DE4416300C2

DE4416300C2 - Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben

Info

Publication number: DE4416300C2
Application number: DE4416300A
Authority: DE
Inventors: Ortwin Dr Faff
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-01
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2014-05-10
Also published as: DE4416300A1

Description

Stand der Technik

Die Notwendigkeit einer verbesserten direkten Virus-Diagnostik ist gegeben durch die medizinische und sozial-politische Aktualität von Retroviren, vor allem durch die gegenwärtig größte medizinische Herausforderung AIDS und durch eine zu beobachtende ansteigende Tendenz und zunehmende Rolle von Retroviren bei tierischen und menschlichen Erkrankungen (Leukämie, Autoimmunerkrankungen, Krebs etc.). Weiterhin birgt die Übertrag barkeit von Retroviren durch Infektion ernste Probleme für die Transfusions- und Trans plantationsmedizin bzw. erfordert Qualitätsuntersuchungen auf Virus-Kontamination bei Lymph-, Speichel-, Sperma- oder Blutproben von Spendern und bei zu verpflanzenden Organen, Haut, Knochenmark etc. Die gleiche Problematik der Virus-Kontaminantion bzw. Infektion gilt auch für die Verwendung von Arzneimitteln und anderen Bio-Pharmazeutika oder gen-technologischen Präparaten biologischen Ursprungs zu Krankheits-Therapien bei Mensch und Tier, in der medizinischen Grundlagen-Forschung sowie in der Kosmetik- und Nahrungsmittelindustrie. Voraussetzung für die Lösung der oben erwähnten Problemstellungen ist der direkte und funktionelle Nachweis von Retroviren mittels möglichst einfacher, verläßlicher und empfindlicher Methoden.

Der routinemäßige Nachweis von Retroviren in biologischen Proben erfolgt gegenwärtig nur indirekt und Struktur-spezifisch (d. h. nichtfunktionell) uzw. über den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und/oder direkt und Struktur-spezifisch über den Nachweis von Einzelkomponenten (Antigene, virale RNA, provirale DNA), z. B. anti-HIV- Antikörper Tests, HIV-p24-Antigen-Tests, HIV-PCR (polymerase chain reaction) Detektions Test (Holodniy M, et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. MDS Res. Hum. Retrovir. 8, 47-52, 1992). Die o.g. Analytik stützt sich lediglich auf eine nicht funktionelle bzw. Struktur spezifische molekulare Interaktion zwischen Antikörper und Antigen oder PCR primer und RNA oder proviraler DNA und erlaubt deshalb nicht den Rückschluß auf ein ganzes und funktionelles intaktes Virus. Außerdem erfaßt die indirekte Analytik nicht alle Stadien einer viralen Infektion, z. B. die Phase, in der die Infektion stattgefunden hat, jedoch noch keine Antikörper gebildet sind. Nachteile der existierenden direkten Nachweismethoden sind mangelnde Spezifität auf Grund von Kreuzreaktionen (z. B. HIV-p24 Antigen Test) sowie mangelnde Quantifizierbarkeit (z. B. PCR). Diese Faktoren bewirken somit gelegentlich falsch positive oder negative oder nur qualitative Ergebnisse.

Deshalb ist der direkte und auch funktionelle Nachweis für Retroviren in biologischen Proben dringlichst notwendig, was sich durch die Analytik von retroviralen Enzymen z. B. Reverse Transkriptase, RNase H, Integrase, Protease oder von anderen noch nicht indentifizierten retroviralen Enzymaktivitäten realisieren läßt. Von diesen Enzymen, ist zur Zeit die Reverse Transkriptase am besten untersucht und deren Analytik am besten entwickelt (Faff et al., Meth. Molec. Cell. Biol.: 1, 67-72, 1989, Eberle, J. & Seibl, B., J. Virol. Meth.: 40, 347-356, 1992). Der Einsatz der Reverse Transkriptase Analytik in der Routine-Diagnostik ist bislang jedoch ausgeblieben weil dafür nach dem jetzigen Stand der Dinge eine sehr Arbeits- und Zeitaufwendige Probenvorbereitung bzw. Virusisolierung aus den Proben mittels Ultrazentrifugation, - wie auch z. B. in WO 93107259 beschrieben - oder Polyethylenglycol-Fällung absolut notwendig ist. Ein Grund für die Notwendigkeit der o.g. Probenvorbereitung ist die komplexe Zusammensetzung biologischer Proben (Blut, Organextrakte etc.), die Proteine, Enzyme, Vitamine, Lipide, Zucker und verschiedene Inhibitoren enthalten und somit den direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren bislang erschweren oder unmöglich machen. Die Extraktion von Viruspartikeln mittels Antikörpern und der Nachweis der retroviralen RNA wurde beschrieben (Henrard DR et al. AIDS Res. Hum. Retrovir. 8, 47-52, 1992). Diese Analytik erlaubt jedoch nur eine strukturelle bzw. nicht funktionelle und rein qualitative Aussage.

Der direkte und biologisch funktionelle Nachweis von Retroviren ist bislang nur in Einzelfällen und mit sehr hohem Arbeits- und Zeitaufwand über Infektion von Zellen und nur in in gereinigten Virus-Präparaten oder in Zellkultur-Überständen möglich. Quantitative, einfache und verläßliche Routine-Methoden gibt es bislang dafür nicht.

Das vorliegende und zur Patentierung angemeldete Verfahren beschreibt den routine mäßigen direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben.

Lösung des Problems

Der direkte und biochemisch funktionelle Nachweis von Retroviren in biologischen Proben wird durch das vorliegende Verfahren ermöglicht, das aus drei Etappen besteht: a) einem Extraktionsschritt, b) einem Reaktionsschritt und c) einem Detektionsschritt.

A) Der Extraktionsschritt beruht auf einer selektiven Bindung der in einer Probe vorhandenen Retrovirus-Partikel anhand deren Oberflächenmoleküle mittels spezifischer Liganden, die ihrerseits an ein solides Träger-Material gebundenen sind. Dadurch werden sowohl Virus-Partikel als auch lösliche virale Oberflächen-Moleküle in einem Träger-Ligand-Virus Komplex immobilisiert und können aus dem komplexen Probengemisch selektiv extrahiert werden. Für den Nachweis von Retroviren in Gewebe-Extrakten bietet sich alternativ eine selektive Extraktion von retroviralen membran-freien Virus-core-Partikeln bzw. intra cisternalen A-Partikeln mittels core-spezifischen Liganden an. Die Selektivität der Extraktion besteht darin, daß Oberflächen-spezifische Liganden für die jeweiligen Retrovirus- Spezies verwendet werden. Virus-Spezifische Liganden können sein: a) Antikörper (monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Oberflächen-Epitope eines Retrovirus gerichtet sind, b) Rezeptoren, Rezeptor-Supramolekularkomplexe oder Rezeptor-Epitope (als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein bzw. Peptid, lösliche oder membran-gebunden in Liposomen, Membran-Präparaten/Fraktionen oder Zellen), die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. einzudringen, c) anti-Rezeptor-idiotypische Antikörper (mono klonale oder polyklonale), die Bindungs-Strukturen der Virus-spezifischen Rezeptoren nachahmen oder d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus- Antikörper-Immunkomplexe über Ig-Fc Regionen bindet. Als Alternative kann auch eine Kombination mehrerer oben genannter Liganden zur selektiven Bindung von Retrovirus- Partikeln verwendet werden.
Da der Extraktionsschritt auf rein struktureller Interaktion beruht unterscheidet er nicht zwischen ganzen Virus-Partikeln und viralen Oberflächen-Komponenten z. B. Glykoproteinen. Deshalb wird der Träger-Ligand-Virus Komplex in einem nachträglichen funktionellen enzymatischen Reaktionsschritt getestet, der für Retroviren spezifisch ist und nur von einem intakten Virus-Partikel, jedoch nicht von einzelnen Virus-Komponenten durchgeführt werden kann.
B) Der Reaktionsschritt beruht auf einer Retrovirus-spezifischen enzymatischen Reaktion, die die in vivo Reaktionen in einer Retrovirus infizierten Zelle nachahmt und von mehreren spezifischen viralen Enzymen durchgeführt werden kann: Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease u. a.. Die endogene Reverse Transkription ist ein komplexer Vorgang an dem mehrere virale Komponenten beteiligt sind uzw. die Reverse Transkription der viralen RNA (vRNA) zu komplementärer DNA (cDNA) in Abhängigkeit der als "primer" funktionierenden viralen transfer RNA (tRNA), Reversen Transkriptase (RT) und exogen zugegebener deoxy-Nukleotid-triphosphate (dNTP′s). Alternativ zur oben genannten endogenen Reaktion können exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden) z. B. oligo-deoxy- Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphophat (oligo-dT) und exogene templates z. B. poly-Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin-triphosphat (30 µg/ml) zur Reverse Transkriptions Reaktion zugegeben werden um die biochemische Funktionalität des Reverse Transkriptase Enzyms zu identifizieren. Die Reverse Transkriptions Reaktion des Träger- Ligand-Virus Komplexes muß nicht gestoppt werden, wenn die Detektion auf der Immobilisierung der neu synthetisierten cDNA basiert (z. B. Markierung mit Biotin, Br-Digoxigenin, FITC). Für genaue kinetische Untersuchungen, wo ein Reaktionsstop notwendig ist, kann die Reaktion auf Grund der Immobilisation des Ligand-Virus Komplexes durch Ersetzen des Lysis-Reaktions-Mix mit Stopper-Mix gestoppt werden, der keine dNTP′s enthält. Dieser Stop-Schritt hat auch den Vorteil das die markierten Edukte (dNTP′s) von den Produkten einfach getrennt werden können und die Test-Empfindlichkeit somit deutlich steigern. Durch eine anschließende komplette Lyse des Virus wird die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigesetzt. Der Einbau von dNTP′s bzw. die Synthese von cDNA ist ein direkter Beweis für die biochemische Funktionalität des Retrovirus und zeigt die simultane Präsenz funktioneller viraler Komponenten (vRNA, tRNA und RT) in der Probe.
Zusätzlich kann die Reverse Transkriptions-Reaktion fortgesetzt werden uzw. über die Synthese des zweiten cDNA Strangs bzw. doppelsträngiger cDNA (mittels DNA Polymerase Aktivität) und deren nachträglichen Integration in ein Plasmid (mittels Retrovirus-spezifischer Integrase Aktivität). Die integrierte dsDNA (doppelsträngige DNA) wird wie auch die vorher synthetisierte cDNA in einem folgenden Detektionsschritt nachgewiesen.
C) Im Detektionsschritt werden die enzymatisch synthetisierten Reaktionsprodukte anhand radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierung mittels optischer, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Verfahren quantitativ gemessen.
Die von der Reversen Transkriptase synthetisierte cDNA wird während der enzymatischen Synthese durch den Einbau von Br-, Biotin- Fluoreszenz- oder Digoxigenin- markiertem dUTP (deoxy-Uridin-Triphosphat) markiert. Die markierte cDNA wird mittels Absorbtion mit spezifischen an einen soliden Träger gebundenen Liganden (Streptavidin, Antikörper, Oligo nukleotide) immobilisiert bzw. von den Edukten getrennt und mittels weiteren Markierungs spezifischen Antikörpern die mit einem Indikator-Enzym (Peroxidase, alkalische Phosphatase) gekoppelt sind und entsprechenden Enzym-Substraten quantitativ gemessen. Die Messung kann photometrisch oder mittels Lumineszenz bzw. Fluoreszenz erfolgen und quantitativ ausgewertet werden.
Bei radioaktiver oder Fluoreszenz-Markierung der Edukte können die markierten Edukte nach dem oben beschriebenen Reaktions-Stop von dem immobilisierten Ligand-Virus-Komplex getrennt und direkt mittels Szintillation oder Fluoreszenz-Emission quantitativ gemessen werden. Alternativ kann die markierte cDNA gefällt werden, mittels Adsorbtion auf Filtern von den Edukten getrennt und anschließend gemessen werden.

Vorteile des Verfahrens

Das beschriebene Verfahren ermöglicht erstmalig den routinemäßigen direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben. Es hat gegenüber den bisher existierenden Nachweismethoden folgende Vorteile:

a) Retroviren werden bei vergleichbarer Sensitivität als Partikel spezifisch und direkt in biologischem Material anhand mehrerer Komponenten (Antigene, Enzyme und Nukleinsäuren) nachgewiesen,
b) der Nachweis erfolgt nicht nur strukturell (im Extraktionsschritt) anhand spezifischer Liganden sondern auch biochemisch funktionell anhand Retrovirus-spezifischer Enzyme (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease), die die Reaktion in vivo nachahmen und somit ein verbesserte Spezifität des Verfahrens gewährleisten,
c) der Nachweis erfolgt quantitativ,
d) das Verfahren ist vom Zeit- und technischen Aufwand einfach durchfürbar, routinemäßig anwendbar, - da es an Mikrotiterformat adaptiert ist - und somit auch billig,
e) das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend spezifischer Liganden universell auf alle Spezies von Retroviren anwendbar.

Anwendungsgebiete

Die potentiellen Anwendungen des zu entwickelnden Verfahrens lassen sich in vier große Bereiche einteilen.

a) Der erste Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die medizinische Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Therapie von Retrovirus bedingten Krankheiten z. B. AIDS, Leukämie beim Menschen. Die gleiche Anwendung gilt auch für Retrovirus bedingte Krankheiten bei Tieren. Dementsprechend sind die potentiellen Abnehmer: Kliniken u. Krankenhäuser sowie klinische Labors und Laborgemeinschaften.
b) Ein zweiter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf virologische Forschung & Entwicklungs-Labors an Universitäten, Großforschungseinrichtungen und Industrie wo an Experimentier-Modellen gearbeitet wird um antivirale Therapiemöglichkeiten, Impfstoffe etc. zu entwickeln. Bei sämtlichen Arbeiten ist der direkte Nachweis von Retroviren (in vitro Modelle, Tiermodelle etc.) absolut notwendig.
c) Ein dritter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die gesamte Transplantations- und Transfusions-Medizin bzw. auf die Spender-Banken von Blut, Organen, Knochenmark, Samen etc. Der Nachweis von Kontamination mit Retroviren in den oben genannten Spender- Materialien ist äußerst wichtig um einer Weiterverbreitung und Infektion durch Transplantation oder Spende vorzubeugen.
d) Ein vierter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die Qualitätskontrolle biologischer Pharmazeutika (z. B. Blutderivate, Gerinnungs-Präparate), biotechnologischer Produkte (z. B. Immunglobuline, therapheutische Enzyme, Insulin, fötale Seren etc.), biologischer Kosmetika und bestimmter (gentechnologisch hergestellter) Lebensmittel, die auf Kontamination mit Retroviren untersucht werden müssen um gegebenenfalls deren Übertragung zu verhindern.

Beispiel

Zur Optimierung des Verfahrens wurden als Modell Virus retrovirale T47D Partikel verwendet, die Retrovirus-typische Eigenschaften: Lipid-Membranhülle, Glykoproteins, Reverse Transkriptase, genomische RNA, endogene cDNA Synthese und eine endogene Verteilung im menschlichen Genom aufweisen (Faff, O., Murray, A.B., Schmidt, J., Leib-Mösch, C., Erfle, V., Hehlmann, R., J. Gen. Virol.: 73, 1087-1097, 1992).

a) Extraktion: Polyklonale Antikörper (10 µg/ml) die gegen die T47D Partikel gerichtet sind, wurden über Nacht in Coating-Puffer (50 mMol/l Carbonat-Puffer pH 9.6) an eine Mikrotiter-Platte gebunden. Anschließend wurden die frei gebliebenen Bindungsstellen der Platte 60 min bei Raumtemperatur mit 1% BSA in Coating-Puffer geblockt und dann der Überschuß an ungebundenem Material mit Waschpuffer (300 mosmol/l Phosphat-Puffer-Saline oder Tris-HCl pH 7.4, NaCl) gewaschen. Als Negativ Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet, daß keine T47D Partikel spezifischen Antikörper enthielt, jedoch mit T47D Partikeln inkubiert wurde. Als Positivkontrolle wurde T47D Partikel-haltige Probe verwendet, die nicht mit spezifischen Antikörpern voradsorbiert bzw. immobilisiert war.
b) Reaktion: Die mit Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 4°C mit 100 µl/well Probe inkubiert, bestehend aus: RPMI-Medium, 10% fötales Kälberserum und 10 µg gereinigte T47D Partikel. Anschließend wurde der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in Waschpuffer gewaschen und in einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer lysiert und in Gegenwart eines dNTP-Mix 60 min bei 42°C inkubiert. Der Lysis- Reaktions-Mix Puffer hatte folgende Zusammensetzung: 0.3% NP40, 50 mMol/l Tris-HCl pH 7.8, 40 mMol/l KCl, 5 mMol/l MgCl₂, 2 mMol/l DTT (Dithiotreit), 2 mMol/l EDTA (Ethylendiaminteraacetat) und je 30 µMol/l dATP, dCTP, dGTP und dTTP+dUTP-Biotin+dUTP- Digoxigenin. Der Einbau der dNTP′s bzw. die Synthese von cDNA wurde anschließend gemessen.
c) Detektion: Der Lysis-Reaktions-Mix wurde auf Streptavidin beschichtete Mikrotiter- Platten übertragen und zur Immobilisierung der Biotin- und Digoxigenin-markierten cDNA 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Waschen des ungebundenen Materials wurde die immobilisierte cDNA mit Peroxidase gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörpern inkubiert (1 Stunde bei 37°C), gewaschen und anschließend mit dem Peroxidase-Substrat ABTS [2,2′-Azino-bis (3-ethylbenz thiazoline-6-Sulfonsäure)Diammoniumsalz] inkubiert. Die Farbentwicklung wurde nach 5 min photometrisch bei 405 nm (und 490 nm als Referenz) gemessen (Eberle, J. and Seibl, B., J. Virol. Meth.: 40, 347-356, 1992).

Die Ergebnisse in Abb. 1 zeigen, daß es möglich ist, T47D Partikel aus Zellkulturmedium immunologisch, mit spezifischen Antikörpern zu extrahieren und anschließend über endogene Reverse Transkription biochemisch funktionell nachzuweisen.

Claims

1. Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß eine Struktur-spezifische Extraktion der Retrovirus-Partikel mit einer Funktions-spezifischen Enzym-Reaktion von Retroviren kombiniert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Extraktion Retrovirus- spezifische Liganden und bei der Enzym-Reaktion Retrovirus-spezifische Enzyme eingesetzt bzw. nachgewiesen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Retrovirus-Partikel mittels spezifischer Liganden (Antikörper, Rezeptoren, Lektine, Proteine, Peptide), die an die Virus-Oberfläche oder Virus-cores binden, selektiv aus dem Proben-Material extrahiert werden (Extraktionsschritt),
b) anschließend durch ein Retrovirus-spezifisches Enzym (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease) auf biochemische Funktionalität bzw. Reaktion getestet werden (Reaktionsschritt) und
c) nachträglich anhand der markierten neu synthetisierten Reaktions-Produkte (cDNA, DNA- Proben, Oligonukleotide, Peptide, Proteine) mittels radioaktiver, photometrischer Methoden oder durch Lumineszenz- bzw. Fluoreszenz-Verfahren identifiziert werden (Detektionsschritt).

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Liganden kovalent oder nicht kovalent, direkt oder mittels eines sogenannten "Spacers" an einen soliden Träger uzw. Mikrotiterplatten, Träger-Sonden oder magnetische oder nicht magnetische Träger- Kügelchen gebunden sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß folgende spezifische Liganden einzeln oder in Kombination miteinander eingesetzt werden können:

a) virusspezifische Antikörper (monoklonale oder polyklonale), die gegen antigene Ober flächen-Epitope oder core-Epitope des entsprechenden Retrovirus gerichtet sind,
b) virusspezifische Rezeptoren, Rezeptor-Komplexe oder Rezeptor-Komponenten, die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. in diese einzudringen,
c) anti-Rezeptor-idiotypische Antikörper (monoklonale oder polyklonale), die Virus- Bindungs-Epitope der viralen Rezeptoren nachahmen oder
d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus-Antikörper- Immunkomplexe über die Fc-Region der Antikörper binden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein oder Peptid, in löslicher Form oder membran-gebunden in Liposomen, Membran-Präparationen/Fraktionen oder ganzen Zellen verwendet werden können.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger immobllisierte Ligand für die Virus-Extraktion mit der Virus-haltigen Probe über Nacht bei 4°C inkubiert wird und anschließend der Träger-Ligand-Vinis-Komplex von dem ungebundenen Material in 300 mosmol/l Phosphat-Puffer oder Tris-HCl pH 7.4 gewaschen wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger-Ligand- Virus-Komplex lysiert wird und in einem weiteren Reaktionsschritt auf enzymatische Aktivität eines oder mehrerer Retrovirus-spezifiseher Enzyme bzw. Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease getestet wird.

9. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis-Puffer folgende Zusammensetzung hat: 10-50 mmol/l Tris-HCl pH 7.8; 2 mmol/l PMSF; 2 mmol/l DTT; 0.1-1% (v/v) NP40, 2 mmol/l EDTA.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem Lyis-Reaktions-Mix Puffer inkubiert wird und mit einem von markiertem dUTP (Br-, Fluoreszenz-, Biotin- oder Digoxigenin-), inkubiert wird um den Nukleotid-Einbau in die neu synthetisierte cDNA mittels endogener Reversen Transkription d. h. mittels Reverser Transkriptase, endogener viraler transfer RNA (primer) und RNA (template) quantitativ zu messen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden), [oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphosphat (oligo-dT)] und exogene templates [poly- Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin-triphosphat] zur Reversen Transkriptions- Reaktion zugegeben werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, da ß der Lysis- Reaktions-Mix Puffer folgende Zusammensetzung hat: 50 mmol/l Tris-HCl pH 7.8, 40-80 mmol/l KCl, 5-10 mmol/l MgCl₂, 2 mmol/l PMSF, 2 mmol/l DTT, 0.1-1% (v/v) NP40, 2 mmol/l EDTA und je 30-500 µMol/l dATP, dCTP, dGTP bzw. dTTP sowie dem Zusatz von (Br-, Biotin-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz-) markiertem dUTP, oder radioaktiv markiertem deoxy- Nukleotid-Triphosphat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reverse Transkription-Reaktion durch den Austausch des Lysis-Reaktions-Mix mit einem Stopper-Mix gestoppt wird, der folgende Zusammensetzung hat: 50-100 mmol/l Tris-HCl pH 7.8, 40-80 mmol/l KCl, 0.1% (v/v) NP40, 5 mmol/l EDTA.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus mittels eines Lysis-Puffers (1% NP40, 10 mmol/l Tris-HCl pH 7.8, 5 mmol/l EDTA) 15 min bei Raum temperatur lysiert und die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigelegt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- Produkte der Retrovirus-spezifischen Enzym-Reaktion bzw. der Reversen Transkription (cDNA) in einem Detektionsschritt mittels Fluoreszenz, Photometrie, Lumineszenz oder Szintillation nachgewiesen werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger immobilisierten markierten Reaktions-Produkte von den löslichen markierten Edukten durch deren einfaches Wegwaschen getrennt werden und anschließend direkt mittels Fluoreszenz-Emission, bzw. Szintillation oder mittels Markierungs-spezifischer Liganden, daran gebundener Indikator- Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die ungebun denen (Br-, Biotin-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz-) markierten Reaktions-Produkte mittels spezifischer Träger-gebundener Liganden (Antikörper, Streptavidin, Oligonukleotide) immobilisiert, von den Edukkten getrennt und mittels Ligand-gebundener Indikator-Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.