DE4416300A1 - Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben - Google Patents

Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben

Info

Publication number
DE4416300A1
DE4416300A1 DE4416300A DE4416300A DE4416300A1 DE 4416300 A1 DE4416300 A1 DE 4416300A1 DE 4416300 A DE4416300 A DE 4416300A DE 4416300 A DE4416300 A DE 4416300A DE 4416300 A1 DE4416300 A1 DE 4416300A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
virus
specific
reaction
carrier
retrovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE4416300A
Other languages
English (en)
Other versions
DE4416300C2 (de
Inventor
Ortwin Dr Faff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE4416300A priority Critical patent/DE4416300C2/de
Priority to US08/557,108 priority patent/US6268123B1/en
Priority to PCT/DE1994/000610 priority patent/WO1994028115A1/de
Priority to AU67933/94A priority patent/AU6793394A/en
Priority to EP94916144A priority patent/EP0707635A1/de
Priority to JP7500112A priority patent/JPH08510136A/ja
Publication of DE4416300A1 publication Critical patent/DE4416300A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE4416300C2 publication Critical patent/DE4416300C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Virus-Diagnostik Stand der Technik
Der routinemäßige Nachweis von Retroviren in biologischen Proben erfolgt gegenwärtig nur indirekt und Struktur-spezifisch (d. h. nichtfunktionell) bzw. über den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und/oder von Einzelkomponenten (Antigene, RNA, provirale DNA), z. B. anti-HIV-Antikörper Tests, HIV-p24-Antigen-Tests, HIV-PCR Detektions Test (Holodniy M, et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. AIDS Res. Hum. Retrovir. 8, 47-52, 1992). Diese Analytik stützt sich lediglich auf eine nicht funktionelle bzw. Struktur spezifische molekulare Interaktion zwischen Antikörper und Antigen oder PCR primer und proviraler DNA und erlaubt deshalb nicht den Rückschluß auf ein ganzes und funktionelles intaktes Virus. Außerdem erfaßt diese Analytik nicht alle Stadien einer viralen Infektion, z. B. die Phase, in der die Infektion stattgefunden hat, jedoch noch keine Antikörper gebildet sind. Diese Faktoren bewirken somit gelegentlich falsch positive oder negative Ergebnisse. Deshalb ist der direkte und auch funktionelle Nachweis für Retroviren in biologischen Proben dringlichst notwendig. Diese Notwendigkeit ist auch gegeben durch die medizinische und sozial-politische Aktualität von Retroviren, vor allem durch die gegenwärtig größte medizinische Herausforderung AIDS und durch eine zu beobachtende ansteigende Tendenz und zunehmende Rolle von Retroviren bei tierischen und menschlichen Erkrankungen (Leukämie, Autoimmunerkrankungen, Krebs etc.). Außerdem birgt die Übertrag­ barkeit von Retroviren durch Infektion ernste Probleme für die Transfusions- und Trans­ plantationsmedizin bzw. erfordert Qualitätsuntersuchungen auf Virus-Kontamination bei Lymph-, Speichel-, Sperma- oder Blutproben von Spendern und bei zu verpflanzenden Organen, Haut, Knochenmark etc. Die gleiche Problematik der Virus-Kontamination bzw. Infektion gilt auch für die Verwendung von Arzneimitteln und anderen pharmazeutisch-biotechnologischen oder gen­ technologischen Präparaten biologischen Ursprungs zu Krankheits-Therapien bei Mensch und Tier sowie in der medizinischen Grundlagen-Forschung. Voraussetzung für die Lösung der oben erwähnten Problemstellungen ist der direkte und funktionelle Nachweis von Retroviren mittels möglichst einfacher, verläßlicher und empfindlicher Methoden.
Der direkte und biologisch funktionelle Nachweis von Retroviren ist bislang nur in Einzelfällen und mit sehr hohem Arbeits- und Zeitaufwand über Infektion von Zellen und nur in in gereinigten Virus-Präparaten oder in Zellkultur-Überständen möglich. Quantitative, einfache und verläßliche Routine-Methoden gibt es bislang dafür nicht. Ein Grund dafür ist die komplexe Zusammensetzung biologischer Proben (Blut, Organextrakte etc.), die Proteine, Enzyme, Vitamine, Lipide, Zucker und verschiedene Inhibitoren enthalten. Diese erschweren oder machen den direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren unmöglich.
Das vorliegende und zur Patentierung angemeldete Verfahren beschreibt den routine­ mäßigen direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben.
Lösung des Problems
Der direkte und biochemisch funktionelle Nachweis von Retroviren in biologischen Proben wird durch das vorliegende Verfahren ermöglicht, das aus drei Etappen besteht: a) einem Extraktionsschritt, b) einem Reaktionsschritt und c) einem Detektionsschritt.
  • A) Der Extraktionsschritt beruht auf einer selektiven Bindung der in einer Probe vorhandenen Retrovirus-Partikel anhand deren Oberflächenmoleküle mittels spezifischer Liganden, die ihrerseits an ein solides Träger-Material gebundenen sind. Dadurch werden sowohl Virus-Partikel als auch lösliche virale Oberflächen-Moleküle in einem Träger-Ligand-Virus Komplex immobilisiert und können aus dem komplexen Probengemisch selektiv extrahiert werden. Für den Nachweis von Retroviren in Gewebe-Extrakten bietet sich alternativ eine selektive Extraktion von retroviralen membran-freien Virus-core-Partikeln bzw. intra­ cisternalen A-Partikeln mittels core-spezifischen Liganden an. Die Selektivität der Extraktion besteht darin, daß Oberflächen-spezifische Liganden für die jeweiligen Retrovirus- Spezies verwendet werden. Virus-Spezifische Liganden können sein: a) Antikörper (monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Oberflächen-Epitope eines Retrovirus gerichtet sind, b) Rezeptoren, Rezeptor-Supramolekularkomplexe oder Rezeptor-Epitope (als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein bzw. Peptid, lösliche oder membran-gebunden in Liposomen, Membran-Präparaten/Fraktionen oder Zellen), die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. einzudringen, c) anti-Rezeptor-idiotypische Antikörper (mono­ klonale oder polyklonale), die Bindungs-Strukturen der Virus-spezifischen Rezeptoren nachahmen oder d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus- Antikörper-Immunkomplexe über Ig-Fc Regionen bindet. Als Alternative kann auch eine Kombination mehrerer oben genannter Liganden zur selektiven Bindung von Retrovirus- Partikeln verwendet werden.
Da der Extraktionsschritt auf rein struktureller Interaktion beruht unterscheidet er nicht zwischen ganzen Virus-Partikeln und viralen Oberflächen-Komponenten z. B. Glykoproteinen. Deshalb wird der Träger-Ligand-Virus Komplex in einem nachträglichen funktionellen enzymatischen Reaktionsschritt getestet, der für Retroviren spezifisch ist und nur von einem intakten Virus-Partikel, jedoch nicht von einzelnen Virus-Komponenten durchgeführt werden kann.
  • B) Der Reaktionsschritt beruht auf einer Retrovirus-spezifischen enzymatischen Reaktion, die die in vivo Reaktionen in einer Retrovirus infizierten Zelle nachahmt und von mehreren spezifischen viralen Enzymen durchgeführt werden kann: Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease u. a. Die endogene Reverse Transkription ist ein komplexer Vorgang an dem mehrere virale Komponenten beteiligt sind uzw. die Reverse Transkription der viralen RNA (vRNA) zu komplementärer DNA (cDNA) in Abhängigkeit der als "primer" funktionierenden viralen transfer RNA (tRNA), Reversen Transkriptase (RT) und exogen zugegebener deoxy-Nukleotid-triphosphate (dNTP′s). Alternativ zur oben genannten endogenen Reaktion können exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden) z. B. oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphophat (oligo­ dT) und exogene templates z. B. poly-Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin­ triphosphat (30 µg/ml) zur Reverse Transkriptions Reaktion zugegeben werden um die biochemische Funktionalität des Reverse Transkriptase Enzyms zu identifizieren. Die Reverse Transkriptions Reaktion des Träger-Ligand-Virus Komplexes muß nicht gestoppt werden, wenn die Detektion auf der Immobilisierung der neu synthetisierten cDNA basiert (z. B. Markierung mit Biotin, Br-Digoxigenin, FITC). Für genaue kinetische Untersuchungen, wo ein Reaktionsstop notwendig ist, kann die Reaktion auf Grund der Immobilisation des Ligand-Virus Komplexes durch Ersetzen des Lysis-Reaktions-Mix mit Stopper-Mix gestoppt werden, der keine dNTP′s enthält. Dieser Stop-Schritt hat auch den Vorteil, daß die markierten Edukte (dNTP′s) von den Produkten einfach getrennt werden können und die Test-Empfindlichkeit somit deutlich steigern. Durch eine anschließende komplette Lyse des Virus wird die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigesetzt. Der Einbau von dNTP′s bzw. die Synthese von cDNA ist ein direkter Beweis für die biochemische Funktionalität des Retrovirus und zeigt die simultane Präsenz funktioneller viraler Komponenten (vRNA, tRNA und RT) in der Probe.
Zusätzlich kann die Reverse Transkriptions-Reaktion fortgesetzt werden uzw. über die Synthese des zweiten cDNA Strangs bzw. doppelsträngiger cDNA (mittels DNA Polymerase Aktivität) und deren nachträglichen Integration in ein Plasmid (mittels Retrovirus-spezifischer Integrase Aktivität). Die integrierte dsDNA wird wie auch die vorher synthetisierte cDNA in einem folgenden Detektionsschritt nachgewiesen.
  • C) Im Detektionsschritt werden die enzymatisch synthetisierten Reaktionsprodukte anhand radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierung mittels optischer, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Verfahren quantitativ gemessen.
Die von der Reversen Transkriptase synthetisierte cDNA wird während der enzymatischen Synthese durch den Einbau von Br-, Biotin-Fluoreszenz- oder Digoxigenin-markiertem dUTP (deoxy-Uridin-Triphosphat) markiert. Die markierte cDNA wird mittels Absorbtion mit spezifischen an einen soliden Träger gebundenen Liganden (Streptavidin, Antikörper, Oligo­ nukleotide) immobilisiert bzw. von den Edukten getrennt und mittels weiteren Markierungs­ spezifischen Antikörpern die mit einem Indikator-Enzym (Peroxidase, alkalische Phosphatase) gekoppelt sind und entsprechenden Enzym-Substraten quantitativ gemessen. Die Messung kann photometrisch oder mittels Lumineszenz bzw. Fluoreszenz erfolgen und quantitativ ausgewertet werden.
Bei radioaktiver oder Fluoreszenz-Markierung der Edukte können die markierten Edukte nach dem oben beschriebenen Reaktions-Stop von dem immobilisierten Ligand-Virus-Komplex getrennt und direkt mittels Szintillation oder Fluoreszenz-Emission quantitativ gemessen werden. Alternativ kann die markierte cDNA gefällt werden, mittels Adsorbtion auf Filtern von den Edukten getrennt und anschließend gemessen werden.
Vorteile des Verfahrens
Das beschriebene Verfahren ermöglicht erstmalig den routinemäßigen direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben. Es hat gegenüber den bisher existierenden Nachweismethoden folgende Vorteile:
  • a) Retroviren werden bei vergleichbarer Sensitivität als Partikel spezifisch und direkt in biologischem Material anhand mehrerer Komponenten (Antigene, Enzyme und Nukleinsäuren) nachgewiesen,
  • b) der Nachweis erfolgt nicht nur strukturell (im Extraktionsschritt) anhand spezifischer Liganden sondern auch biochemisch funktionell anhand Retrovirus-spezifischer Enzyme (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease), die die Reaktion in vivo nachahmen und somit ein verbesserte Spezifität des Verfahrens gewährleisten,
  • c) der Nachweis erfolgt quantitativ,
  • d) das Verfahren ist vom Zeit- und technischen Aufwand einfach durchführbar, routinemäßig anwendbar, - da es an Mikrotiterformat adaptiert ist - und somit auch billiger,
  • e) das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend spezifischer Liganden universell auf alle Spezies von Retroviren anwendbar.
2.4. Anwendungsgebiete
Die potentiellen Anwendungen des zu entwickelnden Verfahrens lassen sich in vier große Bereiche einteilen.
  • a) Der erste Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die medizinische Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Therapie von Retrovirus bedingten Krankheiten z. B. AIDS, Leukämie beim Menschen. Die gleiche Anwendung gilt auch für Retrovirus bedingte Krankheiten bei Tieren. Dementsprechend sind die potentiellen Abnehmer: Kliniken u. Krankenhäuser sowie klinische Labors und Laborgemeinschaften.
  • b) Ein zweiter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf virologische Forschung & Entwicklungs-Labors an Universitäten, Großforschungseinrichtungen und Industrie wo an Experimentier-Modellen gearbeitet wird um antivirale Therapiemöglichkeiten, Impfstoffe etc. zu entwickeln. Bei sämtlichen Arbeiten ist der direkte Nachweis von Retroviren (in vitro Modelle, Tiermodelle etc.) absolut notwendig.
  • c) Ein dritter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die gesamte Transplantations- und Transfusions-Medizin bzw. auf die Spender-Banken von Blut, Organen, Knochenmark, Samen etc. Der Nachweis von Kontamination mit Retroviren in den oben genannten Spender- Materialien ist äußerst wichtig um einer Weiterverbreitung und Infektion durch Transplantation oder Spende vorzubeugen.
  • d) Ein vierter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die Qualitätskontrolle biologischer Pharmazeutika (z. B. Blutderivate, Gerinnungs-Präparate), biotechnologischer Produkte (z. B. Immunglobuline, therapheutische Enzyme, Insulin, fötale Seren etc.), biologischer Kosmetika und bestimmter (gentechnologisch hergestellter) Lebensmittel, die auf Kontamination mit Retroviren untersucht werden müssen um gegebenenfalls deren Übertragung zu verhindern.
Beispiel
Zur Optimierung des Verfahrens wurden als Modell Virus retrovirale T47D Partikel verwendet, die Retrovirus-typische Eigenschaften: Lipid-Membranhülle, Glykoproteins, Reverse Transkriptase, genomische RNA, endogene cDNA Synthese und eine endogene Verteilung im menschlichen Genom aufweisen (Faff, O., Murray, A.B., Schmidt, J., Leib-Mösch, C., Effle, V., Hehlmann, R., J. Gen. Virol.: 73, 1087-1097, 1992).
  • a) Extraktion: Polyklonale Antikörper (10 µg/ml) die gegen die T47D Partikel gerichtet sind, wurden über Nacht in Coating-Puffer (50 mM Carbonat-Puffer pH9.6) an eine Mikrotiter- Platte gebunden. Anschließend wurden die frei gebliebenen Bindungsstellen der Platte 60 min bei Raumtemperatur mit 1% BSA in Coating Puffer geblockt und dann der Überschuß an ungebundenem Material mit Waschpuffer (300 mosmol Phosphat-Puffer-Saline oder Tris-HCl pH 7.4, NaCl) gewaschen. Als Negativ Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet, daß keine T47D Partikel spezifischen Antikörper enthielt, jedoch mit T47D Partikeln inkubiert wurde. Als Positivkontrolle wurde T47D Partikel-haltige Probe verwendet, die nicht mit spezifischen Antikörpern voradsorbiert bzw. immobilisiert war.
  • b) Reaktion: Die mit Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 4°C mit 100 µl/well Probe inkubiert, bestehend aus: RPMI-Medium, 10% fötales Kälberserum und 10 µg gereinigte T47D Partikel. Anschließend wurde der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in Waschpuffer gewaschen und in einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer lysiert und in Gegenwart eines dNTP-Gemischs 60 min bei 42°C inkubiert. Der Lysis- Reaktions-Mix Puffer hatte folgende Zusammensetzung: 0.3% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7.8, 40 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 2 mM EDTA und je 30 µM dATP, dCTP, dGTP und dTTP+dUTP-Biotin+dUTP-Digoxigenin. Der Einbau der dNTP′s bzw. die Synthese von cDNA wurde anschließend gemessen.
  • c) Detektion: Der Lysis-Reaktions-Mix wurde auf Streptavidin beschichtete Mikrotiter- Platten übertragen und zur Immobilisierung der Biotin- und Digoxigenin-markierten cDNA 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Waschen des ungebundenen Materials wurde die immobilisierte cDNA mit Peroxidase gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörpern inkubiert (1 Stunde bei 37°C), gewaschen und anschließend mit dem Peroxidase-Substrat ABTS (Fa. Böhringer Mannheim) inkubiert. Die Farbentwicklung wurde nach 5 min photometrisch bei 405 nm (und 490 nm als Referenz) gemessen (Eberle, J. and Seibl, B., J. Virol. Meth.: 40, 347-356, 1992).
Die Ergebnisse in Abb. 1 zeigen, daß es möglich ist, T47D Partikel aus Zellkulturmedium immunologisch, mit spezifischen Antikörpern zu extrahieren und anschließend über endogene Reverse Transkription biochemisch funktionell nachzuweisen.

Claims (17)

1. Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß eine Struktur-spezifische Extraktion der Retrovirus Partikel mit einer Funktions-spezifischen Enzym-Reaktion von Retroviren kombiniert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Extraktion Retrovirus­ spezifische Liganden und bei der Enzym-Reaktion Retrovirus-spezifische Enzyme eingesetzt bzw. nachgewiesen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) die Retrovirus-Partikel mittels spezifischer Liganden (Antikörper, Rezeptoren, Lektine, Proteine, Peptide), die an die Virus-Oberfläche oder Virus-cores binden selektiv aus dem Proben-Material extrahiert werden (Extraktionsschritt),
  • b) anschließend durch ein Retrovirus spezifisches Enzym (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease) auf biochemische Funktionalität bzw. Reaktion getestet werden (Reaktionsschritt) und
  • c) nachträglich anhand der markierten neu synthetisierten Reaktions-Produkte (cDNA, DNA- Proben, Oligonukleotide, Peptide, Proteine) mittels radioaktiver, photometrischer Methoden oder durch Lumineszenz- bzw. Fluoreszenz-Verfahren identifiziert werden (Detektionsschritt).
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Liganden kovalent oder nicht kovalent, direkt oder mittels eines sogenannten "Spacers" an einen soliden Träger uzw. Mikrotiterplatten, Träger-Sonden oder magnetische oder nicht magnetische Träger- Kügelchen gebunden sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß folgende spezifische Liganden einzeln oder in Kombination miteinander eingesetzt werden können:
  • a) virus spezifische Antikörper (monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Ober­ flächen-Epitope oder core-Epitope des entsprechenden Retrovirus gerichtet sind,
  • b) virus spezifische Rezeptoren, Rezeptor-Komplexe oder Rezeptor-Komponenten, die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. in diese einzudringen,
  • c) anti-Rezeptor-Idiotypische Antikörper (monoklonale oder polyklonale), die Virus- Bindungs-Epitope der viralen Rezeptoren nachahmen oder
  • d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus-Antikörper- Immunkomplexe über die Fc-Region der Antikörper binden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein oder Peptid, in löslicher Form oder membran-gebunden in Liposomen, Membran-Präparationen/Fraktionen oder ganzen Zellen verwendet werden können.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger immobilisierte Ligand für die Virus-Extraktion mit der Virus-haltigen Probe über Nacht bei 4°C inkubiert wird und anschließend der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in 300 mosmol Phosphat-Puffer oder Tris-HCl pH 7.4 gewaschen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger-Ligand- Virus Komplex lysiert wird und in einem weiteren Reaktionsschritt auf enzymatische Aktivität eines oder mehrerer Retrovirus-spezifischer Enzyme bzw. Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease getestet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis-Puffer folgende Zusammensetzung hat: 10-50 mM Tris-HCl pH 7.8, 2 mM PMSF, 2 mM DTT, 0.1-1% (v/v) NP40, 2 mM EDTA.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger- Ligand-Virus Komplex mit einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer inkubiert wird und mit einem Gemisch von deoxy-Nukleotid-Triphosphaten (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und einem Zusatz von markiertem dUTP (Br-, Fluoreszenz-, Biotin- oder Digoxigenin-), inkubiert wird um den Nukleotid-Einbau in die neu synthetisierte cDNA mittels endogener Reversen Transkription d. h. mittels Reverser Transkriptase, endogener viraler transfer RNA (primer) und RNA (template) quantitativ zu messen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden), [oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphosphat (oligo-dT)] und exogene templates [poly- Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin-triphosphat] zur Reversen Transkriptions- Reaktion zugegeben werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis- Reaktions-Mix Puffer folgende Zusammensetzung hat: 50 mM Tris-HCl pH 7.8, 40-80 mM KCl, 5-10 mM MgCl₂, 2 mM PMSF, 2 mM DTT, 0.1-1% (v/v) NP40, 2 mM EDTA und je 30-500 µM dATP, dCTP, dGTP bzw. dTTP sowie dem Zusatz von (Br-, Biotin-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz-) markiertem dUTP, oder radioaktiv markiertem deoxy-Nukleotid-Triphosphat.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reverse Transkriptions Reaktion durch den Austausch des Lysis-Reaktions-Mix mit einem Stopper-Mix gestoppt wird, der folgende Zusammensetzung hat: 50-100mM Tris-HCl pH 7.8, 40-80 mM KCl, 0.1% (v/v) NP40, 5 mM EDTA.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus mittels eines Lysis-Puffers (1% NP40, 10 mM Tris-HCl pH7.8, 5 mM EDTA) 15 min bei Raum­ temperatur lysiert und die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigelegt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- Produkte der Retrovirus spezifischen Enzym-Reaktion bzw. der Reversen Transkription (cDNA) in einem Detektionsschritt mittels Fluoreszenz, Photometrie, Lumineszenz oder Szintillation nachgewiesen werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger immobilisierten markierten Reaktions-Produkte von den löslichen markierten Edukten durch deren einfaches Wegwaschen getrennt werden und anschließend direkt mittels Fluoreszenz-Emission, bzw. Szintillation oder mittels Markierungs-spezifischer Liganden, daran gebundener Indikator- Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die ungebun­ denen (Br-, Biotin-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz-) markierten Reaktions-Produkte mittels spezifischer Träger-gebundener Liganden (Antikörper, Streptavidin, Oligonukleotide) immobilisiert, von den Edukten getrennt und mittels Ligand-gebundener Indikator-Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.
DE4416300A 1993-06-01 1994-05-09 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben Expired - Fee Related DE4416300C2 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4416300A DE4416300C2 (de) 1993-06-01 1994-05-09 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben
US08/557,108 US6268123B1 (en) 1993-06-01 1994-05-31 Direct and biochemically functional detection process of retrovirus in biological samples
PCT/DE1994/000610 WO1994028115A1 (de) 1993-06-01 1994-05-31 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen nachweis von retroviren in biologischen proben
AU67933/94A AU6793394A (en) 1993-06-01 1994-05-31 Direct and biochemically functional detection process of retrovirus in biological samples
EP94916144A EP0707635A1 (de) 1993-06-01 1994-05-31 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen nachweis von retroviren in biologischen proben
JP7500112A JPH08510136A (ja) 1993-06-01 1994-05-31 生体試料中のレトロウイルスの直接的かつ生化学的機能的な検出方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4318229 1993-06-01
DE4416300A DE4416300C2 (de) 1993-06-01 1994-05-09 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE4416300A1 true DE4416300A1 (de) 1994-12-08
DE4416300C2 DE4416300C2 (de) 1997-04-10

Family

ID=6489398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4416300A Expired - Fee Related DE4416300C2 (de) 1993-06-01 1994-05-09 Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4416300C2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997032995A1 (de) * 1996-03-06 1997-09-12 Retro-Tech Gmbh Gesellschaft Für Retrovirale Technologie Verfahren und test-kit für den nicht-radioaktiven und enzymatischen nachweis von reverser transkriptase

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10058915A1 (de) * 2000-11-20 2002-06-06 Attomol Gmbh Molekulare Diagno Verfahren zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993007259A1 (en) * 1991-10-11 1993-04-15 Scleroseforeningen (The Danish Ms-Society) Type c-like human retrovirus linked to multiple sclerosis (ms)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993007259A1 (en) * 1991-10-11 1993-04-15 Scleroseforeningen (The Danish Ms-Society) Type c-like human retrovirus linked to multiple sclerosis (ms)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EBERLE, J. u. SEIBL, R.: Journal of Virological Methods 40(1992)347-356 *
HENRARD, D.R. et.al.: Aids Research and Human Retroviruses 8(1992)47-52 *
O. Faff et al., Methods in Molecular and Cellular Biology 1 (1989) 67-72 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997032995A1 (de) * 1996-03-06 1997-09-12 Retro-Tech Gmbh Gesellschaft Für Retrovirale Technologie Verfahren und test-kit für den nicht-radioaktiven und enzymatischen nachweis von reverser transkriptase
US6174672B1 (en) 1996-03-06 2001-01-16 Retro-Tech Gmbh Gesellschaft Fur Retrovirale Technologie Process and test kit for non-radioactive enzymatic detection of reverse transcriptase

Also Published As

Publication number Publication date
DE4416300C2 (de) 1997-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102018100967B4 (de) Verfahren zur feststellung der wirksamkeit von viralen vektoren
Kuroda et al. Emergence of CTL coincides with clearance of virus during primary simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys
Klein et al. Chemokine receptor expression and signaling in macaque and human fetal neurons and astrocytes: implications for the neuropathogenesis of AIDS
Lagaye et al. Cell-to-cell contact results in a selective translocation of maternal human immunodeficiency virus type 1 quasispecies across a trophoblastic barrier by both transcytosis and infection
Egan et al. Use of major histocompatibility complex class I/peptide/β2M tetramers to quantitate CD8+ cytotoxic T lymphocytes specific for dominant and nondominant viral epitopes in simian-human immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys
EP0871393A1 (de) In situ immundetektion von antigenen
DE102020117636A1 (de) Kits und Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae
Chadwick et al. Enzymatic amplification of the human immunodeficiency virus in peripheral blood mononuclear cells from pediatric patients
EP0707635A1 (de) Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen nachweis von retroviren in biologischen proben
Noyes A simple technic for demonstrating plaque formation with virus of vaccinia.
DE4416300C2 (de) Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben
Patel et al. Epstein-Barr Virus (EBV)–Lymphoid Cell Interactions. I. Quantification of EBV Particles Required for the Membrane Immunofluorescence Assay and the Comparative Expression of EBV Receptors on Different Human B, T and Null Cell Lines
Zucker-Franklin et al. Hypopigmented mycosis fungoides associated with human T cell lymphotropic virus type I tax in a pediatric patient
Pisareva et al. PCR-amplification of influenza A virus specific sequences
DE69924380T2 (de) Verfahren zur erkennung von xenogenetischen organ persistenzen und infektiösen materialien
DE19608687A1 (de) Verfahren und Test-Kit für den nichtradioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase
Canto-Nogues et al. Ultrastructural localization of the RNA of immunodeficiency viruses using electron microscopy in situ hybridization and in vitroinfected lymphocytes
Salah et al. A new controversial pathophysiology confirms that HIV does not kill the CD4+ T-cell but mutates its physiological behavior becoming an unaccountable CD8+ T-cell.
DE69630135T2 (de) Verfahren zum nachweis der aktivität von dns polymerasen
Gengozian et al. Antibody-dependent cellular cytotoxicity with platelets as the target cell: potential application to the study of immune thrombocytopenia.
DE69729655T2 (de) Immunoenzymatischer assay für die diagnose von infektiöser pferdeanämie-viren-krankheit mit hilfe des rekombinanten virusproteins rgp90
Aulakh et al. Search for type‐c oncornavirus–related genetic information in tissues from patients with systemic lupus erythematosus
US5580772A (en) Association between a novel human intracisternal A-type retroviral particle-type II (HIAP-II) and idiopathic CD4+ T-lymphocytopenia (ICL)
WO1989001156A1 (en) Process and device for examining whole blood, other body fluids and other biological fluids
Contoreggi et al. Evaluation of HIV1 infection status by HIV1 PCR and culture methodologies in a small cohort of intravenous drug users

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8122 Nonbinding interest in granting licences declared
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20131203