DE10058915A1

DE10058915A1 - Verfahren zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz

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Publication number: DE10058915A1
Application number: DE10058915A
Authority: DE
Original assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Current assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2002-06-06

Abstract

Verfahren zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz mit einer Sonde inkubiert wird, mindestens ein Phosphorthioatnucleotid in Gegenwart eines ersten Enzyms, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist, zugegeben wird, ein zweites Enzym zugegeben wird, das Phosphorthioatnucleotid-freie komplementäre Nucleotidsequenzen abbaut, ein Detektionsmolekül zugegeben wird, das spezifisch mit der komplementären Nucleotidsequenz wechselwirkt und über die Wechselwirkung des Detektionsmoleküls die Nucleotidsequenz bestimmt wird, wobei die einzelnen Verfahrensschritte vertauschbar bzw. kombinierbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz sowie einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung sehr kurzer Nucleotidsequenzen, beispielsweise im Zusammenhang mit der Charakterisierung von Single Nucleotide Polymorphisms (SNP).

Auf der Basis molekularbiologischer Methoden wurden im Stand der Technik zahlreiche Verfahren etabliert, mit denen Nucleotidsequenzen bestimmmt werden können.

Die DNA-Bestimmung bzw. Sequenzierung nach Maxam-Gilbert beruht auf der basenspezifischen Spaltung von DNA mit Hilfe chemischer Reagenzien. Sowohl einzel- als auch doppelsträngige DNA-Moleküle können nach dieser Methode analysiert werden. Das zu untersuchende DNA-Fragment wird zunächst isoliert und an einem Ende mit einer Phosphatgruppe radioaktiv markiert. Anschließend wird die DNA in vier verschiedenen Reaktionen eingesetzt, in denen sie basenspezifisch gespalten wird. Diese Spaltreaktion erfolgt in drei Schritten: Nach einer spezifischen chemischen Modifikation von ein bzw. zwei Basen werden diese von der Desoxyribose entfernt. Anschließend wird das DNA-Rückgrat an dieser Stelle mit Piperidin gespalten und an. Hand des Strangbruchs die Sequenz bestimmt.

Ein weiteres Verfahren zur DNA-Sequenzierung ist das sogenannte Kettenabbruch- oder Didesoxynucleotidverfahren. Dabei wird die DNA zuerst in eine einzelsträngige Form, die Matrize, überführt. Diese Matrizen-DNA wird mit einem Oligonucleotid, dem Sequenzenprimer, hybridisiert. Die Sequenz des Primers sollte dabei so gewählt sein, dass er nur zu einer einzigen Stelle der Matrize komplementär ist. Ausgehend von diesem Primer erfolgt die enzymatische Synthese des zur Matrize komplementären Stranges. Abhängig von den an das System gestellten Anforderungen können dabei verschiedene, speziell für die DNA-Sequenzierung optimierte DNA-Polymerasen eingesetzt werden.

Die DNA-Synthese findet in vier Mikroreaktionsgefäßen statt. Jedes Gefäß enthält Matrizen-DNA, Primer, Enzym, alle vier 2'-Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) und zusätzlich jeweils ein 2',3'-Didesoxynucleotidtriphosphat (ddNTP). In jedem der vier parallel durchgeführten Reaktionsansätze laufen nun gleichzeitig zahlreiche Primerverlängerungen ab. Das Enzym akzeptiert dabei sowohl die dNTPs als auch das jeweilige ddNTP als Substrat zur Kettenverlängerung. Wird ein ddNTP eingebaut, stoppt die Reaktion danach (Kettenabbruch), denn aufgrund der fehlenden 3'-Hydroxygruppe kann kein weiteres Nucleotid angefügt werden. Man erhält damit in jedem der vier Reaktionsansätze eine Mischung an DNA-Fragmenten unterschiedlichster Kettenlängen. Die DNA-Fragmente werden in einem Polyacrylamidgel nach ihrer Größe aufgetrennt und beispielsweise mit Hilfe der Autoradiographie sichtbar gemacht. Durch Auftragen der vier Reaktionssätze nebeneinander kann dem Bandenmuster die fortlaufende Nucleotidsequenz zugeordnet werden.

Den bekannten Methoden ist gemeinsam, dass über den Einbau modifizierter Nucleotide ein Kettenabbruch oder eine selektive Spaltung eines während der Sequenzierreaktion am zu sequenzierenden Template gebildeten DNS-Stranges erreicht wird und sich die Abbruchprodukte oder Spaltprodukte in ihrer Länge unterscheiden. Aus der Spezifität der letzten Base, die die chemische Modifizierung trägt und der Länge des Spaltproduktes lässt sich die Sequenz des Templates rekonstruieren. Die Längenermittlung der gebildeten Fragmente erfolgt über die Polyacrylamidgelelektrophorese, die Massenspektrometrie oder die Kapillarelektrophorese. Alle diese Verfahren zielen darauf, längere bis sehr lange Sequenzbereiche - ca. 100 bis 3500 Basenpaare - zu analysieren, innerhalb derer eine gewisse Fehlerquote tolerabel ist.

Die Entwicklung der Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenzen ermöglicht die umfassende Genomanalyse und somit die indirekte Analyse der durch Genom verschlüsselten Baupläne für Proteine für einzelne Organismen. Neben dem generellen Aufbau des Genoms sind systematische Schwankungen interessant, die Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), die im wesentlichen für die funktionelle Variablität der Natur verantwortlich sind. SNP sind Sequenzveränderungen in einer Nucleotidposition, die mit einer Häufigkeit von ca. 1% in der Gesamtpopulation auftreten müssen. Es wird angenommen, dass sich ca. 300000 SNP im menschlichen Erbmaterial befinden und durch ihre ständige Neukombination während der Vererbung komplexe Funktionsmuster ergeben, die sich von Individuum zu Individuum unterscheiden und so für die Variablität der Phänotypen maßgeblich verantwortlich sind. Daher wird sich nach der vollständigen Sequenzierung des Genoms eines Organismus die Suche nach SNP anschließen. Die Kartierung der SNP kann bisher als vergleichsweise schneller Prozeß angesehen werden, der z. B. für das menschliche Genom binnen weniger Jahre abgeschlossen sein wird. Wesentlich länger wird die Korrelation einzelner SNP oder Kombinationen von SNP mit der physiologischen Leistungsfähigkeit oder mit Erbkrankheiten in Anspruch nehmen. Hierzu bedarf es neben den geeigneten genetischen Analyseverfahren, um einen Genotyp mit einem Phänotyp zu korrelieren, auch leistungsstarke Verfahren, mit denen Genotypen erfasst werden. Durch die Anlayse der SNP können SNP-Profile erstellt werden, die z. B. mit einer erhöhten Anfälligkeit für Krankheiten, wie Asthma, Herzleiden oder der parkinsonschen Krankheit korrelieren. Beispielsweise entscheidet ein SNP an Position 16 im Gen für den Beta-2-adrenergen-Rezeptor, ob im zugehörigen Protein die Aminosäure Ariginin oder Glycin eingebaut wird. Asthmatiker, die ein Arginin tragen, profitieren stark von der Behandlung mit Albuterol, das bei sogenannten Glycin-Trägern kaum wirksam ist.

Die Analyse von SNP, die sich auf sehr kleine Sequenzbereiche beschränkt, ist sehr kostenaufwendig. Nachteilhaft ist, dass entweder aufwendige Sequenziergele und/oder Sequenziergeräte benötigt werden.

Ein weiteres, sehr aufwendiges und kostenintensives Verfahren ist das Markieren eines Referenz-DNA-Moleküls mit mehreren voluminösen sogenannten "Tags", wie beispielsweise Streptavidin. Nach Hybridisierung des Moleküls mit einer Sequenz mit Genvariationen tastet ein Rasterkraftmikroskop die Oberfläche nach den Tags ab, die Sequenzvariationen als einen stark vergrößerten Bereich visualisieren. Durch den Einsatz von Rasterkraftmikroskopen ist dieses Verfahren technisch sehr aufwendig und weiterhin ist nachteilig, dass es eine zu große Fehlerspanne aufweist. Die Kosten pro analysierter Base erhöhen sich extrem, wenn mit diesen Methoden lediglich einzelne Nucleotidpositionen analysiert werden sollen.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung sehr kurzer Nucleotidsequenzen, beispielsweise von Fehlpaarungen, ist die differentielle Hybridisierung mit Hilfe einer Sonde. Durch die Bestimmung einer Schmelzpunktdifferenz kann eine Fehlpaarung detektiert werden. Nachteilig ist bei diesem Verfahren, das eine Fehlpaarung lediglich zu einer Schmelzpunktdifferenz von 4°C führt. Besteht die Wahrscheinlichkeit, daß im Hybridisierungsbereich der Sonde die Fehlpaarung in unterschiedlichen Positionen vorliegen kann, wie z. B. beim K-RAS Gen, wird eine genaue Aussage unmöglich, insbesondere bei der komplizierten Heterozygotenanalyse.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Nucleotidsequenzen, insbesondere sehr kurze Nucleotidsequenzen ohne Seguenziergele, Sequenziergeräte oder Rasterkraftmikroskope sicher und effizient bestimmt werden können.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz, wobei die Nucleotidsequenz mit einer Sonde inkubiert wird, mindestens ein Phosphorthioatnucleotid in Gegenwart eines ersten Enzyms, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist, zugegeben werden, ein zweites Enzym zugegeben wird, das Phosphorthioatnucleotid-freie komplementäre Nucleotidsequenzen abbaut, ein Detektionsmolekül zugegeben wird, das spezifisch mit der komplementären Nucleotidsequenz wechselwirkt und über die Wechselwirkung des Detektionsmoleküls die Nucleotidsequenz bestimmt wird, wobei die einzelnen Verfahrensschritte vertauschbar oder kombinierbar sind.

Nukleoinsäuresequenzen im Sinne der Erfindung sind ein natürliches und/oder synthetisches Polymer einzel- oder doppelsträngiger DNA oder RNA, die alternativ synthetische, nicht-natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthalten können, die in die DNA- oder RNA-Polymere eingebaut werden können.

Eine Sonde im Sinne der Erfindung ist ein Molekül, das eingesetzt wird, um nach einem bestimmten Gen, Genprodukt, Mutationsort oder Allel oder einem bestimmten Sequenzabschnitt zu suchen oder um eine zelluläre Umgebung anzuzeigen. Eine Sonde kann somit ein Molekül sein, das spezifisch an eine bestimmte Nucleotidsequenz in einer Ziel- DNA oder -RNA bzw. an ein charakteristisches Strukturmerkmal eines Allels bindet und/oder in einer radioaktiv oder chemisch markierten Form hergestellt werden kann. Bei der Sonde handelt es sich beispielsweise um ein Molekül, das zur Hybridisierung mit einer Targetsequenz, z. B. einer zu bestimmenden Nucleotidsequenz, befähigt ist.

Die Sonde umfasst ein 3'- und einen 5'-Bereich. Eine Hybridisierung im Sinne der Erfindung ist die Bildung eines Duplexmoleküls aus zwei komplementären Nukleinsäurensträngen. Die Bildung eines Hybrid-Nukleinsäureduplexes erfolgt erfindungsgemäß durch die Assoziation von Einzelsträngen der DNA und/oder der RNA oder von Einzelsträngen und/oder der RNA, die in einer natürlichen Duplex nicht aneinandergebunden sind. Es jedoch selbstverständlich auch möglich, dass sich DNA-RNA-Hybride bilden.

Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu bestimmende Nucleotidsequenz mit einer Sonde inkubiert. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass vor der Hybridisierung die zu bestimmende Nucleotidsequenz als Einzelstrang präpariert wird. Dabei wird der zum bestimmenden Strang komplementäre Strang 5' von der zu identifizierenden Nucleotidsequenz mit einer Blockadesonde, die am 3'-Ende eine Modifizierung trägt, hybridisiert. Damit liegt die zu bestimmende Nucleotidsequenz im komplementären Abschnitt, d. h. 3' zu der zu identifizierenden Nucleotidsequenz, als Einzelstrang vor. Die Sonde, z. B. ein DNA oder RNA-Molekül, kann beispielsweise so beschaffen sein, dass sie spezifisch an einen bestimmten Bereich der Nucleotidsequenz hybridisiert. Erfindungsgemäß kann die Nucleotidsequenz auch mit einer am 5'-Bereich markierten Sonde in einer Weise hybridisiert werden, dass das 3'-Ende der Sonde unmittelbar vor der ersten Nucleotidposition oder zu bestimmenden Nucleotidsequenz endet. Die nächsten Nucleotide, die an das 3'-Ende der Sonde gekoppelt werden können, sind demzufolge komplementär zu der zu bestimmenden Nucleotidsequenz.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin den Schritt der Zugabe von mindestens einem Phosphorthioatnucleotid in Gegenwart eines ersten Enzyms, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist. Das erste Enzym im Sinne der Erfindung kann jede Substanz sein, die die Synthese der komplementären Nucleotidsequenz initiiert und/oder die Synthese der komplementären Nucleotidsequenz katalysiert. Beispiele für derartige Enzyme sind: reverse Transcriptasen, DNA- Polymerasen oder RNA-Polymerasen. Durch die Zugabe des ersten Enzyms in Gegenwart mindestens eines Phosphorthioatnucleotids erfolgt gleichzeitig mit oder nach der Hybridisierung die Verlängerung bzw. Modifizierung der gebundenen Sonden. Die Verlängerung der Sonden kann neben den Phosphorthioatnucleotiden auch durch Desoxynucleotide und/oder Didesoxynucleotide erfolgen. Die Sonde kann z. B. so positioniert sein, dass sich die zu bestimmende Nucleotidsequenz unmittelbar upstream zu der Sondenbindungsstelle befindet.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein zweites Enzym zugegeben, das Phosphorthioatnucleotid-freie komplementäre Nucleotidsequenzen abbaut. Beispiele für derartige Enzyme sind: Exonukleasen oder DNA-Polymerasen mit 3'-5- Exonuckleaseaktivität. Bei erfolgtem Einbau des mindestens einen Phosphorthioatnucleotids ist die Sonde bzw. die verlängerte Sonde und/oder die komplementäre Nucleotidsequenz gegen den Abbau durch das zweite Enzym, beispielsweise eine Exonuklease III, resistent, so dass das Hybrid aus zu bestimmender Nucleotidsequenz und komplementärer Nucleotidsequenz bzw. der verlängerten Sonde erhalten bleibt. Alle komplementären Nucleotidsequenzen bzw. verlängerten Sonden, die nicht durch mindestens ein Phosphorthioatnucleotid beispielsweise am 3'-Ende verlängert wurden, können durch das zweite Enzym bis zu der Position abgebaut werden, wo sich ein Phosphorthioatnucleotid befindet, so dass das gebildete Hybrid aus zu bestimmender, komplementärer Nucleotidsequenz und der Sonde aufgelöst werden kann. Die erfindungsgemäße Lehre basiert also auf der spezifischen Hybridisierung der Sonde an der zu bestimmenden Nucleotidsequenz, dem selektiven Einbau mindestens eines Phosphorthioatnucleotids am 3'-Ende der Sonde komplementär zu bestimmenden Nucleotidsequenz z. B. durch eine DNS-Polymerase, wobei die Sonde bzw. die synthetisierte komplementäre Nucleotidsequenz gegen den Abbau durch das zweite Enzym resistent werden können. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die Sonde markiert ist. Die Markierung kann beispielsweise durch eine Seperationsmodifizierung erfolgen. Dadurch kann das Hybrid, umfassend die zu bestimmende Nucleotidsequenz, die Sonde sowie die komplementäre Nucleotidsequenz, anhand der Markierung detektiert bzw. separiert werden, insbesondere wenn der Abbau durch das zweite Enzym nicht zu einem Abbau der Phosphorthioatnucleotid-freien komplementären Nucleotidsequenzen führte.

In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Detektionsmolekül zugegeben, das spezifisch mit der komplementären Nuncleotidsequenz wechselwirkt und über die Wechselwirkung des Detektionsmoleküls die Nucleotidsequenz bestimmt wird. Erfindungsgemäß können durch das Detektionsmolekül vor allem die Sonden bzw. Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden, die nicht durch das zweite Enzym abgebaut worden sind. D. h., das Detektionemolekül kann nach der Inkubation mit dem zweiten Enzym zugegeben werden, es ist aber selbstverständlich auch möglich, dass die Sonde, die zu bestimmende Nucleotidsequenz oder die synthetisierte komplementäre Nucleotidsequenz mit einem Detektionsmolekül in einem beliebigen Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens markiert werden. Es ist somit beispielsweise möglich, dass bereits die Sonde oder die Nucleotidsequenz, einen Marker, beispielsweise einen Fluoreszenzfarbstoff, aufweisen. Wenn das zugegebene zweite Enzym die Sonde nicht abbaut, ist ein Detektionssignal auch nach der Zugabe des zweiten Enzyms nachweisbar. Der Nachweis dieses Detektionssignals ist ein Hinweis darauf, dass mindestens ein Phosphorthioatnucleotid bei der Verlängerung der Sonde bzw. der Bildung der komplementären Nucleotidsequenz eingebaut worden ist. Neben der Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff sind als Detektionsmoleküle alle Substanzen einsetzbar, die in der Lage sind, mit der komplementären Nucleotidsequenz, zu bestimmenden Nucleotidsequenz bzw. der Sonde nachweisbar wechselzuwirken. Dies können beispielsweise Enzyme, Peptide, Proteine, Antikörper, Antigene, Chromophore, Spin-markierte Lipide bzw. Kohlenhydrate, radioaktive oder magnetische Substanzen, Komplexverbindungen, Lumineszenzfarbstoffe oder ähnliches sein. Über die Wechselwirkung der Detektionsmoleküle wird die Nucleotidsequenz bestimmt, da durch die Auswahl des mindestens einen Phosphorthioatnucleotids auf die komplementäre Position geschlossen werden kann, so dass ein nachzuweisendes Detektionsmolekül Rückschlüsse auf die zu bestimmende Nucleotidsequenz ermöglicht. Der Einsatz der Detektionsmoleküle kann beispielsweise mit der Schmelzpunktanalyse kombiniert werden. Die Änderung des Schmelzpunktes des modifizierten Hybrids ist so zuverlässig nachweisbar.

In einer vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass in Gegenwart des ersten Enzyms mindestens ein Desoxynucleotid, Didesoxynucleotid und/oder Phosphorthioatnucleotid zugegeben werden. Durch das erste Enzym folgt vorteilhafterweise gleichzeitig oder nach der Hybridisierung die Verlängerung bzw. Modifizierung der Sonde durch Desoxynucleotide, Didesoxynucleotide oder Phosphorthioatnucleotide. Dazu werden beispielsweise den für die betreffende Sequenzierung notwendigen Kombinationen der Substanzen in Gegenwart des ersten Enzyms sowie notwendiger Salze zugesetzt. Die Verlängerung bzw. Modifizierung der Sonde ist vorteilhafterweise eine limitierte Verlängerung, d. h., dass sich beispielsweise maximal drei der vier verschiedenen Nucleotidspezifitäten im Ansatz befinden dürfen. Es ist jedoch auch möglich, dass es sich beispielsweise bei einem vierten Nucleotid um ein Didesoxynucleotidtriphosphat (ddNTP) handelt, welches zum Kettenabbruch führen kann. Geeignete Kombinationen von Desoxynucleotidphosphaten, beispielsweise mit den Basenspezifität Adenin (dATP), Guanin (dGTP), Cytosin (dCTP), Thymin (dTTP) bzw. synthetische oder natürliche Äquivalente und Phosphorthioatnucleotide(aSdNTP), wie beispielsweise αSdATP; αSdATP, dCTP; αSdATP, dGTP; αSdATP, dTTP; αSdATP, dCTP, dGTP; αSdATP, dCTP, dGTP; αSdATP, dGTP, dTTP; αSdATP, ddTTP; αSdATP, dCTP, ddTTP; αSdATP dGTP, ddTTP; αSdATP, dCTP, dGTP, ddTTP. Entsprechend αSdATP und ddTTP können auch die anderen Nucleotidspezifitäten der Phosphorthioatnucleotide und der Didesoxynucleotide miteinander und mit Desoxynucleotiden kombiniert werden.

Aus den verschiedenen Kombinationen von Nucleotidtriphosphaten, die gezielt eingesetzt werden, den möglichen Genotypen, insbesondere, wenn sei bekannt sind, und der Wechselwirkung der Detektionsmoleküle kann die Nucleotidsequenz bestimmt werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Sonde und/oder die zu bestimmende Nucleotidsequenz immobilisiert werden. Unter Immobilisierung im Sinne der Erfindung werden alle Verfahren zum Fixieren der Sonden bzw. der zu bestimmenden Nucleotidsequenzen beispielsweise als Biokathalysatoren auf bestimmten Trägern verstanden. Vorteilhafterweise können die Sonden und/oder die zu bestimmenden Nucleotidsequenzen durch biologische, chemische oder physikalische Verfahren durch die Immobilisierung stabilisiert werden. Die Immobilisierung solle zweckmäßigerweise so erfolgen, dass ein wiederholter Einsatz unter technischen Bedingungen möglich ist; weiterhin sollen die Sonden bzw. die Nucleotidsequenzen kontinuierlich mit den Enyzmen bzw. den Nucleotiden, beispielsweise dem mindestens einen Phosphorthioatnucleotid, umgesetzt werden können. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Immobilisierung so erfolgt, dass die dreidimensionale Strukur am aktiven Zentrum der Moleküle nicht verändert wird. Die Spezifität des Substrates und der von den Substraten initiierten bzw. katalysierten Reaktionen geht durch die Immobilisierung vorteilhafterweise nicht verloren. Erfindungsgemäß sind grundsätzlich folgende Methoden der Immobilisierung zu unterscheiden: Die trägergebundene Immobilisierung, die quervernetzende Immobilisierung, die Immobilisierung durch Einschluss und die Mikrokapsel- Immobilisierung. Bei der trägergebundenen Immobilisierung erfolgt die Bindung der Sonden und/oder der Nucleotidsequenz durch Absorption, Ionen, Ionenbindung oder kovalente Bindung an einen Träger. Dies kann beispielsweise auch innerhalb der ursprünglichen mikrobiellen Zelle stattfinden, die die Sonde bzw. das Nucleotid enthalten kann. Vorteilhafterweise können die Sonden und/oder die Nucleotidsequenzen auch miteinander querfixiert werden, ohne dass ihre Aktivität beeinflusst wird. Dies kann beispielsweise mit einer kovalenten Quervernetzung mittels bi- oder multifunktioneller Reagenzien, wie beispielsweise Glutaraldehyd erfolgen. Bei der Immobilisierung durch den Einschluss der Sonden und/oder der Nucleotidsequenzen erfolgt die Immobilisierung in polymeren Netzwerken, Membranen, hinter Ultrafiltrationsmembranen bzw. in Mikrokapseln oder Fasern. Die eingeschlossenen Sonden und/oder Nucleotidsequenzen sind durch die Membran von der umgebenden Substrat- und Produktlösung getrennt. Die Sonden und/oder die Nucleotidsequenzen sind bei der Einschlussimmobilisierung in ihrer Aktivität vorteilhafterweise nicht beeinflusst. Selbstverständlich sind auch mehrere Formen der Immobilisierung gleichzeitig möglich, beispielsweise können die Sonden und/oder die Nucleotidsequenzen auf makroporösen Trägern immobilisiert werden, um eine möglichst große Oberfläche für die Absorption oder kovalente Verbindung zu erhalten. Die Immobilisierung in einem solchen Fall wäre eine Immobilisierung einen Träger und durch Einschluss und die makroporösen Strukturen des Trägers. Eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Fixierung an einen porösen Träger ist beispielsweise die Anwesenheit von funktionellen Gruppen am Träger. Ein oft benutztes Aktivierungsverfahren, beispielsweise bei makroporösen Dextrangelen ist die Umsetzung mit Bromcyan. Entsprechend der chemischen Natur der funktionellen Gruppen können sich verschiedene Bindungstypen ausbilden, wie beispielsweies Äther, Thioäther und Ester sowie andere. Die Immobilisierung der Sonden und/oder der Nucleotidsequenzen kann auch in Form einer Co-Immobilisierung mit dem ersten und/oder zweiten Enzym bzw. mit vollständigen oder extrahierten Zellen erfolgen. Durch eine Co- Immobilisierung, beispielsweise mit Zellen, können bestimmte Enzyme bzw. Co-Enzyme, die an Kompartimente von Zellen festgebunden sind, innerhalb des Verfahrens zur Stimmung der Nucleotidsequenzen genutzt werden. Als feste Phase für die Immobilisierung können z. B. Mikrotestplatten, DNA-Chips, Mikropartikel oder andere eingesetzt werden. Für eine Parallelisierung der Bestimmung der Nucleotidsequenzen können verschiedene Sonden beispielsweise an individuelle Mikropartikelpopulationen gebunden werden. Die nicht am Träger immobilisierte Sonde und/oder zu bestimmende Nucleotidsequenz bzw. die verlängert oder modifizierte Sonde sowie das gebildete Hybrid können eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Die Messung des Fluoreszenzsignals bzw. der Fluoreszenzsignale erfolgt mit Vorteil vor der Inkubation mit dem zweiten Enzym bzw. unmittelbar nach dem Zusatz nach der Inkubation mit dem zweiten Enzym bzw. nach einer ein- oder mehrfachen Temperaturerhöhung. Die Temperaturerhöhung kann beispielsweise homogen oder in verschiedenen Stufen erfolgen und dient der Schmelzpunktanalyse des Hybrids beispielsweise aus zu bestimmenden Nucleotidsequenz und modifizierter Sonde. Die Analyse des Hybrids kann jedoch auch durch Erhöhung der Detergenzkonzentration, beispielsweise Formamid oder DMSO, erreicht werden. Die Bestimmung der Nucleotidsequenz kann aus dem Fluoreszenzsignal, der Kombination der Nucleotidtriphosphate, der Kenntnis der möglichen Genotypen und/oder der Schmelztemperatur des Hybrids erfolgen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung werden während der Immobilisierung Spacer eingesetzt, insbesondere Avidin, Biotin, Antigen-Antikörper- Komplexe, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und/oder Polyethylenglycol. Mit Hilfe der Spacer kann die Sonde und/oder die Nucleotidsequenz bzw. das erste oder zweite Protein an eine feste Phase, beispielsweise die Oberfläche von Glas, Nitrozellulose, Polypropylen, Polysteren und/oder Polycarbonat, über einen Spacer kovalent oder nichtkovalent gebunden werden. Durch das Zwischenschalten eines Spacers erhalten die Sonden und/oder Nucleotidsequenzen mehr Beweglichkeit, wodurch ein ungehindeterer Kontakt mit den verschiedenen Substanzen möglich ist. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Wechselwirkung des Detektionsmoleküls bei unterschiedlichen Temperaturen, Detergenz- und/oder Salzkonzentrationen mehrfach durchgeführt. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass das Detektionsmolekül zusammen mit der Sonde und der Nucleotidsequenz so inkubiert wird, dass die Sonde durch das Detektionsmolekül markiert ist. Durch eine Temperaturerhöhung und/oder eine Erhöhung der Detergenzkonzentration können die nichtmodifizierten Sonden selektiv dehybridisiert werden. In einem solchen Fall kann beispielsweise auf den Abbau der Sonde und/oder der komplementären Nucleotidsequenz durch das zweite Enzym teilweise oder vollständig verzichtet werden. Als Detergenzien können beispielsweise Foramid oder DMSO in Konzentration zwischen 1% und 70%, bevorzugt 1% bis 50% und insbesondere 1% bis 20%, dem Inkubationsmedium in unterschiedlichen Konzentrationsstufen oder kontinuierlich zugemischt werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz, die mindestens eine Sonde umfasst. Als Sonde können beispielsweise RNA und/oder DNA-Moleküle eingesetzt werden, die so konstuiert sind, dass sie beispielsweise mit der bestimmenden Nucleotidsequenz in einer Weise hybridisieren, dass das 3'-Ende der Sonde unmittelbar bzw. nahezu unmittelbar vor der zu identifizierenden Nucleotidsequenz endet. Das nächste Nucleotid, das dann an das 3'-Ende der Sonde gekoppelt wird, ist dementsprechend komplementär zu dem ersten zu bestimmenden Nucleotid der Nucleotidsequenz.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Testkit die Sonde und mindestens ein Phosphorthioatnucleotid.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Testkit die Sonde, das Phosphorthioatnucleotid und mindestens ein erstes Enzym, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, ist es, durch den Verzicht der Längenanalyse von DNA-Fragmenten, der Sequenzierreaktion aufwendiger Auswerteverfahren entfallen können. Das gesamte Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz bis hin zur Auswertung, d. h. bis zur Bestimmung der Nucleotidsequenz, läuft beispielsweise im Mikrotiterplattenformat ab und ist deshalb auf vorhandene Laborroutinen gut übertragbar und eine Automatisierung ist daher kostengünstig möglich. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die spezifische Hybridisierung der Sonde, die Modifikation der Sonde durch den Einbau von ausgewählten Nucleotiden, beispielsweise Phosphorthioatnucleotide, durch das erste Enzym und der enzymatische Abbau durch das zweite Enzym von nicht ausreichend modifizierten Sonden und/oder Nucleotidsequenzen miteinander effizient und kostengünstig kombiniert. Die erfindungsgemäße Kombination der einzelnen Schritte führt dazu, dass in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Nucleotidsequenz und der Nucleotidtriphosphate im Reaktionsansatz unterschiedliche lange, gegen den Abbau durch das zweite Enzym resistente Modifizierungen der Sonden und/oder der Nucleotidsequenzen erzielt werden können, beispielsweise auch über eine Schmelzpunktanalyse des entstehenden Hybrids detektiert werden können.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass demgemäß die nicht ausreichend modifizierten Sonden und/oder Nucleotidsequenzen durch das zweite Enzym komplett eliminiert und nicht mehr detektiert werden können, somit können die im Reaktionsansatz verbliebenen Sonden und/oder Nucleotidsequenzen durch Analyse der Schmelzpunktveränderungen bestimmt werden. Die erzielten Schmelzpunktänderungen können in Abhängigkeit des Nucleotids 2 oder 4°C pro Base betragen, was bei einer zu analysierenden Sequenz von durchschnittlich 6 Barenpaaren eine Temperaturerhöhung von maximal ca. 24°C erfordert. Ein Vorteil ist, dass derartige Schmelzpunktveränderungen des modifizierten Hybrids so groß sind, dass sie sehr zuverlässig und effizient nachgewiesen werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren weist daher besondere Vorteile zur Sequenzierung mehrerer variabler Nucleotidpositionen in unmittelbarer Nachbarschaft auf, es eignet sich jedoch, auch sehr gut zur Analyse einzelner variablen Nucleotidpositionen. Von Vorteil ist es, dass im erfindungsgemäßen Verfahren das modifizierte Nucleotid beispielsweise nicht in der genau zu identifizierenden Position eingebaut werden muß, es ist vielmehr auch möglich, es weiter downstream komplementär einzubauen. Dadurch wird die Modifizierung einer Schmelzpunktveränderung der Sonde erreicht, die strigenten Waschprozeduren für die Entfernung unmodifizierter aber unvollständig, aber nicht abgebauter Sonden durch das zweite Enzym ermöglicht. Damit erhöht sich vorteilhafterweise das Verhältnis aus Messignale und Hintergrundsignale und somit Selektivität des Verfahrens. Aus diesem Grunde ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine besonders günstige Bestimmung sehr kleiner Sequenzen, d. h. Sequenzen bis zu 10 Barenpaaren.

Im folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung auf dieses Beispiel zu beschränken ist.

Beispiele Beispiel 1 Nachweis des Sequenzpolymorphismus 677C < T im humanen MTHFR- Gen

Der Nachweis des Sequenzpolymorphismus ist in Fig. 1 dargestellt: Zuerst erfolgt die Präparation der genomischen Patienten-DNS z. B. durch Verwendung des InViSorb-Kits nach den Vorschriften des Herstellers (InViTek, Deutschland). Zur Vorbereitung des Mutationsnachweises wird ein Sequenzabschnitt des humanen MTHFR-Gens an die Oberfläche einer NucleoLink®-Mikrotestplatte, die als Träger fungiert, durch asymmetrische PCR entsprechend den Vorschriften des Herstellers (Nung, Dänemark) immobilisiert. Das Reaktionsgemisch enthält:
0,075 µM Vorwärtsprimer
0,6 µM Rückwärtsprimer
0,8 µM dNTPs
0,02 U/µl InViTaq-DNS-Polymerase
1,8 mM MgCl₂
100 ng Genomische Patienten-DNS
Reaktionspuffer nach Herstellerangaben

Die PCR erfolgt in den Kavitäten einer NucleoLink®- Mikrotestplatte, die entsprechend Herstellerangaben (Nunc) mit 25 nM Vorwärtsprimer, der um einen Poly-dT-Spacer am 5'- Ende verlängert worden ist, beschichtet wurde.

Für die Immobilisierung verwendeter Vorwärtsprimer

5'-TTT TTT TTT GGA GCT TTG AGG CTG ACC TGA-3'
5'-phosphoryliert

Vorwärtsprimer in der Flüssigphase

5'-GGA GCT TTG AGG CTG ACC TGA-3'

Rückwärtsprimer

5'-GGA CGA TGG GGC AAG TGA T-3'

Die PCR erfolgt in einem Thermocycler unter bevorzugt folgendem Temperaturregime:
1 Zyklus: 95°C 10 min
6 Zyklen: 95°C 1 min < 65°C 1 min < 72°C 1 min
30 Zyklen: 95°C 30 sec < 65°C 30 sec < 72°C 30 sec
1 Zyklus: 72°C 2 min
1 Zyklus: 4°C ohne zeitliche Begrenzung

Nach erfolgter PCR werden die an die Oberfläche der Mikrotestplatte immobilisierten, doppelsträngigen Amplifikatmoleküle, durch Zugabe von 0,4 M NaOH und anschließendem Waschen mit H₂O denaturiert. Der immobilisierte Einzelstrang der entsprechenden DNS-Moleküls verbleibt am Träger und wird mit der Sonde hybridisiert. Sonde mit 5'-FITC-Markierung:
5'-GCT GCG TGA TGA TGA AAT CG-3'

Nach der Abtrennung der nicht gebundenen Sonden, wird die Modifizierungsreaktion bei einer Reaktionstemperatur von bevorzugt 55°C für vorzugsweise 5 min mit 25 µl Modifizierungsgemisch vorgenommen. Es werden folgende Modifizierungsgemische eingesetzt:

Modifizierungsgemisch A

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
0,4 µM αSdCTP (Amersham-Pharmacia, Schweden), dGTP, dTTP (beide Promega, USA)

Modifizierungsgemisch B

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
0,4 µM αSdCTP (Amersham-Pharmacia, Schweden), dATP, dTTP (Promega, USA)

Nach einem erneuten Waschschritt zur Entfernung des Reaktionsgemisches der Modifizierungsereaktion wird der Exonuklease III-Verdau bevorzugt kombiniert mit der Inkubation mit dem Anti-FITC-Fab-Peroxidasekonjugat bei 37°C für mindestens 5 min durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch folgende Bestandteile enthält:
1 × Exonuklease III-Reaktionspuffer (New England Biolabs, USA)
0,1 U/µl Exonuklease III (New England Biolabs, USA)
1 : 5000 Anti-FITC-Fab-Peroxidasekonjugat (Roche Diagnostics, Schweiz)

Über die nachfolgende Substrat-Farbstoff-Peroxidasereaktion, bevorzugt unter Verwendung von Tetramethylbenzidin- Substratlösung (Sigma, USA), werden die modifizierten Sondenmoleküle nachgewiesen, die durch Einbau von Phosphorthioatdesoxynucleotiden gegenüber dem Exonuklease III-Verdau resistent waren.

Das erhaltene Resultat wird nach folgendem Schema ausgewertet:

Beispiel 2 Nachweis von Sequenzpolymorphismen im Kondon 12 und 13 des humanen K-RAS-Gen

Der Nachweis der Sequenzpolymorphismen erfolgt prinzipiell wie in Fig. 1 dargestellt. Zur Charakterisierung disseminierender Karzinomzellen werden epitheliale Zellen aus dem Patientenblut immunaffinitätschromatographisch mit dem Kit CellSelect (Labsoft, Deutschland) isoliert. Mittels RT- PCR wird Kodon 1 des humanen K-RAS-Gens amplifiziert, wobei das Reaktionsgemisch folgende Zusammensetzung hat:
0,6 µM Rückwärtsprimer
0,6 µM Vorwärtsprimer
0,8 µM dNTPs
0,02 U/µl Tth-DNA-Polymerase
0,05% Tween 20
Reaktionspuffer nach Herstellerangaben

Vorwärtsprimer

5'-ATG ACT GAA TAT AAA CTT GT-3'
5'-phosphoryliert

Rückwärtsprimer

5'-CTC TAG TGT TGG ATC ATA ATC-3'
5'-biotinyliert

Danach werden zu 20 µl Reaktionsmix 5 µl Zellsuspension gegeben und folgendermaßen inkubiert:
1 Zyklus: 45°C 60 min
6 Zyklen: 95°C 1 min < 65°C 1 min < 72°C 1 min
40 Zyklen: 95°C 30 sec < 65°C 30 sec < 72°C 30 sec
1 Zyklus: 72°C 2 min
1 Zyklus: 4°C ohne zeitliche Begrenzung

Das Reaktionsgemisch wird mit 0,1 U/µl Lambda Exonuklease versetzt und für 30 min bei 37°C und 5 min bei 95°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird 1 : 10 in den Modifizierungsgemischen A-D verdünnt:

Modifizierungsgemisch A

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
1 U Refenrenztemplate CCACCG
0,4 µM αSdCTP (Amersham-Pharmacia, Schweden), dGTP, dTTP (beide Promega, USA)

Modifizierungsgemisch B

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
1 U Referenztemplate CCACCG
0,4 µM αSdGTP (Amersham-Pharmacia, Schweden), dTTP

Modifizierungsgemisch C

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
Referenztemplate ACACCG
0,4 µM αSdTTP (Amersham-Pharmacia, Schweden

Modifizierungsgemisch D

1 × NEB2 (New England Biolabs, USA)
0,04 U/µl Bst-DNS-Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs, USA)
1 U Referenztemplate CCACTG
0,4 µM aSdATP (Amersham-Pharmacia, Schweden), dGTP, dTTP

Dazu werden 5 µl RT-PCR-Reaktionsgemisch und je 45 µl Modifizierungsgemisch A in Kavität A, Modifizierungsgemisch B in Kavität B, Modifizierungsgemisch C in Kavität C Modifizierungsgemisch D in Kavität D und nochmals Modifizierungsgemisch C in Kavität E eines vorbereiteten NucleoLink®-Streifens (schwarz; Nung, Dänemark) gebeben und bei 37°C für 5 min ikubiert. Die Referenztargets unterscheiden sich in ihren Genotypen und werden parallel zur Referenzierung des Targets aus der amplifizierten Probe bestimmt. Die Referenztargets sind synthetische Oligos von ca. 40 bp mit einer 5'-Fluoresceinmarkierung, die im Sondenbindungsbereich dem Target aus der Probe entsprechen. Der zu sequenzierende Abschnitt des Referenztargets entspricht einem ausgewählten Genotyp (siehe Tabelle und Zusammensetzung der Modifizierungsgemische). 1 U Referenztarget ist die Menge an Target, die benötigt wird, um 30% aller immobilisierten Sonden abzusättigen.

Die Vorbereitung der Nucleolink-Streifen umfaßt die Immobilisierung der Sonde 1 in den Kavitäten A-D und die Immobilisierung der Sonde 2 in der Kavität E nach Protokollen des Herstellers mit 50 µl Inkubationsmedium. Um Hintergrundprobleme bei der Messung mit dem Laserfluoskop zu vermeiden, werden die gekoppelten Sonden im Bereich des Bodens der Kavität mit S1-Nuklease abgebaut. Dazu werden 5 µl Nucleasegemisch folgender Zusammensetzung in die Kavitäten pipettiert und 10 min bei 37°C inkubiert:
1 × Reaktionspuffer (Amersham Pharmacia)
0,1 U/µl S1-Nuclease (Amersham Pharmacia)
0,05% Tween 20 (Sigma, USA)

Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,4 M NaOH abgestoppt. Die Streifen werden mit Wasser gespült, getrocknet und bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt:

Sonde 1

5'-GTG GTG GTG GTG GTG GTG GGT AGT TGG AGC T-3'
5'-phosphoryliert

Sonde 1

5'-GTG GTG GTG GTG GTG GTG GGT AGT TGG AGC TG-3'
5'-phosphoryliert

Nach Abschluß der Modifizierungsreaktion befinden sich an der Gefäßwandung des NucleoLink®-Streifen die Hybride aus modifizierten Sonden bzw. nich modifizierten Sonden und Template oder Referenztemplate.

Nach einem Waschschritt zur Entfernung des Reaktionsgemisches der Modifizierungsreaktion wird der Exonuklease III-Verdau bei 37°C für 5 min durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch bevorzugt folgende Bestandteile enthält:
1 × Exonuklease III-Reaktionspuffer (New England Biolabs, USA)
0,1 U/µl Exonuklease III (New England Biolabs, USA)

Danach werden die Kavitäten mit der Detektionslösung folgender Zusammensetzung bei 4°C für 10 min inkubiert:
1 : 500 TransFluoSpheres, 0,04 µm, 488/645(Molecular Probes, USA) mit Anti-Fluorescein-Antikörper (Roche Diagnostics, Schweiz) nach Standardverfahren konjugiert
1 : 500 TransFluoSpheres, 0,04 µm, 488/560(Molecular Probes, USA) mit Streptavidin (Sigma) nach Standardverfahren konjugiert
0,05 M Tris-HCl, pH 7,4 + 0,9% NaCl + 0,1% Tween 20 (Sigma, USA)

Danach werden Kavitäten erneut gespült. Der Nucleolink®- Streifen wird in den Thermocycler GeneAmp® PCR system 9700 überführt und im Stufengradienten von 40°C auf 70°C temperiert: 40°C, 1 min. 45°C, 1 min. 50°C, 1 min. 55°C, 1 min. 60°C 1 min. 65°C 1 min. 70°C, 5 min. Simultan werden mit dem Laserfluoskop (IOM, Deutschland) emittiertes Fluoreszenzlicht der Wellenlängen 560 nm bzw. 645 nm detektiert. Die Meßanordnung ist in Fig. 2 dargestellt: In der Meßanordnung ist die Durchführung der Schmelzpunktanalyse der modifizierten und nicht durch Exonuklease III abgebauten Targets dargestellt. Die Meßsonde des Laserfluoskopes ist über eine Portalkinematik in x/y-Richtung frei über dem Thermoblock positionierbar.

Als Referenztarget wird bevorzugt ein Genotyp eingesetzt, an dem die Sonde bei der entsprechenden Modifizierungsreaktion maximal verlängert wird. Außerdem wird bevorzugt die Wildtypsequenz eingesetzt, da Abweichungen des Schmelzpunktes des Targets der Probe vom Referenztarget somit leicht als Abweichung vom Wildtyp zu identifizieren ist. Aus den ermittelten Schmelzpunkten können alle möglichen Genotypen bestimmt werden. Tabelle zwei gibt die theoretischen Schmelzpunkterhöhungen der modifizierten Sonden an (T, A: Schmelzpunkterhöhung jeweils 2°C; G, C: Schmelzpunkterhöhung jeweils 4°C). Der Schmelzpunkt wird als Temperatur definiert, bei der sich das Fluoreszenzsignal um 50% verringert hat. Aus der Kombination der ermittelten Schmelztemperaturen für alle 5 Modifizierungsreaktionen kann entsprechend Tabelle 2 der Genotyp ermittelt werden.

Tabelle 2

Theoretische Schmelpunkterhöhungen des Hybrids aus Sonde und Target durch die Modifizierungsreaktion in °C

Wird die Sonde nicht ausreichend modifiziert, wird sie durch Exonuklease III abgebaut und es resultiert keine Temperaturangabe im jeweiligen Feld.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nucleotidsequenz mit einer Sonde inkubiert wird,
mindestens ein Phosphorthioatnucleotid in Gegenwart eines ersten Enzyms, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist, zugegeben werden,
ein zweites Enzym zugegeben wird, dass Phosphorthioatnucleotid-freie komplementäre Nucleotidsequenzen abbaut,
ein Detektionsmolekül zugegeben wird, das spezifisch mit der komplementären Nucleotidsequenz wechselwirkt und über die Wechselwirkung des Detektionsmoleküls die Nucleotidsequenz bestimmt wird, wobei die einzelnen Verfahrensschritte vertauschbar sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Gegenwart des ersten Enzyms mindestens ein Desoxynucleotid, Didesoxynucleotid und/oder Phosphorthioatnucleotid zugeben werden.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde und/oder die zu bestimmende Nucleotidsequenz immobilisiert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für die Immobilisierung Spacer eingesetzt werden, insbesondere Avidin und/oder Biotin, Antigen-Antikörper- Komplexe, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und/oder Polyethylenglcol.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Wechselwirkung des Detektionsmoleküls bei unterschiedlichen Temperaturen, Detergenz- und/oder Salzkonzentrationen mehrfach durchgeführt wird.

6. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Testkit mindestens eine Sonde umfasst.

7. Testkit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Testkit die Sonde und mindestens ein Phosphorthioatnucleotid umfasst.

8. Testkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Testkit die Sonde, das Phosphorthioatnucleotid und mindestens ein erstes Enzym umfasst, das zur Katalyse der Synthese einer komplementären Nucleotidsequenz am 3'-Ende der Sonde befähigt ist.