmåter plukker opp både aktive og innaktive enzym. Disse proteindeteksjonsanalysene korrelerer følgelig dårlig med s-TK-aktiviteten. Det er ikke et uventet fenomen siden TK1 bare er aktivt i Gl til S-stadiene av cellesyklus, dvs. ved celledeling, mens TKl-proteinet eller degraderingsproduktene av dette kan ha ulike halveringstider. Følgelig vil kun den kjente teknikk som måler TK-aktiviteten bli adressert her.

Generelt består alle TK-aktivitsanalyser av en inkubasjon av prøven som skal analyseres med T eller en analog av denne, i nærvær av en fosfatdonor (for eksempel adenosin tri-fosfat, ATP) og Mg<2+>(eller Mn<2+>). Deretter bestemmes mengden av produkt, dvs. TMP eller et hvilket som helst T-analogt monofosfat som følger: A) I de tidlig beskrevne TK-aktivitetsanalyser ble<3>H-merket tymidin (T) anvendt som substrat. TMP ble bundet til dietylaminoetyl (DEAE)-ladet filterpapir, som deretter ble vasket for å fjerne ubrukt T-substrat. Etter tørking av filterpapiret ble<3>H-radioaktiviteten målt i en betateller. Imidlertid utvikles fortsatt radioaktive tester som indikerer den vedvarende interesse av å anvende s-TK som en markør for celleproliferering (14). B) I dem kommersielt tilgjengelige Prolifigen<®>TK-REA (DiaSorin S.p.A. Saluggia,

Italia)-analysen anvendes radioaktivt jod-deoksyuridin(12<5>IdU) som substrat for TK. Det monofosforylerte produktet; jod-deoksyuridinmonofosfat (<125>IdUMP), separeres ved at dette bindes til selv-sedimenterende aluminiumhydroksid (AL(OH)3) som deretter vaskes for å fjerne ubrukt<125>IdU. Den<125>Jod-radio aktivitet som er bundet til AL(OH)3-pulvere telles deretter i en gammateller (2, 3). C) De nylig publiserte ikke-radioaktive TK-analyser (15, 16) beskriver en tilsvarende teknologi for å kvantifisere TK-aktivitet. I disse analysene ble enten Azido-Tymidin (AZT, fig. 2D) eller bromdeoksyuridin (BrdU, fig. 2A) anvendt som substrat, og de respektive dannede monofosfat (AZTMP eller BrdUMP fig. 2B) ble kvantifisert ved å analysere den evne reaksjonsløsningen har til å konkurrere med bindingen av enzymmerket AZTMP eller BrdUMP til et anti-AZTMP eller anti-BrdUMP antistoff immobilisert på bunnen av brønner i en annen 96-brønns mikrotiterplate (dvs. deteksjon ved kompetitiv ELISA).

EP 0094923 A2, også angitt som referanse #2, beskriver en fremgangsmåte for å bestemme dTK isoenzymaktivitet og anvendelse av denne. Videre beskrives beslektede metoder i WO 2004100760, WO 9006320 Al og Wickremasinghe RG. et al., Biochim Biophys Acta. 1983, vol. 740, no. 3, side 243-248; Gel filtration ofacomplex of DNA polymerase and DNA precursor- synthesizing enzymes from a human lymphoblastoid cell line

Selv om radioaktivitet unngås synes ikke de hittil kjente ikke-radioaktive analyser å være effektive nok til å analysere biologiske prøver inneholdende lave nivåer av TK,

siden den måler reduksjon av et bundet sporstoff, som krever at ganske høy mengder av TK-produktet er til stede i den analyserte prøven (15, 16). Dette hindrer god oppløsning av TK-aktivitet i det normale området, som kan variere mer enn tre ganger mellom unge og eldre individer, og spesielt når TK-analysen anvendes på biologiske prøver fri for

målbare referansenivåer, slik som spinalvæske, pleuralvæske, ascites og andre kropps-væsker.

Nylig ble en ny rekombinant vertscellelinje beskrevet som benytter den komplementære aktiviteten til TMPK, NdK alene eller i kombinasjon med TK der TMPK, NdK eller TK genet var fjernet. Oppfinnelsen er rettet på å lage en rekombinant cellelinje og et kitt som inkluderer cellelinjen for screening av forbindelser som påvirker kinasereaksjons-veiene (17).

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse frembringer en sensitiv ikke-radiometrisk tymidinkinase-analyse som enkelt kan automatiseres om ønskelig. TK-produktet er direkte prosessert for immobilisering på en fastfaseoverflate og TK-aktivitetsnivået kvantifiseres direkte for eksempel ved anvendelse av ELISA-fremgangsmåte (18) uten overføring av prøvene til sekundære målinger.

Den nye fremgangsmåten kvantifiserer tymidinkinase (TK) (ATP: tymidin-5'- fosfotransferase: E.C. 2,7,1,2Inaktiviteten i en biologisk prøve, for eksempel en kropps-væskeprøve. Fremgangsmåten muliggjør enkel, billig, nøyaktig og svært sensitiv bestemmelse av TK-aktiviteten i en biologisk prøve, for eksempel kroppsvæske, eller en vevsprøve eller celleprøve, så vel som rene rekombinante TK- isosymer.

Følgelig er oppfinnelsen rettet mot en fremgangsmåte for å bestemme tymidinkinase (TK)-aktivitet i en biologisk prøve omfattende trinnene å bringe, i en beholder inneholdende et enkelttrådet polynukleotid som en primer eller templat festet til en fast overflate, en basisk reaksjonsblanding i en buffer omfattende følgende komponenter: et ikke bundet enkelttrådet polynukleotid som et templat og/eller primer, et modifisert deoksynukleosid som et kinaseenzymsubstrat, en fosfatdonor, et nukleotid-polymeriseringsenzym og en kinaseenzymkilde fri for TK-aktivitet i kontakt med den biologiske prøven,

inkubering av blandingen,

eventuelt vasking av den inkuberte blandingen for å fjerne ubundede reaksjons-komponenter, bestemmelse av mengden av det modifiserte deoksynukleosid som er blitt inkorporert i primeren og/eller templatet festet til den faste overflaten, og

bestemmelse av TK-aktiviteten til stede i den biologiske prøven ut i fra mengden inkorporert modifisert deoksynukleosid.

Uttrykket "fritt for TK-aktivitet" er i denne beskrivelsen og de følgende krav tilsiktet å bety at det er så lav mengde av TK-aktivitet, om noen, til stede at det ikke vil interferere med resultatet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Videre skal det forstås at den bestemte TK-aktivitet er proporsjonal med mengden inkorporert modifisert nukleosid.

I en foretrukket utførelsesform vaskes den inkuberte blandingen og bestemmelse av mengden inkorporert modifisert deoksynukleosid gjøres ved å tilsette til den inkuberte blandingen et merket affinitetsmolekyl med affinitet til det modifiserte deoksynukleosid og bestemme mengden av modifisert deoksynukleosid som er blitt inkorporert ved å bestemme mengden festet merket affinitetsmolekyl ved hjelp av markøren.

I en utførelsesform ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utvelges kinaseenzymkilden fra gruppen bestående av et pattedyrcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et soppcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et bakteriecellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, en kombinasjon av TMPK og nukleosid defosfatkinaser (NdK) fra rensede pattedyrcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede soppcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede bakteriecelleekstrakter, en kombinasjon av rekombinant pattedyr TMPK og rekombinant pattedyr NdK, en kombinasjon av rekombinant sopp TMPK og rekombinant sopp NdK, og en kombinasjon av rekombinant bakteriell TMPK og rekombinant bakteriell NdK. Det skal forstås at kinasene kan komme fra ulike kilder i de ovennevnte kombinasjoner. Fortrinnsvis er enzymkilden et gjærcelleekstrakt, slik som et ekstrakt fra Saccharomyces cerevisiae.

I en annen utførelsesform er det inkorporerte modifiserte nukleosid avledet fra et tilsvarende modifisert deoksynukleosid.

I en annen utførelsesform er det modifiserte deoksynukleosid kinaseenzymsubstrat utvalgt fra gruppen bestående av BromdeoksyUridin, JoddeoksyUridin, Fluoreoksy-Uridin og VinyldeoksyTymidin, og er fortrinnsvis BromdeoksyUridin. I en foretrukket utførelsesform er plastfasen en plastoverflate, for eksempel en plast-mikrotiterplate. Imidlertid kan den faste overflaten være av et annet materiale til hvilket affinitets-molekylene kan testes, slik som plastkuler, magnetiske kuler og avarose eller silika-overflater som brikker eller kuler.

I en annen utførelsesform festetes det enkelttrådede polynukleotid til den faste overflaten via dens 5' ende eller immobiliseres ved anvendelse av imidasol på aktiverte plater. Fortrinnsvis utvelges den biologiske prøven analysert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra gruppen bestående av blod, serum, plasma, cerebral spinalvæske (CSF) (4), pluralvæske, ascites, vev, celler og ekstrakter av slike. Vevs- og celleprøver angår cytosol- eller kjerneekstraktprøver.

Oppfinnelsen er også rettet på et analysesett for bestemmelse av tymidinkinase (TK)-aktivitet i en biologisk prøve omfattende, i flere separate beholdere, et fastfasebundet enkelttrådet polynukleotid som en primer og/eller templat, et ubundet enkelttrådet polynukleotid som et templat og/eller primer, et modifisert deoksynukleosid som et kinaseenzymsubstrat, en fosfatdonor, et nukleotidpolymeriserende enzym og en kinase enzymkilde fri for tymidinkinase (TK) og en buffer.

I en foretrukket utførelsesform av analysesettet ifølge oppfinnelsen omfatter settet referanse-TK for standardisering av analysen. Eksempler på egnede referanser er serum fra pattedyr som har en tumorsykdom, og celler som vokser suspendert i dyreserum.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform av analysesettet ifølge oppfinnelsen omfatter settet i tillegg en eller flere mikrotiterplater inneholdende i en eller flere brønner overflatebundet enkelttrådet polynukleotid (18).

I en annen utførelsesform av settet ifølge oppfinnelsen omfatter analysesettet ytterligere et merket affinitetsmolekyl med affinitet for et modifisert deoksynukleosid, fortrinnsvis et enzymmerket affinitetskonjugat, slik som et antistoff merket med alkalisk fosfatase eller med pepperrot peroksidase.

I en utførelsesform av analysesettet ifølge oppfinnelsen utvelges kinaseenzymkilden fra gruppen bestående av et pattedyrecellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et soppcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, en bakteriecellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, en kombinasjon av tymidylatkinase (TMPK) og nukleosid difosfatkinase (NdK) fra rensede pattedyrcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede soppcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede bakteriecelleekstrakter, en kombinasjon av rekombinant pattedyr TMPK og rekombinant pattedyr NdK, en kombinasjon av rekombinant sopp TMPK og rekombinant sopp NdK, og en kombinasjon av rekombinant bakteriell TMPK og rekombinant bakteriell NdK. Det skal forstås at kinasene kan komme fra ulike kilder i de ovennevnte kombinasjoner. Fortrinnsvis er enzymkilden et gjærcelleekstrakt, slik som et ekstrakt fra Saccharomyces cerevisiae.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av fremgangsmåten og/eller analysesett ifølge oppfinnelsen for diagnostisering, kontroll og/eller prognose av celleprolifereringsforstyrrelser eller -sykdommer, slik som cancer eller visse virusinfeksjoner hos pattedyr, spesielt mennesker. Oppfinnelsen angår i tillegg anvendelse av fremgangsmåten og/eller analysesettet ifølge oppfinnelsen for screening av forbindelser, for eksempel nye medikamentkandidater, som påvirker enzymatiske reaksjonsveier som kan hindre dannelsen av tymidinfosfater.

De to sistnevnte aspekter ifølge oppfinnelsen kan formuleres på en alternativ måte, nemlig som en fremgangsmåte for anvendelse ved diagnostisering, kontroll, og prognose av celleprolifereringsforstyrrelser eller -sykdommer, slik som cancer eller visse virusinfeksjoner, hos pattedyr, spesielt menneske, omfattende fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og/eller analysesettet ifølge oppfinnelsen, og en fremgangsmåte for anvendelse ved screening av forbindelser, for eksempel nye medikamentkandidater, som påvirker enzymatiske reaksjonsveier som kan hindre dannelsen tymidinfosfater eller interferere med syntesen av nukleinsyrer omfattende fremgangsmåten ifølge opprinnelsen og/eller analysesettet ifølge oppfinnelsen.

Et viktig trekk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at bestemmelsen av TK-aktiviteten i en kroppsvæskeprøve oppnås ved å benytte et celleekstrakt fritt for TK-aktivitet. Dette i kombinasjon med en foretrukket fastfase immundeteksjon av BrdUMP-inkorporering overvinner både problemet forbundet med den nåværende radioaktive fremgangsmåten (Prolifigen<®>TK-REA, DiaSorin S.p.a. Saluggia, Italia) (2, 3) og med de ikke-radioaktive fremgangsmåtene beskrevet (15, 16). Foreliggende oppfinnelse frembringer ikke bare en ikke-radioaktiv fremgangsmåte og analysesett for bestemmelse av serum TK-aktivitet, fremgangsmåten er også enkel å utføre, robust og frembringer en analytisk nyttig fremgangsmåte for diagnostikkhensikter.

For at fosforyleringstrinnene skal skje ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det et absolutt krav til at en fosfatdonor er til stede i den basiske reaksjonsblandingen i en buffer. Som fosfatdonorer kan flere nukleotidtrifosfater anvendes, spesielt ATP. Fortrinnsvis er valget et nukleotid som ikke vil bli inkorporert i den voksne kjeden av primer/templatsystem på den faste overflaten. Det er særlig foretrukket å anvende et ribo-tri-fosfatnukleotid som fosfatdonor.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen frembringes en fremgangsmåte for bestemmelse av TK-aktivitet i en biologisk prøve ved å bringe, i en buffer, prøven med en basisk reaksjonsblanding inneholdende et enkelttrådet polynukleotid festet til en fast overflate som et templat og/eller primer, et ikke-festet enkelttrådet polynukleotid som et templat og/eller primer og et celleekstrakt fritt for TK-aktivitet slik at den biologiske prøven frembringer den eneste kilden for TK. TK-aktiviteten i den biologiske prøven bestemmes deretter ved å bestemme mengden modifisert nukleosid som er blitt inkorporert av polymerasene til den nylig syntetiserte dobbelttrådede nukleinsyren festet til den faste overflaten, for eksempel polymerasedirigert fastfaseinkorporering av BrdUMP som deretter påvises ved å anvende et enzym-antistoffkonjugat mot inkorporert BrdU.

I en foretrukket utførelsesform er ekstraktet fritt for TK-aktivitet avledet fra et ekstrakt fra eukaryote celler. I en mer foretrukket utførelsesform er ekstraktet avledet fra ekstrakter fra pattedyrceller. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er ekstraktet fritt for TK-aktivitet avledet fra renset pattedyrecelleekstrakt, dvs. ved anvendelse av, men ikke begrenset til, affinitetsrensing. I en annen foretrukket utførelsesform er ekstraktet fritt for TK-aktivitet laget ved å kombinere de rekombinante enzymer TMPK (Tymidylatkinase; EC 2,7,4,9; ATP:dTMP fosfotransferase) og NdK (EC 2,7,4,6; Nukleosiddifosfat (NDP) kinase) fra rekombinante celler, eksemplifisert men ikke begrenset til, klonede gjær TMPK- og NdK-gener uttrykt i egnede bakterievertsstammer slik som Escherichia coli. I en annen foretrukket utførelsesform er ekstraktet avledet fra en sopp. I en særlig foretrukket utførelsesform er celleekstraktet fritt for TK-aktivitet avledet fra bakegjær, Saccharomyces cerevisiae.

Foreliggende oppfinnelsen viser at TK-aktivitet, som er til stede i en biologisk prøve, kan påvises og bestemmes ved anvendelse av et celleekstrakt fritt for TK-aktivitet som en kinaseenzymkilde kombinert med en polymerasedirigert inkorporering av et modifisert nukleosid.

Bestemmelsen av mengden av inkorporert modifisert nukleosid kan gjøres på flere forskjellige måter, slik som ved deteksjon av modifiseringen av nukleosidet, for eksempel Br i BrdUMP. Oppfinnelsen illustreres ved anvendelse av en immunologisk fremgangsmåte, nemlig enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).

Følgelig anvendes et enzymmerket affinitetskonjugat for bestemmelse av det inkorporert modifiserte nukleosid, som er relatert til nivået av celleproliferering i den biologiske prøven. Eksempler på affinitetsmolekyler inkluderer antistoffer, slik som monoklonale antistoffer eller antigen-bindende fragmenter av disse.

Foreliggende oppfinnelse illustreres ved anvendelse av det for tiden foretrukne modifiserte nukleotid, BrdU, og et antistoff rettet mot BrdU, men flere andre modifiserte nukleosider er kjent innen teknikken som kan bli fosforylert ved TK og følgelig kan bli anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til; VinyldexoyTymidin, FdU og IdU (fig. 2A). De to sistnevnte modifiserte nukleotider er faktisk blitt anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og gir resultater sammenlignbare med BrdU selv om de krever lengre inkuberingstider, muligens på grunn av mangel på et ideelt monoklonalt antistoff siden det tilgjengelige anti-BrdU-anitstoffkonjugat ble anvendt også i disse eksperimentene.

I en foretrukket utførelsesform er polymerasen anvendt for inkorporering av BrdUMP inn i fastfaseprimertemplatoppsettet RNA-dirigert DNA-polymerase (RNA-templatavhengig DNA-polymerase = revers transkriptase) (RT) og fastfasefestede nukleinsyretemplat er poly-rA (polyriboadenylsyre). I en annen tilsvarende foretrukket utførelsesform er polymerasen en DNA-dirigert DNA-polymerase og at et fastfasefestet nukleinsyretemplat er en oligo-dA og primeren er en kortere oligo-dT komplementært til primeren. I en ytterligere utførelsesform er polymerasen en hvilken som helst polymerase kjent innen teknikken og den fastfasefestede templat er et variabelt DNA og uten en homopolymer region, og den kortere primeren er komplementær enten med en variabel region eller med den homopolymere delen av templaten. Avhengig av hvordan nukleinsyren er festet til overflaten er enten templaten eller primeren festet til overflaten. En forutsetning er at det ikke kan være to ribonukleinsyretråder som danner det initielle primer/templatsystemet.

Et antall native og modifiserte DNA-dirigerte DNA-polymeraser er kjent innen teknikken; disse er eksemplifisert ved, men ikke begrenset til, eukaryote DNA-polymerase alfa fra ulike kilder, Escherichia coli DNA polymerase I, modifisert Klenow-fragment fra Escherichia coli DNA-polymerase I, Phag T4-polymerase nativt eller modifisert, Taq-polymerase fra Thermophilus aquaticus nativt eller modifisert, vent-polymerase fra Thermococcus litoralis og Pfu polymerase fra Pneumococcusfuriousus.

Mange native og modifiserte RNA-dirigerte DNA-polymeraser, (Reverse Transcriptase = RT) (EC: 2,7,7,49) er kjent innen teknikken: disse er eksemplifisert ved, men ikke begrenset til alfalfa mosaic virus RT (AMV-RT), Moloney Murine Leukemia Virus RT (M-MuLV-RT), Simian Immunsvikt Virus (SIV RT) og Human Immunsvikt (HIV), hvilket er typisk eksempel på denne type polymerase.

Lengden av templaten er fortrinnsvis 30 til 300 nukleotider langt og primeren er fortrinnsvis 10 til 30 nukleotider langt. Metoder for kovalent kobling av proteiner til fastfasen av polystyrenplast 96-brønns mikrotiterplater er vel kjent innen teknikken. Binding av polystyrenoverflaten kan gjøres lettere ved anvendelse av imidasol, som herved er inkludert som et eksempel, men ikke som begrensende, for denne teknologi. Anvendelse av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDCC)-aktivert overflate for å koble 5'-aminmodifisert oligonukleotidprimere er vel kjent innen teknikken ved anvendelse av fotokobling.

Mange ulike fremgangsmåter for anvendelse av teknologier for måling av biomolekyler til stede i en prøve, som benytter enzymbundet immunsorbentanalyse (ELISA)-teknologi er vel kjent innen teknikken. I en foretrukket utførelsesform er et monoklonalt antistoff rettet mot hapten BrdU konjugert til enzymet Alkalin Fosfatase, (AP) { Alkalin Phosphatase: Orthophosphoric- monoesterphosphohydrolase ( alkalin optimum), EC 3, 1, 3, 1). Imidlertid kan et hvert annet enzym kjent innen teknikken for å være nyttig ved ELISA-prosedyrer anvendes ifølge oppfinnelsen, slik som et enzym konjugert til anti-BrdU-antistoffet, for eksempel pepperrotperoksidase { Hydrogen peroxide oxidoreductase EC 1, 11, 1, 7) (FIRP). I en annen metode kan en hver kromatofor, fluorofor, luminofor som er kjent innen teknikken konjugeres til sporstoffantistoffet, for eksempel anti-BrdU-anti stoffet.

Flere egnede substrater for enten AP eller HRP er vel kjent innen teknikken. Spalting av substratet para-Nitro Phenyl Phosphate (pNPP) av AP gjør at substratets farge endres fra fargeløs til gult. Absorbansen kan avløses ved 405 nm følgelengde ved anvendelse av et spektrofotometer. Chemiluminescent AP substrater inkluderer, men er ikke begrenset til, derivater av adamantyl 1,2-dioksethan (for eksempel AMPPD, CSPD, CDP, og CDP-Star-substrater alle markedsført av Tropix (Bedford, MA, US)), som emiterer et glødende lys i likevektstilstanden ved 477 nm ved defosforilering av AP og den følgende dekomponering av de gjenværende molekyl. Et eksempel på, men ikke en begrensning til, fluorescentsubstrater for AP er 4-Metyl Umbelliferyl Phosphate (4-MUP). Etter defosforylering av MUP eksiteres det gjenværende metyl Umbelliferyl (MU) ved 370 nm bølgelengde. Den emitterte fluorescensen detekteres ved 430 nm ved anvendelse av et fluorometer.

Beskrivelse av tegningene

Figurer for fastfase ELIS A-analyse av TK-aktiviteten.

Fig. 1. Ulike reaksjonsveier for TTP-produksjon i pattedyrceller.

<*>Reaksjonsvei: I. deNovo-reaksjonsveien H bevaringsreaksjonsveien

<*>Relevante enzymer: 1. Tymidinkinase (TK), 2. Tymidylatsyntase (TS), 3. ribonukleotidreductase (RR), 4. Tymidylatkinase (dTMPK), 5 deoksy ribonukleosidmonofosfatkinase (dNMPK), 6. nukleosiddifosfatkinase (NDPK), 7. Terminal Transferase (TT), 8. RNA-dependent DNA polymerase

(RT), 9. DNA dependent DNA polymerase (DNA-Pol).

* Viktige regulerende faktorer: A. feedbackinhibisjon, B. defosforylering av enzymet deoksyuridintrifosfatase (dUTPase)

Fig. 2. Modifiseringer for tymidinnukleosider og nukleotidanaloger A. Nukleosider

B. Nukleotid Monofosfater C. Nukleotid Trifosfater D. Azidotymidin Fig. 3. Kapasiteten til ulike gjærekstraktkonsentrasjoner sammen med RT, til å påvise ulike BrdUMP-konsentrasjoner. Fig. 4 S-TK måling av kapasiteten til analysen ifølge oppfinnelsen (A405), ved anvendelse av 2d ekstraktinkubering og to ulike mengder av hvert serum henholdsvis 5 og 1 mikroliter og korrelering med Prolifigen<®>TK-REA (TK U).

Forkortelser

4-MUP 4-Metyl Umbelliferylfosfat

Al(OH)3Aluminiumhydroksid

AMPPD Admantal 1,2-dioksetanarylfosfat

AP Alkalinfosfatase: EC 3,1,3,1; Ortofosforisk-monoester

fosfohydrolase (alkalisk optimum)

ATP Adenosin 5'-Tri-fosfat

AZT 3'-azido-3'-deoksytymidin

BrdU BromodeoksyUridin

BrdUMP BromodeoksyUridin Mono-fosfat

BrdUTP BromodeoksyUridin Tri-fosfat

CSF Cerebralspinalvæske

DEAE Di-etyl aminoetyl

DTT Dithiothreitol

EDCC l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimide

EDTA Etylendiaminetereddiksyre

EGTA Etylenglykol-bis[beta-aminoetyl eter]-N,N,N'N'-tetraeddiksyre ELISA Enzymlinket immunosorbentassay

Fdu Fluorodeoksy Uridin

HIV Human Immunsvikt Virus

HRP Hydrogenperoksid oksidoreductase EC 1,11,1,7

IdU Iododeoksy Uridin

NdK Nukleosid di-fosfat kinase: EC 2,7,4,6

pNPP para-Nitro Fenylfosfat

PSA Prostate spesifikk antigen

RT Reverse Transkriptase; RNA-directed DNA-polymerase: EC

2,7,7,49

SIV RT Ape immunsvikt virus revers transkriptase

TK Tymidinkinase: E.C. 2,7,1,21; ATP: tymidin - 5'fosfotransferase TMPK Tymidylat kinase: EC 2,7,4,9; ATP:dTMP fosfotransferase TMP deoksy Tymidin Mono-Fosfat

TTP deoksy Tymidin Tri-Fosfat

dUTP 2'-deoksyUridin 5' -Tri-Fosfat

Eksempel 1: Tilberedelse av kinaseekstrakter fra gjæren Saccharomyces cerevisiae som komplementerer TK- aktivitet

Gjærekstrakt inneholdende komplimenterende/reddende ki naseaktivitet ble tilberedt i samarbeid med Uppsala Yeast Resource kompetansesenter iwww. veastlab. vbiol. slu. sel). Breifly;

Tilberedelse av giærcelleekstrakter.

200 ml Gal-medium (1 % gjærekstrakt; Bacto ™Yeast Extract. DIFCO; 2 % peptone, Bacto™Peptone, BD; 2 % galactose (Sigma) og 2 % Agar (Bacto™Agar; DIFCO) ble innokkulert med frisk Saccharomyces cerevisiae stamme Gl 16 (genotype: MATa ura3-52 his3 leu::pLEU-lexAop6). Gjærcellene blir dyrket over natten ved 30°C og tillatt å oppnå en tetthet ved OD6oonm på omtrent 1,2. Cellene ble deretter høstet ved sentrifugering ved 230XG i 5 minutter ved 4°C, ved anvendelse av fire 50 ml Flacon™ polypropylenrør med skrukork. Hver av fellesene ble resuspendert og vasket i 40 ml steril iskald MilliQ™vann og igjen sentrifugert ved 230XG i 5 minutter ved 4°C. MilliQ™vannet ble dekantert fra å kastes. Cellene ble deretter resuspendert i det gjenværende MilliQ vannet ved pipettering. Hver gjærsuspensjon i de 50 ml Fal con polypropylenrørene med skrukork (omtrent 0,8 g per 2,2 ml mikrorør, Sarstedt (Cat#: 72,694,006) ble overført til en 2,2 ml mikrorør med skrukork, som ble veid før tilsetting av gjærsuspensjonen, og sentrifugert ved 230XG i 2 minutter i et kaldt rom (8°C). Det gjenværende vannet ble helt av og kastes. Gjenværende pelleter ble veid (omtrent 0,4 g per 2,2 ml mikrorør). Vekten ble merket på utsiden av det 2,2 ml mikrorøret. Cellene ble deretter lagret ved -80°C før tilberedning av de komplimenterende ekstrakter.

Tilberedning av komplimenterende giærekstrakter

Gjærcellepelletene ble oppbevart ved 25-28°C inntil de var fullstendig tinet (mellom 15 og 20 minutter) og ble deretter oppbevart på et isbad før gjærekstraktpreparerings-prosedyren. Alt senere arbeid ble utført i et kaldt rom (8°C). Til hvert 2,2 ml mikrorør inneholdende 0,4 g gjærcellepellet ble det tilsatt omtrent 0,5 pelletvolumer av 3Xoppbrytningsbuffer, tilpasset ved bruk av mikrorørvolumoverflateindikatoren (lXoppbrytningsbuffer se tabell 1). Deretter ble 1 ml zirkoniumkule tilsatt (gjennom-snittlig kulediameter lmm; Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Boks 788, OK 74005, USA). Deretter ble rørene fullstendig fylt (nesten overfylt) med lXoppbrytningsbuffer (3Xoppbrytningsbuffer = oppbrytningsbuffer fortynnet tre ganger med MilliQ™vann) og korken ble skrudd til forsiktig og tett. Rørene ble ført inn i en Mini-BeadBeater-8™-maskin (Biospec Products, Inc., Bartlesville PO Boks 788, OK 74005, USA). Kulebehandlingen av gjærcellesuspensjonen ble utført 5X i 1 minutt for hver kulebehandling med nedkjøling på isbad (0°C) i 1 til 2 minutter mellom kule-behandlingene. Cellerester og kuler ble deretter fjernt ved sentrifugering i en mikrorør-sentrifuge ved 10000XG i 2 minutter. Supernantantene ble overført til nye 2,2 ml mikrorør og sentrifugert ved 10.000XG i 5 minutter. Enzyminneholdende gjærekstrakt-supernantanter ble utporsjonert ved 10 ul til 2,2 ml mikrorør og deretter lagret ved - 80°C før anvendelse.

Eksempel 2: Kapasitet til preparert gjærekstrakt, sammen med RT, til å detektere BrdUMP gjennom fosforilering og inkorporering i

fastfasetemplat/ primerkomplekset

I dette eksperimentet ble en basisk reaksjonsblanding i buffer inneholdende reagensene listet i tabell 2 anvendt.

Den basiske blandingen i en buffer ble tilberedt fra stamløsninger av hver komponent der 10 ul ble tilsatt til hver brønn av en 96 brønnsplate med immobilitet poly-RA (tre plater ble tilberedt).

Gjærekstrakter ble tinet ved 22-25°C og deretter hensatt på et isbad før anvendelse. Ekstraktet ble seriefortynnet i 5-gangers trinn og 25 ul av toppkonsentrasjonen ble tilsatt rad A mens den neste ble tilsatt rad B osv. BrdUMP ble seriefortynnet 10-ganger startende med 1,3 ganger 10"<5>M og endte på 1,3 x 10"nM. Toppkonsentrasjonen tilsvarende en konsentrasjon 250X mindre enn i tilberedningen beskrevet i eksempel 1. Den høyeste konsentrasjonen ble tilsatt brønnene i kolonne 1 av 96-brønnsplaten og den neste konsentrasjonen i kolonne 2 etc. Også en kolonne uten BrdUMP ble inkludert i hver plate, som deretter ble dekket og forseglet med plastteip (Fasson S695, eat. No. SH 236269, Nunc Danmark). Deretter ble alle tre platene inkubert ved 33°C. Den første platen ble vasket etter 3 timers inkubering og deretter hensatt ved -20°C. Den andre platen ble vasket etter 24 timer og hensatt ved -20°C og den tredje platen ble vasket etter 48 timers inkubering og hensatt ved -20°C. Platene ble fjernet fra -20°C og vasket ved fire påfølgende nedsenkninger i 4X1L of Wash-Buffer pH 8,6 (3 mM Tris-HCl, 0,01 % Tween-20, 0,5 % Triton X-100.0,25 % EtOH CavidiTech AB, Uppsala Sverige). For å visualisere inkorporering av BrdUMP i fastfasen, ble 100 ml av et sporstoff (AP, dvs. alkalisk fosfatase konjugert til et anti-BrdUMP monoklonalt antistoff, RT produkt Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Sverige) tilsatt til hver brønn og inkubert i 90 minutter ved 33°C. Platene ble igjen vasket ved 4 påfølgende nedsenkninger i 4X1L of Wash-Buffer pH 8,6 (3 mM Tris-HCl, 0,01 % Tween 20, 0,5 % Triton X-100, 0,25 % EtOH CavidTech AB, Uppsala Sverige). Etter vasking ble 125 mikroliter av en løsning inneholdende pNPP-substrat 0,5 mgml"<1>, 1 mm MgCl2i 200 mm of Tris-HCL pH 9,8, tilsatt hver brønn. Platene ble inkubert ved romtemperatur. Absorbansen ved OD405ble registrert med en Syva Micro Trak<®>EIA-avleser ved anvendelse av filter med en dobbeltbølgelengde satt til wl=405 og w2=630nm etter 5 minutter og etter ulike intervaller i opptil 24 timer.

Absorbansen etter 5 minutters avlesningen ble trekket fra hver absorbans ved enhver av de sendere avlesningstidspunktene for hver brønn. Absorbansen til stede ble deretter plottet mot mengden gjærekstrakt anvendt og mot BrdUMP-konsentrasjonen. Fra fig. 3 kan det ses av signalet økte jo mer gjær som ble anvendt. BrdUMP-konsentrasjoner ned til 1,3 x 10"nM, ble detektert, se fig. 3.

Eksempel 4: Kapasiteten til det presenterte BrdUMP- deteksjonssystemet til å måle s- TK- aktiviteten og dens korrelasjon med radioaktiv TK- analyse.

I dette eksperimentet ble 20 ulike sera varierende fra normalt serum TK-aktivitet (for eksempel <5 U) opp til svært høy TK-aktivitet (>800 U) ifølge Prolifigen<®>TK-REA (Cat#324250/50 tabletter, Diasorin S.p.A. Saluggia, Italia) utvalgt. Den basiske reaksjonsblandingen i en buffer ble tilberedt ifølge tabell 2, imidlertid ble i tillegg BrdU som gir en sluttkonsentrasjon på 2,5x10"<5>M og gjærekstrakt til en konsentrasjon av 12X lavere enn den høyeste konsentrasjonen gitt i eksempel 2 tilsatt. 125 ul av denne basiske reaksjonsblandingen i en buffer ble tilsatt hver brønn i en 96-brønns plate med immobilisert poly-rA.

Sera ble seriefortynnet i 5-gangers trinn startene ved 1:5 og ende ved 1:625 i basisk reaksjonsblanding i en buffer. 25 ul av hver serumfortynning ble tilsatt en brønn i mikrotiterplaten som inneholdt basisk reaksjonsblanding i en buffer, dvs. et volum tilsvarende; 5, 1, 0,2, 0,04 ul av hvert patentserum ble analysert.

Platen ble deretter forseglet med plastteip (Fasson S695, eat. No. SH 232669, Nunc Danmark) og inkubert i 2 dager ved 33°C. Platen ble vasket ved 4 påfølgende nedsenkninger i 4X1L of Wash-Buffer pH 8,6 (3 mM Tris-HCl, 0,01 % Tween-20, 0,5 % Triton X-100 og 0,25 % EtOH, CavidiTech AB, Uppsala, Sverige). For å visualisere inkorporering av BrdUMP til fastfasen ble 100 ul av et sporstoff (AP dvs. alkalisk fosfatase konjugert til et anti-BrdUMP-monoklonalt antistoff, RT produkt Tracer HS, CavidiTech AB, Uppsala, Sverige) tilsatt hver brønn og platen ble deretter inkubert i 90 minutter ved 33°C. Platen ble vasket ved 4 nye påfølgende nedsenkninger i 4X1L of Wash-Buffer pH 8,6 (3 mM Tris-HCl, 0,01 % Tween-20, 0,5 % Triton X-100 og 0,25 % EtOH, CavidiTech AB, Uppsala Sverige). Etter vasking ble 125 ul av en løsning inneholdende pNPP-substrat 0,5 mgmL"<1>in 1 mM of MgCL2, 200 mM of Tris-HCL, pH 9,8 tilsatt hver brønn. Platen ble inkubert ved romtemperatur. Absorbansen ved OD405ble registrert med en Syva Micro Trak<®>EIA-avleser ved anvendelse av filter med en dobbel bølgelengde satt til wl=405 og w2=630 nm allerede 5 minutter etter tilsetting av pNPP-substratet og deretter ved ulike intervaller i opptil 24 timer.

Absorbansen ved 5 minutters avlesningen ble trukket fra hver absorbans ved enhver av de senere avlesningstidspunkter for hver brønn. A^-verdiene ble rekalkulert til A405per t ved anvendelse av avlesningene innenfor avlesningsområdet til ELISA-avleseren. Resultatene fra pasientsera ved anvendelse av henholdsvis 1 ul og 5 ul er illustrert i fig. 4 der absorbansen er relatert til TK-aktiviteten til stede i sera i forhold til det eksisterende radioaktive Prolifigen<®>TK-REA (Cat#324250/50 tabletter, Diasorin S.p.A. Saluggia, Italia). Resultatene viser en sterk korrelasjon mellom analysen ifølge oppfinnelsen og det eksisterende radioaktive Prolifigen<®>TK-REA.

Referanser:

1. Arnér, Elias S. J. and Eriksson Staffan. Mammalian Deoxyribonucleoside Kinases. Pharmac.Ther.67(2): 155-186. 1995. 2. Gronowitz J.S., Kållander CF .R. TK-REA patent. A method for determining dTK isoenzyme activity and use thereof. EP94923. Pr. 14.05,1982 SE82030401. EP filing date 10.05.1983. 3. Gronowitz J.S., Kållander CF .R., Diderholm H., Hagberg H. and U. Petterson. Application of an in vitro assay for serum thymidine kinase: results on viral disease and malignancies in humans. Int.J.Cancer, 33:5-12, 1984. 4. Gronowitz J.S., Kållander CF .R, Hagberg H. and L. Persson. Deoxythymidine kinase in cerebrospinal fluid: A potential "marker" for brain tumors. Acta Neurochir. 73:1-12, 1984. 5. Doi S, Naito K, Yamada K. Serum deoxythymidine kinase as a progressive marker of hematologi cal malignancy. Nagoya J Med Sei. 1990 Mar; 52(1-4): 19-26. 6. Eriksson B., Hagberg H., Glimelius B., Sundstrom C, Gronowitz J.S. and Kållander C.F.R. Serum thymidine kinase as a prognostic marker in Hodgkin's disease. ActaRadiol.Oncol. 24:167-71, 1985. 7. Hagberg H., Gronowitz J.S., Killander A., Kållander CF., Simonsson B., Sundstrom C. and G. Oberg. Serum thymidine kinase in acute leukemia. Brit.J.Cancer 49:537-540, 1984. 8. Morgan M.A.M., Cooper E.H., Bailey CC, Gronowitz J.S. and C.F.R. Kållander. Serum deoxythymidine kinase in acute lymphoblastic leukaemia in children. TumourDiagnostik & Therapie 6:155-158, 1985. 9. Rehn S., Gronowitz J.S., Kållander C, Sundstrom C, and B. Glimelius. Deoxythymidine kinase in tumour cells and serum of patients with non-Hodgkin lymphomas. Brit.J. Cancer 71:1099-1105, 1995. 10. Simonsson B., Kållander C.F.R, Brenning G, Killander A. and J.S. Gronowitz.

Evaluation of serum deoxythymidine kinase as a marker in multiple myeloma. Brit.J.Haematol. 61:215-224, 1985. 11. Letocha H., Eklov S., Gronowitz J.S., Norle'n B-J., and S. Nilsson. Deoxythymidine kinase in the staging of prostatic adenocarcinoma. The Prostate, 29:15-19, 1996. 12. Gronowitz J.S., Bergstrom R, Nou E. Påhlman S., Brodin O., Nilsson S., and C.F.R. Kållander. Clinical and serologjcal markers of stage and prognosis of small cell lung cancer (SCCL): A multivariate analysis. Cancer, 66:722-32, 1990. 13. Zhang F, Li H, Pendleton AR, Robison JG, Monson KO, Murray BK, OTSTeill KL Thymidine kinase 1 immunoassay: a potential marker for breast cancer. Cancer DetectPrev. 2001;25(1):8-15. 14. Seah LH, Ton SH, Cheong SK, Hamidah NH.An in-house assay for serum deoxythymidine kinase.Malays J Pathol. 1991 Dec; 13(2): 109-13 15. Ohrvik A, Lindh M, Einarsson R, Grassi J, Eriksson S. Sensitive nonradiometric method for determining thymidine kinase 1 activity. Clin Chem. 2004 Sep;50(9): 1597-606. Epub 2004 Jul 09. 16. Armstrong B. The development of a TK tumor maker system for cancer diagnosis, staging and treatment monitoring. Theses submitted for the degree of doctor of philosophy, University of Ulster., 1991 17. Chaperon. D. New recombinant host cell line comprising a thymidylate kinase gene and/or thymidylate synthase gene that have been functionally complemented by at lest one functional homologue of an other organism, useful in activity testing. WO200411627 Pr. 25.07.2002 US2002398948. PCT filing date 24.07.2003.

18. Ekstrand D. H. L., Awad R, Kållander Clas F.R and J. Simon Gronowitz.

A Sensitive Assay For Quantification of RT Activity, based on the use of Carrier Bound Template and Non Radioactive Product Detection, with Special Reference to HIV Isolation. Biotechn. Appl. Biochem. (1996) 23, 95-105.

Claims (24)

1. Fremgangsmåte for å bestemme tymidinkinase (TK)-aktivitet i en biologisk prøve,karakterisert vedat den omfatter trinnene: å bringe, i en beholder inneholdende et enkelttrådet polynukleotid som en primer eller templat festet til en fastfase, en basisk reaksjonsblanding i en buffer omfattende følgende komponenter: et ikke bundet enkelttrådet polynukleotid som et templat og/eller primer, et modifisert deoksynukleosid som et kinaseenzymsubstrat, en fosfatdonor, et nukleotidpolymeriserende enzym og en kinaseenzymkilde fri for TK-aktivitet, i kontakt med den biologiske prøven, inkubering av blandingen, eventuelt vasking av den inkuberte blandingen for å fjerne ubundede reaksjons-komponenter, bestemmelse av mengden modifisert deoksynukleosid som er blitt inkorporert i den fastfasebundede primer eller templat og bestemme TK-aktiviteten til stede i den biologiske prøven ut i fra mengden inkorporert modifisert deoksynukleosid.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den inkuberte blandingen vaskes og der bestemmelsen av mengden inkorporert modifisert deoksynukleosid gjøres ved å tilsette til den inkuberte blandingen et merket affinitetsmolekyl med affinitet for det modifiserte deoksynukleosid og bestemme mengden modifisert deoksynukleosid som er blitt inkorporert ved å bestemme mengden bundet merket affinitetsmolekyl ved hjelp av markøren.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat kinaseenzymkilden er utvalgt fra gruppen bestående av et pattedyrcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et soppcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et bakteriecellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, en kombinasjon av tymidylatkinase (TMPK) og nukleosid di-fosfatkinaser (NdK) fra rensede pattedyrcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede soppcelleekstrakter, en kombinasjon av TMPK og NdK fra rensede bakteriecelleekstrakter, en kombinasjon av rekombinant pattedyr TMPK og rekombinant pattedyr NdK, en kombinasjon av rekombinant sopp TMPK og rekombinant sopp NdK, og en kombinasjon av rekombinant bakteriell TMPK, rekombinant bakteriell NdK og enhver kombinasjon av TMPK og NdK fra nevnte kilder.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat kinaseenzymkilden er et gjærekstrakt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat gjæren til gjærekstraktet er Saccharomyces cerevisiae.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat det modifiserte nukleosid er avledet fra et korresponderende modifisert deoksynukleosid.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisert vedat det modifiserte deoksynukleosid er utvalgt fra gruppen bestående av BromdeoksyUridin, JoddeoksyUridin, FluordeoksyUridin og Vinyldeoksy Tymidin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det modifiserte deoksynukleosid er BromdeoksyUridin.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8,karakterisert vedat fastfasen er en plastoverflate.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat plastoverflaten er en plast-mikrotiterplate.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det fastfasefestede enkelttrådede polynukleotid er festet via dens 5'-ende eller immobilisert ved anvendelse av imidasol i aktiverte plater.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den biologiske prøven er utvalgt fra prøven bestående av blod, serum, plasma, Cerebral Spinal Væske (CSF), pleuralvæske, ascites, vev, celler og ekstrakter av slike.

13. Analysesett for bestemmelse av tymidinkinase (TK)-aktivitet i en biologisk prøve,karakterisert vedat den omfatter i flere atskilte beholdere et fast overflatefestet enkelttrådet polynukleotid som en primer og/eller templat, et ubundet enkelttrådet polynukleotid som et templat og/eller en primer, et modifisert deoksynukleosid som et kinaseenzymsubstrat, en fosfatdonor, et nukleotidpolymeriserende enzym, en kinaseenzymkilde fri for TK-aktivitet, og en buffer.

14. Analysesett ifølge krav 13,karakterisert vedat den ytterligere omfatter referanse-TK for standardisering av analysen.

15. Analysesett ifølge krav 13,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en eller flere mikrotiterplater inneholdende en eller flere brønner inneholdende overflatebundet enkelttrådet polynukleotid.

16. Analysesett ifølge krav 13,karakterisert vedat det ytterligere omfatter et merket affinitetsmolekyl med affinitet for et modifisert deoksynukleosid.

17. Analysesett ifølge krav 16,karakterisert vedat det merkede affinitetsmolekyl er et enzymmerket affinitetskonjugat.

18. Analysesett ifølge krav 17,karakterisert vedat det enzymmerkede affinitetskonjugat er et antistoff merket med alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase.

19. Analysesett ifølge krav 13,karakterisert vedat kinaseenzymkilden fri for TK-aktivitet er utvalgt fra gruppen bestående av et pattedyrcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et soppcellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, et bakteriecellelinjeekstrakt fritt for TK-aktivitet, en kombinasjon av tymidylatkinase (TMPK) og nukleosid di-fosfatkinaser (NdK) fra rensede pattedyrcelleekstrakter, en kombinasjon av tymidylatkinase og NdK fra rensede soppcelleekstrakter, en kombinasjon av tymidylatkinase og NdK fra rensede bakteriecelleekstrakter, en kombinasjon av rekombinant pattedyr tymidylatkinase og rekombinant pattedyr NdK, en kombinasjon av rekombinant sopp- tymidylatkinase og rekombinant sopp-NdK, og en kombinasjon av rekombinant bakteriell tymidylatkinase og rekombinant bakteriell NdK.

20. Analysesett ifølge krav 19,karakterisert vedat kinaseenzymkilden er et gjærekstrakt.

21. Anvendelse av en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-12 og/eller analysesett ifølge et hvilket som helst av kravene 13-20 ved diagnostikk, kontroll og/eller prognose av celleprolifereringsforstyrrelser eller -sykdommer slik som cancer, hos pattedyr, spesielt mennesket.

22. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12 og/eller analysesettet ifølge et hvilket som helst av kravene 13-20 for screening av forbindelser, for eksempel nye medikamentkandidater, som påvirker enzymatiske reaksjonsveier, som kan være til hinder for dannelsen av tymidinfosfater eller interferere med nukleinsyresyntesen.

23. Fremgangsmåte for anvendelse ved diagnostisering, kontroll og/eller prognose av celleprolifereringsforstyrrelser eller -sykdommer, slik som cancer, hos pattedyr, spesielt menneske,karakterisert vedat den omfatter fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12 og/eller analysesettet ifølge et hvilket som helst av kravene 13-20.

24. Fremgangsmåte for anvendelse ved screening av forbindelser for eksempel nye medikamentkandidater som påvirker enzymatiske reaksjonsveier som kan være til hinder for dannelsen av tymidinfosfater eller interferere med nukleinsyresyntesen,karakterisert vedat den omfatter fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12 og/eller analysesettet ifølge et hvilket som helst av kravene 13-20.