DE60316807T2

DE60316807T2 - Neue mutationsmuster in hiv-1 reverser transcriptase, die mit phenotypischer resistenz gegen medikamente korrelieren

Info

Publication number: DE60316807T2
Application number: DE60316807T
Authority: DE
Inventors: Hilde Azijn; Marie-Pierre T.M.M.G De Bethune; Johan Hendrika Vingerhoets
Original assignee: Tibotec Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Janssen R&D Ireland ULC
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2023-07-01
Also published as: EP1520036A1; AU2003251731C1; AU2003251731B2; AU2003251731A1; EP1520036B1; CA2490918A1; WO2004003227A1; DE60316807D1; ATE375400T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Sektor der Nukleinsäurediagnostika und die Identifizierung von Basenvariation in Ziel-Nukleinsäuresequenzen. Die Erfindung liefert neue Mutationen oder Mutationsprofile des HIV-1-Reverse Transkriptase-Gens, die mit einem Phänotyp korreliert sind, der zu Veränderung der Empfindlichkeit gegen Anti-HIV-Arzneimittel führt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der genotypischen Charakterisierung einer HIV-Zielpopulation und die anschließende Assoziation, d. h. Korrelation, dieser Information mit der phänotypischen Interpretation, um Virusmutationsprofile mit Arzneimittelresistenz zu korrelieren. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Nutzung der erfindungsgemäßen Mutationsprofile in Datenbanken, zur Arzneimittelentwicklung, d. h. zum Arzneimitteldesign, und zur Arzneimittelmodifizierung, zum Therapie- und Behandlungsdesign sowie Klinikmanagement.
Die Entwicklung und Standardisierung von Plasma-HIV-1-RNA-Quantifizierungs-Assays hat zur Verwendung von Viruslastmessungen als entscheidendes Monitoring-Werkzeug der Ansprache auf die Therapie geführt. Das Ziel der antiretroviralen Therapie ist die Reduktion der Plasmavirämie unter die Nachweisgrenze auf Langzeitbasis. Bei einer signifikanten Zahl von Patienten wird jedoch keine maximale Unterdrückung der Virusreplikation erreicht, und bei denjenigen, bei denen dieses Ziel erreicht wird, tritt in einer signifikanten Anzahl ein erneutes Ansteigen ("Rebound") der Viruslast auf. Die Viruslastdaten geben keine Informationen über die Ursache des Versagens.
Therapieversagen kann auf zahlreiche Faktoren zurückzuführen sein, einschließlich unzureichender antiviraler Wirkung des Therapieplans, individuellen Varianten des Arzneimittelmetabolismus und der Pharmakodynamik, Problemen bei der Einhaltung des Dosierschemas, Notwendigkeit der Therapieunterbrechung infolge von Toxizität und Resistenz gegen virale Arzneimittel. Bei einem Patienten, der mit einer suboptimalen antiretroviralen Therapie behandelt wird, kann sich zudem eine Arzneimittelresistenz entwickeln, oder ein Patient kann mit arzneimittelresistentem HIV-1 infiziert sein. Obwohl Arzneimittelresistenz möglicherweise nicht der Hauptgrund für Therapieversagen ist, gibt in vielen Fällen jede Situation, die die virale Replikation in Gegenwart eines Inhibitors ermöglicht, den Raum für die Selektion resistenter Varianten.
Resistenz gegen Virusarzneimittel kann als jegliche Veränderung des Virus definiert werden, die die Replikation in Gegenwart eines Inhibitors verbessert. Die Resistenz gegen HIV-1-Arzneimittel wurde zuerst 1989 beschrieben und beinhaltete Patienten, die mit Zidovudin-Monotherapie behandelt worden waren (B. A. Larder et al., Science 243, 1731–1734 (1989)). Das Auftreten von Resistenz wird fast immer während des Verlaufs der Behandlung von Patienten mit einzelnen antiretroviralen Arzneimitteln beobachtet. Wenn Viruskulturen mehrere Replikationsrunden in Gegenwart antiretroviraler Verbindungen in vitro durchlaufen, führt dies in ähnlicher Weise zur Selektion von Viren, deren Replikationszyklus gegenüber den verwendeten antiretroviralen Verbindungen nicht länger empfindlich ist. Die Resistenzentwicklung ist auch mit der Einführung der Doppelkombinationstherapie von Nukleosid-Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) sowie während der Verabreichung der potenteren Nicht-Nukleosid-Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs), Proteaseinhibitoren (PIs) sowie Kombinationen davon beobachtet worden. Individuelle antiretrovirale Mittel unterscheiden sich in der Geschwindigkeit, mit der sich die Resistenz entwickelt: Die Selektion resistenter Varianten kann innerhalb von Behandlungswochen auftreten, oder die Resistenz kann nach einer längeren Behandlungsperiode auftreten.
Umfassende genetische Analyse resistenter viraler Isolate, die durch in vivo- oder in vitro-Selektion erzeugt wurden, hat gezeigt, dass Resistenz allgemein durch Mutationen an irgendeiner spezifischen Stelle/irgendwelchen spezifischen Stellen des viralen Genoms verursacht wird. Die Mutationsmuster, die für HIV-1 beobachtet wurden und über die berichtet wurde, welche mit Arzneimittelresistenz korreliert wurden, sind sehr unterschiedlich; einige antiretrovirale Mittel erfordern nur eine einzigen genetische Veränderung, während andere mehrere Mutationen benötigen, damit die Resistenz auftritt. Eine Zusammenfassung von Mutationen im HIV-Genom, die mit Arzneimittelresistenz korreliert wurden, ist zusammengestellt worden (siehe z. B. Schinazi, Int. Antiviral News. 6, 65 (2000)). Elektronische Listings mit Mutationen sind an unterschiedlichen Stellen im Internet verfügbar, wie hiv-web.lanl.gov/content/index, www.hivb.stanford.edu and www.hivresistanceweb.com.
Das Dokument WO-A-00/73511 offenbart die Mutation 194Q der reversen Transkriptase bei einem mit AZT behandelten Patienten.
Eine genetische Mutation wird normalerweise in Bezug auf den Virus vom Wildtyp beschrieben, d. h. K101N bezieht sich auf das Ersetzen eines Lysins an Codon 101 durch ein Asparagin (The Molecular biology of the Cell, 1994, Garland Publishing, NY). Die Mutationen der Erfindung hängen jedoch nicht von dem aufgeführten Beispiel vom Wildtyp ab, um erfindungsgemäß zu sein. Die Mutation 101N bezieht sich beispielsweise unabhängig davon, ob sich vor der Mutation an 101 ein Lysin befunden hat, auf ein Asparagin am Codon 101. Es kann alternativ gesagt werden, dass eine spezielle Aminosäure an einer gegebenen Position erscheint, wobei "Position" "Codon" entspricht. Mutationen können auch in Nukleinsäuren identifiziert werden, wie RNA, DNA, mRNA.
Der Grad der Empfindlichkeit einer genetischen Variante gegenüber einer antiretroviralen Verbindung wird hier relativ zu dem Virus vom Wildtyp ausgedrückt (HIV IIIB/LAI Referenzsequenz), wie beispielsweise in GenBank, (K03455, gi 327742, M38432) gefunden wird. Eine Änderung der Empfindlichkeit der viralen Arzneimittelresistenz ist als Änderung der Resistenz oder eine Änderung der Empfindlichkeit eines Virenstamm definiert. Die Empfindlichkeiten werden allgemein als Verhältnisse der EC₅₀- oder EC₉₀-Werte (wobei der EC₅₀- oder EC₉₀-Wert die Arzneimittelkonzentration ist, bei der 50% beziehungsweise 90% der viralen Population an der Replikation gehindert werden) des untersuchten Virusstamms ausgedrückt, verglichen mit dem Stamm vom Wildtyp. Die Empfindlichkeit eines Virusstamms kann als Fold Change der Empfindlichkeit ausgedrückt werden, wobei der Fold Change von dem Verhältnis beispielsweise der EC₅₀-Werte eines mutierten Virusstamms, verglichen mit dem Wildtyp, abgeleitet ist. Die Empfindlichkeit eines Virusstamms oder einer Virenpopulation kann insbesondere auch als Resistenz eines Virusstamms ausgedrückt werden, wobei das Verhältnis als Fold-Anstieg der EC₅₀, verglichen mit der EC₅₀ des Wildtyp, angegeben wird.
Da antivirale Arzneimittel über längere Zeiträume verabreicht werden, meistens in Kombination miteinander, und da neue antiretrovirale Mittel entwickelt und den aktuellen Arzneimitteln zugefügt werden, werden neue mit Resistenz korrelierte genetische Varianten identifiziert. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Kombination der antiretroviralen Mittel die Resistenzcharakteristika beeinflussen kann.
Nachdem sich die Virenresistenz entwickelt hat, sind die Möglichkeiten der rettenden Therapie wegen der Kreuzresistenz innerhalb jeder Arzneimittelklasse wahrscheinlich deutlich eingeschränkt. Dies ist sowohl für die Erstbehandlung als auch für eine erforderliche Therapieänderung von Bedeutung, um das Auftreten von Resistenz zu minimieren und die Langzeitprognose des Patienten zu verbessern. Die Wahl des Therapieschemas wird durch die Kenntnis des Resistenzprofils der zirkulierenden Viruspopulation gestützt. Therapiekombinationen haben außerdem eine größere Wirkungswahrscheinlichkeit, wenn sie Mittel enthalten, die ein erwiesenes Potential der Unterdrückung einer speziellen Viruspopulation haben.
Zahlreiche Anmeldungen beschreiben das Auftreten von Mutationen bei HIV und ihre Korrelation mit der Entwicklung von Arzneimittelresistenz ( WO 00/73511 ; WO 02/33402 ; WO 02/22076 ; WO 00/78996 ). Die vorliegende Erfindung liefert einen Beitrag zum Stand der Technik in Form von Mutationen in dem Reverse Transkriptase-Gen sowie ihre Korrelation, d. h. Assoziation, mit der Resistenz gegen virale Arzneimittel.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Wissen, dass die Mutation 194G mit einem Fold Change der Resistenz korreliert, kann in zahlreichen brauchbaren Verfahren genutzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit eines Reverse Transkriptase-Inhibitors, bezogen auf die Anwesenheit mindestens einer Mutation 194G in der HIV-Reverse Transkriptase. Die Anwesenheit der Mutation korreliert mit einem Fold Change der Empfindlichkeit oder Resistenz eines HIV-1-Virenstamms gegenüber mindestens einem Reverse Transkriptase-Arzneimittel. Die Wirksamkeit eines Reverse Transkriptase-Inhibitors in Gegenwart von mindestens einer der Mutationen kann unter Verwendung von z. B. enzymatischen, phänotypischen und genotypischen Verfahren bestimmt werden. Die Korrelation zwischen den Mutationsprofilen in HIV-1-Reverser Transkriptase und der Arzneimittelverwendung kann für klinische, toxikologische und forensische Anwendungen nützlich sein. Es kann ein kombinierter Ansatz verwendet werden, der das Testen von genotypische und phänotypischer Resistenz beinhaltet, um Mutationen mit Resistenzphänotypen zu korrelieren. Die vorliegende Erfindung liefert insbesondere eine Korrelation zwischen mindestens einem HIV-1-Stamm mit mindestens einer 194G-Mutation in der HIV-1-Reverse Transkriptase und einem Fold Change der Resistenz.
Die Wirksamkeit eines Reverse Transkriptase-Inhibitors als antivirale Therapie für einen mit mindestens einem HIV-1-Stamm infizierten Patienten kann unter Verwendung eines Verfahrens bestimmt werden, umfassend: (i) Bestimmen, ob eine von einem HIV-infizierten Patienten erhaltene Probe eine HIV-1-Reverse Transkriptase mit mindestens einer Mutation 194G umfasst, und (ii) Korrelieren der Anwesenheit der mindestens einen Mutation in Stufe (i) mit einer Veränderung der Wirksamkeit des Reverse Transkriptase-Inhibitors.
Eine Änderung der Wirksamkeit kann allgemein als Fold Change der Empfindlichkeit ausgedrückt werden. Der Fold Change kann mit einem zellulären Assay bestimmt werden, der den zytopathogenen Assay oder das Antivirogram^® ( WO 97/27480 ) beinhaltet. Der Fold Change der Empfindlichkeit kann alternativ durch Datenbankanalyse abgeleitet werden, wie dem VirtualPhenotype^TM ( WO 01/79540 ). Eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber dem Virus vom Wildtyp korreliert mit einer erhöhten Arzneimittelresistenz des Virus und somit reduzierter Wirksamkeit des Arzneimittels. Um die Empfindlichkeit des Virus gegenüber dem Arzneimittel zu bestimmen, kann die Wirksamkeit des mutierten Enzyms mit der Wirksamkeit eines Enzyms vom Wildtyp verglichen werden. Bei Phänotypisierungs-Assays können pseudotypisierte Viren verwendet werden. Die in HIV-1-Reverse Transkriptase vorliegenden Mutationen können auf Nukleinsäure- oder Aminosäureebene unter Verwendung von Sequenzierungs- oder Hybridisierungstechniken bestimmt werden. Es kann ein Datensatz erstellt werden, der die Region des Patientenvirus zeigt, die sequenziert worden ist, einschließlich mindestens einer Mutation 194G. Der Datensatz kann antiretrovirale Arzneimittel, Arzneimittel, für das bzw. die eine bekannte mit Resistenz verbundene Mutation identifiziert worden ist bzw. sind und/oder das Ausmaß beinhalten, in dem die beobachtete(n) Mutation(en) ausgewählt aus mindestens 194G die Resistenz gegen Arzneimittel anzeigen. Die zu bewertende Probe kann eine Körperflüssigkeit, einschließlich Blut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, oder ein Gewebe einschließlich Darmgeweben sein.
Die Tatsache, dass bestimmte Daten korrelieren, zeigt, dass es zwischen den Daten eine Kausalbeziehung gibt. Ein spezielles Ergebnis erhöht die Wahrscheinlichkeit einer speziellen Schussfolgerung, verglichen mit anderen Schlussfolgerungen.
Ein Arzneimittel, das gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase wirksam ist, ist nach einem Verfahren identifiziert worden, umfassend: (i) Bereitstellen einer HIV-1-Reverse Transkriptase umfassenden Nukleinsäure, umfassend mindestens eine Mutation 194G; (ii) Bestimmen einer phänotypischen Reaktion des rekombinanten HIV-1-Virus auf das Arzneimittel und (iii) Identifizieren eines Arzneimittels, das gegen mutantes HIV wirksam ist, auf Basis der phänotypischen Reaktion von Stufe (ii). Die Nukleinsäure, die HIV-1 der Stufe (i) umfasst, kann zu einer proviralen Nukleinsäure rekombiniert werden, bei der die Sequenz deletiert worden ist, um ein rekombinantes HIV-1-Virus zu erzeugen.
Das Identifizieren eines Arzneimittels ist definiert als das Treffen einer Auswahl von Arzneimitteln, die klinisch verfügbar sind, auf Grundlage der Wirksamkeit des Arzneimittels. Zusätzlich zu der Auswahl der klinisch verfügbaren Arzneimittel betrifft das Identifizieren auch die Auswahl der Kandidaten für das klinische Arzneimittel. Die phänotypische Reaktion kann unter Verwendung zellulärer Assays bestimmt werden, wie dem Antivirogram^®. Ein wirksames Arzneimittel gegen mutantes HIV-1, das mindestens eine Mutation 194G in der Reversen Transkriptase umfasst, ist definiert als Arzneimittel mit einer phänotypischen Reaktion, die z. B. als Fold Change der Empfindlichkeit ausgedrückt wird, der unterhalb einer definierten Trennlinie liegt, die für ein Arzneimittel bestimmt werden kann.
Ein weiteres brauchbares Verfahren zum Identifizieren eines Arzneimittels, das gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase wirksam ist, umfasst: (i) Bereitstellen einer HIV-1-Reversen Transkriptase, umfassend mindestens eine Mutation 194G, (ii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf die HIV-1-Reverse Transkriptase für das Arzneimittel, (iii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf HIV-1-Reverse Transkriptase vom Wildtyp, (iii) Bestimmen des Verhältnisses der in Stufe (iii) bestimmten Wirksamkeit zu der in Stufe (ii) bestimmten Wirksamkeit, (v) Identifizieren eines wirksamen Arzneimittels gegen mutantes HIV auf Basis des Verhältnisses von Stufe (iv). Ein Verhältnis, das unter einem definierten Trennlinienwert liegt, der für dieses Arzneimittel spezifisch sein kann, zeigt an, dass das Arzneimittel gegen mutantes HIV-1 wirksam ist ( WO 02/33402 ).
Die Wirksamkeit des Arzneimittels gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase mit mindestens einer Mutation 194G kann in einem enzymatischen Assay bestimmt werden, wobei die mutante Reverse Transkriptase durch ihre enzymatischen Charakteristika mit dem Enzym vom Wildtyp verglichen wird (z. B. Maximalgeschwindigkeit (V_max), Michaelis-Menten-Konstante (K_m), Katalysatorkonstante (k_cat)) (Antimicrob. Agents Chemotherap. 1989 33(12), 2109–2114; Antimicrob. Agents Chemotherap. 1989 33(10), 1729–1734; Anal. Biochem. 1996,235(2) 141–152). Eine Aktivität bedeutet jede Ausgabe, die der Assay erzeugt, einschließlich Fluoreszenz, Fluoreszenzpolarisierung, Lumineszenz, Extinktion, Radioaktivität, Resonanzenergietransfermechanismus, Magnetismus.
Die Reaktion einer mutanten HIV-Reversen Transkriptase mit mindestens einer Mutation 194G kann als virale Fitness ausgedrückt werden ( WO 00/78994 ). Diese virale Fitness kann als Fähigkeit eines Virenstamms zur Replikation in Gegenwart oder Abwesenheit einer Komponente, wie eines Reverse Transkriptase-Inhibitors, definiert werden. Diese virale Fitness hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich viralen Faktoren, zu denen Mutationen gehören, die in viralen Proteinen stattfinden, Wirtsfaktoren, zu denen Immunreaktion gehört, Differentialexpression von Membranproteinen und Selektionsdrücken, wozu die Anwesenheit antiviraler Mittel gehört, wie Reverse Transkriptase-Inhibitoren.
Die Reverse Transkriptase-Inhibitoren, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden können, umfassen interessanterweise Zidovudin, Nevirapin, Efavirenz, Abacavir, Capravirin, Lamivudin, Didanosin, Stavudin, Adefovir, Zalcitabin, Delavirdin, DPC-086, DPC-083, Tenofovir und Verbindung 1 (4-[[6-Amino-5-brom-2-[(4-cyanophenyl)-amino]-4-pyrimidinyl]oxy]-3,5-dimethylbenzonitril, Verbindung 1). Der Reverse Transkriptase-Inhibitor ist insbesondere ausgewählt aus Nevirapin, Efavirenz, Capravirin, DPC-086 und Verbindung 1. Der Inhibitor ist geeigneterweise ausgewählt aus Verbindung 1, Nevarapin und Efavirenz.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden zweckmäßig unter Verwendung von Proben eines HIV-infizierten Patienten durchgeführt, der mit mindestens einem Reverse Transkriptase-Inhibitor behandelt worden ist. Der Patient weist insbesondere mutante Viren auf, die mindestens eine zusätzliche Mutation an der Position der HIV-Reverse Transkriptase ausgewählt aus 41, 62, 65, 67, 69, 70, 74, 75, 98, 100, 101, 103, 106, 108, 116, 118, 138, 151, 178, 181, 184, 188, 190, 210, 215, 219, 225, 227, 230, 234, 236, 238 und 318 enthalten. Die mutierten Viren sind bevorzugter resistent gegen die Therapie, die der Patient erhalten hat.
Ein Vektor, umfassend eine HIV-1-Sequenz mit mindestens einer Mutation 194G in dem HIV-1-Reverse Transkriptase-Gen, kann für die phänotypische Analyse brauchbar sein. Das aktuelle Wissen über die Korrelation zwischen einem Fold Change der Empfindlichkeit und der Anwesenheit von mindestens einer Mutation 194G in der HIV-1-Reverse Transkriptase kann zur Herstellung einer isolierten und gereinigten HIV-1-Reverse Transkriptase-Sequenz mit mindestens einer Mutation 194G verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Kenntnis der Mutationen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung von Sonden und Primern, die auf diese Mutationen gerichtet sind. Ein isoliertes und gereinigtes Oligonukleotid, umfassend eine HIV-1-Reverse Transkriptase-Sequenz von 5 bis 100 Basen, umfassend mindestens eine Mutation 194G, kann zur in-vitro-Diagnostik der Resistenz der Viren gegen Arzneimittel brauchbar sein. Geeignete Oligonukleotide für Nukleinsäure-Amplifizierungstechniken enthalten 5 bis 35 Nukleinsäurebasen. Derartiges Oligonukleotid enthält besonders geeignet zwischen 15 und 30 Nukleinsäurebasen. Ein Oligonukleotid kann die mutante Base am 3'-Ende enthalten, um so die Detektion der Mutante unter Verwendung von PCR zu ermöglichen. Es können auch Oligonukleotide als Sonden einschließlich molekularer Ortungsgeräte (Tyagi, Nature Biotechnol. 1998, 16(1) 49–53), und TaqMan-Sonden verwendet werden.
Ein Computersystem, welches durch eine Software gesteuert wird, wobei die Software die Anwesenheit mindestens einer Mutation in einer Reversen Transkriptase eines menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) und einem Fold Change der Empfindlichkeit mindestens eines Stammes von HIV-1 gegenüber einem Reverse Transkriptase-Inhibitor korreliert, dadurch gekennzeichnet, dass die Software mindestens einen Datensatz verwendet, der einer Korrelation zwischen mindestens einer Mutation 194G in der Reversen Transkriptase und der Behandlung mit mindestens einem Reverse Transkriptase-Inhibitor entspricht, kann zur Bewertung der Resistenz gegenüber der Therapie verwendet werden.
Es kann ein neurales Netz verwendet werden, welches die Entwicklung der Resistenz gegen ein therapeutisches Mittel oder die Empfindlichkeit gegen mindestens einen Virusstamm, umfassend mindestens eine Mutation 194G, vorhersagt ( WO 01/95230 ).
Genotypisierungsmethoden
Die Resistenz von HIV gegen antiretrovirale Arzneimittel kann auf genotypischer Ebene bestimmt werden, indem Mutationen in dem HIV-1-Genom identifiziert werden und daraus die Resistenz von HIV-1 gegen antiretrovirale Arzneimittel gefolgert wird, indem nach Mutationsmustern gesucht wird, die bekanntermaßen mit Resistenz korrelieren. Assays zur Detektierung von Mutationen von HIV-1 können auf Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Amplifizierung viraler Genomsequenzen basieren. Diese amplifizierten Sequenzen werden dann unter Verwendung von Hybridisierungs- oder Sequenzierungstechniken analysiert. Zu Assays auf Hybridisierungsbasis gehört Primer-spezifische PCR, die synthetische Oligonukleotide nutzt, die entworfen worden sind, um selektives Priming der DNA-Synthese zu ermöglichen. Siehe B. A. Larder et al., AIDS 5, 137–144 (1991); D. D. Richman et al., J. Infect. Dis. 164, 1075–1081 (1991); T. R. Gingeras et al., J. Infect.
Dis. 164, 1066–1074 (1991). Nur wenn die Primersequenzen am 3'-Ende zu der Zielsequenz (Wildtyp oder Mutante) passen, wird die Amplifizierung der Zielsequenzen möglich, und es werden DNA-Fragmente produziert. Die Kenntnis der Primersequenzen ermöglicht die Folgerung der Sequenzen des untersuchten viralen Isolats, jedoch nur für die Region, die durch die Primersequenzen abgedeckt wird. Zu anderen Assays auf Hybridisierungsbasis gehören differentielle Hybridisierung (P. S. Eastman et al., J. Acq. Imm. Def. Syndr. Human Retrovirol. 9, 264–273 (1995); M. Holodniy et al., J. Virol. 69, 3510–3516 (1995); P. S. Eastman et al., J. Clin. Micro. 33, 2777–2780 (1995).); Line Probe Assay (LiPAJ HIV-11 RT, Innogenetics) (L. Stuyver et al., Antimicrob. Agents Chemotherap. 41, 284–291 (1997)) und Biochip-Technologie, wie GENECHIP^® Technologie (Affymetrix) (R. T. D'Aquila, Clin. Diagnost. Virol. 3, 299–316 (1995); S. P. A. Fodor et al., Nature 364, 555–556 (1993); S. P. A. Fodor, Nature 227, 393–395 (1997)). Die Sequenz kann auch unter Verwendung von massenspektroskopischen Techniken bestimmt werden. DNA-Sequenzierungs-Assays liefern Informationen über alle Nukleotide der sequenzierten Region. Die Sequenzierungsergebnisse können als Aminosäureveränderungen an Positionen in dem Protease-Gen und dem Reverse Transkriptase-Gen angegeben werden, verglichen mit der Referenzsequenz vom Wildtyp. Die Änderungen, die in dem Genotypisierungsdatensatz enthalten sind, können auf Mutationen an Positionen begrenzt sein, die sich bekanntermaßen als mit Arzneimittelresistenz zusammenhängende Polymorphismen manifestieren. Polymorphismus an Positionen, die nicht mit Arzneimittelresistenz zusammenhängen, kann weggelassen werden.
Phänotypisierungsmethoden
Phänotypisierungs-Assays messen die Fähigkeit eines replizierenden Virus, in Gegenwart von Verbindungen zu wachsen, verglichen mit einem Referenzvirus vom Wildtyp, wie z. B. HIV-1/LAI, HIV-1/NL4.3, HIV-1/HXB2 oder z. B. HIV-2/ROD. Phänotypisierungs-Assays werden alternativ mit pseudotypisierten Viren durchgeführt, die sich nicht replizieren können. Diese Assays messen demnach direkt den Grad der Virusresistenz, oder die Empfindlichkeit gegenüber spezifischen Inhibitoren. In diesem Fall misst man die Wirkung aller Mutationswechselwirkungen, die Wirkungen von genetischen Veränderungen, die noch unbekannt oder nicht zuvor identifiziert worden sind, die Wirkung des Hintergrund-Genotyps, usw. auf den Phänotyp. Einige phänotypische Assays werden nachfolgend erörtert.
Zytopathischer Effekt-Assay (CPE-Assay)
Die Bestimmung der antiviralen Wirkung einer Verbindung erfolgt wie in R. Pauwels et al. (J. Virol. Methods 1988; 20(4):309–21) beschrieben. In jede Mulde einer Mikrotiterplate mit flachem Boden werden verschiedene Konzentrationen an Testverbindungen eingebracht. Anschließend werden HIV- und MT4-Zellen mit einer Endkonzentration von 200–250 50% Zellkultur infizierenden Dosen (CCID₅₀)/Mulde beziehungsweise 30.000 Zellen/Mulde zugegeben. Nachdem 5 Tage inkubiert worden ist (37°C, 5% CO₂), wird die zytopathische Wirkung des replizierenden Virus nach dem kolorimetischen MTT-Verfahren mit Tetrazolium bestimmt. Die Dosis, die 50% der Zellen vor dem zytopathischen Effekt des Virus schützt, ist als EC₅₀ definiert, während die Dosis, die 90% Schutz erreicht, als EC₉₀ definiert ist.
Reportergen-Assay
Der Reportergen-Assay verwendet MT4-LTR-EGFP-Zellen. Nach Infektion durch HIV-1 erhöht die Expression des viralen tat-Produkts die Transkription aus dem HIV-1 LTR-Promoter, die zu Expression des Reportergenprodukts auf hohem Niveau führt. Das Assayverfahren ist dem CPE-Assay ähnlich, außer der Endablesung des Assays, die am 3. Tag durch Messen der relativen Fluoreszenz der behandelten Kulturen und Vergleich mit der relativen Fluoreszenz der unbehandelten Kulturen durchgeführt wird. Die EC₅₀ oder EC₉₀ einer Verbindung wird als die Konzentration definiert, die die relative Fluoreszenz um 50% beziehungsweise 90% inhibiert.
Antiviraler Assay mit PBMC-Kulturen
Die Reinigung und Aktivierung von PBMCs sowie die antiviralen Assays werden wie beschrieben (CDER, Guidance for Industry Points to Consider in the Preclinical Development of Antiviral Drugs, 1990) durchgeführt. Der Assay misst den Inhibierungsgrad eines Arzneimittels auf die HIV p24-Antigenproduktion durch periphere mononukleäre Blutzell-(PBMC)-Kulturen, die akut mit einem Virenstamm infiziert werden. Die Bestimmung der Empfindlichkeit verwendet Photohämaglutinin-(PHA)-stimulierte PBMCs von normalen Spendern. In den in vitro-Infektionsexperimenten werden 1000 CCID₅₀ pro Million PHA-stimulierter PBMCs verwendet. Die Kulturen werden alle 3 bis 4 Tage in Hälften geteilt, und zusammen mit der Zugabe von neuem Medium wird Verbindung zugefügt.
Die p24-Antigen-Produktion wird mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (NEN) in dem Moment gemessen, in dem die p24-Produktion der unbehandelten infizierten Kulturen maximal ist, d. h. zwischen 7 und 11 Tagen nach der Infektion.
Die % p24-Produktion wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
wobei [p24]_Sample die p24-Konzentration in einer infizierten behandelten Kultur ist, [p24]_{HIV control} die p24-Konzentration in einer infizierten unbehandelten Kultur ist und [p24]_Mock
control die p24-Konzentration in einer scheininfizierten (MOCK-infizierten) Kultur ist. Die Dosis, die gemäß der obigen Formel 50% p24-Produktion erreicht, wird als EC₅₀ definiert, während die Dosis, die gemäß der obigen Formel 10% p24-Produktion erreicht, als EC₉₀ definiert wird.
Antiviraler Assay mit Monozyten/Makrophagen
Der Assay misst den Grad, mit dem ein Arzneimittel die HIV p24-Antigenproduktion inhibiert, mit primären Monozyten/Makrophagen, die akut mit HIV-1/BaL (300 CCID₅₀/ml) infiziert werden. Die Bestimmung der Empfindlichkeit verwendet Monozyten/Makrophagen, die aus PBMCs von normalen Spendern durch Haften an Kunststoff isoliert worden sind. Die Kulturen werden alle 5 Tage mit Komplettmedium versorgt, das die geeigneten Konzentrationen der Verbindung enthält. Die p24-Antigenproduktion wird am 14. Tag nach Virusprovokation gemessen, und die EC₅₀- und EC₉₀-Werte werden berechnet.
Rekombinante Virus-Assays
Ein rekombinanter Virus-Assay (RVA) beginnt mit der Amplifizierung viraler Zielsequenzen mittels PCR. Die Amplikons werden in einen proviralen Laborklon eingebracht, bei dem die Sequenzen deletiert worden sind, die in dem Amplikon vorhanden sind. Hierdurch wird ein Bestand an chimären Viren erzeugt. Die Viren werden auf ihre Fähigkeit getestet, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an Arzneimitteln zu wachsen. Die Ergebnisse werden erhalten, indem EC₅₀-Werte für jeden Inhibitor berechnet werden, und die Ergebnisse werden als EC₅₀-Werte angegeben, ausgedrückt in μm-Konzentrationen, oder indem das Verhältnis der für die chimären Viren gefundenen EC₅₀-Werte mit den EC₅₀-Werten, die für einen parallel getesteten, empfindlichen Laborvirus vom Wildtyp gefunden wurden, berechnet wird. Im letzteren Fall wird die Resistenz als "Fold-Resistenz" angegeben (Fold Change der Empfindlichkeit, FC), verglichen mit einem empfindlichen HIV-1-Stamm vom Wildtyp. Die Verwendung von Reporter-Gensystemen zum Testen der Empfindlichkeit ermöglicht die Implementierung von Laborautomatisierung und Standardisierung (Pauwels et al., J. Virol. Methods 20, 309–321 (1988); S. Paulous et al., International Workshop an HIV Drug Resistance, Treatment Strategies and Eradication, St. Petersburg, Florida, USA, Abstr. 46 (1997); und S. G. Deeks et al., 2nd International Workshop an HIV Drug Resistance and Treatment Strategies, Lake Maggiore, Italien, Abstr. 53 (1998)).
Der Antivirogram^©-Assay (Virco) ( WO 97/27480 ) basiert auf homologer Rekombination der von Patienten erhaltenen HIV-1 gag/PR/RT-Sequenzen zu einem proviralen HIV-1-Klon, bei dem die gag/PR/RT-Sequenzen entsprechend deletiert sind. Ein ähnlicher Assay (Phenosense^® ViroLogic, WO 97/27319 ) basiert auf enzymatischer Ligierung der von Patienten erhaltenen PR/RT-Sequenzen zu einem entsprechend deletierten proviralen Vektor, der ein Indikatorgen, Luciferase, trägt, das in das deletierte HIV-1 Hüllgen insertiert ist. Von Bioalliance (Phenoscript, WO 02/38792 ) ist ein weiterer Assay entwickelt worden. Die Entwicklung von High-Throughput-Phänotypisierungs- und Genotypisierungs-Assays hat die Erstellung einer Datenbank ermöglicht, die die phänotypischen Resistenzdaten und die genotypischen Sequenzen von mehr als 30.000 klinischen Isolaten enthält.
Experimenteller Teil
Beispiel 1. Die Identifizierung von Mutationsmustern in HIV-1-Reverser Transkriptase und die korrelierte phänotypische Resistenz.
Plasmaproben HIV-1-infizierter Individuen aus der klinischen Routinepraxis wurden erhalten und auf Trockeneis zum Labor transportiert und bis zur Analyse bei –70°C gelagert. Virale RNA wurde unter Verwendung des QIAAMP^® Viral RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus 200 μL Patientenplasma extrahiert. cDNA, die einen Teil des pol-Gens bildete, wurde unter Verwendung von Expand^TM Reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim) hergestellt. Ein 2,2 kb Fragment, welches die Protease- und RT-Regionen kodierte, wurde durch verschachtelte Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von PCR-Primern und Bedingungen wie beschrieben aus viraler RNA amplifiziert, die von Patienten erhalten worden war. (K. Hertogs et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42: 269–276 (1998), WO 01/81624 ). Dieses genetische Material wurde in Phänotypisierungs- und Genotypisierungsexperimenten erhalten.
Die phänotypische Analyse wurde unter Verwendung des rekombinanten Virus-Assays durchgeführt (Antivirogram^®) ( WO 97/27480 ). MT-4 Zellen (S. Harada et al, Science 229: 563–566 (1985)) wurden mit pol-Gen-PCR-Fragmenten und dem Protease-RT-deletierten HIV-1-molekularen Klon, pGEM3ΔPRT, co-transfektiziert. Dies führte zu lebensfähigen rekombinanten Viren, die Protease/RT von dem Donor-PCR-Fragment enthielten. Nach homologer Rekombination von Amplikons zu einem PR-RT-deletierten proviralen Klon wurden die resultierenden rekombinanten Viren geerntet, titriert und für in vitro-Empfindlichkeitstests gegenüber antiretroviralen Arzneimitteln verwendet. Die Ergebnisse dieser Analyse wurden als Fold Change der Empfindlichkeit ausgedrückt, die den Fold Change des Mittelwerts der EC₅₀ (μM) eines speziellen Arzneimittels im Test mit rekombinanten Virusisolaten vom Patienten relativ zu dem Mittelwert der EC₅₀ (μM) desselben Arzneimittels widerspiegeln, der beim Test mit einem Referenz-Virusisolat vom Wildtyp (IIIB/LAI) erhalten wurde. Die Genotypisierung wurde mit einer automatisierten Vollsequenzanalyse auf Populationsbasis über einen Ansatz auf Dideoxynukleotidbasis unter Verwendung des BigDye^TM Terminatorkits (Applied Biosystems, Inc.) und Auflösung mit einem ABI 377 DNA-Sequenzer durchgeführt. Die Genotypen sind als Aminosäureänderungen an Positionen an dem Reverse Transkriptase-Gen angegeben, verglichen mit der Referenzsequenz vom Wildtyp (HXB2). Die Analyse durch VirtualPhenotype^TM Interpretationssoftware ( WO 01/79540 ) ermöglichte die Detektierung von Mutationsmustern in der Datenbank, die die Gensequenzen der klinischen Isolate enthielt, und Verlinkung mit den entsprechenden Resistenzprofilen derselben Isolate.
Beispiel 2. Empfindlichkeitsanalysen von HIV-1-Varianten, die durch gezielte (site-directed) Mutagenese konstruiert wurden
Mutationen in der Protease- oder RT-Kodierregion wurden durch gezielte Mutagenese unter Verwendung des QuikChange^® Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE^®) des Wildtyp-HXB2-D EcoRl-Pstl Restriktionsenzymfragments durchgeführt, welches das HIV-1 pol-Gen umfasst, und in pGEM3 (Promega) kloniert. Alle mutanten Klone wurden durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert. PCR-Fragmente wurden aus den mutierten Klonen hergestellt, und die geänderten Reverse Transkriptase-Kodierregionen wurden durch homologe Rekombination wie oben beschrieben in HIV-1-HXB2-D überführt. Die Empfindlichkeit dieser rekombinanten Viren gegenüber Arzneimitteln wurde durch den MT-4-Zell-CPE-Schutz-Assay bestimmt.
Beispiel 3. In vitro-Selektion resistenter Stämme
Zellen wurden mit hoher MOI (wie 1–50 CCID₅₀/Zelle) entsprechend > 10⁹ viralen RNA-Kopien/ml infiziert. Diese Experimente sind entworfen worden, um die Quasi-Spezies-Variabilität zu imitieren, die man bei HIV-infizierten Individuen beobachten kann, bei denen täglich 10⁹ bis 10¹⁰ neue Viren mit einer Mutationsrate von 10^–4 bis 10^–5 produziert werden. Die infizierten MT4-LTR-EGFP-Zellen wurden maximal 30 Tage lang mit Inhibitoren in 40, 200 nM, 1 μM und höher behandelt. Die Kulturen werden in Unterkulturen geteilt und alle 3 bis 4 Tage auf virusinduzierte Fluoreszenz und Zytopathizität untersucht Wenn ein vollständiger Virendurchbruch (100% CPE) beobachtet wurde, wurden die Überstände aufgefangen und gelagert (neuer Virenstamm). Wenn kein vollständiger CPE beobachtet wurde, wurden die Zellen in Unterkulturen geteilt und in Gegenwart der gleichen Konzentration der Verbindung bis zum vollständigen Virusdurchbruch weiter gezüchtet, maximal 30 Tage lang. Aus den entstandenen Viruspopulationen wurde in Abwesenheit der Verbindungen ein Virusbestand gezüchtet und titriert. Die Empfindlichkeiten der isolierten Stämme gegenüber HIV-1-RT-Inhibitoren wurden bestimmt, und die Stämme wurden genotypisiert.
Es wurden in vitro-Arzneimittel-Selektionsexperimente ausgehend von HIV-1/LAI vom Wildtyp unter Druck von Verbindung 1 durchgeführt. Tabelle 1 zeigt die genotypische und phänotypische Charakterisierung der selektierten Stämme.

Claims

Computersystem, welches durch eine Software gesteuert wird, wobei die Software die Anwesenheit mindestens einer Mutation in einer Reversen Transkriptase eines menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) und eine Änderung der Empfindlichkeit mindestens eines Stammes von HIV-1 gegenüber einem Reverse-Transkriptase-Inhibitor korreliert, dadurch gekennzeichnet, dass die Software mindestens einen Datensatz verwendet, der einer Korrelation zwischen mindestens einer Mutation 194G in der Reversen Transkriptase und der Behandlung mit mindestens einem Reverse-Transkriptase-Inhibitor entspricht.
In-Vitro-Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit eines Reverse-Transkriptase-Inhibitors als antivirale Therapie für einen Patienten, der mit mindestens einem mutanten HIV-1-Stamm infiziert ist, umfassend: (i) Bestimmen, ob eine von einem HIV-infizierten Patienten erhaltene Probe eine Nukleinsäure umfasst, die HIV-1-Reverse Transkriptase mit mindestens einer Mutation 194G kodiert; (ii) Korrelieren der Anwesenheit der mindestens einen Mutation in Stufe (i) mit einer Veränderung der Wirksamkeit des Reverse-Transkriptase-Inhibitors.
Verfahren zum Identifizieren eines Arzneimittels, das gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase wirksam ist, umfassend: (i) Bereitstellen einer HIV-1-Reverse-Transkriptase-Nukleinsäure, umfassend mindestens eine Mutation 194G; (ii) Rekombinieren der Nukleinsäure aus Stufe (i) zu einer proviralen Nukleinsäure, bei der die Sequenz deletiert worden ist, um ein rekombinantes HIV-1-Virus zu erzeugen; (iii) Bestimmen einer phänotypischen Reaktion des Arzneimittels auf die HIV-1-Reverse Transkriptase und (iv) Identifizieren eines Arzneimittels, das gegen mutantes HIV-1 wirksam ist, auf Basis der phänotypischen Reaktion von Stufe (iii).
Verfahren zum Identifizieren eines Arzneimittels, das gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase wirksam ist, umfassend: (i) Bereitstellen einer HIV-1-ReverseTranskriptase, umfassend mindestens eine Mutation 194G; (ii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf die HIV-1-Reverse Transkriptase; (iii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf HIV-1-Reverse Transkriptase vom Wildtyp; (iv) Bestimmen des Verhältnisses der in Stufe (iii) bestimmten Wirksamkeit zu der in Stufe (ii) bestimmten Wirksamkeit; (v) Identifizieren eines wirksamen Arzneimittels gegen mutantes HIV-1 auf Basis des Verhältnisses von Stufe (iv).
In-Vitro-Verfahren zur Bewertung einer Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber viralem Arzneimittel, umfassend: (i) Bestimmen, ob eine von einem HIV-infizierten Patienten erhaltene Probe eine HIV-1-Reverse Transkriptase mit mindestens einer Mutation 194G umfasst; (ii) Korrelieren der Anwesenheit der mindestens einen Mutation in Stufe (i) mit einer Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber viralem Arzneimittel.
Verfahren zur Bewertung einer Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber viralem Arzneimittel, umfassend: (i) Bereitstellen eines HIV-1, umfassend eine Reverse Transkriptase, umfassend mindestens eine Mutation 194G; (ii) Bestimmen einer phänotypischen Reaktion des Virus auf das Arzneimittel und (iii) Korrelieren der phänotypischen Reaktion von Stufe (ii) auf eine Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber viralem Arzneimittel.
Verfahren zur Bewertung einer Veränderung der Arzneimittelwirksamkeit gegen mutante HIV-1-Reverse Transkriptase, umfassend: (i) Bereitstellen einer HIV-1-Reversen Transkriptase, umfassend mindestens eine Mutation 194G; (ii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf die Reverse Transkriptase; (iii) Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneimittels auf HIV-1-Reverse Transkriptase vom Wildtyp und (iv) Bestimmen des Verhältnisses der in Stufe (iii) bestimmten Wirksamkeit zu der in Stufe (ii) bestimmten Wirksamkeit; (v) Identifizieren eines wirksamen Arzneimittels gegen mutante HIV-1 auf Basis des Verhältnisses von Stufe (iv).
Vektor zur Durchführung von phänotypischer Analyse, umfassend eine HIV-1-Sequenz mit mindestens einer für 194G kodierenden Mutation in der HIV-Reverse Transkriptase.
Isolierte und gereinigte HIV-1-Reverse-Transkriptase-Sequenz mit mindestens einer Mutation 194G, wobei die mindestens eine Mutation in der Sequenz mit einem Fold Change der Empfindlichkeit für einen HIV-1-Reverse-Transkriptase-Inhibitor korreliert.
Isoliertes und gereinigtes Oligonukleotid, umfassend eine HIV-1-Reverse-Transkriptase-Sequenz von 5 bis 100 Basen zur in-Vitro-Diagnose der Resistenz gegen virales Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid mindestens eine für 194G kodierende Mutation umfasst.