JPH06509477A - 逆転写酵素の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 逆転写酵素の検出方法 本発明は成る被検物の中の逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又はデ オキシヌクレオシドトリホスファート：　ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトラン スフェラーゼ）の型の酵素の超高感度検出方法に関する。本発明はまた、この方 法により逆転写酵素の型の種々の酵素を検出するためのスクリーニング用キット 並びにその逆転写酵素の活性を、一定の共通の特徴を有する成る特定の病原粒子 又は病原粒子群に帰属させるような典型化キットにも関する。

逆転写酵素（以下においてＲＴと略記する）は複製競合レトロウィルスの成熟し たピリオンの偏性的成分である［Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｄ、　：Ｎａｔｕｒｅ” 　２２６．１２０９−１２１１（１９７０１、Ｔｅｍ１ｎ　ＨＭ、及びＭｉｚｕ ｔａｎｉ　Ｓ、　：Ｎａｔｉｒｅ”　２２６．１２１１−３　（１９７０１参昭 ］。しかしながら、少なくとも部分的に類似の活性を有する種々の酵素はまたレ トロウィルスの科に属しない他の種々のレトロエレメントにおいても見出すこと ができる。これらのレトロエレメントには、一方において、サブユニットである レトロトランスポゾン、パラレトロウィルス（コーリモウイルス及びヘパドナウ ィルス）及びＬＩＮＥエレメント類を含む種々のレトロウィルス類似のエレメン ト及び、他方において、例えばミトコンドリアプラスミド又はｍ５ＤＮＡのよう なレトロウィルス非類似の種々のエレメントが従属する〔レトロエレメントにつ いての簡単な展望のためにはＲｉｃｃｈｅｔｔｉ　Ｍ、　：　”Ｂｕｌｌ、　Ｉ ｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ”　８９．１４７−５８　（１９９１１を参照された い１゜従って本発明は全てのレトロウィルス類並びに活性ＲＴを含むか、又はこ れを発現する全ての他のレトロエレメントの超高感度検出のための方法をも記述 する。ＲＴは予め与えられたテンプレートＲＮＡ　（基質）に基づいてこれと相 補性のＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を産生ずるＤＮＡである（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ メラーゼ）。逆転写反応（ＲＴ反応）と呼ばれるこの反応の反応生成物としてＲ ＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ重複体が生ずる。レトロウィルスのＲＴはもう一つの活性 としてＲＮアーゼＨ機能を有する。最後にこのものはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ ラーゼ活性をも有する。レトロウィルス性逆転写酵素の諸特性についての展望に ついてはＲ，Ｗｅｉｓｓ　、　Ｎ、　Ｔｅ１ｃｈ、　Ｈ，Ｖａｒｗｕｓ　、　Ｊ 、　Ｃｏｆｆｌｎ編集の、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　１９Ｂ４年及び１９８５年刊行のＲＮＡＴｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ ｅｓ″　第２版第５章、第５頁の、Ｈ，Ｖａｒｍｕｓ及びＲ，Ｓｗａｎｓｔｒｏ ｍの「レトロウィルスの複製」に見出される。

ＲＴの検出について現在用いられている試験は、一般にＲＮＡ依存性ＤＮＡの合 成に基づいている。この酵素の天然のもと型（テンプレート）としてそれらピリ オンの中に存在する？０Ｓ　ゲノムＲＮＡが用いられるが、しかしながら合成の ホモ重合体のＲＮＡは１０ないし１０００倍も効果的に使用できる。ＲＴ反応が 成立するための前提条件は、そのテンプレート核酸がホモポリマーであれ又はヘ テロポリマーであれ、適当なＲＴアブイマーが存在することである。天然にはこ れはそれぞれのウィルスに特性的なｔＲＮＡが利用されるが、絵断的ＲＴ分析法 においては、通常はプライマーとしてオリゴデオキシリボヌクレオチドが用いら れる。今日ではテンプレート／プライマー複合物として主としてポリ（ｒＡ）− オリゴ（ｄＴ）の型の合成ホモポリマーが用いられる。このものは種々の真核性 ＤＮＡポリメラーゼによっても利用されることができるので、これらによっては 利用されないポリ（ｒＣ）−オリゴ（ｄＧ）もしはしば用いられる。しかしなが らこのものもなお特定の原核性ＤＮＡポリメラーゼによって利用され得る。これ らの酵素はヘテロポリマーのＲＮＡテンプレートをすら効率的に処理できるにュ ーヨークのＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓより１９８０年に刊行されたＪＲ，５ ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ編集の”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＮ Ａ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ”　の第９章、Ｇｅｒａｒｄ　ＧＦ、及びＧｒ ａｎｄｇｅｎｅｔｔ　ＤＰ、　：　ｒレトロウィルス逆転写酵素」）。

今日知られているＲＴ検出のための標準方法は下記のように説明することができ る。基質としてポリ−ｒＡ−（又はポリ−ｒＣ）ホモポリマーを用い、これに約 １２−２４　単位の長さの合成デオキシリボヌクレオチドオリゴマーｄＴ（又は ｄＧ）がプライマーとしてハイブリッドされている。ＲＴを含む被検物は適当な 処理の後で、テンプレート／プライマー複合物、３Ｈでラベルされたヌクレオシ ドトリホスファートｄＴＴＰ　（又はｄＧＴＰ）　、適当な２価のカチオン（Ｍ ｇ”又はＭｎ”　）並びに、可能であればその反応を支持する他の物質が適当な 緩衝系の中に入れられているような反応混合物の中に加えられる。適当な時間に わたつて適当な温度でインキュベーションした後でその反応を停止させ、そして 生じたヘテロ重複体をトリクロル酢酸の添加によって沈殿させて成るフィルタの 上に移す。乾燥させたそのフィルタをシンチレーション液体の中に入れ、そして その取り込まれた放射能を液体シンチレーション法によって測定する〔米国特許 第３，７５５、０８６　参照；また類似の技術はＰｏ１ｅｓｚ　Ｂ、等によりＰ ｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ″７７、１４１５　（１９８０１、Ｈｏｆｆ＋ｎａｎｎ　ＡＤ、等：Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ″１４７．３２６（１９８５１その他にも記述されている１゜僅か に高められた感度及び／又は比較的容易な実施の可能性をもたらし、及び／又は 特定の他の利点を持つようなこの分析法の種々の変形態様は、他のアイソトープ の使用［例えばＩＩｓ、′叩又はγ−放射装置等（例えばＰＣＴ出願ＷＯ９０１ ０６３７３参照）Ｊ、放射線的にラベルされていないヌクレオシドトリホスファ ート類の使用、支持体の上に不動化された基質の使用（例えば１９９０年４月ｌ Ｏ日出願のヨーロッパ特許出願９０１０６８４７．８　）或いはＥＬＩＳＡ法の 使用［例えば　Ｅｂｅｒｌｅ　Ｊ、等：　１９９１年６月１６−２１　日の、Ｆ ｌｏｒｅｎｃｅ　におけるＡＩＤＳに関する第７回国際会議のアブストラクトＭ 、　Ａ、　１０８４．　ｒＥＬＩＳＡによって測定した逆転写酵素活性」］を包 含する。

ホモポリマーの合成テンプレートを使用した場合でさえ、それらをレトロウィル スの検出のための他の種々の方法と比較した場合に、今日のＲＴ分析法は分析的 に感度が低い。これは、大免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染した細胞の培養に おいてＲＴ活性の検出のためにそのウィルスの検出をウィルス特異性（ｐ２４１ 抗原検出によって行った場合よりも約１００　倍も高いＨＩＶ濃度を必要とする ということによって説明されよう［Ｌｅｅ　ＹＳ、　：　”Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　Ｍｅｔｈ、２０．８９−９４ｆ１９８８１１゜この抗原検出法に比して細胞培 養による種々のウィルス検出法［Ｈ。

ＤＤ、等：　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、”　３２１．１６２１−５　ｆ １９８９１］或いはその検出されるべき病原菌の特定の核酸配列を検出する種々 の分子診断法はオーダーで何倍も高い分析感度を有する。これは、その選ばれた 核酸配列を核酸増加のための種々の方法によって高い値まで増幅することによっ て達成される。このような増幅法には下記が含まれる： ｌ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 米国特許４．６１１３．２０２　種々の核酸配列を増幅する方法米国特許４．６ ８３．１９５　種々の核酸配列を増幅し、検出し、及び／又はクローニングする 方法 ２）リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）／リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）Ｗｏ　８９／１ ２６９６　種々の核酸配列を検出するための方法と試薬ｌｆ０８９／［１９８３ ５リガーゼに基づく増幅方法３）転写法に基づく増幅／検出 ＥＰ　０４０８２９５　核酸配列の増幅方法ＷＯ８９１０１０５０標的ポリヌク レオチド配列の選択的増幅ＷＯ８８／１０３１５　転写法に基づく核酸の増幅検 出系４）複製ＲＮＡに基づ（方法 Ｎｏ　９０１０３４４５　標的核酸の増幅／検出系ＷＯ９０１０２８２０複製Ｒ ＮＡに基づく増幅／検出米国特許４，９５７，８５８　複製的ＲＮＡレポーター 系米国特許４，７８６，６００　口触作用的な組換え体ＲＮＡの複製５）複製Ｄ ＮＡに基づ（方法 ドイツ特許３９２９０３０　種々の核酸の増加方法ＷＯ９０／１００６４　試験 管内でのＤＮＡの増幅及びゲノムのクローニング及びマツピングのための改良法 ６）その他 米国特許４，９９４，３６８　ポリヌクレオチド分析のための増幅方法Ｎｏ　９ ０１０１０６９　ｎ酸を増幅し、検出するための方法これら全ての方法に共通し ているのは、各核酸区画を従来の種々の分子的同定法で分析し、同定するのに先 立って選択的に高い量まで増加させることである。

これの変形態様の一つは、検出される配列自身を増加させるのではなくてその相 補的配列に加えてなお１つの特異的なインジケータ配列又はレポーター配列を含 むもう一つの核酸をこのものにハイブリッドさせ、そしてそれを次に増幅させる ことよりなる（いわゆるプローブ増幅法）。

しかしながらレトロウィルスを検出するための全ての分子診断的方法、中でも種 々のレトロウィルスについてのスクリーニングと関連させた方法の重大な欠点の １つは、これが配列特異的であり、また従ってその病原体に特異的であることで ある。このことは、それらが少なくとも部分的に知られているゲノム配列を含ん だ病原体しか同定できず、そして１つの試験は原則的にただ１つの病原体しか検 出しないと言うことを意味する。多くのレトロウィルスに共通ないくつかの配列 を選んだときには、不適当な種々の配列、例えばその検査されている種の細胞ゲ ノムの他の種々の偏在性成分や内在性レトロウィルス等も検出され、そしてその 試験が非特異的になってしまったり、或いはその検出感度を低下させてしまうと 言う危険が生ずる。手間のかがる培養的な種々の検出方法も原理的に病原体に特 異的であり、そしてその宿主細胞が知られていて試験管内で増殖できる場合にし か利用することができない。

全ての複製競合レトロウィルスは成る活性のＲＴを有しているので、この酵素に ついての検出方法によれば存在する全てのレトロウィルスを検出することができ る。その上に活性のＲＴと組み合わされた種々のレトロウィルスも検出され得る 。この意味において逆転写酵素分析法を効率的な診断に利用するにはその分析感 度を著しく高めることが前提条件である。

本発明の課題は、それによりおよそのオーダーで感度を数百万倍に高めることが できるような方法、すなわちいわゆるＰ　Ｅ　ＲＴ　（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈ ａｎｃｅｄ　ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｌ　分析方法を提案し 、そしてこの方法を実施するための対応するキットを提供することである。

このために、本発明によれば、被検物の中に存在するＲＴ活性を次のように、す なわち成る特定の核酸増幅方法において増加されるべき核酸を準備調整するため に、被検物の中に逆転写酵素活性が存在するときにだけその増加されるべき核酸 が準備調整されるよう蹟使用する。次にその増加されるべき核酸を適当な増幅法 によって増加させ、そして適当な分析法によって検出する。これによって僅かな 量のＲＴ活性も検出することができる。

およそのオーダーで数百万倍のＲＴ分析法の感度をもたらすような方法及びキッ トは請求の範囲工ないし３４に記載されている。

以下において本発明を添付の図面並びに種々の例によって詳細に説明する。

第１図はこのＰＥＲ７分析法の構成を図式的に示す。

第２図はこのＰＥＲ７分析法の構成を別な図式図で示すが、ここではその増加さ れるべき核酸はポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されるｃＤＮＡの配列である 。

第３図はこのＰＥＲ７分析法の構成のもう１つの変形態様を図式図で示すが、こ こではその増加されるべき核酸はポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されるレポ ーターゾンデの１つの配列である。

第４図はこのＰＥＲ７分析法の構成の更に別なもう１つの変形態様を図式図で示 すが、ここではその増加されるべき核酸はりガーゼ連鎖反応によって増幅される ｃＤＮＡの１つの配列である。

第５図はこのＰＥＲ７分析法の構成の更に別な変形態様を図式図で示すが、ここ ではその増加されるべき核酸はりガーゼ連鎖反応によって増幅されるレポーター ゾンデの１つの配列である。

第６図はこのＰＥＲ７分析法の構成の更に別な変形態様を図式図で示すが、ここ ではその増加されるべき核酸はＰＣＨのエレメントもＬＣＲのエレメントも一体 化される方法によって増幅されるｃＤＮＡの１つの配列である。

第７図はこのＰＥＲ７分析法の構成のなお別な変形態様を図式図で示すが、ここ ではその増加されるべき核酸はＰＣＨのエレメントもＬＣＲのエレメントも一体 化される方法によって増幅されるレポーターゾンデの１つの配列である。

第８図はこのＰＥＲ７分析法の構成のい（つかの変形形態を図式図で示すが、こ こではそのｃＤＮＡは等温的な多重酵素的増幅法を用いて増幅されるようなその 増加されるべき核酸を含んでいる。

第９図はこのＰＥＲ７分析法の構成の３つの変形形態を図式図で示すが、ここで その増加されるべき核酸は等温的な多重酵素的増幅法を用いて増幅される、その ｃＤＮＡから導かれたＲＮＡである。

第１０図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸は等温的な多重酵素的増幅法によって増幅されるレポ ーターゾンデの１つの配列である。

第１１ないし１４図は、このＰＥＲ７分析法の構成の４つの変形形態を図式図で 示すが、これらにおいてその増加されるべき核酸は適当なＲＮＡ複製系によって 増幅されたそのｃＤＮＡの配列から少なくとも部分的に導かれた１次複製ＲＮＡ である。

第１５図は、このＰＥＲ７分析法の構成の更になお別な変形態様を図式図で示す が、ここでその増加されるべき核酸は複製ＲＮＡからなるレポーターゾンデであ る。

第１６図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸は適当なＲＮＡ複製系によって増幅される、あるＤＮ Ａレポーターゾンデより導かれた１次複製ＲＮＡである。

第１７図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸は成るレポーターゾンデの配列から導かれた１次複製 ＲＮＡであり、その際このレポーターゾンデは「スマートプローブ」によってそ のｃＤＮＡと結合される。

第１８ないし１９図は、このＰＥＲ７分析法の構成の更に別な２つの変形形態を 図式図で示すが、これらにおいてその増加されるべき核酸はそのｅＤＮＡの配列 から部分的に導かれた、適当なりＮＡ複製系によって増幅される１次複写ＤＮＡ である。

第２０図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸はそのｃＤＮＡの配列から導かれた１次複製ＤＮＡで あり、その際ＲＴプライマーとして、又はｏｒｉ配列の導入のために１重鎖オリ ゴヌクレオチドの代わりにいくつかのアダプターが用いられる。

第２１図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸は１次複製ＤＮＡであり、これは同時に、適当なりＮ Ａ複製系によって増幅されたレポーターゾンデである。

第２２図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸は適当なりＮＡ複製系によって増幅されたレポーター ゾンデから導かれた１次複製ＤＮＡである。

第２３図は、このＰＥＲ７分析法の構成の別な変形態様を図式図で示すが、ここ でその増加されるべき核酸はｄｓＤＮＡの合成とこのものの制限酵素による消化 とを含むサイクル的な方法によって増幅されるレポーターゾンデの１つの配列で ある。

第２４図は、第１の実施例を示し、ここでは逆転写酵素分析法（ＲＴ）の分析感 度をＭ　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素を用いて第２図に従い実施されたＰＥＲ７分析法 と比較したものである。

第２５図は、第２図に示した方法についてのもう１つの応用例、すなわちＨＩ■ に感染した５人の患者の血漿の中のＲＴ活性の直接の検出及びそれを含まない健 康な５人の献血者の血漿の中のそれを示す。

用いた種々の概念の定義 椋　、Ｉり　士　びそれ　の 「ヌクレオチド」の概念は、成る核酸の構成員として［重合された形で１現れる ような構造の、天然に現れるか、又は変性された塩基を有する全てのりボヌクレ オチドモノホスファート及びデオキシリボヌクレオチドモノホスファートを表わ す。

ｒｒＮＴＰＪ及びｒｄＮＴＰＪの概念はそれぞれ、任意の天然に現れる、又は変 性された塩基を含むリボヌクレオチドトリホスファ−ト及びデオキシリボヌクレ オチドトリホスファートを表わす。ｒｒＮＴＰｓＪ及びｒｄＮＴＰｓＪはそれぞ れ、少なくとも２つの異なったりボヌクレオチドトリホスファート又はデオキシ リボヌクレオチドトリホスファートよりなる、リボヌクレオチドトリホスファ− ト及びデオキシリボヌクレオチドトリホスファートの混合物を表わす。

「核酸」の概念は、いくつかのヌクレオチドよりなる、１重鎖の、部分的な、又 は完全に２重鎖のオリゴマー又はポリマーを表わす。その核酸がもつばらりボヌ クリオチドモノホスファートよりなっているときはこれはｒＲＮＡＪであり、も しこれがもっばらデオキシリボヌクレオチドモノホスファートよりなるときはこ れはｒＤＮＡＪである。しカルながら成る１つの核酸はいくつかのりボヌクレオ チドモノホスファートといくつかのデオキシリボヌクレオチドモノホスファート とを含むことができる。付加記号ｒｓｓＪ又はｒｄｓＪはそれぞれ１重鎖として 又は２重鎖としての核酸を表わす。

「オリゴヌクレオチド」の概念は、少なくとも２つ以上、但し１００を超えない 、天然の、又は変性されたヌクレオチド或いはそれらの混合物よりなる１重鎖の 核酸を表わす。オリゴヌクレオチドは天然の核酸であるか、又はそれから作るこ とができ、或いはまた化学的又は酵素的合成によって作ることができる。

「ポリヌクレオチド」の概念は１００以上の天然の、又は変性されたヌクレオチ ド或いはそれらの混合物からなる１重鎖の、又は２重鎖の核酸を表わす。

「ホモポリマー」の概念は、ヌクレオチドが全て同一の塩基を有しているような 核酸又は核酸の成る区画を表わす。この「ホモポリマー」の概念との関連におい て、その結合の機能においてしか成る相補性塩基と同じではなくてその化学的構 造においては異なっているような塩基類も同一と考える。

「ヘテロポリマー」の概念は、そのヌクレオチドが、結合の機能において成る相 補性塩基と異なっている少なくとも２の塩基を有する核酸又は核酸の成る区画を 表わす。

「上流側」及び「下流側」の概念は、成る１つの核酸連鎖内でのそれぞれの位置 及び方向を表わす。「上流側」は１本の核酸連鎖の、成る基準要素から見てその ５゛末端へ向かう位置又は方向を、「下流側」は３°末端へ向かうそれを表わす 。

「アダプター」の概念は、成るオリゴヌクレオチド及び第２の短いオリゴヌクレ オチドよりなる、部分的に２重鎖になっている核酸を表わす。それら両方のオリ ゴヌクレオチドの短い方は長い方のものに対して相補的であってその５°末端又 は３°末端においてハイブリッドされており、それによってその２重鎖片の核酸 が生ずる。長い方のオリゴヌクレオチドの残部は１重鎖であり、そしてそのもう 一方の末端においてハイブリッド化配列を有し［成る特定の核酸に対して相補的 な配列を有し］、これによってこのものは特定の核酸にハイブリッドされること ができる（「ハイブリッド化配列」の項参照）。

脛果類及Ｕ酵索括牲 「逆転写酵素Ｊ（ｒＲＴＪと略記する）の概念は、その機能において自然的にｄ ＮＴＰｓを利用してプライマー依存性反応において成るテンプレートＲＮＡに対 して相補性のＤＮＡを合成するような酵素を表わす。

「逆転写酵素活性Ｊ（ｒＲＴ活性」と略記する）の概念は、それによってプラィ マー依存性の反応においてｄＮＴＰｓの利用のもとにテンプレートＲＮＡに対し て相補性のＤＮＡが合成されるような任意の酵素の活性を表わす。

ｒＲＮＡポリメラーゼ」、すなわちｒＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とも表 わされるものの概念は、成る配列に特異的な態様において成る転写プロモータに 結合し、成るＲＮＡの転写をこの転写プロモータの下流の特定の位置から出発し て開始させ、そしてｒＮＴＰｓの利用のもとに成る１重鎖又は２重鎖のＤＮＡか らその転写されたＤＮＡ連鎖に対して相補的なＲＮＡを合成するような酵素を表 わす。

ｒＤＮＡポリメラーゼ」、すなわちｒＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とも表 わされるものの概念は、プライマー依存性反応において、ｄＮＴＰｓの利用のも とに成るＤＮＡ連鎖に対して相補的なりＮＡ連鎖を合成するような酵素を表わす 。

ｒＲＮＡＲＮＡポリメーゼ念は、ｒＮＴＰｓの利用のもとにこのＲＮＡＮブレカ ーゼと一致した複製ＲＮＡを複製することができ、その際その複製過程の生成物 としてその複製された複製ＲＮＡに対して相補的である複製ＲＮＡの新しい分子 が生ずるような、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性を有する酵素又は酵素 複合体を表わす。

ｒＤＮＡレプリカーゼ」の概念は、成る蛋白質により開始される過程においてそ のＤＮＡＮプレカーゼと一致した複製ＤＮＡの複製をｄＮＴＰｓの利用のもとに ＤＮＡ−。ｒｉのところで開始させ、そしてそのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー ゼの活性によってその複製ＤＮＡの複製をもたらし、その際そのＤＮＡＮプレカ ーゼはその複製過程の間にその複製されたＤＮＡ連鎖に対して既に存在している 相補的なりＮＡ連鎖をこのものから排除するような酵素又は酵素複合体を表わす 。

Ｕ　夕１　び　重の　自 「官能性配列」の概念は、成る核酸の１本の連鎖の上の次のような区画を表わし 、すなわちこれにこの方法の枠内で成る特定の機能が従属しており、その際この 機能はその官能性配列がそれによって導入されるような核酸によって、及び／又 はそれから導かれてそれに後続する、センス的に同一であるが、又は相補的な塩 基配列を有する１重鎖の核酸によって、又は成る２重鎖の核酸によって代表され る。成る１つの官能性配列の中に含まれる塩基配列はその機能によって厳密に定 義されているか、又は自由に選ぶことができる。

「ハイブリッド化配列」の概念は、もう一方の核酸とハイブリッドさせる目的で このもう一方の核酸のハイプツト化配列に対して相補的な塩基配列を有するよう な官能性配列を表わす。

「側面画定性配列」の概念は、任意の他の官能性配列の上流又は下流において成 る核酸の５°末端又は３゛末端を形成するような官能性配列を表わす。

「スペーサ配列」の概念は、２つの他の官能性配列を成る核酸の上で互いに分離 する機能を発揮するような官能性配列を表わす。

「転写プロモータ配列」の概念は、転写プロモータの機能と関連付けられている ような、成る特定の塩基配列を有する官能性配列を表わす、成る転写プロモータ のｒｐ（＋ｌ配列」は、その合成されたＲＮＡに対して相補的なりＮＡ鎖の上に 存在するような塩基配列を表わす。成る転写プロモータのｒＰｆ−１配列」とし ては、その合成されたＲＮＡと同じポラリティを有するＤＮＡ鎖の上に存在する ような塩基配列を表わす。

「転写プロモータ」の概念は、成る配列特異性のＲＮＡポリメラーゼの１それへ の１結合によってその特定の塩基配列の配向により定められる方向へＲＮＡの合 成を開始させるような、各相補的なＰ（−）−及びＰ（＋）−転写プロモータの 配列よりなる２重鎖ＤＮＡ区画を表わす。その転写されるべきＤＮＡが１重鎖で あるときはその転写プロモータは追加的にその転写されるべきＤＮＡの少なくと も最初の３つのヌクレオチドを２重鎖ＤＮＡの形で包含する。

「Ｎプレカーゼ結合ドメイン」の概念は、成る１重鎖ＲＮＡの中で２次構造の形 成によってそのＮプレカーゼ結合ドメインと一致したＲＮＡＮプレカーゼの結合 を媒介するような官能性配列を表わす。

ｒＲＮＡ−ｏｒｉ−配列」の概念は、成る核酸鎖の上に次のような特定の塩基配 列、すなわちこれが１重鎖のＲＮＡの３゛末端に存在する場合にそのＲＮＡ複製 の開始を、ＲＮＡ−ｏｒｉ−配列に対応する、そのＲＮＡに結合しているＲＮＡ Ｎプレカーゼによって可能にするような塩基配列、を有する官能性配列を表ゎ［ ５°−ＲＮＡ−ｏｒｉ配列」の概念は、その複製ＲＮＡの５°末端に存在するか 、又は存在することになるようなＲＮＡ−ｏｒｉ配列を表わす。

「３°−ＲＮＡ−ｏｒｉ配列」の概念は、その複製ＲＮＡの３°末端に存在する か、又は存在することになるようなＲＮＡ−ｏｒｉ配列を表わす。

ｒＲＮＡ−ｏｒ　ｉ　（＋ｌ配列」の概念は、成るＲＮＡの３゛末端に置かれ、 そしてＲＮＡ複製を可能とするようなポラリティにある塩基配列を表わす。

ｒＲＮＡ−ｏｒｉ　（−１配列」の概念は、ｒＲＮＡ−ｏｒｉ（＋１配列」に対 して相補的な塩基配列を表わす。

ｒＤＮＡ−ｏｒｉ配列」の概念は、成る核酸連鎖の上に、成るＤＮＡ複写系の中 でのＤＮＡ複写の開始と関連付けられている特定の塩基配列を有する官能性配列 を表わす。ＩＩ）ＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（＋ｌ配列」としては、そのＤＮＡの複製 に際して最初に相補化されるような塩基配列が示される。ｒＤＮＡ−ｏｒｉ　（ −１配列」はｒＤＮＡ−ｏｒｉ　ｆ＋１配列」に対して相補的な塩基配列を表わ す。

ｒＤＮＡ−ｏｒｉＪの概念は、成る２重鎖ＤＮＡの末端に置かれてそのｒＤＮＡ −ｏｒｉＪに対応する成る試験管内ＤＮＡ複製系の中で特定の共因子（蛋白質類 ）の結合によってその複製を試験管内複製系の中でＤＮＡＮプレカーゼにより開 始させるような、各相補的ＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（＋ｌ−及びＤＮＡ−ｏｒ　ｉ 　ｆ−１−配列よりなる２重鎖のＤＮＡ区画を表わす。ｒＤＮＡ−ｏｒｉＪはま た、成る複製ＤＮＡの単一連鎖の互いにハイブリッド化されるＤＮＡ−ｏｒｉ（ ＋１−配列とＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（＋ｌ−配列とによっても形成され得る。

特定の機能に有工杢核酸 「プライマー」の概念はそのもう一方の核酸に対して相補的な配列により、ハイ ブリッド化された状態においてその３°末端のところの遊離ＯＨ基を介して、成 るＲＴ活性又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる核酸連鎖の合成の出発点 となるような核酸を表わす。

ｒＲＴプライマー」の概念は、そのＲＴ活性のためにプライマーの作用を発揮す るようなプライマーを表わす。

「テンプレート核酸」の概念は、それに対して少なくともい（つかの部分に分け て逆転写酵素活性により相補的なりＮＡ鎖が合成されるような全ての１重鎖の核 酸を表わす。

［テンプレートＲＮＡＪの概念は、テンプレート核酸の、各ＲＮＡよりなり、そ してそれらに対して少なくともいくつかの部分に分けて１つのｃＤＮＡが合成さ れるような部分を表わす。

［テンプレートＤＮＡＪの概念は、テンプレート核酸のＤＮＡよりなる部分を表 わす。

「テンプレート／プライマー複合物」の概念は、　［ＲＴ又はＩＲＴの活性のた めの基質として用いられた、ＲＴプライマーも含めてそれにハイブリッドされて いる全ての核酸とのテンプレート核酸の組み合わせ物を表わす。

ｒｃＤＮＡＪの概念は、ＲＴ活性によって合成された、テンプレート核酸に対し て相補的なりＮＡ並びにそのＲＴプライマーの全ての構成員を包含するような核 酸を表わす。

ｒＣＤＮＡ／テンプレート２重体」の概念は、そのテンプレート核酸及びこれと ハイブリッドされているｃＤＮＡよりなるような、少なくとも部分的に２重鎖に なっている核酸を表わす。

ｒｃＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ重複体」の概念は、テンプレートＲＮＡ及びこれとハ イブリッドされているｃＤＮＡよりなるような、ｃＤＮＡ／テンプレート重複体 の区画を表わす。

［複製ＲＮＡＪの概念は、このＲＮＡと一致した試験管内ＲＮＡ複製系による複 製に必要な全ての官能性配列を含み、そしてこの系の中で複製されるような１重 鎖ＲＮＡを表わす。

「１次複製ＲＮＡＪの概念は、その増加されるべき核酸として第１段階において 生ずるような複製ＲＮＡを表わす。

［複製ＤＮＡＪの概念は、その複製ＤＮＡに対応する、試験管内ＤＮＡ複製系の 中で複製されるような、１重鎖の、又は少なくとも部分的に２重鎖になっている ＤＮＡを表わす。これはその複製されたＤＮＡ鎖の両端に１個のＤＮＡ−ｏｒｉ 配列が存在すること及びこれが成る１重鎖ＤＮＡの中でＤＮＡ−ｏｒｉを形成す るか、又はその部分的に２重鎖になったＤＮＡの少な（とも一方の末端に活性の ＤＮＡ−ｏｒｉが存在すると言うことによって特徴づけられる。

「１次複製ＤＮＡＪの概念は、その増加されるべき核酸として第１段階において 生ずるような複製ＤＮＡを表わす。

「レポーターゾンデ」の概念は、そのｃＤＮＡとは異なっているけれどもこれと 直接に、又は間接的に結合している、成るｃＤＮＡの、実行された合成の検出の ために用いられる核酸を表わす。このレポーターゾンデはその増加されるべき核 酸を含んでいるか、又はその増加されるべき核酸へ導くような成る反応又は成る １連の反応の遊離物である。

天の助 「レトロエレメント」の概念は、逆転写酵素活性により生じた、及び／又は逆転 写酵素によって複製されるような、遺伝子的な種々のエレメント及びその発現生 成物を表わす。

「キャリヤ」の概念は、例えばビーズ、成るマイクロタイタ板の窪の表面、濾過 膜等であることができるような固体の支持相を表わす。

第１図は、互いに結合されている３つの段階よりなるＰＥＲ７分析法を示す。

第１段階においてはその被検物の中に存在するＲＴ活性の関与のもとに増加され るべき核酸が準備調整される。その第２段階においてはこれが適当な核酸増幅方 法で増加され、そしてその第３段階においてその増加された核酸が適当な分析方 法により同定される。

策１戊臘においてはその被検物が処理されてＲＴ活性の検出に適した形にされる 。成るテンプレート核酸が少な（とも１つの適当なＲＴプライマーと一緒にその 処理された被検物の中におそらく含まれているであろうＲＴ活性のための基質と して、そのｃＤＮＡ合成に必要な、例えば種々のデオキシリボヌクレオシドトリ ホスファ−ト（ｄＮＴＰｓ）　、２価の陽イオン類（Ｍｇ”、Ｍｎ”′）、適当 な緩衝系及びその他の、そのｃＤＮＡの特異的合成を最適に促進する物質のよう な種々の反応剤と一緒に提供される。そのＲＴ活性の作用によって第１の反応生 成物としてその選ばねたテンプレート核酸に対して相補的なｃＤＮＡが合成され る。このｃＤＮＡは少なくとも部分的にｅＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ重複体であるよ うなＣＤＮＡ−テンプレート重複体の形であり、そのテンプレート核酸と結合し ており、そして未反応のテンプレート／プライマー複合物、結合しなかったプラ イマー分子及び開始されなかったテンプレート分子よりなる核酸混合物の中に存 在するその増加されるべき核酸の準備調整のためには多くの可能な方法が存在す る。

ＰＥＲ７分析法の特定のい（つかの変形方法においてその増加されるべき核酸は そのｃＤＮＡと同一であるか、又はこのものの一部である。他のｌ／Ｘりつ力） の場合に、その核酸混合物の中に存在するｃＤＮＡ、又はこのものの部分は場合 をこよっては更に別ないくつかの核酸の関与のもとにその増加されるべき核酸へ 導くような成る反応又は成る１遣の反応のｔ１１１物である。更に、そのｃＤＮ Ａのし）りつ力）の部分を用いて、レポーターゾンデであるか、又は成るレポー ターゾンデへの結合を作り出すような核酸の選択をもたらし、その際このレポー ターシンデカＳその増加されるべき核酸であるか、又はこれを含み、或いは、場 合により更養こｇｌｌなし１くつかの核酸の関与のもとにその増加されるべき核 酸へ導くような成る反応又番よ成るｌ連の反応の遊離物を構成するような可能性 も存在する。最後に、更ｉこその増加されるべき核酸の準備調整のためにそのｃ ＤＮＡ自身ではなくてｃＤＮＡ−テンプレート重複体を使用するという可能性も 存在する。この場合はそのｃＤＮＡ−テンプレート重複体はその増加されるべき 核酸であるか、又ｉよごれを含み、或いはこのちの又はその１部がその増加され るべき核酸へ導く成る反応又（よ成る１連の反応の遊離物を形成する。更にその 第１段階には、増加可能であるけれども増加されるべきでない予め入れられた核 酸類を除（のに用いる種々の手段も含まれる。

！ス玖朧において、第１段階の生成物すなわちその増加されるべき核酸カイこれ に合致した核酸増幅方法で高い含有量まで増加される。この生成物は、その用し 八た増幅方法に依存して成る特定のＤＮＡ及び／又は特定のＲＮＡよりなる。

このＰＥＲＴ法の第１ｍにおいて、その増幅された核酸を同定し、そして場合に より定量する。この同定は、成る特定の核酸配列を同定し、そして全ての場合に 、これを定量するのに適し、又はその合成を検出するのに適した任意の方法によ り行うことができる。多数のそのような分析方法が、熟練し、力）つ専青通した 全ての分子生物学者に周知である。最初の２つの段階の組み合わせによって第３ 段階において臨界値の限界的場合においても単一分子のｃＤＮＡを合成するのに まさに充分であるような極めて僅かな量のＲＴ活性の同定も可能となる。

以下に、このＰＥＲ７分析法の各段階の一般的な様相を更に詳細に記述する。

被検物及び試料の処理 その被検物の処理の仕方は、それが何からなっているかということ、及びレトロ エレメントに関連付けたいかなる種類のＲＴ活性がＰＥＲ７分析法で分析される べきか、又は分析されるべきでないかと言うことに左右される。それによってこ れは成る特定の程度までそのＰＥＲ７分析法の特異性及び感度を決定する。しか しながらこれは一般にこのＰＥＲ７分析法のどの変形方法を選ぶべきかというこ とを決定するものではない。

最も広い意味においてその被検物は少なくとも成る部分において生物学的物質よ りなり、その際これは人、動物又は植物の起源のものであることができ、そしＣ また真核単細胞生物や原核単細胞生物をも共に包含する。被検物の説明的な例示 として下記があげられる： ］記を含む人又は動物起源の体組織又は体器官：ａ）ｆｌ々の液態組織、例えば 血液及びその各種フラクション、例えば血清、血漿、特定の血球集団又は血球フ ラクション、血漿又は血清の種々のワラクシ３ン、例えば血液蛋白質、血液凝固 因子、過免疫血清、抗体濃厚化物、ホルモン等の血液製剤 ｂ）ｆｌ々の固体の組織及び器官、例えば移植片、生検物質や死体解剖物、粘膜 やその他の表面の塗抹標本、個々の細胞又は例えば種々の腸組織、胎盤等からの ホルモン槽水のような槽水類や抽出物、肉及び家畜の肉製品等Ｃ）生理学的又は 病理学的分野の種々の体液又は体排泄物、例えば髄液、尿、唾、胆汁、汗、乳、 他の腺分泌物、水痢内容物、羊水、滑液、房水、腹水又は他の体腔滲出液、リン パ液、便等、或いはこのような物質を成分として含む生成物 ｄ）試験管内で増殖された全てのｆＩ類の原核細胞及び真核細胞の培養物並びに それらから得られる生物学的製品、例えばワクチン、抗体、成長因子及び分化因 子、ホルモン類、組換え体蛋白質等ｅ）例えば食料品、水、及び他の飲料の試料 、環境的検査試料、衛生的検査試料、栽培植物（野菜、果物、木材、繊維植物等 ）の試料のような雑資料一般に、試料の準備調整には、その被検物の中に含まれ ているＲＴ活性を、そのＲ７反応を接触できるような形にしなければならないと 言うことが共通する。

被検物中のＲＴ活性が細胞、細胞小器官、又はウィルス粒子の中に閉じ込められ ている場合には、これらを適当な方法で開放してその酵素を抽出しなければなら ない。

例えばレトロウィルス性ＲＴの検出におけるできるだけ大きな特異性のためには 細胞のＤＮＡポリメラーゼ類による汚染を避けなければならない、この目的のた めに被検物を種々の手段によって前処理することができる。これらは一方におい て、生理学的手段、例えば原核性細胞や真核性細胞はペレット化されるけれども ウィルスや溶解している酵素類はペレット化されないような条件のもとての遠心 分離、或いは細胞は残留させるけれどもウィルス粒子や溶解した酵素は残留させ ないような限外濾過等を包含する。もう一つの例は、成る適当な２相系の一方の 相の中でウィルス粒子を濃縮することである。他方において、ＰＥＲＴ法の特異 性や感度を所望の方向へ向けるために免疫学的方法を用いることもできる。例え ば、適当な抗体を用いる免疫吸着又は免疫沈殿法によってその試料物質の中の成 る特定の種類の生のままのウィルス粒子、それらの部分、或いは遊離の酵素を濃 厚化させることができる。この目的のためには種々の免疫試薬に加えて、例えば 特定の糖蛋白質に対して親和性を有するレクチン並びに種々のレトロエレメント に対して親和性を有する種々の他の反応剤或いはそれらの構成成分又はその他の 反応剤を使用することができる。もう一つの例はＲＴに対して親和性を有するポ リＵである。他方においてこのような方法によれば、望ましくない種々の活性を その試料物質から除去することも可能である。

しばしば用いられる被検物は人又は動物の血液試料であり、そして中でもそれら からの液体成分、血漿、又は血清である。この場合には試料の処理に１つ又は多 くの下記の段階を含むことができる：ａ）細胞、細胞の破片及び他の望ましくな い粒状物を除去するための、例えば１５０００　Ｇでの超遠心分離 ｂ）望ましくない粒状物を更に除去するための適当な孔サイズのフィルタを用い る限外濾過 Ｃ）ウィルス粒子のペレット化のための超遠心分離、又はウィルス粒子を種々の 抗体又は他の適当な分子で覆われた固体相や他の適当な担体に吸着させること、 或いは免疫試薬や化学物質（例えばポリエチレングリコール等）による沈殿 ｄ）適当な界面活性剤を含む緩衝液を用いるＲＴ活性の抽出又はその他の、その 酵素に好都合な化学的又は物理的方法この方法において処理することのできる他 の被検物は全ての液体物質又は液体中に溶解させたり懸濁させたりすることがで きるような、例えば全ての種類の粉末（例λば凍結乾燥製品）等を含む。

用いられる核酸 Ｉ熊性配列 この方法において用いられる全ての核酸は種々の官能性配列より構成されている 。第２ないし２３図にこれらは種々の記号を付した棒の形で示しである。２つの 核酸のハイブリッド化領域はそれぞれ、両者の間に垂直の綿を入れることによっ て示しである。各官能性配列が一般に同じ長さであげであるということはこれら が同じ長さを有しなければならないことを意味するものではない。それらの棒の 、基準よりも大きな長さ又は小さな長さはその象徴的に表わした配列の長さに間 してなんらの意味をも持つものではなく、そのような違いは単に図の見やすさだ けのために採用したものである。特記しない限り各官能性配列は他の官能性配列 と異なった特定の塩基配列を有する。全ての官能性配列には特記しない限りもっ ばらただ１つだけの機能が従属している。可能なその例外はそれぞれ図の説明又 は「変形態様」の表題のもとで記述されている。更に、成る与えられた１つの機 能はこのＰＥＲ７分析法の以下に記述する変形態様の機能発現のためには必要で あることも必要でないこともある。用いた全ての換算は少なくとも１つのハイブ リッド化配列よりなっている。

宣能基 この方法において用いられる核酸はしばしばい（つかの官能基を有しており、こ れらは図において（Ｒ１）、　（Ｒ２）等で示されている。これらは好ましくは ５゜末端に存在するが、簡単のために添付図においてはそれぞれ５゛末端にのみ 極在させて示しである。これらの官能基は技術的可能性の枠内で、またそれらが このＰＥＲ７分析法の機能や進行を阻害しないという前提条件のもとに、任意の 追加的な性質を与える。（Ｒ１は、例えばビオチン分子のようなリガンドであり 、これはこの（Ｒ１を備えた核酸をアビジンで被覆されたキャリヤに結合させる ことができる。リガンドについての他の例は、キャリヤの上で不動化された対応 的な特定の抗体をそれに結合させることができるような種々の抗原的特性を有す る分子である。けれども（Ｒ１はまたそれ自身キャリヤであることもでき、この 場合には（Ｒ１を備えた核酸が共有結合的に成るキャリヤに結合されている６そ れぞれ１つよりも多くない（Ｒ１が１個のキャリヤであるのが好ましい。これと 異なって、種々の核酸はまた、いくつかの官能基を備えたｄＮＴＰｓやｒＮＴＰ ｓの合成に用いることによっても（Ｒ１でラベルすることができる。

テンプレート　プライマー　Ａ これはテンプレート核酸とこれにハイブリッドされている全ての核酸とからなる 。このＰＥＲ７分析法に用いられる全てのテンプレート／プライマー複合物はヘ テロポリマーのテンプレート核酸を含んでいる。このものの１つの区画、すなわ ち好ましくは成るＲＴプライマーに対するハイブリッド化配列の５゛末端に直接 隣接している区画はＲＮＡよりなり、そして「テンプレートＲＮＡＪと呼ばれる 。このテンプレートＲＮＡは成るＲＴ又はＲＴ活性の本来の基質であり、このテ ンプレートＲＮＡに対して相補性のＤＮＡ鎖の合成がその反応混合物の中でのＲ ＴまたはＲＴ活性の存在を明らかにする。ＰＥＲ７分析法のほとんどの変形態様 においてその全テンプレート核酸は天然の、組換え体の、又は合成的な起源のＲ ＮＡよりなる。しかしながらい（つかの変形態様のものにおいてはそのテンプレ ートＲＮＡの上流に置かれているテンプレート核酸の特定の官能性配列はＤＮＡ の形で存在している。このテンプレート核酸のＤＮＡ部分が「テンプレートＤＮ ＡＪを形成する。このテンプレート核酸とそれぞれ少なくとも１つのＲＴプライ マーが結合しており、その際少なくともその３°末端はそのテンプレート核酸に ハイブリッドされている。このＲＴプライマーに追加的にそのテンプレート核酸 の５′末端へ向かって置かれたハイブリッド化配列にもう一つの１重鎖の、又は 部分的に２重鎖になった核酸、好ましくは成るＤＮＡがハイブリッドされていて もよく、これはこの方法に必須の官能性配列の導入に利用される。ＲＴ反応が終 了した後で、このＤＮＡは成るＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４−ＤＮＡリガーゼ） によってそのＲＴ反応で合成されたｃＤＮＡと結合される。その最も下流にある ハイブリッド化配列、すなわちそのＲＴプライマーのための最も僅かしか必要で ないハイブリッド化配列の下流に存在するテンプレート核酸の部分はＲＮＡ及び ／又はＤＮＡからなっていることができる。

テンプレート／プライマー組み合わせの選択は、このＰＥＲ７分析法がその検出 すべきレトロエレメントの検出に対して可能な最も高い特異性及び感度を保証す るように行われる。いかなる条件のもとでも、もっばら第１段階において充分な 長さのテンプレートＲＮＡが逆転写されたときにのみ成る核酸増幅方法が開始さ れることが保証されなければならない。更に、その被検物の中に存在する核酸（ ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）によって第２段階において第１段階で合成されたＣＤ ＮＡと無関係な成る増幅過程が開始されることは排除しなければならない。従っ て特異性及び感度のためにはそのテンプレート核酸がその被検物の中に存在する いかなる核酸とも、たといそれが成る１つの種の正常な１つのゲノムの１部であ るか、又は感染性（伝染性）の病原体の成る核酸であるか、或いは被検物の中に それが存在することを排除できないような他の汚染核酸であったとしても、同一 でないか、又は部分的に同一でないことが必要である。レトロウィルス性ＲＴに ついてのこの試験の感度を最も大きくするために、好ましくはヘテロポリマーの テンプレートＲＮＡが用いられる。追加的に、中でもそのテンプレートＲＮＡの 長さ及び性質（２次構造）についてそのｃＤＮＡ合成の効率はＲＴ活性を有する 種々の型の酵素によって影響を受け、また従ってこのＰＥＲ７分析法の感度及び 特異性を制御することができる。

はとんどのテンプレート核酸はその最少必要な１つのハイブリッド化配列に加λ て少なくとももう一つのハイブリッド化配列を有する。これらはそのＲＴ反応の 開始のため及び／又は必須の官能性配列の導入のために必要な種々の核酸のアニ ーリングに用いられる。レポーターゾンデを使用する場合にはそのテンプレート 核酸は、そのハイブリッド化配列がもっばらレポーターゾンデの選択のために用 いられ、すなわちなんら追加的な機能を発揮しない場合には常に、前後に配置さ れて好ましくはそれぞれ成る短いスペーサ配列によって互いに隔てられた多数の ハイブリッド化配列を含むことができる。ｃＤＮＡの１分子にそれによって多数 のレポーターゾンデ分子がハイブリッドされることができ、これによって感度が 上昇する。１つ以上のハイブリッド化配列をレポーターゾンデに用いる場合には これらは異なったいくつかの塩基配列を有することができ、それによって種々異 なったレポーターゾンデの使用が可能になる。ＲＴプライマーについてもそのテ ンプレート核酸の上に１つ以上のハイブリッド化配列を設けることができる。

このＰＥＲ７分析法の変形の態様に従ってそのテンプレート核酸はそれらハイブ リッド化配列に加えて他のいくつかの官能性配列を含むことができ、或いはそれ らを包含させることが必要である。

上に述べたように、ＲＮＡ配列のみならずＤＮＡ配列も組み込まれているような テンプレート核酸を使用するのが有利である場合がある。このような可能性はそ の増加されるべき核酸が少なくとも部分的に２重鎖になっているＤＮＡを必要と する場合、又はその増加されるべき核酸の合成のため或いはその増幅方法の開始 のために少な（とも部分的に２重鎖になっているＤＮＡが必要である場合に魅力 あるものである。これは、第２段階において複製核酸の使用又は転写に基づく核 酸増幅方法が用いられ、そして１重鎖のＤＮＡ−ｏｒｉ又は転写プロモータを必 要とする場合がそれに該当する。このような方法のための種々のテンプレート核 酸の構成に際してはそのテンブレー１−ＤＮＡとＲＴプライマーのために定めら れたハイブリッド化配列との間に充分な長さでかつ対応的に形成されたテンブレ 性の作用によって開始され得ると言うことに注意しなければならない。このテン プレートＲＮＡの逆転写に引き続いてそのテンプレートＤＮＡが複製される。こ の場合にその被検物の中に存在するＲＴの弱いＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ の活性を、まった＜ＲＴ活性を持たない成るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを 加えることによって補充するのが有利な場合がある。

第２段階において複製核酸を用いる場合にはＤＮＡ／ＲＮＡよりなるテンプレー ト核酸はただ一つのハイブリッド化配列、すなわちＲＴプライマーのためのそれ しか必要としない。ＲＮＡとＤＮＡとを含むテンプレート核酸の例を図面の説明 の部分にあげる。

ＲＴプライマー この方法において用いられる全てのＲＴプライマーはＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれら 両者の混合よりなり、そして１重鎖の、又は部分的に２重鎖となっている核酸で ある。それらは少なくとも成る１つのハイブリッド化配列よりなり、この配列で テンプレート核酸にハイブリッドされる。成る特定の場合にはその３°末端に置 かれたハイブリッド化配列の上流にそのテンプレート核酸に対して相補的でない １つ又はいくつかの配列が連結されていてもよい。種々のレトロウィルスの複製 のサイクルにおいてＲＴプライマーとして用いられる天然のｔＲＮＡはそのよう な２つの部分よりなるＲＴプライマーの１例である。このＲＴプライマーがＤＮ Ａであるときは、それら非相補的な配列をそのテンプレート核酸の中にまだ存在 していない新しい官能性配列を導入するために利用することができる。このＲＴ プライマーの非相補的な５゛末端においてもう一つの核酸が部分的にハイブリッ ドされていてもよい。この場合にはそのＲＴプライマーはこの部分において２重 鎖になっている。それら非相補的なプライマー配列の長さや性質に関しては、こ れらがこのＰＥＲ７分析法の最適の進行を許容できない程に阻害しないと言う条 件を除いては自由である。更にこのＲＴプライマーは成る官能基（Ｒ１）を有し ていることができる。

一蛙店比配り官Ｊ！現用飢類 このＰＥＲ７分析法の多くの変形態様においてｃＤＮＡ合成が終わった後で第２ の、そのｃＤＮＡに対して少なくとも部分的に相補的な第２のＤＮＡ鎖を作り出 ４−ことが必要である。このためには少なくとももう一つの核酸、好ましくはＤ ＮＡオリゴヌウレオチドをそのｃＤＮＡにハイブリッドさせる必要がある。この ようなもう一つのＤＮＡは少なくとも１つのハイブリッド化配列よりなる。これ に更に、成る特定の場合にはそのｃＤＮＡに対して非相補的な更にもう一つの官 能性配列がｊｌｌｌわり、これはその第２のＤＮＡ鎖の中でそのハイブリッド化 配列に関１．て末端に貢か第１、そして成る側面画定性配列に相当する。これら の非相補性の配列がＤＮＡよりなる場合にはそれらはそのｃＤＮＡＯ中にまだ存 在してし１ない更に必要ないくつかの官能性配列又は他の望ましい官能性の導入 のため１こ利用することができる。これらの配列の長さと性質とに関しては、そ れらがこのＰＥＲ７分析法の最適の進行を許容できない襲様で阻害しないという 条件以外は自由である。これらの核酸類は更にもう一つの官能基（Ｒ１を備えて し）ること力Ｓできる。

ｋ菱−牡ニケグ朋 これらの核酸は成るｃＤＮＡの合成が行われたことの検出に用いられ、その際こ れは直接的又は間接的にそのｃＤＮＡとハイブリッド化によって結合される。

この結合は、そのレポーターゾンデの成るハイブリッド化配列がそのｃＤＮＡの 成るハイブリッド化配列とハイブリッドされるように行われること力Ｓできる。

この場合にそのレポーターゾンデはｃＤＮＡとのハイブリッド化がそれによって 起こるような配列を除いてそのテンプレート核酸と異なって１／入る。或しＡ番 よまた更に、レポーターゾンデを間接的にｃＤＮＡと結合させ、その際レポータ ーゾンデとｃＤＮＡとの間に少なくとももう一つの核酸が中間配置されてこれを それら両者とハイブリッド化によって結合させることも可能である。この場合に Ｌまレポーターゾンデの配列は好ましくはテンプレート核酸の配列と完全に異な って５ｓるのがよい。このレポーターゾンデはその増加されるべき核酸である力 ）、又ζよそれを含み、或いはこのもの、又はこのものの１部はその増加される べき核酸へ導くもう一つの反応又は一連の反応の遊離物である。

この方法の第１段階についての一般的な様相そのｊ　口されるべき　の備・整 特定の仕方で配置された各官能性配列の、テンプレート／プライマー複合物合物 を用いて導入されたセットより出発して第１段階においてＲＴ活性をこよってこ れらの官能性配列を同様に含むｃＤＮＡが作り出され、これがそのテンプレート 核酸と一緒にｃＤＮＡ／テンプレート２重体を形成する。これがその増加される べきｔ）ｉ［を及びその合成に必要な全ての官能性配列を必要な配置龜こおＩ７ Ｘてまだ有してし１ない場合にはそれらまだ欠けているものを別な核酸類又は反 応各こよって導入し、そして既に存在している官能性配列とともに一緒に接合し てその増加されるべき核酸にする必要がある。

宣仙ユ配烈の組左込立 その増加されるべき核酸の準備調製及び増幅に必要な配列の組み込みは、そのテ ンプレート核酸が既に全ての官能性配列を含んでいるように行うことができ、そ の際そのＲＴプライマーと反応条件とはそのｃＤＮＡも、又はｃＤＮＡ−テンプ レート重複体もこれらの官能性配列を含むように選ばれる。この場合はｃＤＮＡ 又はｃＤＮＡ−テンプレート重複体はその増加されるべき核酸であるか、又はそ れを含むことができる。また更に、その増加されるべき核酸の製造と増幅とに必 要な全ての官能性配列は含んでいないテンプレート核酸を用いることもでき、た だしこの場合にはそわら欠けているものを別のいくつかの核酸によって導入しな ければならない。これについてのいくつかの可能性が、そのＲＴプライマー、Ｒ Ｔ反応が行われた後でリガンド結合反応によりその合成されたｃＤＮＡど結合さ れるような、そのテンブレー　ト核酸のところに部分的にハイブリッドされた別 なりＮＡ分子、成るｄｓＤＮＡを合成するためのそのＤＮＡにハイブリッドされ るプライマー又は他の、少なくとも１つがそのｅＤＮＡの中で最も下流に置かれ たハイブリッド化配列にハイブリッドされるようないくつかの核酸によって提供 される。これら後者の核酸にはｃＤＮＡと成るレポーターゾンデとの間で特異的 な結合を作りだすようなレポーターゾンデ又は核酸が含まれる。

重工反応り条件 このＰＥＲ７分析法の感度に対してはその検出それるべきＲＴ活性に、ｐＨ１塩 濃度、イオン強度、その用いた２価陽イオン（叱、ｕｎ）の種類と濃度、用いた ｄ　Ｎ　Ｐ　Ｔ　ｓの濃度及び反応温度に関して最適の反応条件を与えることが 必要である。更に、テンプレート／プライマー複合物の機能的な完全性をそのＲ Ｔ反応の継続時間にわたって保証することが重要である。

二重ＮΔの則り二工之否或 これはその５゛末端においてＲＴプライマーよりなる。その３°末端はそのＲＴ 反応において合成された区画により形成される。そのテンプレート核酸がそのテ ンプレートＲＮＡ以外にテンプレートＤＮＡをも含んでいる場合には、そのＣＤ ＮＡはその５°末端においてＲＴプライマーよりなり、その中央部においてその テンブレー１−ＲＮＡに対して相補的な部分よりなり、そしてその３゛末端にお いて少なくともそのテンプレートＤＮＡの３゛末端に対して相補的であるような 成る部分からなる。これに対し、そのテンプレート核酸に部分的にハイブリッド して予め入れられた各核酸はｃＤＮＡの構成成分ではなく、これらは最初もう一 つの反応においてリガンド結合反応によりｃＤＮＡと結合される。

１之１且二上猪龍り脱離 このＰＥＲ７分析法の成る特定的な変形態様においてそのＲＴ反応が終了した後 でそのテンプレート核酸を引き続（各反応における反応関与物として脱離するこ とが有利であるか、又は必要である。これに用いることのできる技術手段は例え ば、その反応混合物の中に存在するＲＮＡを酵素反応的に、例えばＲＮアーゼに より処理するか、又は化学的に（塩基による加水分解）処理し、その際それらｃ ＤＮＡの分子は脱離されないようにして完全に分解することよりなる。このＲＮ Ａの分解によってそのテンプレート核酸の機能も破壊され、というのはこれが偏 性的にテンプレートＲＮＡを含んでいるからである。その上にこのＰＥＲＴ法の 全ての変形態様においてそのＲＴプライマーをその５°末端を介して、例えば成 る官能基（Ｒ１）により成るキャリヤに結合させるという可能性が存在する。こ のＲＴ活性により合成されたｃＤＮＡはそれによって同様にそのキャリヤに結合 される。一般にこれによってテンプレート核酸を変性と引き続く洗浄除去とによ り取り除き、それによりこれを以下の諸反応においてもはや阻害を及ぼさなくす る可能性が生ずる。洗浄が不完全な場合には、そのテンプレート核酸のＲＮＡの 部分も塩基による加水分解によって分解され、そして引き続いて取り除かれてし まう場合がある。中性の緩衝液で洗浄した後でそれ以降の反応にｌ・要な試薬を 適当な緩衝液の中で加える。

全ての習熟した分子生物学者には、ここで記述し、また以下において記述する原 理により、そして合理的な種々の組み合わせを採用することによって本発明に従 う基準を満足するＰＥＲ７分析法を実施するための多種多様な可能性が与えられ ることは自明である。いずれにしても本質的なことは、この方法において使用さ れる全ての核酸並びにそれらの官能性配列及び官能基、他の種々の試薬類及びそ の選ばれた反応条件をこの方法の予め与えられた特異性及び感度が保証されるよ うに互いに、及びその被検物に対して適合化させておくことである。

−Ｊ２Ｆ　においてＰＣＲを　いた　ＡのＰＥＲＴ　去の　み立て第２及び第３ 図は第２段階においてポリメラーゼ連鎖反応を利用することに基づ＜ＰＥＲ７分 析法の各変形態様を示す。この場合に好ましくはテンプレート核酸として純粋な ＲＮＡが用いられる。そのＲＴ活性の作用によって合成されたＣＤＮＡを有感的 に、すなわち成る増幅方法によって検出するための原理的に異なった２つの可能 性が存在する。まず一方においてそのｃＤＮＡ又は少なくともその１部の配列を 直接増幅することができる。この原理は第２図に図式的に示しである。他方にお いてこのｃＤＮＡの代わりにそのｃＤＮＡと特異多岐な、すなわちハイブリッド 化によって結合されるＤＮＡレポーターゾンデの成る部分配列を増幅することが できる（第３図）、それら両方の場合に僅かに３種類の官能性配列だけが用いら れ、すなわちハイブリッド化配列、スペーサ配列及び側面画定性配列である。

第２図は、その増加されるべき核酸がｃＤＮＡの１つの配列である変形態様を示 す。

東上玖朧 官能性配列（ｌａ）　、　（ｌｂｌ、（ｌｃｌ、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ） 及びｆｌｇｌを含むテンプレート核酸を用いる。これらのうち（ｌｂｌ　、　＋ ｌｄｌ　及びｆｌｆｌはハイブリッド化配列であって必要である。　［１ｃｌ　 及び（ｌｅｔは不必要なスペーサ配列であるが、（１Ｃ）　は存在しているのが 好ましい。側面画定性配列（１ａ）及び（１ｇ）は不必要である。これら３つの ハイブリッド化配列のうちｆｌｆｌがＲＴプライマーのアニーリングに用いられ る。（ｌｂ）　及び（１ｄ）は第２段階においてＲＴ反応の生成物の増幅のため のプライマー（増幅プライマー）のアニーリングに用いられる。この場合に（ｌ ｂｌの中に置かれた配列は第１増幅プライマーのアニーリングに、そして（１ｄ ）の中に置かれた配列は第２増幅プライマーのアニーリングに用いられる６ＲＴ プライマー（Ｒ１１ｆ２ａｌ　（２ｂ）は好ましくはオリゴヌクレオチドである 。その３°末端に取り付けられて必要な（２ｂ）はテンプレート核酸の（１ｆ） のところのアニーリングを媒介する。これに対してその５°末端に置かれた非相 補的な（２ａ）　は不必要であり、そしていずれにしても望ましい他の種々の機 能をそのＣＤＮＡの中に導入する役目をする。ＲＴ活性がその処理された被検物 の中に存在しない場合は、反応（３）　において必要なｄＮＴＰｓの利用のもと に成るｃＤＮＡ（２）が合成され、このものは最大でｆＲｌｌ　、　（２ａ）、 （２ｂ）、（２ｃ）、（２ｄ）、（２ｅ）、（２ｆ）及び（２ｇ）の各エレメン トを包含する。このＰＥＲ７分析法の機能発現のためには、そのＲＴ反応におい て少なくとも（２ｆ）を含めてそこまでの官能性配列を合成する必要がある。こ のｃＤＮＡはＰＣＲにより増加されるべき核酸を含む。

次に対応的ないくつかの手段によって、第２段階における増幅はもっばらそのＲ Ｔ反応において合成されたｃＤＮＡ　（２１から出発するものであって、そのＲ ＮＡよりなるテンプレート核酸（１）から出発するものではないことを確認しな ければならない。この後者は、例えば、第２段階において用いたＤＮＡ依存性Ｄ ＮＡポリメラーゼが成る特定のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をも有する か、或いはその用いた酵素の試料がそのような活性を有する成る酵素によって汚 染されているような場合に現れる。第２段階において用いたＤＮＡ増幅法がその 場合にただ１つのＲＮＡ分子も反応してｃＤＮＡとならないことが保証されるな らば、或いはまた実際上ＲＮＡ分子が反応してｃＤＮＡとなる場合にこのＰＥＲ ７分析法の感度がその選んだ条件のもとてこの非特異的な活性を検出するのに充 分でないことが確かめられるときは、このような技術手段は省略できる。しかし ながら一般に大過剰で存在するテンプレート核酸（１）は以降の諸反応において 増幅プライマーの飽和によってそれらＤＮＡ配列の効率的な増加を不可能にせず 、従って誤ったマイナスの結果に達するのを確認しなければならない。従って反 応（４）においては好ましくはその存在するテンプレート核酸（１１を既に述べ た技術手段の１つによって、以降の諸反応の反応物として除去するのがよい。１ 重鎖ｃＤＮＡ　第２１　は第１段階の生成物である。

第ス伐歯 そのｃＤＮＡｆ２１　のところで第１の増幅プライマー（Ｒ２１ｆ６ａｌ　ｆ６ ｂｌは次に反応（５）　において部分ハイブリッド化される。このものは好まし くはＤＮＡオリゴヌクレオチドであるのがよい。　（Ｒ２）は好ましくは（Ｒ１ ）と異なっているのがよい。このプライマーの３゛末端に置かれた必要な（６ｂ ）はｃＤＮＡの（２ｆ）におけるハイブリッド化に用いられる。その５°末端に 置かれた不必要（６ａ）はＣＤＮＡに対してまったく相補性を持たない。ＤＮＡ 依存性ＤＮＡポリメラーゼを添加することによって、ｄＮＴＰｓの関与のもとに 反応（７）　においてｄｓＤＮＡ　［２１／／１６１が合成される。

反応（４）　においてこのｄｓＤＮＡは変性され、その後で反応（５）　におい てその第１増幅プライマー（Ｒ２１（６ａｌ　（６ｂ）の改めてのアニーリング 及びその第２増幅プライマーｆＲ３１ｆ８ａｌ　ｆ８ｂｌの対応するＤＮＡ１重 鎮への最初のアニーリングが行われる。この第２増幅プライマーも同様に、好ま しくは第１増幅プライマーと全く相補性を有しないＤＮＡオリゴヌクレオチドで あるのがよい。　（Ｒ３）もまた（Ｒ１１と異なっているのが好ましい。このプ ライマーの３°末端に置かれた個性（８ｂ）は第２のＤＮＡ鎖の（６ｄ）へのハ イブリッド化に用いられる。その５′末端に置かれた非偏性（８ａ）　はそのｃ ＤＮＡに対して全く相同性を持たない。このＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに よってｄＮＴＰｓの関与のもとに反応（月　においてｄｓＤＮＡ　（２１／／（ ６１又は＋６＋　／／　（８１が合成される。これらは次の増幅サイクルに送り 込まれる。この増幅過程の主生成物として、一方の鎖の上のエレメント　ｆＲ２ １ｔ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　（６ｃｌ　（６ｄｌ　（８ａ’ｌともう一方の鎖の上の エレメント　（Ｒ３１（８ａｌｆ８ｂｌ　（８ｃｌ　（８ｄｌ　ｆ８ｅｌとから なるｄｓＤＮＡが生ずる。

員旦段朧 上記のｄｓＤＮＡは後にあげる第３段階についての一般的な注意書きに従う分析 法に用いることができる。これと異なり、官能基ｆＲ１をラベルとして用い、そ してそのようにしてこれらの標識の２つ、好ましくは（Ｒ２）及び（Ｒ３）を付 けたｄｓＤＮＡの分子の検出のための簡単な検出系が可能となる。このような検 出系は例えばＥＬＩＳＡ法に基づき、或いはまた簡単で経済的な粒子凝集法に基 づくことができる。

又形嬰球 テンプレート核酸及び種々のプライマーの中の、非偏性としてあげられる官能性 配列及び官能基は単一で、又は可能な種々の異なった組み合わせにおいて欠落す ることができる。それら増幅プライマーの中で（６ａ）及び（８ａ）が除去され る場合には、増幅生成物としてｆ６ｂｌ　（６ｃｌ　ｆｄｌ／／　（８ｂｌ　（ ８ｃｌ　ｆ８ｄｌ　の配列よりなる２重鎖ＤＮＡが生ずる。

ある。

（１ｄ）がテンプレート核酸（１）へのＲＴプライマー（Ｒ３１ｆ８ａｌ　ｆ８ ｂｌのアニーリ列並びに別個のＲＴプライマー（Ｒ１１ｆ２ａｌ　ｆ２ｂｌが欠 落する。

更に別な変形態様として、これらのハイブリッド化機能を、それらを発揮する各 配列（１ｄ）及び（１ｆ）が部分的に重複するように接合することができる。こ の場合にはスペーサ配列（１ｅ）及びこのものから導かれる種々の配列カ吹落す る。

異なった種々の配列をＲＴプライマー及び第２増幅プライマーのアニーリングの ために用いることは、他方においてそのＲＴプライマーの中のＲＮＡの利用を可 能にし、それによってこのＰＥＲ７分析法の感度及び特異性に影響を与えるこで きる。これはテンプレート核酸（１）の側面画定性配列（１ａ）及び（１ｇ）並 びにスペーサ配列（ｃｌ　及び（ｅｌ　に当てはまり、これらはポモポリマーで あることができ、及び／又は互いに同一であることができる。

最後に、１つのテンプレート核酸にＲＴプライマーのための多数のハイブリッド 化配列を設ける可能性が存在する。

第３図はレポーターゾンデを用いる場合を示す。

皐↓段当 ｅＤＮＡの代わりにレポーターゾンデを増幅のために用いる場合には、そのテン プレート核酸は第２図に挙げられている全ての官能性配列を含んでいる必要はな い。この場合には、官能性配列（ｌａｌ　ｆｌｂｌ　（ｌｃｌ　ｆｌｄｌ　（ｌ ｅｌを含むテンプレート核酸が用いられる。（１ｄ）はＲＴプライマーの結合に 用いられて必要である。ｆｌｃｌはスペーサ機能を持ち、そして不必要である。

ハイブリッド化配列＋ｌｂ）は必要であり、このものから導かれたｃＤＮＡの配 列（２ｄ）はそのレポーターゾンデの結合に用いられる。ｆｌａｔ　及び（１ｅ ）は不必要な側面画定性配列である。

そのテンプレート核酸はそのハイブリッド化配列を介してＲＴプライマー（Ｒ１ １（２ａｌ　ｆ２ｂ）　と結合している。これには第２図の第１段階においてＲ Ｔプライマーについて挙げた記述が当てはまる。その前処理された被検物中にＲ Ｔ活性が存在する場合には反応（３）　においてその必要なｄＮＴＰｓの組み込 みのもとにｃＤＮＡ［２１が合成され、これは最大限、要素（Ｒ１１ｆ２ａｌ　 ｆ２ｂｌ　ｆ２ｃｌ　ｆ２ｄｌ　（２ｅｌを含んでいる。このＰＥＲＴ分析法の 機能を発揮するためには、最小限、要素ｆＲ１）　ｆ２ａｌ　ｆ２ｂ）　ｆ２ｅ ｌ　（２ｄｌ　が存在している必要がある。このｃＤＮＡ　（２）　は成るペグ ロ２重体の形でそのテンブレー１−核酸（１）　と結合しており、そして（Ｒ１ ）を介して成るキャリアに結合することができるか、あるいは（Ｒ１）がキャリ アであるときは既にキャリアと結合した状態になっている。

ここでも再び、そのテンブレ＝１−核酸（１１はレポーターゾンデ　（６）に対 する特異的な競合物として現われることなく、そしてそれにより誤ったマイナス の結果に導くことがないことを確実にしなければならない。従って反応（４）　 においては１記り、た方法の１つによってその存在するテンプレート核酸、すな わちＲＮＡ　（１＋　がそのアニーリング反応（５ａ）　における本来の反応物 として脱離される。そのようにして次に反応（５ａ）においてそのｃＤＮＡ　（ ２１に、その増加さハるべき核酸であるかまたはそれを含み、そして官能性配列 ［６ａｌ　（６ｂｌ　ｆ６ｃｌ　ｆ６ｄｌ（６ｅ）　（６ｅｌ　（６ｆ）　（６ ｇｌよりなるＤＮＡ−レポーターゾンデ（６）　がハイブリッドされる。これら のうち（６ｆ）は必要であってそのＲＴ反応（３）　において合成されるそのｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１の（２ｄ）と特異的にハイブリッドされる配列である。レ ポーターゾンデ（６）の他の全ての官能性配列はｃＤＮＡ　（２１とはハイブリ ッドせず、そしてそのものの官能性配列と何等の配列同一性を持たない。（６ｂ ）及び（６ｄ）　は増幅プライマーのための必要なハイブリッド化配列である。

（６ｄ）　は第１増幅プライマーのアニーリングに用いられ、その（６ｂ）に対 し相補性の配列は第２の増幅プライマーのアニーリングに用いられる。　（６ｃ ｌ　及び（６ｅ）は不必要なスペーサ配列である。しかしながら（６ｃ）は存在 しているのが好ましい。（６ａ）と　（６ｇ）とは非偏性の側面画定性配列であ る。このレポーターゾンデ（６）はその５゛末端において、又は別の位置におい て同様に一個の官能基（Ｒ２）を有している。このものは（Ｒ１）と異なってい なければならない。

遅（ともそのレポーターゾンデ（６）のｃＤＮＡ　［２１へのハイブリッド化（ ５ａ）の後でこのｃＤＮＡはその官能基（Ｒ１１により成るキャリヤに結合され 、そして結合されなかったレポーターゾンデは変性化しない条件のもとにその反 応混合物から完全に除去される。激しく洗浄することができるように、そのキャ リヤに結合されたｅＤＮＡ　［２１とレポーターゾンデ（６）　との間に強い結 合が必要である。これら両方の核酸（２ｄ）及び（６ｆ）のハイブリッド化領域 は従って充分な長さと適当な性質とを有している必要があり、そしてレポーター ゾンデ（６）のアニーリングは最適の反応条件のもとで行なわなければならない 。また、ｃＤＮＡ　（２１のキャリアへの結合が維持されたままに留まることに も注意しなければならない。

１１胆阻 未結合のレポーターゾンデ（６）を完全に洗浄除去したあとで適当な緩衝液の中 でのもう一つの反応（５ｂ）において第１増幅プライマー（Ｒ３）　［８ａ）　 （８ｂｌを加える。このものは好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドであり。（ Ｒ３）は好ましくはｆＲｌｌ　と異なっているのが良い。その３゛末端に存在す る（８ｂ）はレポーターゾンデの（６ｄ）におけるアニーリングに用いられる。

その５°末端に存在する（８ａ）は非個性的であり、そのレポーターゾンデに対 して何等の相補性を持たず、モしてｃＤＮＡ　（２１に対して同一性も相補性も 有しない。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを添加することにより反応（７）に おいてｄＮＴＰｓの関与のもとにｄｓＤＮＡ　［６１／／（８１が合成される。

反応（４）においてこのｄｓＤＮＡが変性され、その上で改めての反応（５）に おいて今度はその第１の増幅プライマーのアニーリングも、その第２増幅プライ マーのアニーリングも対応するＤＮＡ１重鎮へ行なオっれる。第２増幅プライマ ー（Ｒ４）　（９ａｌ　（９ｂｌは好ましくはＣＤＮＡとなんらの同一性も相補 性も持たないＤＮＡオリゴヌクレオチドであるのが良い。好ましくは（Ｒ４）は （Ｒ１）と異なっているのが良い。その５°末端に存在する非相補性の（９ａ） は非偏性であるやその３゛末端に存在する個性の（９ｂ）は（８ｄ）　とのアニ ーリングを媒介する。そのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって、反応（７ ）　においてｄＮＴＰｓの関与のもとにｄｓＤＮＡ　（６１／／（８１または＋ ８１　／／　＋９１が合成される。これらは次の増幅サイクルに送られる。増幅 の主生成物としてｄ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ３１（８ａｌ　（８ｈｌ　ｆ８ｃｌ 　ｆ８ｄｌ　ｆ９ａ’ｌ／／　ｆＲ４１（９ａｌ　（９ｂｌ　ｆ９モ戟@（９ｄ ｌ　ｆ９ｅｌ が生ずる。

可且現陽 これは第２図の第３段階と同様である。

叉彫嬰梯 テンプレート核酸（１）の中で種々のレポーターゾンデのために多数のハイブリ ッド化配列（ｌｂ）を、好ましくはそれぞれ一個の短いスペーサ配列で互いを隔 てて入れることができる。これらのハイブリッド化配列は同一である必要はなく 、従って種々異なったレポーターゾンデを用いることができる。また、そのテン プレート核酸にＲＴプライマー用の多数のハイブリッド化配列を設けるという可 能性も存在する。

テンブレー１〜核酸、各プライマー及びレポーターゾンデの中の、非個性的とし て挙げた種々の官能性配列及び官能基は単独でも、又は種々の可能な組み合わせ としても脱落することができる。それらの増幅プライマーの中で（８ａ）及び（ ９ａ）が欠落している場合には、増幅生成物として官能性配列（８ｂｌ　（８ｃ ）　（８ｄｌ／／　（９ｂｌ　（９ｃｌ　ｆ９ｄｌ　を含む２重鎮ＤＮＡが生ず る。この場合にそのＲＴ反応条件を、その新しく合成されたｃＤＮＡの中にいく つかのリガンドで標識されたデオキシリボヌクレオチドモノホスファートが組み 込まれるような反応条件が選ばれたときにはＲＴプライマーの構成成分としての （Ｒ１１は欠落していてもよい。この場合にはこれらの官能基は（Ｒ１）の枠内 でそのｃＤＮＡを成るキャリアに結合させることができる。

レポーターゾンデ（６）　において（６ａ）及び（６ｇ）　は任意の機能を有す ることができる。これはレポーターゾンデとして天然起源の直鎖上または環状の 核酸の使用を可能にする。

さらにまた、そのレポーターゾンデ（６）の増幅されるべき領域をそのｃＤＮＡ に結合する領域（６ｆ）の上流側ではなくて下流側に配置し、それによりこれが （６ｇ１　の範囲内に存在するようにする可能性が存在する。（６ｆ）　もその 増幅されるべき領域を含むか、またはこれと重なりあうことができる。この後者 はいずれにしても好ましい形態ではない。

この基準から離れて、成る特定の状況においては成る一つの官能性配列が一つ以 上の機能を有することもできる。例えば（６ｄ）及び（６ｆ）の各ハイブリッド 化機能を合体することができる。この場合には（６ｄ）がまず第１にそのｃＤＮ Ａへのそのレポーターゾンデのアニーリングを媒介し［これはもちろん（１ｂ） において対応的に修飾されたテンプレート核酸をも条件付ける］、そしてこの場 合には未結合のレポーターゾンデ（６）の洗浄除去及びこの場合に必要となる成 る変性段階の後でプライマーｆＲ１ｆ８ａ）　ｆ８ｂｌ　をも結合する。これに よってこのレポーターゾンデの（６ｅ）及び（６ｆ）並びにこれらから導かれる 種々の官能性配列が欠落する。もう１つの可能性としてそれら（６ｄ）及び（６ ｆ）の各ハイブリッド化機能を、それらを発揮する各配列が部分的に重なりあう ように設けることができる。

最後に、このいずれにしても僅かであるが部分的に重なり合うという可能性はそ のレポーターゾンデがそれによって（２ｂ）にハイブリッド化しない限り、テン プレート核酸ｉｌｌ　の（ｌｂｌ及びｆｌｄｌにも存在する。

この基準と機能的に異なって、種々の官能性配列に対して同一の塩基配列を用い ることができ、そしてこれらはホモポリマーであることもできる。これはテンプ レート核酸の側面画定性配列１１ａｌ及び（ｌｅｌ並びにスペーサ配列（ｌｃｌ に当てはまり、これらはホモポリマーであることができ、及び／または互いに同 一であることができる。またレポーターゾンデ（６）の側面画定性配列（６ａ） 及び（６ｇ）、並びにスペーサ配列（６Ｃ）及び（６ｅ）もホモポリマーである ことができ、及び／または互いに同一であることができる。

第２段階のりガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づく増幅方法を用いる場合のＰＥＲ Ｔ法の組み立て特許出願ｐｓ−胃０８９／１２６９６及びＷＯ８９１０９８３５ によれば、ＬＣＲは種々の核酸配列の増幅のためのもうひとつの方法である。こ れをこのＰＥＲ７分析法の枠内で使用することが第４及び第５図に示されている 。この場合に好ましくはテンプレート核酸として純粋なＲＮＡが用いられる。そ の第２段階において増幅されるべきテンプレート核酸の配列はいかなる場合にも ＤＮＡよりなるべきではない。

その用いられる官能性配列はハイブリッド化配列、スペーサ配列及び側面画定性 配列である。

第４図はｃＤＮＡの成る部分配列自身を増幅する場合の原理的な方法の進行の態 様を示す。

第１段層 官能性配列（１ａ）ないしｆｌｆｌを含むテンプレート核酸（１１を用いる。こ れらのうち（１ｂ）、（１ｃ）及び（ｔｅｌはハイブリッド化配列であってこの ＰＥＲ７分析法の機能発揮に必要である。（ｌｄｌ　は不必要なスペーサ配列で あり、そして（Ｉａｌ　及び（１ｆ）は不必要な側面画定性配列である。これら 三つのハイブリッド化配列のうち（ｌｅ）はＲＴプライマーのアニーリングに用 いられる。互いに直接隣り合っている（ｌｂｌ及び（ＩＣ）並びにこれに対して 相補性の各配列は両方のＤＮＡオリゴヌクレオチド対のアニーリングに用いられ 、これらによってＲＴ反応の生成物のある部分配列のＬＣＲ増幅が行なわれる。

ＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌ（２ｂ）　はその３°末端に必要なハイブリッ ド化配列（２ｂ）を有している。その５゛末端に置かれた（２ａ）は非偏性であ り、そしてテンプレート核酸に対して全（相補性を持たない。ｆＲｌｌ　は同様 に非偏性である。このＲＴプライマーがＤＮＡの一つであるときは、　（２ａ） はそのｃＤＮＡの中に追加的な望ましい種々の機能を組み込むことを可能にする 。その処理される被検物の中にＲＴ活性が存在する場合には、反応（３）　にお いてｄＮＴＰｓの使用のもとにｃＤＮＡ　ｆ２１　が合成され、これは最大限、 要素（川（２ａｌ　（２ｂｌ　（２ｃｌ　（２ｄｌ　（２ｅｌ　（２ｆ）を含む 。このＰＥＲ７分析法の機能発現のためにはそのＲＴ反応において少なくとも（ ２ｅ）を含めてそこまでの官能性配列を合成する必要がある。このｃＤＮＡはＬ ＣＲによって増加されるべき核酸を含んでいる。

このＰＥＲ７分析法の最適の進行のためにはまずテンプレート核酸（１１のテン プレートＲＮＡを反応（４）　において分解し、そして後続の各反応において反 応物として脱離させる。これはそれによってその第２のオリゴヌクレオチド対が そのテンプレート核酸にアニーリングするのを防止できるので望ましい。このよ うなアニーリングは選んだ反応条件及び反応試薬に従ってこのＰＥＲ７分析法の 誤ったプラスの、または誤ったマイナスの結果に導くことがあり、この場合には その誤ったプラスの結果は、それぞれｆＲ４１ｆ９ａ）　（９ｂｌ　及び（９ｃ ）　ｆ９ｄ）　ｆＲ５１よりなる（下記参照）そのテンプレート核酸に結合され る第２のオリゴヌクレオチド対がバクテリオファージＴ４からのそれのような成 るリガーゼによってコヒーレントな１本のＤＮＡ連鎖に連結される場合に生ずる 。誤ったマイナスの結果は、そのテンプレート核酸ｆｌｌ　に結合されている第 ２のオリゴヌクレオチド対が用いたりガーゼによっては連結しであるコヒーレン トなりＮＡ鎖にはならないけれども、これが大量に存在しているテンプレート核 酸への結合によって反応から除かれるような場合に現われる。

員Ｚ段階 反応（５）　において２個のＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｒ２１（６ａｌ　（６ ｂｌ及び（６ｃｌ　ｆ６ｄｌ　ｆＲ３１がそのｃＤＮＡに付加される。これら２ つのオリゴヌクレオチドはそれらのハイブリッド化配列（６ｂ）または（６Ｃ） の中でそのｃＤＮＡの（２ｅ）または（２ｄ）に対して完全に相補的であり、そ してこれらへのアニーリングの後でＮ１ｃｋによって簡単に互いに分離される。

　（６ａｌ　及び（６ｄ）は非偏性であり、そのｃＤＮＡに対して全く同一性ま たは相補性を持たず、そしていずれにしても望ましい追加的ないくつかのＤＮＡ 配列をその増幅生成物の中に導入するのに用いられる。オリゴヌクレオチドｆ６ Ｃ１＋６ｄｌ　ｆＲ３１はその５°末端においてホスホリル化されている。同様 に非偏性の各官能基の極在性については（Ｒ２）が好ましくはｆ６ａｌ　ｆ６ｂ ｌ　の５°末端に対して出来るだけ遠くへ、そしてｆ６ｃ）　（６ｄ）の３“末 端に対して出来るだけ遠く存在するのが良いということが当てはまる。反応（１ １）においては成るＤＮＡリガーゼ（例えばバクテリオファージＴ４のそれ一熱 安定性酵素が有利に用いられる）が両オリゴヌクレオチドの連結に用いられ、こ れによってＤｒｕｖ１４　（６１が作り出される０反応（８）において変性が行 なわれ、その後で鎖（２）は再び両方のオリゴヌクレオチドｆＲ２１ｆ６ａｌ　 （６ｂｊ及び（６ｃｌ　ｆ６ｄｌ　（Ｒ３１のアニーリングに用いられる。鎖（ ６）はさらに次の増幅に用いられる。

まず反応（５）　において第１の対と同様に構成されたもう一つのＤＮＡオリゴ ヌクレオチド対のアニーリングが行なわれる。これはオリゴヌクレオチド（Ｒ４ ）（９ａｌ　（９ｂｌ　及び（９ｃｌ　（９ｄｌ　ｆＲ５１を含み、これらのハ イブリッド化配列（９ｂ）または（９ｃ）は（６ｃ）または（６ｄ）に対して完 全に相補的であり、そしてこれへのアニーリングの後で直接互いに隣り合って、 すなわち最適の場合には一方の３°末端ともう一方の５′末端との間のニックが その鎖（６）の中に存在していたニックに対して１個のヌクレオチド分だけ位置 がずれているように互いに直接隣り合って位置するに至る。（９ｃｌ　ｆ９ｄｌ 　ｆＲ５１の５゛末端はさらに１個の燐酸基を有していなければならない。その 非偏性の官能基の位置については（Ｒ４）が（９ａｌ　１９ｂｌの５°末端へ向 かい出来るだけ遠くへ、そして（Ｒ５）がｆ９ｃｌ　（９ｄｌの３°末端へ向か い出来るだけ遠（に存在するのが好ましいということが当てはまる。ここでも（ ９ａ）　と　（９ｄ）とは非偏性である。（９ａ）は（６ｄ）に対して相補性で あるか、または相補性ではない。同様に（９ｄ）は（６ａ）に対して相補性であ るかまたは相補性でない。非相補的な配列（９ａ）または（９ｄ）はさらに他の 官能性配列をその増幅物の中に導入するのに用いられる。これに対して相補性の 配列（９ａ）または（９ｄ）　はハイブリッド化配列の延長をもたらす。ＤＮＡ リガーゼ（１１）の改めての作用によりそれら両方のオリゴヌクレオチドｆＲ４ １（９ａｌ　ｆ９ｂｌ　と　（９ｃｌ　（９ｄｌ　（Ｒ５１とは連結されて鎖（ ９）　となり、これは鎖（６）　と平行に２重体を形成する。改めての変性（８ ）の後で再びそれらの対応する相補性のオリゴヌクレオチド対のそれら分離され た鎖（６）及び（９）へのアニーリング（５）が行なわれる。このサイクル的な 増幅の結果として大量の２重鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマー　（６１／／ （９１が生ずる。

員旦段隋 上記の生成物は後続の第３段階についての一般的注意書きに従う分析にかけるこ とができる。これと異なって、（Ｒ１による標識が導入されている場合には、官 能基（Ｒ１の特定的な新しく形成された種々の組み合わせを有しているＤＮＡ分 子を検出するための簡単ないくつかの検出系を用いることができる。これらの組 み合わせは、　（Ｒ２）と（Ｒ３）、（Ｒ２）　と（Ｒ４）、（Ｒ５）　と（Ｒ ４）及び（Ｒ５）と（Ｒ３）である。このような検出系は例えばＥＬＩＳＡに基 づくことができるがまた粒子凝集法に基づくこともできる。それらオリゴヌクレ オチドによって導入された非相補的な官能性配列（６ａ）、（６ｄｌ　、　（９ ａｌ及び（９ｄ）は、それらのＤＮＡがこの領域において一重鎖であるのでハイ ブリッド化を用いる検出に際して使用することができる。

支形聾楊 その使用した核酸の、非偏性として挙げられた諸官能性配列及び官能基は単独で も、或いは種々の可能な組み合わせの形ででも欠落することができる。これら（ ６ａ）、（６ｄｌ　、　（９ａｌ　及び（９ｄ）が組み合わせて欠落している場 合にはその増幅生成物（６１／／　（９１はｄｓＤＮＡの分子であり、これは断 片（６ｂｌ　（６ｃｌ　／／　（９ｂｌ　（９ｃｌ　より成っている。側面画定 性配列（９ａ）または（９ｄ）は、これらが（６ｄ）または（６ａ）に対して相 補性であるように形成することができる。

テンプレート核酸（１）の場合にはそれら側面画定性配列（ｌａｌ及びｆｌｆｌ は任意の機能を有することができ、従って天然由来のＲＮＡ分子をテンプレート 核酸（１）　として使用することができる。

このテンプレート核酸ｆｉｌ　はそのＲＴプライマーのために１個よりも多ｌ／ ）ハイブリッド化配列を含むことができる。

この基準と異なって、成る特定の状況においては一つの官能性配列が一つ以上の 機能に用いられる場合がある。例えば（ＩＣ）及び（１ｅ）の各ハイブリッド化 配列を一緒にすることができる。この場合には（ｌｃｌが今やＲＴプライマーと しても用いられるｆＲ４１ｆ９ａｌ　（９ｂ）のテンプレート核酸（１）へのア ニーリングを媒介する。第２段階においてｆＲ４１ｆ９ａｌ　ｆ９ｂｌは公知の ようにその用いた増幅オリゴヌクレオチドの一つである。これによってテンプレ ート核酸ｆｌ）　の官能基（１ｄ）及び（１ｅ）並びにこれらから導かれる全て の官能性配列が脱落する。またもう一つの別個のＲＴプライマーｆＲ１１（２ａ ｌ　ｆ２ｂｌ　も除かれる。

別な変形態様として、このハイブリッド化機能を次のように、すなわちこれを発 揮する各配列ｆｌｃ）及び（１ｅ）が部分的に重なりあうように導入することが できる。この場合ｌこはスペーサ配列（１ｄ）及びこのものから導かれる種々の 配列が脱落する。

異なったいくつかの配列をＲＴプライマーのアニーリング及び増幅オリゴヌクレ オチド　１Ｒ４１ｆ９ａｌ　（９ｂｌのアニーリングのために用いることは他方 において成るＲＮＡプライマーの使用を可能にし、これによってこのＰＥＲＴ分 析法の感度及び／または特異性に影響を与えることができる。

この基準から離れて、異なった種々の官能性配列に対して同一の各塩基配列を用 いるという可能性が存在し、これはまたホモポリマーであることもできる。こハ はテンプレート核酸（１）の側面画定性配列（１ａ）及び（１ｆ）並びにスペー サ配列ｆｌｄｌについて当てはまり、これらはホモポリマーであることができ、 及び／／又は互いに同一であることができる。

余り好ましくはないけれども可能な可能性の１つは、そのテンプレート核酸ｔｌ ）のハイブリッド化配列ｆｌｂｌ及び（ＩＣ）に対して同一で、そしてスペーサ 要ｇ　（ｌｄｌの、ＲＴプライマーのためのハイブリッド化配列ｔｅｌの、及び 側面画定性配列ｆｌａｌ及び＋ｌｆｌの各配列と異なった配列を使用することで ある。この場合にその各増幅オリゴヌクレオチドはただ１個のハイブリッド化配 列よりなり、そしてその５°末端においてホスホリル化されている必要がある。

第５図はｃＤＮＡの代わりに１ノボ−ターゾンデの少な（とも１つの部分配列を 増幅させる場合のこの方法の進行様相を示す。

皐上戊搦 う゛ンブレー１へ／プライマー複合物、Ｒ７反応（３）及びその生成物は全ての 様相において第３図に示したものと同一である。反応（３）から出てくる種々の 核酸混合物は反応（４）　において、そのテンプレート核酸ｆ１）　がそれ以降 の各反応においてそのレポーターゾンデ（６）に対する特異的競合物として現れ ずそしてそれによって誤ったマイナスの結果に導くことがないことを確実にする ように修飾される。従って反応（４）　においては上述したい（つかの方法の１ つによってその存在するテンプレート核酸がそのアニーリング反応における本来 の反応物として除かれる。

つぎに反応（５ａ）においてｃＤＮＡ　（２１にその増加されるべき核酸である か又はそれを含み、そして（６ａ）　（Ｓｂ）　ｆ６ｃ）　＜６ｄ）　ｆｅｅ） 　ｆ６ｆ）よりなるＤＮＡ−レポーターゾンデ（６）が部分ハイブリッド化され る。これらのうち（６ｅ）はそのＲ７反応（３）　においてｃＤＮＡの合成され た（２ｄ）と特異的にハイブリッド化される配列である。このレポーターゾンデ の他の全ての官能性配列はこのｃＤＮＡとはハイブリッドしない。　（６ｂ）及 び（６ｃ）は互いに直接隣接し、そして増幅オリゴヌクレオチドのための必要な ハイブリッド化配列である。それらは有利には互いに同一性も相補性も持たず、 そしてそのｃＤＮＡに対して同一性も相補性も持つべきではない、　（６ｄｌ　 不必要なスペーサ配列である。　（６ａ）及び（６ｆ）は不必要な側面画定性配 列である。最も遅（ともそのレポーターゾンデ（６）のｃＤＮＡ（２）へのハイ ブリッド化（５ａ）の後そのｃＤＮＡは官能基（Ｒ１１により成るキャリヤに結 合され、そして結合しなかったレポーターゾンデは、第３図に示すように、変性 しない条件のもとて完全にその反応混合物から除かれる。

！λ股朧 その後で成る適当な緩衝液の中での更にもう１つのアニーリング反応（５ｂ）に おいて増幅オリゴヌクレオチドの第１の対（Ｒ２１ｆ９ａｌ　ｆ９ｂ）及びｆ９ ｃｌ　ｆ９ｄｌ　［Ｒ３１が加えられる。これら両方のオリゴヌクレオチド（９ ｂ）又は（９ｃ）は（６ｃ）又は（６ｂ）　に対して完全に相補性であり、そし てこれらのアニーリングの後で成るニックによって簡単に互いに分離される。更 に（９ｃｌ　ｆ９ｄｌ　（Ｒ３１はその５°末端においてホスホリル化されてい る。（９ａ）又は（９ｄ）は非偏性であり、そのレポーターゾンデに対して全く 同−性或は相補性を持たず、そしていずれにしても望ましい追加的なりＮＡ配列 をその増幅生成物の中に導入するのに用いられる。それら非偏性官能基の位置関 係については、（Ｒ２）が好ましくは（９ａｌ　（９ｂｌの５゛末端へ向かって 出来るだけ遠くへ、そして（Ｒ３）が１９ｅ）　１９ｄｌの３′末端へ向かって 出来るだけ遠くへ存在しているのが良いということが当てはまる。更に（Ｒ２） と（Ｒ３）　は（Ｒ１１と異なっておりそしてキャリヤであるべきではない。反 応（１１）においてそれら両方のオリゴヌクレオチドｆＲ２１ｆ９ａｌ　ｆ９ｂ ｌ及び（９ｃ）　ｆ９ｄｌ　ｆＲ３１はＤＮＡリガーゼによって連結されて１本 のコヒーレントな配列（９）になる。反応（８）において変性が行なわれ、その 後でそのレポーターゾンデ（６）は両方のオリゴヌクレオチド　ｆＲ２１（９ａ ｌ　（９ｂｌ及び（９ｃｌ　ｆ９ｄｌ　ｆＲ３１のアニーリングのために用いら れる。鎖（９）　は次の増幅に用いられる。

まず最初反応（５）　においてもう一つの、第１の対と同様に構成されているＤ ＮＡオリゴヌクレオチド対のアニーリングが行なわれる。こればオリゴヌクレオ チド（Ｒ４１（１０ａｌ　１ｌｏｂｌ及び（ｌｋｌ　ｆｌＯｄｌ　（Ｒ５１を含 み、その官能性配列（１０ｂｌ　又はｆｌＯｅｌ　は（９ｃ）又は（９ｂ）に対 して完全に相補性であり、そしてこれへのアニーリングの後で直接互いに隣り合 って位置するに至り、即ち最適には一方の３°末端ともう一方の５゛末端との間 のニックが鎖（９）の中に存在していたニックに対してヌクレオチド１個分だけ 隔たっているような位置へ来る。オリゴヌクレオチド　ｆｌＯｃｌ　（１０ｄｌ 　ｆＲ５１の５゛末端は更に１個の燐酸基を有している必要がある。

それら非個性的官能基の位置に関しては、（Ｒ４）が（１０ａｌ　（１０ｂ）の ５°末端に向かって好ましくは出来るだけ遠くへ、そして（Ｒ５）がｆｌＯｅｌ 　（１０ｂｌの３゛末端に向かい出来るだけ遠くに存在するのが良いということ が当てはまる。更に（Ｒ４）及び（Ｒ５）は好ましくは（Ｒ１）と異なっていて キャリヤではない、、ｆｌＯａ）又は＋１０ｄｌは非偏性で非相補性の側面画定 性配列であり、そして他の種々の機能をその増幅物の中に導入するのに用いられ る。

ＤＮＡリガーゼ（Ｉｌｌの改めての作用によって両方のオリゴヌクレオチドｆＲ ４１ｆｌＯａｌ　ｆｌ［ｌｂｌ　及びｆｌｏｃｔ　ｆｌＯｄｌ　（Ｒ５１は連結 されて鎖（ｌＯ）となり、これは鎖（９）　と平行に二重体を形成する。改めて の変性（８）の後で再び対応する相補性オリゴヌクレオチド対のそれら分離され た鎖（９）及び（ｌＯ）のアニーリングが行なわれる。このサイクル的な増幅の 結果として部分的に二重鎖になった大量のＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマー（ ９１／／ｆｌＯ）が生ずる。

工旦段脂 上記の部分的に二重鎖になったＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマー［９１／／（ １０１は第４図に示した方法によって検出される。

五形慧佳 そのテンプレート拡散ｆｌ＞　の中にレポーターゾンデのための多数のハイブリ ッド化配列（ｌｂ）が好ましくはそれぞれ１個の短いスペーサ配列によって互い に分離されて置かれることができる。それらのハイブリッド化配列は同一である 必要はなく、従って種々のレポーターゾンデを使用することができる。同様にＲ Ｔプライマーのための多数のハイブリッド化配列が存在していてもよい。

テンプレート核酸の中の非偏性として挙げた種々のエレメント、ＲＴプライマー 、レポーターゾンデ及び増幅オリゴヌクレオチド類は単独に、又は種々の可能な 組み合わせの形で脱落することができる。側面画定性配列ｆｌＯａｌ　又は（１ ０ｄｌはそれらが（９ｄ）又は（９ａ）に対して相補性であるように形成される ことができる。その場合にＲＴプライマーの構成成分としての（Ｒ１）はＲ７反 応のための種々の条件をその場合にいくつかのリガンドで標識されたデオキシヌ クレオチドモノホスファートがその新しく合成されたｃＤＮＡの中に組み込まれ るように選ばれるときは存在しなくてもよい。これらの官能基はその場合に（Ｒ １１の意味においてそのｃＤＮＡを成るキャリヤに結合させることができる。

ｌノボ−ターゾンデ（６）においてはそれら側面画定性配列（６ａ）及び（６ｆ ）は任意の塩基性配列であることができる。即ち天然起源の直鎖状又は環状のＤ ＮＡ分子をレポーターゾンデとして用いることができる。

更にまた、レポーターゾンデ（６）のその増幅されるべき領域をそのｃＤＮＡを 結合するハイブリッド化配列（６ｅ）の上流ではなくて下流に配置しそれによっ てこれが（６ｆ）の領域の中に存在するようにすることも可能である。その増幅 されるべき領域は（６ｅ）と重なり合っていることができる。いずれにしてもこ れは好ましい形態ではない。

この基準から隔たって、成る特定の状況において成る与えられた一つの官能性配 列は一つ以上の機能を満足してもよい。例えば（６Ｃ）及び（６ｅ）のハイブリ ッド化機能を一緒にすることができる。この場合には（６Ｃ）はまずレポーター ゾンデのそのｃＤＮＡへのアニーリングを媒介しくこれはもちろん対応する成る 修飾されたテンプレート核酸をも条件付ける）、そして次にその結合しなかった レポーターゾンデの洗浄除去及びこのような場合に必要となる変性段階の後で、 増幅オリゴヌクレオチド　（Ｒ２１ｆ９ａｌ　（９ｂｌ　も結合する。（６Ｃ） の上でのこれら両方の機能の結合によってレポーターゾンデの各官能性配列（６ ｄ）及び（６ｅ）並びにこれらから導かれる種々の官能性配列が脱落する。

もう一つの変形態様としてこれらのハイブリッド化配列を、それらを発揮する各 配列が互いに部分的に重なり合うようにすることができる。この場合にはスペー サ領域（６ｄ）及びこのものから導かれる各配列が除かれる。

最後に、この、はんの僅かのヌクレオチドを含む部分的な重畳の可能性は、その レポーターゾンデがそれによって（２ｂ）にハイブリッド化されない限りテンプ レート核酸（１１の各官能性配列（ｌｂｌ及び（ｌｄｌにも存在する。この基準 から離れて、異なったい（つかの官能性配列に対して同一の塩基配列を使用する 可能性が存在し、またこれはホモポリマーであることもできる。これはテンプレ ート核酸の側面画定性配列（ｌａｌ及び（ｌｅ）並びにスペーサ配列（ｌｃ）に ついて当てはまり、それらはホモポリマーであることができ、及び／又は互いに 同一であることができる。またレポーターゾンデ（６）の側面画定性配列（６ａ ）及び（６ｆ）並びにスペーサエレメント　（６ｄ）もホモポリマーであること ができ及び／又は互いに同一であることができる。

好ましくはないけれども可能な変形態様の一つは、レポーターゾンデ（６）のオ リゴヌクレオチドハイブリッド化領域（６ｂ）及び（６ｃ）に対してスペーサエ レメント　（６ｄ）と、ハイブリッド化配列（６ｅ）と、及び側面画定性配列（ ６ａ）及び（６ｆ）　と異なっている同一の塩基配列を用いることより成る。こ の場合にはそれら増幅オリゴヌクレオチドはただ１個のハイブリッド化配列から なり、そしてその５゛末端においてホスホリス化されていなければならない。

第２段階において「種々の核酸配列を増幅し検出する方法Ｊ　（ＷＯ９０１０１ ０６９）を用いた場合のこのベルト法の組み立て第６及び第７図はりガーゼ連鎖 反応の各要素のみならずポリメラーゼ連鎖反応の各要素も用いられるようなこの 増幅方法を用いてのこのベルト分析法の反応の経過を示す。この場合に好ましく はテンプレート核酸としである純粋のＲＮＡが用いられるが、その第２段階にお いて用いられるべきテンプレート核酸の配列はけっしてＤＮＡより成っていては ならない。それら官能性配列においてハイブリッド化配列、スペーサ配列及び側 面画定性配列が用いられる。

第６図は、その増加されるべき核酸がｃＤＮＡの成る部分配列であるような変形 態様を示す。

第上段風 官能性配列ｆｌａ）ないしく１ｇ）を含むテンプレート核酸が用いられる。この テンプレート核酸［１１、そのＲＴプライマー（Ｒ１１［２ａｌ　ｆ２ｂｌ及び そのｃＤＮＡ　ｆ２）は構造、機能の配分及び記号について第２図のそれと同じ である、第２図と異なっているのはここではスペーサ配列（ｌｃｌが常に必要で あることである。またＲＴ反応及びその生成物についての試薬及び反応条件も同 一である。このぺＪｌ、ｈ分析法の機能発現のためにはこの中で少なくとも（２ ｆ）を含みそこまでの官能性配列を合成しなければならない。

このベルト分析法の最適の進行のためにまず最初反応（４）　においてテンプレ ート核酸を前述した種々の方法の一つによって分解し、そしてそれ以降の各反応 において反応物として脱離させる。これはそれによってその第２のオリゴヌクレ オチド対のそのテンプレート核酸のアニーリングを防止できるために望ましい。

このようなアニーリングは選んだ反応条件及び反応剤に従ってこのベルト分析法 の誤ったプラスの又は誤ったマイナスの結果に導くことがある。誤ったプラスの 結果は、それ以降の諸反応において用いられるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ もＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性をも有している場合及び その用いたりガーゼが同時にＤＮＡフラグメントをこれらがＲＮＡ／／ＤＮＡへ テロ二重体の形で存在している場合に結合できる場合に現われる。このような機 能を有するリガーゼは例えばバクテリオファージＴ４がらのそれである。誤った マイナスの結果は、そのテンプレート核酸（１）に結合している第２のオリゴヌ クレオチド対がその用いたりガーゼによっては連結して１本のコヒーレントなり ＮＡ鎖にはならないけれども、それのテンプレート核酸への結合に基づいてその 連結された第１のオリゴヌクレオチド対への結合から引き離され、それによって これがそのＰＣＲの成る最適でない進行をもたらす場合に現われる。

第旦玖階 次にｃＤＮＡ　ｆ２１　に反応（５）において第１対のＤＮＡオリゴヌクレオチ ドブライマーを部分ハイブリッドさせる。このプライマーｆＲ２１（６ａｌ　ｆ ６ｂｌの３°末端に配置された変性の（６ｂ）はｃＤＮＡの（２ｆ）へのハイブ リッド化に用いられる。その５°末端に存在する（６ａ）は非偏性であり、その ｃＤＮＡに対して全く相補性を持たず、そしてそのｃＤＮＡの中にまだ存在して いない新しい配列を導入するのに用いられる。（Ｒ２）　も非偏性であり、そし て好ましくは（Ｒ１）と異なっている。両方のプライマーの第２の（６ｄｌ　ｆ ６ｅｌ　ｆＲ３１は第１のものと同じボラリゾイーを有し、そしてそのｃＤＮＡ の（２ｄ）に対して相補性であって５°末端においてホスホリル化されているそ の５°末端に位置するハイブリッド化配列（６ｄ）　及びそのプライマーの３° 末端に位置していずれにしてももう一つの配列の導入に用いられる非偏性の（６ Ｅ）とから成る。その非偏性の（Ｒ３）は好ましくはｆＲＩ＋　と異なっている のが良い。

成る一対の両方の増幅オリゴヌクレオチドが互いに直接接するようになるＬＣＲ と異なって、ここではこれはｃＤＮＡのスペーサ配列（２ｅ）によって互いに分 は隔てられている。ＰＳ−ＷＯ９０１０１０６９に従い好ましい（２ｅ）の長さ はほんの僅かの数のヌクレオチドであるけれども、このベルト分析法は比較的長 い（２ｅ）　においても機能する。成るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより （これには合成に依存する５゛→３°エクソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリ メラーゼのみを使用しなければならない）反応（７）においてｄＮＴＰｓの関与 の下に成る「間隙充填」反応において（２ｅ）に対して相補的な（６ｃ）が合成 され、これはプライマー（６ｄｌ　ｆ６ｅｌ　ｆＲ３）と成るのニックによって 隔てられたままに留まる。

反応（１１）において成るＤＮＡリガーゼ（例えばバクテリオファージＴ４から のもの、有利には熱安定性酵素が用いられる）が両方の断片を繋ぐために用いら れ、これによってコヒーレントなりＮＡ鎖（６）が作り出される０反応（８）　 において変性が行なわれ、その上で連鎖（２）は再び第１のプライマー対のアニ ーリングのために用いられる。連鎖（９）は次の増幅に用いられる。

まず反応（５）　においてＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマーの第２の対のア ニーリングが行なわれる。これに用いられるハイブリッド化配列（９ｂ）又は（ ９ｄ）は第１のプライマー対の（６ｄ）又は（６ｂ）に対して相補性である。そ の第２のプライマー対の第１のプライマーは要素ｆＲ４１（９ａｌ　（９ｂｌよ り成り、その際前に述べたようにこのプライマーの３°末端に置かれた変性の（ ９ｂ）は第２のＤＮＡ鎖の（６ｄ）へのハイブリッド化に用いられる。その５° 末端に置かれた（９ａ）は非偏性であり、（６ｅ）　に対して非相補性であって 、いずれにしても望ましい他の種々の機能をその増幅生成物の中に導入するのに 用いられる。　（Ｒ４）は非偏性であり、そして好ましくは（Ｒ４）とは異なっ ているのが良い。この対の第２のプライマーは同じポラリティーのものであり、 そして官能性配列（９ｄｌ　ｆ９ｅｌ　（Ｒ５１から成っている。その５゛末端 においてこれはホスホリル化されている。その５゜末端に置かれた変性の（９ｄ ）は（６ｂ）に対して相補性である。その３゛末端に置かれた（９ｅ）は非偏性 で（６ａ）に対して相補性がなく、そしていずれにしても望ましい他の機能をそ の増幅生成物の中に導入するのに用いられる。　（Ｒ５）は非偏性であって好ま しくは（Ｒ１１とは異なっているのが良い。このプライマー対は従ってＤＮＡ鎖 （６）　に部分ハイブリッドされる。そのＤＮＡポリメラーゼの改めての作用及 びｄＮＴＰｓの利用の下にもう一つの「間隙充填」反応において両方のプライマ ーの間の隙間が閉じられ、そして両断片は反応（１１）においてＤＮＡリガーゼ により連鎖（９）　に結合される。これは各官能性配列（９ｂｌ　ｆ９ｃｌ　ｆ ９ｄ）を介して鎖（６）　と結合して平行な二重体になっている。これに対して （９ａ）及び（９ｅ）　は鎖（６）の（６ｅ）又は（６ａ）に対して全く相補性 を持たない。改めての変性（８）の後で対応する相補性のプライマー対のそれら 分離された連鎖（６）及び（９）へのアニーリング（５）が再び行なわれる。こ のサイクル的増幅の結果としてこの部分的二重体＋６１／／１９１が大量に生ず る。

第１段階 上記の生成物はのちに続く第３段階についての一般的注意書きに従う分析にかけ ることができる。これと異なって、（Ｒ１による標識が用いられている場合には 、官能基ｆＲ１の特定の新しく形成された組み合わせを備えているＤＮＡ分子の 検出のために簡単な検出系を使用することができる。この組み合わせは、（Ｒ２ ）と　（Ｒ３１，ｆＲ２＋　と（Ｒ４１、ｆＲ５１と（Ｒ４）、（Ｒ５）　と（ Ｒ３）である。このような検出系はここでも例えばＥＬＩＺＡ法又は簡単で経済 的な粒子凝集法に基づくことができる。オリゴヌクレオチド類によって導入され た非相補性の官能性配列（６ａ）、（６ｅ）、及び（９ａ）はこれらの領域にお いてそのＤＮＡが一重鎖であるのでハイブリッド化による検出において利用する ことができる。

衷形悪慝 用いた核酸の非偏性として挙げた官能性配列及び官能基は単一でも、又は可能な 異なった種々の組み合わせにおいても欠落することができる。　（６ａｌ、（６ ｅ）、（９ａ）＆び（９ｅ）の四つの全てが存在しない場合には増幅生成物とし てｆ６ｂ）　ｆ６ｅｌ　（６ｄｌ／／　（８ｂｌ　ｆ８ｃｌ　［８ｄｌ　の配列 より成る二重鎖ＤＮＡが生ずる。その側面画定性配列（９ａ）又は（９ｅ）もこ れらが（６ｅ）又は（６ａ）に対して相補的であるように形成することができる 。

テンプレート核酸＋１１　においては（１ａ）及び（Ｉｇｌは、これらがこのベ ルト分析法の最適の進行を許容できない態様において阻害しないというただ一つ の制限と共に任意の配列であることができる。この条件の下で天然起源のＲＮＡ 分子をテンプレート核酸ｆｉｌ　として使用することも可能である。このテンプ レート核酸はＲＴプライマーのために多数のハイブリッド化配列を有することが できる。

、二の基準から離れて、ハイブリッド化配列ｆｌｄｌ及び（１ｆ）は−緒に総合 されても良い。この場合に＋ｌｄｌは今やＲＴプライマーとしても用いられる（ Ｒ４）ｆ９ａｌ　（９ｂｌ　のテンブレーｌ−核酸ｆｉ＋　へのアニーリングを まず媒介する。第２段階においてｆＲ４１（９ａｌ　ｆ９ｂｌは公知のように増 幅プライマーの−っである。これによってテンプレート核酸（ｌｌ　の（１ｅ） 及び（１ｆ）が欠落する。別個の成るＲＴプライマーｆＲ１）　（２ａｌ　ｆ２ ｂｌ　も除かれる。

もう一つの変形態様としてハイブリッド化配列（１ｅ）及び（ｌｆｌをこれらが 部分的に重なり合うようにすることができる。この場合にはスベーづ配列（ｔｅ ｌ及びこのものから導かれる各配列が脱落する。

ＲＴプライマー及び第２増幅プライマーのアニーリングのために異なったいくつ かの配列を使用することは、他方においてＲＮＡプライマーの使用を可能にし、 それｌこよ−ってこのベル１−分析法の感度及び／又は特異性に影響を与えるこ とができる。この基準から離ねで、神々異なった官能性配列に対して同一の塩基 配列を使用する可能性が存在し、そしてこれらもホモポリマーであることができ る。

これはテンプレート核酸（１）の側面画定性配列（１ａ）及び（１ｇ）並びにス ペーサ配列（ｌｃｌ及びｆｕｅｌについて当てはまり、そしてこれらはホモポリ マーであることができ、及び／又は互いに同一であることができる。

更に、テンプ１ノー１〜核酸［１）　のハイブリッド化配列（ｉｂ）、（ｌｄｌ 　及び（１ｆ）の少なくとも二つに対してそれらスペーサ配列及び側面画定性配 列と異なった同じ塩基配列を用いることが可能である。その例としては全ての三 つのハイブリッド化配列が同一であるような場合が挙げられる。この場合に、そ の尚、必要なひとつのプライマーまたは、これと相補的なプライマーに対しても 、これがもっばらあるハイブリッド化配列よりなり、そしてその５°末端におい てホスホリル化されているということが該当する。このような条件のもとてその テンプレート核ｌ！！（１）　に最高で３個のこのようなプライマー分子が結合 する。ｃＤＮＡの合成は（ｉｔ、（ｌｃｌ　及び（ｌａｌに対して相補的に行わ れ、そしてそのＲ７反応の生成物としてそれぞれ一つのニックによって隔てられ た、テンプレート核酸に結合している３つの断片（２ｂｌ　ｆ２ｃｌ　、　（２ ｄｌ　ｆ２ｅｌ　及びｆｚｆｌ　ｆ２ｇｌ　が生ずる。これらの断片は前に述べ たＤＮＡリガーゼによって連結されてｆ２ｂ）　（２ｃｌ　ｆ２ｄｌ　ｆ２ｅｌ 　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌになる。この変形態様は更に尚、そのテンプレート核酸か ら各官能性配列（１ｅ）及びｆｌｆ）が前述のように脱離されるように単純化す ることができる。この場合ｃＤＮＡ断片ｆ２ｄｌ　［２ｅ）及び＋２ｆｌ　ｆ２ ｇｌだけが形成されてＤＮＡリガーゼによって連結される。連鎖ｆ２ｂｌ　ｆ２ ｃｌ　ｆ２ｄｌ　ｆ２ｅｌ　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌはこの場合に鎖（２ｄｌ　ｆ２ ｅｌ　＋２ｆｌ　ｆ２ｇ■ と同様に第２のプライマーの支援のもとにもＰＳ４００９１０１０６９に従う増 幅過程におけると同じ原理により増加される。

第１図は、そのＲ７反応において合成されたｃＤＮＡがその増加されるべき核酸 である部分的に相補性になっているレポーターゾンデの特異的な部分ハイブリッ ド化のためにのみ用いられる変形態様を示す。

工土改朧 テンプレート／プライマー複合物、Ｒ７反応（３）及びその生成物はすべての様 相において第３図のそれと同一である。Ｒ７反応（３）から現れる核酸混合物は 反応（４）　においてそのテンプレート核酸（１１が以降の反応においてレポー ターゾンデ（６）　に対する特異的競合物として現れて、それによって誤ったマ イナスの結果に導くことがないことを確認出来るように変形されている。したが って反応（４）　においては前述したいくつかの方法の一つによってその存在し ているテンプレート核酸ｆｉｌ　がアニーリング反応（５）　における本来の反 応物として脱離される。次にｃＤＮＡ（２１に反応（５ａ）においてその増加さ れるべき核酸でるかまたはこれを含み、かッｆ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　ｆ６ｅｌ　ｆ Ｇｄｌ　ｆ６ｅｌ　（６ｆｌ　ｆ６ｇｌ　よりなるＤＮＡレポーターゾンデ（６ ）　が部分ハイブリッドされる。これらのうち（６ｆ）は反応（３）においで合 成されたｃＤＮＡの（２ｄ）とハイブリッドするような必要なハイブリッド化配 列である。ｌ／ボータゾンデ（６）の他のすべての官能性配列はｃＤＮＡ　ｆ２ １　とハイブリッドせず、そしてその部分とも何らの配列の同一性は持たない、 　（６ｈｌ　及び（６ｄ）も同様にその増幅プライマーに必要なハイブリッド化 配列である。ｆＧｄｌ　４Ｊ第１の増幅プライマーのアニーリングに用いられ、 その（６ｂ）　に対して相補性の配列は第２の増幅プライマーのアニーリングに 用いられる。　（６ｃｌ　及び（６ｅ）はスペーサー機能を有する。それらのう ち（６ｃ）だけが必要である。（６ａ）及び（６ｇ）は非偏性の側面画定性配列 である。

最も遅くともレポーターゾンデ（６）のｃＤＡＮ　（２１へのハイブリッド化（ ５ａ）の後でそのｃＤＮＡは官能基（Ｒ１）によって成るキャリアに結合され、 そし７て結合されなか−）だレポーターゾンデは変性をもたらさない条件のもと て第３図に示すようにその反応混合物から完全に除去される。

工旦稔歯 もう一つのアニーリング反応（５ｂ）においてその第１の増幅オリゴヌクレオチ ドブライマーの第１の対、即ち（Ｒ２１（９ａｌ　ｆ９ｂｌ及びｆ９ｄｌ　（９ ｅ）　（Ｒ３１は適当な緩衝液の中で加えられる。この第２プライマーは（９ｂ ）または（９ｄ）において（６ｄ）又は（６ｂ）に対して完全に相補性である。

さらにｆ９ｄｌ　ｆ９ｅｌ　ｆＲ３１はその５°末端においてホスホリル化され ている。（Ｒ２）又は（Ｒ３）は非変偏性あって好ましくは（Ｒ１）と異なって いるのがよい。次に反応（７）においてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより ｄＮＴＰｓの利用のもとに両方のプライマーの間の隙間が閉じられ、そして反応 ｔｉｌ）において両方の断片ｆＲ２１（９ａ）　ｆ９ｂｌ　ｆ９ｃｌ及び（９ｄ ）（９ｅｌ　（Ｒ３１はそのＤＮＡリガーゼによって合体して１重鎮（９）　に なる。反応（８）において変性が行われ、その上でそのレポーターゾンデ（６） は両方のオリゴヌクレオチド（Ｒ２１ｆ９ａｌ　ｆ９ｂｌ及び（９ｄｌ　（９ｅ ｌ　ｆＲ３１のアニーリングのために用いられる。鎖（９）　はさらに次の増幅 のために用いられる。

まず最初反応（５ｃ）においてＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマーの第２の対 のアニーリングが行われる。この第２のプライマー対の第１のプライマーはｆＲ ４１ｆｉｎａｌ　ｆｌＯｂｌよりなり、その際その３°末端におかれた個性ｆｌ Ｏｂｌ　は（９ｄ）へのハイブリッド化に用いられる。その５°末端に置かれた （１０ａｌ　は非偏性であり、そしていずれにしても望ましい別な種々の機能を その増幅生成物の中に導入するのに用いられる。これについては（２ａ）または （９ａ）と同じ制限条件が当てはまる。（Ｒ４）　は非偏性でありそして好まし くは［Ｒ１１と異なっていてキャリアではない。この対の第２のプライマー（１ ０ｄｌ　ｆｌＯｅｌ　ｆＲ５１は同じポラリティのものであり、そしてその５° 末端においてホスホリル化されている。この５°末端におかれた＋１０ｄｌ　は （９ｂ）に対して相補性である。その３゛末端に置かれた非個性のｆｌＯＥｌ　 はまた同様にもう一つの官能性配列を導入するのに用いられる。

（Ｒ５）　はもう一つの非偏性の官能基であり、好ましくは（Ｒ１１と異なって いてキャリアではない。

このプライマーはＤＮＡ鎖（９）　に部分ハイブリッドされる。ＤＮＡポリメラ ーゼの改めての作用により、そしてｄＮＰＰｓの利用のもとにもう一つの「間隙 充填」反応において両方のプライマーの間の隙間が閉じられ、そして両方の断片 は反応（１１）においてＤＮＡリガーゼにより連結されて連鎖（１０）になる。

このものは官能性配列（ｌｏｂｌ　ｆｌＯｃｌ　ｆｌｏｄｌ　を介して鎖（９） と結合して平行な２重体になる。これに対して（１０ａｌ及びｆｌＯｅｌ　は鎖 （９）の（９ｅ）または（９ａ）に対してまったく相補性を持たない。改めての 変性（８）の後で対応する相補的プライマー対のそれら分離された鎖（９）及び （１０）へのアニーリングが再び行われる。このサイクル的な増幅の結果として 大量の平行な２重体ｆ９１／／１ｌｏｌ　が生ずる。

里旦段臘 上記の生成物は後続の第３段階についての一般的な注意書きに従って分析にかけ ることが出来る。これと異なって（Ｒ１によりＩ識が導入されているときは、（ Ｒ１の特定の幾つかの組み合わせを備えているＤＮＡ分子の検出のために簡単な 検出系を使用することが出来る。これらの組合わせは（Ｒ２）と　［Ｒ３１、ｆ ８２１　と（Ｒ４）、（Ｒ５）　と　（Ｒ４）　、ｆＲ５１と　（Ｒ３）である 。このような検出系はこの場合にもＥＬＩＳＡ法に基づくか、または簡単で経済 的な粒子凝集法に基づ（ことができる。オリゴヌクレオチドによって導入された 非相補性の官能性配列（９ａ）、（９ｅ）、（１０ａｌ及び（１０ｅｌ　はこの ＤＮＡがこれらの領域内で１重鎖であるのでハイブリッド化による検出において 用いることができる。

人形３橿 テンプレート核酸ｉｌｌの中でレポーターゾンデのために多数のハイブリッド化 配列（ｌｂｌが、好ましくはそれぞれ短いスペーサ配列によって互いに隔てられ て位置していることが出来る。それらハイブリッド化配列は同一である必要はな （、従って種々のレポーターゾンデを使用することができる。同様にＲＴプライ マーに多数のハイブリッド化配列を使用することが出来る。

その用いた核酸の中の非偏性としてあげた各反応性配列及び反応基は個別に、ま たは可能な種々の組み合わせにおいて脱落させることができる。テンプレート核 酸（１１の中でこれは側面画定性配列ｆｌａｔ及び（１ｅ）並びにスペーサ配列 （１ｃ）　である、レボータゾンデ（６）　においてはその側面画定性配列（６ ａ）及び（６ｇ）並びにそのスペーサ配列（６ｅ）は欠落していることが出来る 。（９ａ）、（９ｅ）、ｆｌｏａ）及びｆｌＯｅｌ　の４つが全て欠落している ときは増幅生成物としてｆ９ｂｌ　ｆ９ｃｌ　（９ｄｌ／／　（１０ｂｌ　ｆｌ Ｏｃｌ　［１Ｏｄｌ　よりなる２重鎖ＤＮＡが生ずる。増幅プライマーの第２の 対の各側面画定配列（１０ａｌ　または（１０ｅｌ　はそれらが（９ｅ）または （９ａ）　に対して相補正であるように形成することが出来る。それら官能基（ Ｒ２１、（Ｒ３）、（Ｒ４）、（Ｒ５）　の１つ、多数、または全てが欠落して いることも出来る。この場合にはＲＴ反応についての条件を、その場合に種々の リガンドで標識されたデオキシリボヌクレオチドモノホスファ−トがその新しく 合成されたｃＤＮＡＯ中に組み込まれるように選んだ場合には、そのＲＴプライ マーの構成成分としてのｆＲｌｌは欠落していてもよく、その場合にこれらの官 能基は（Ｒ１１の意味においてそのｃＤＮＡを成るキャリアに結合させることが 出来る。

レポーターゾンデ（６）　においては（６ａ）及び（６ｇ）は任意の配列を有す ることが出来る。即ち天然起源の直鎖状または環状のＤＮＡ分子をレポーターゾ ンデとして使用することが可能である。

さらにまた、そのレポーターゾンデ（６）の増幅されるべき領域はそのｃＤＮＡ を結合するハイブリッド化配列（６ｆ）の上流側ではなくて下流側に置き、それ によってこれが（６ｇ）の領域内に存在するに至るようにすることも可能である 。

その増幅されるべき領域は（６ｆ）をも包含するか、またはこれと重なり合うこ とが出来る。この後者はいずれにしても好ましい形態ではない。

この基準と異なって、ある特定の状況においては一つの官能性配列が一つ以上の 機能を有することも出来る。例えば（６ｄ）及び（６ｆ）のハイブリッド化機能 を一緒に合体させることが出来る。この場合には反応（５ａ）において配列（６ ｄ）がまず最初そのレポーターゾンデのそのｃＤＮＡへのアニーリングを媒介し くこれは当然対応する修飾されたテンプレート核酸をも条件づける）、そして次 にその結合しなかったレポーターゾンデの洗浄除去及びこのような場合に必要と なる成る変性段階の後でそのプライマーｆＲ２１（９ａｌ　ｆ９ｂｌをも結合す る。そのテンプレート核酸の配列ｆｌａｔが欠落してる場合には変性は不必要で ある。　（６ｄ）　の上でのこれら両方の機能の合体に基づいてレポーターゾン デの官能性配列（６ｅ）及び（６ｆ）　は省略される。これらのハイブリッド化 機能は別な変形態様としてそれらを発揮する配列（６ｄ）及び（６ｆ）が部分的 に重なり合うようにすることができる。この場合にはスペーサ配列（６ｅ）及び これから導かれる種々の配列が除かれる。

最後にこの僅かなヌクレオチドしか包含しない部分的な重畳の可能性はそのレポ ーターゾンデがそれによって（２ｂ）にハイブリッドしない限りそのテンプレー ト核酸（１）の各官能性配列（ｌｂｌ　ｆｌｄｌにも存在する。

この基準から離れて、種々異なった官能性配列に対して同じ塩基配列を用いるこ とができ、そしてこれらもホモポリマーであることが出来る。これはテンプレー ト核酸の側面画定性配列（１ａ）及び（１ｅ）並びにスペーサ配列（１ｃ）につ いて当てはまり、そしてこれらはホモポリマーであることが出来、及び／又は互 いに同一であることが出来る。レポーターゾンデ（６）の側面画定性配列（６ａ ）及び（６ｇ）並びにそのスペーサ配列（６ｃ）及び（６ｅ）もホモポリマーで あることが出来、及び／又は互いに同一であるとこが出来る。

さらに、レポーターゾンデ（６）のハイブリッド化配列＋６ｂｌ　、ｆ６ｄｌ　 及び（６ｆ）　の少なくとも２つに対してそれらスペーサー配列及び側面画定性 配列の各配列と異なった同一の塩基配列を使用することが可能である。その例と しては、これがもっばら成るハイブリッド化配列よりなり、そしてその５゛末端 においてホスホリル化されていることが当てはまる。このような条件のもとて反 応（５ａ）においてそのｃＤＮＡのハイブリッド化配列（２ａ）にｆ６ｂｌ　、 　ｆ６ｄｌ　又は（６ｆ）がハイブリッドする。洗浄して変性した後に反応（５ ｂ）においてそのレポーターゾンデ（６）　に最大で３個の上述のプライマー分 子が結合する。ＤＮＡの合成（７）はｆ６ｅｌ　、　（６ｃｌ　及び（６ａ）に 対して相補的に行われる。生成物としてそれぞれ１個のニックにより隔てられて レポーターゾンデに結合されている３つの断片（６ｂｌ　（６ｃｌ　、　（６ｄ ｌ　ｆ６ｅｌ　及びｆ６ｆｌ　ｆ６ｇｌが生じ、これらはりガーゼ（１１）の添 加によって互いに連結される。この変形態様はまた、そのレポーターゾンデがら 上に記述したように各官能性配列（６ｅ）及び（６ｆ）が脱離されることによっ て単純化されよう。この場合にはそれら３つの断片の代わりに２つだけが連結さ れてさらに増幅される。

転写に基づく増幅法を用いる場合のＰＥＲ７分析法の組み立てこのＰＥＲＴ法の 変形態様においてもその被検物の中に存在するＲＴ活性によって成るｃＤＮＡが プライマーの付されたテンプレート核酸に基づいて合成される。この場合に特に 記載しない限りテンプレート核酸として好ましくは純粋なＲＮＡが用いられる。

第２段階において増加されるべきそのテンプレート核酸の配列はいかなる場合に もＤＮＡよりなるべきではない。この方法にはそのＲＴ反応（３ａ）　の後でテ ンプレートＲＮＡが脱離されることが必要である。その増加されるべき核酸はそ のｃＤＮＡ中に含まれているが、またはこれは他の種々の反応においてこのｃＤ ＮＡから出発して合成される。このためにはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ 例えばバクテリオファージＴ７．Ｔ３　またはＳＦ３　のそれ）に対する官能性 プロモーターを有する少なくとも部分的に２重鎖になったＤＮＡが作り出され、 このものから次にＲＮＡが合成される。

そのプロモーターを含む少なくとも部分的に２重鎖になったＤＮＡの組み立ての ためには種々の可能性が存在する。その転写プロモータはｃＤＮＡの５°末端の 近傍あるいは第２ＤＮＡ鎖の５°末端の近傍に存在していることができる。両方 の場合にそのプロモーターについての配列情報はすでにそのテンプレート核酸の 中に入れられていることができるか、あるいはまたこれは成るプライマーを介し て導入することができる。そのＲＴプライマーをこれに用いた場合にはそのプロ モーターはそのｃＤＮＡの５°末端の近傍にくることになる。これに対してこの 第２ＤＮＡ鎖のためのプライマーがそれに用いられるときはこのプロモーターは その第２ＤＮＡ鎖の５゛末端の近傍に（ることになる。

このＰＥＲＴ法のこれら２つの型の原形が第８及び第９図に示されている。

このＰＥＲ７分析法の、以上に記述した各変形態様におけると同様に、ここでも またそのｃＤＮＡの代わりにこれに対して部分的に相補性のレポーターゾンデの 一部を増幅のために使用することが可能である。このレポーターゾンデはＤＮＡ からなるか、またはＲＮＡからなることができる（第１０１゜同様に成るＤＮＡ レポーターゾンデかも導かれたＲＮＡがその増加されるべき核酸を含んでいても よい。

すべての場合に増加されるべき核酸の増幅はＰＳ−ＥＰ　０４０８２９５、ｗｏ 　８９１０１０５０及びＷＯ８８／１０３１５　に従い成る多重酵素的方法によ って行なわれ、その際これはＰＳ−ＥＰ　０４０８２５　においては他の両者と 異なって等温的に行われる。

第旦図はそのＲＴ反応において合成されたｃＤＮＡがその増加されるべき核酸を 含んでいるようなこのＰＥＲ７分析法のいくつかの変形態様を示す、これらの変 形態様のすべてにおいてその反応（３ａ）において合成されたｃＤＮＡはその５ ゛末端の近傍において転写プロモーターのＰ（−）−配列を含んでいる。それら 転写ブローター配列はこの場合にそのテンプレート核酸の中にすでに含まれてい てもよく（変形態様１及び２）、及び／又はそのＲＴプライマーによって送りこ まれてもよい（変形態様２及び３）。これはそのテンプレート核酸の中に一体化 してこれはプロモーターの（Ｐ＋）−配列に相当する。ＲＴプライマーの構成部 分としてこれは（Ｐ−）−配列に相当する。

第１貌原上亥形聾復１ 官能性配列ｆｌａｌ　（ｌｂｌ　［１ｃｌ　（ｌｄｌ　（ｌｅｌ　ｆｌｆｌ　（ １ａｌ　（ｌｈｌを含んでいるテンプレート核酸を用いる。これらのうちｆｌｂ ｌ　、　ｆｌｄｌ　及び［１ａｌは必要なハイブリッド化配列である。（１ｅ） 　も必要であり、これはその選んだＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのためのプ ロモーターのためにコードする。スペーサー配列（ｌｃｌ及び（１ｆ）は非偏性 であり、そして側面画定性配列（１ａ）及びｆｌｈｌ　も非偏性である。それら ３つのハイブリッド化配列のうち（ＩＧ）はＲＴプライマーのアニーリングに用 いられる。ハイブリッド化配列（１ｂ）はその組み合わされた形（２ｇ）におい て第２段階において第２ＤＮＡ鎖の合成のための第１増幅プライマーのアニーリ ング及び（１０ｃｌ　として増幅のための第１増幅プライマーのアニーリングに 用いられる。　ｆｌｄｌ　またはこれに対応する（６ｄ）は第２段階において第 ２増幅プライマーのアニーリングに用いられる。

ＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂｌはその必要なハイブリッド化配列（ ２ｂ）によってテンプレート核酸のｆｌｇｌに結合する。その５゛末端に置かれ た（２ａ）は非偏性であり、そしてそのＲＴプライマーがＤＮＡオリゴヌクレオ チドである時はそのテンプレート核酸の中にまだ存在していない新しい配列を導 入するのに用いられる。　（Ｒ１１は非偏性である。

その処理された被検物中にＲＴ活性が存在する場合には反応（３ａ）においてｄ ＮＴＰｓの利用のもとにｃＤＮＡ　（２１が合成され、これは最大限、官能性配 列（２ａ）から（２ｈ）までを含んでいる。このＰＥＲＴ分析法の機能発現のた めには天−のＲＴ７ｃｌおいて少なくとも（２ｇ）を含めてそこまでの配列が合 成される必要がある。

宜形裂士１ （ｌａ）　ｆｌｂｌ　（ｌｃ）　ｆｌｄｌ　ｆｕｅｌ　（ｌｆｌ　よりなるテン ブレー１−核酸を用いる。変形型Ｉと讃なり　（Ｉｇｌ及びｔｌｈｌは削除され ている＠（ｌｂｌ、（１ｄ）及びｆｉｅｆは必要なハ２１′ブリッド化配列であ る。　１ｌｅｌ　はその上に転写プロモーターのＲＮＡの中にコー　ドされた配 列を含んでい乙。そのプライマーのアニーリングに用いられた配列は一方側また は両側へ、そのプロモーターをコードする配列を越えて伸び出している。スペー サ配列（１ｃ）及び各側面画定性配列（ｌａｌ及びｆＲｌｌは非偏性であこ）。

それら；３つのハイブリッド化配列のうち（１ｅ）はＲＴプライマーのアニーリ ノくｆに用いられる。（１ｈ）　及び（１ｄ）は変形型Ｉにおけると同じ機能を 有する。

午彫ｐ、１７　ｉに比してより短（なっているテンプｌ／　−トｎ酸に対応して そのＲＴブラｆマー、即ちｉ）　Ｎ　ＡオリゴヌクレオチドｆＲ１１（２ｅｌ　 （２ｄｌは変形型Ｉにおいて用いら第１たものと異なっている。その３゛末端に 置かれた必要な（２ｄ）はそのテンプ１、・−１４酸ｆｉ＋　の（ｌｅｌへのア ニーリングを媒介し、そしてその上に転写プロモーターの（Ｐ−）−配列を含ん でいる。　ｆ２ｄｌ　のそのアニーリングに用いられる配列は（ｌｅｌ　におけ ると同様に一方側または両側でそのプロモーター配列を越えて伸び出しているこ とが出来る。その５°末端に置かれた（２ｃ）は非偏性であり、そして変形型工 における（２ａ）の機能を持つ。（Ｒ１）は非偏性である。ＲＴ７ｃｌ３ａ）の 生成物として最大でそれら官能性配列（２ｃ）ないしく２ｈ）よりなるｃＤＮＡ 　ｆ２１　が生ずる。このＰＥＲＴ法の機能発現に対してはそのＲＴ７ｃｌおい て（２ｇ）を含めて少なくともここまでの配列が合成される必要がある。

ｉ形型上上上 官能性配列ｆｌａｌ　ｆｌｂｌ　ｆｌｃｔ　ｆｌｄｌ　［１ｅ）を含むテンプレ ート核酸を用いる。即ち変形型ＩＩと異なってその転写プロモーターのためにコ ードする配列もさらに削除されている。　ｆｌｂｌ　と（１ｄ）とは必要なハイ ブリッド化配列である。スペーサ配列（ｌｃｌ及び各側面画定性配列（１ａ）及 び［１ｅ）は非偏性である。それら２つのハイブリッド化配列のうち（ｌｄｌは ＲＴプライマーの、及び第２増幅プライマーのアニーリングに用いられる。　（ ｌｂｌ　は変形型１と同じ機能を有する。そのテンプレート核酸の中で欠落して いる転写プロモーター配列はそのＲＴプライマーによって供給される。このＤＮ ＡオリゴヌクレオチドであるｆＲｌｌ　ｆ２ｃｌ　（２ｄｌ　ｆ２ｅｌはテンプ レート核酸（１）のｆｌｄｌへのアニーリングを媒介する、その３゛末端に置か れてた　必要なハイブリッド化配列（２ｅ）を有している。これの直ぐ上流で（ ２ｄ）　は転写プロモーターの（Ｐ−）−配列を含んでいる。その５゛末端に置 かれた（２Ｃ）　は変形型ＩＩにおけると同様に非偏性である。ＲＴ７ｃｌ３ａ ）の生成物として最大で官能性配列（２ｃ）ないしく２ｈ）よりなるｃＤＮＡ　 （２１が生ずる。このＰＥＲＴ分析方法の機能発現のためには（２ｇ）を含めて 少なくともそこまでの配列がそのＲＴ７ｃｌおいて合成される必要がある。

衾寒形型 これら３つのすべての変形型においてまず最初、反応（４）においてＲＮ　Ａよ りなるテンプレート核酸（１）が前述したい（つかの方法の１つによって分解さ れ、そしてそれによりそれ以降の反応における反応物として脱離される。これら の手段で作用を受けなかった１重鎖ｃＤＮＡ　［２）　は配列（２ｅ）ないしく ２ｇ）においてその増加されるべき核酸を含んでいる。

ｌλユ肯 このｃＤＮＡｆ２１　を次に、はじめにあげたいくつかの特許明細書の記載に従 っで多数の酵素の含まれた、すなわちその選ばれたプロモーターに対応するＩ） 　Ｎ　Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリポリーゼｆＲＴｌの含まれている反応混合物の中に移し た。この後者が不十分なＲＮアーゼＨ作用を有する場合には、追加的にさらにＲ ＮアーゼＨを添加することができる。

加えて、その反応混合物中へ移す前またはそれと同時に、そのＲＮＡの安定性を 前に述べたいくつかの方法の１つによって再び保証しなければならない。

次に、このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１に、全ての変形型で反応（５ａ）において第 １増幅プライマー、すなわちＤＮＡオリゴヌクレオチド　（Ｒ２１（６ａｌ　（ ６ｂｌを部分的にハイブリッドさせる。　ｔＲ２）　は好ましくは　ｆＲｌｌ　 と異なっており、そしてキャリアではないのがよい。このプライマーの３°末端 に置かれた偏性のハイブリッド化配列（６ｂ）はすべての変形態様においてｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａ　（２）　の　（２ｇ）に対して相補性を有する。その５°末端に１ かねた非偏性で非相補性の（６ａ）はそのｃＤＮＡＯ中にまだ存在していない成 る新しい配列を導入するのに用いられる。その反応混合物中に存在するＤＮＡ依 存性ＤＮＡポリメラーゼにより、モしてｄＮＴＰｓの使用のもとに反応（７）　 において第２ＤＮＡ鎖が合成される。結果として平行２重鎮のＤＮＡ　（２＋／ ／（６１が生ずる。変形型ＩについてはこれはｆＲｌｌ　ｆ２ａｌ　−ｆ２ｈｌ 　／／　（Ｒ２１（６ａｌ　−ｆ６ｈｌよりなり、これに対して変形型ＩＩ及び 変形型ＩＩＩについてはこれはｆＲｌｌ　（２ｃ）　−ｆ２ｈｌ　／／　（Ｒ２ １ｆ６ｃｌ　−（６ｈｌよりなる。

その反応混合物の中に入れられた、３つの全変形型のｆ２ｄｌ　／／　（６ｅｌ の中にその選んだＲＮＡポリメラーゼのための１個の機能性プロモータを有する ｄｓＤＮＡ　（２）／／（６１から、反応　（８）においてそのＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼにより、そしてｒＮＴＰｓの利用のもとに、（１０ａｌ　ｆｌ ｏｂｌ　（ｌｏｃｌ　（ＩＯｄ）　を包含する成るｓ　ｓ　ＲＮ　Ａｆｉ　ｆｌ ｏｌの合成が行われる。この５ｓＲＮＡ　１ｌｏｌはすべての３つの変形型にお いてそのＣＤＮＡのポラリティを有する。　ｆｌｏａ）　ｆｌｏｂｌ　（１０ｃ ｌはそれら異なったテンプレートＲＮＡ　ｆｉ＋　の［１ｄｌ　（ｌｃｌ　ｆｌ ｂｌ　に対して相補性である。これに対し、て（１０ｄｌは（６ａ）から導かれ ている。

引き続く各反応において、この５ｓＲＮＡ　ｆｌｏｌ　より出発して成るＲＴ７ ｃｌより転写可能なｄｓＤＮＡの構築が改めて行われる。反応（５ｂ）　におい てはまず最初その第１増幅プライマー（Ｒ２１（６ａｌ　（６ｂｌのその５ｓＲ ＮＡ　（１口）へのアニーリングが行われる。この場合にオリゴヌクレオチド　 （Ｒ２１ｆ６ａｌ　ｆ６ｂ）の全ＤＮＡ配列がアニーリングに用いられる。

その反応混合物中に存在するＲＴによって反応（３ｂ）においてｄＮＴＰｓの利 用のもとにｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆＲ２１ｆ６ａｌ　（６ｂ）　（６ｃｌ　（６ｄｌ が合成される。このＲＴのＲＮアーゼＨ作用により、または必要の場合、追加的 な任意のＲＮアーゼＨの作用によって反応（１２）においてその第２の増幅プラ イマー（Ｒ３１（ｌｌａｌ　ｆｌｌｂｌ　（ｌｌｃｌ　のｃＤＮＡの（６ｄ）へ のアニーリングが反応（５Ｃ）において起こることができる限り、そのｃＤＮＡ ／ＲＮＡのへテロ２重体からＲＮＡ　ｆｌｏｌが分解される。この増幅プライマ ーはその３°末端において　（６ｄ）に対して相補性の偏性ハイブリッド化配列 （ｌｌｃ）よりなる。これの上流に同様にそのＲＮＡポリメラーゼのプロモータ ーの（Ｐ−）−配列のための同様に個性の官能性配列（ｌｌｂｌ　が存在する。

この５゛末端において側面画定性の非偏性配列ｆｌｌａｌが存在する。

（Ｒ３）　は同様に非偏性である。

そのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの改めての作用により、そしてｄＮＴＰＳ の利用のもとに、反応（７）　においてｄ　ｓ　ＤＮＡ　（Ｉｌｌ／／（６１が 生ずる。この場合に鎖（川は要素（Ｒ３１ｆｌｌａｌ　ないし［１１ｆ＋を含み 、そして鎖（１６）は要素（Ｒ２）　（６ａｌないしく６ｆ）を含む。このｄｓ ＤＮＡは（１１ｂｌ　／／　ｆ６ｅｌ　の中に同様にそのＲＮＡポリメラーゼの ための官能性プロモータを有し、これによって反応（８）　において改めて５ｓ ＲＮＡ　（１０ａｌ　ｆｌｏｂｌ　（１０ｃｌ　（ｌｏｄｌが合成される。５ｓ ＲＮＡ　（１０）は再びその増幅サイクルへ送り込まれ、そして同時に第２段階 の主生成物である。

策止段ｍ その増幅過程からもたらされるｓ　ｓ　ＲＮ　Ａ　（ＩＡＩ　（１０ｂｌ　（１ ０ｃｌ　（１０ｄｌ　は後続する第３段階についての一般的な注意書きに従って 分析のために用いられる。

良肚聾樺 用いた種々の核酸の非偏性としてあげた各官能性配列及び官能基ｆＲ１は個別に 、または可能な種々の組み合わせにおいて脱落することができる。そのＲＴプラ イマーの５゛末端の所に位置する官能性配列［変形型Ｉにおいては（２ａｌ　、 変形型工及びＩＩにおいてはｆ２ｃｌ　］の欠落は第２段階において作り出され た５ｓＲＮＡの組成に対して何等の作用も持たない。その第１増幅プロモータの 配列（６ａ）の欠落は、その５ｓＲＮＡ　（１０１の３°末端に存在する配列（ １０ｄｌ　が欠落する結果をもたらす。これに対してテンプレート核酸の（１ａ ）及び／又は第２増幅プライマーの（ｌｌａｌ　が欠落することはその５ｓＲＮ Ａ　（１０１の組成に対して何等の影響も持たない。反応（４）　においてはｆ Ｒｌｌの存在することが有利である場合がある。

テンプレート核酸の中で要素（１ｇ）と　（１ｅ）との間、ＲＴプライマーにお いて（２ｄ）と　（２ｅ）との間、及び／又はその第２増幅プライマーにおいて （ｌｌｂｌ　と　（ｌｌｃｌ　との間に１個の追加的なスペーサ配列が挿入され ていてもよい。

変形型ＩＩＩにおいてはそのテンプレート核酸（１１において両方の側面画定性 配列は任意の塩基配列を有することができる。これは天然起源のＲＮＡ分子をテ ンプレート核酸（１１として使用することを可能にする。

この基準から離れて、成る１つの官能性配列又はいくつかの官能性配列の１つの 組み合わせが１つよりも多い機能に用いられることが可能である。すなわちすべ ての変形型においてその第２増幅プライマー（Ｒ３１［１１ａｌ　（ｌｌｂｌ　 （１１，ｃｌはそのＲＴプライマーの機能をも持つことができる。このＲＴプラ イマーのハイブリッド化配列（ｌｉｅ）　によるアニーリングはこの場合にその テンプレート核酸（１１のハイブリッド化配列（１ｄ）へ行われる。その３゛末 端へ向かって（１ｄ）を含めてそこまでの配列を包含するテンプレート核酸（１ ）はこのような状況のもとでこのＰＥＲ１分析法の機能発現に十分である。

種々の異なった分子をＲＴプライマーに、及びその第２増幅プライマーに使用す ることは他方において成るＲＮＡプライマーをそのＲ７反応に用いることを可能 にし、それによりこのＰＥＲ７分析方法の感度及び／又は特異性に影響を与える ことができる。

この基準から離れて、種々異なった官能性配列に同一の塩基配列を使用する可能 性が存在し、その際これらはホモポリマーであることができる。これは全ての変 形型においてホモポリマーであることができ、及び／又は互いに同一であること ができるようなそのテンプレート核酸（１）の側面画定性配列またはスペーサ配 列について当てはまる。

さらに、これらの各変形態様を、その転写プロモータが第２ＤＮＡ鎖の５°末端 へ向かう方向へ来るように修飾する事が可能である。この場合にはその第２段階 において合成される５ｓＲＮＡ　（１０１はテンプレート核酸（１）　と同じポ ラリティを有する。その転写プロモータ配列はＰ（＝）−列としてそのテンプレ ート核酸を介して組み込まれることができ、その際これはハイブリッド化配列（ １ｂ）の上流に存在しなければならない。しかしながらその第２ＤＮＡ鎖の合成 に用いた増幅プライマーはその３°末端に置かれたハイブリッド化配列において 転写プロモータＰ（−）−配列を常に有している必要がある。

この転写プロモータ配列がもっばらその第２ＤＮＡ鎖の合成のためのプライマー を介して組み込まれるときは、テンプレート核酸として天然のＲＮＡを用いるこ とができる。しかしながら成る官能性プロモータを有する部分的に２重鎖になっ たＤＮＡを構築するためには、いずれの場合にもその第２ＤＮＡ鎖の合成の後で そのＤＮＡを変性させてその第１増幅プライマーのアニーリングにより、そして 改めてのＤＮＡ合成によって成る官能性プロモータを構築することが必要である 。この場合にはそのＲＴ活性によって合成されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２）　はそ の増加されるべき核酸の合成のための遊離物だけである。第２段階において合成 されるＳｓ　ＲＮ　Ａ　（１０１はこの場合にテンプレート核酸（１１と同じポ ラリティを有する。

第９図は、その増加されるべき核酸がＲＮＡであるようなこのＰＥＲ１分析法の 種々の変形態様を示す。このＲＮＡの合成に必要な転写プロモーターは図示のす べての変形態様において第２ＤＮＡ連鎖の５°末端の近傍に存在する。その転写 プロモータ配列はこの場合にそのテンプレート核酸の中に（Ｐ−）−配列として すでに存在している（変形型ＩまたはＩＩ）か、又はこれは同様にこのＰ（−） −配列に対応してその第２　ＤＮＡ連鎖のためのプライマーを介して送り込んで もよい。

東上役隆二亥五駕↓ 官能性配列（ｌａｌ　ないしく１ｈ）を含むテンプレート核酸を用いる。これら のうち　［ｌｂｌ　、　（ｌｅｔ　および（１ｇ）は必要なハイブリッド化配列 である。同様に必要なのは、その転写プロモータのためにコードする（１ｄ）で ある。スペーサ配列（ｌｃｌ及びｆｌｆ）ならびに側面画定性配列（１ａ）及び Ｆｌｈｌは非偏性である。３つのハイブリッド化配列のうちｆｌｇｌはＲＴプラ イマーのアニーリングに、そして第２段階においてこれから導かれる配列　（１ ３ｄｌ　は第１増幅プライマーのアニーリングに用いられる。（１ｂ）　はその 相補性の形（２ｇ）において第１段階における第２ＤＮＡ連鎖のためのプライマ ーのアニーリングに用いられる。（１ｅ）はその相補性の形（１４ｂｌ　におい て第２段階で第２増幅プライマーのアニーリングに用いられる。ＲＴプライマー 　ｆＲｌｌ　（２ａｌ　［２ｂ）はＲＮＡオリゴヌクレチドまたはＤＮＡオリゴ ヌクレオチドである。その３°末端に位置する必要な（２ｂ）はテンプレート核 酸の（１ｇ）へのアニーリングを媒介する。官能基ｆＲ１１は非偏性である。そ の処理される被検物中にＲＴ活性が存在する場合には反応（３ａ）において必要 なｄＮＴＰｓの利用のもとに成るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１が合成され、これは最 大限、その官能性配列（２ａ）から　（２ｈ）までを含でいる。このＰＥＲ１分 析法の機能発揮のためにはそのＲ７反応（３ａ）において（２ｇ）を含めて少な くともそこまでの配列を合成する必要がある。

衆形鼠±１ （ｌｃｌ　ｆｌｄｌ　ｆｌｅｌ　ｆｌｆｌ　（Ｉｇｌ　（ｌｈｌ　を含むテンプ レート核酸を用いる。変形型■と異なり、（ｌａｌ　及び（１ｂ）が欠落してい る。残存している各配列の機能についてはここでは（ＩＣ）が側面画定性配列で あるということを除いて変形型工の所で述べたものが該当する。そのＲＴプライ マーｆＲ１１（ｌａｌ　ｆｌｂｌ　も変形型工におけると同じである。その処理 される被検物中にＲＴ活性が存在する場合には反応（３ａ）において必要なｄＮ ＴＰＳの利用のもとに成るｃＤＮＡ　（２１が合成され、これは最大限、官能性 配列（２ａ）から　（２ｆ）までを含んでいる。このＰＥＲ１分析法の機能発揮 のためにはそのＲ７反応（３ａ）において（２ｅ）を含めて少なくともそこまで 各配列を合成しなければならない。

！肚型上１１ ｆｌｅｌ　（ｌｆｌ　（Ｉｇｌ　ｆｌｈｌ　を含むテンプレート核酸を用いる。

変形型ＩＩと異なり、（ｌｃｌ　およびｆｌｄｌが削除されている。残存の各官 能性配列の機能については変形型工の所で述べたものが該当する。そのＲＴプラ イマー（Ｒ１１（２ａｌ　ｆ２ｂｌ　も変形型工におけると同じである。その処 理される被検物の中にＲＴ活性が存在しているときは反応（３ａ）においてその 必要なｄＮＴＰｓの利用のもとに成るｃＤＮＡ　（２１が合成され、これは最大 限、官能性配列（２ａ）から　（２ｄ）までを含んでいる。このＰＥＲ７分析方 法の機能発揮のためにはそのＲ７反応（３ａ）において配列（２Ｃ）及び（２ｄ ）が合成される必要がある。

衾交形Ｉ そのＲＮＡは反応（４）　において、第２図のところで述べたいくつかの方法の 一つにより、それ以降の各反応における反応物として脱離される。

東肚裂工において、次に反応（５ａ）で第２ＤＮＡ連鎖のためのプライマー、す なわちＤＮＡオリゴヌクレオチド　ｆＲ２１（６ａｌ　ｆ２ｂｌがそのｃＤＮＡ （２）　に部分的にハイブリッドされる。その３°末端に位置する個性ハイブリ ッド化配列（６ｂ）はそのｃＤＮＡの（２ｇ）に対して相補性を有する。その５ ゛末端に置かれた（６ａ）は非偏性であり、そのｃＤＮＡに対して全（相補性を 持たず、そしてそのｃＤＮＡＯ中にまだ存在していない成る新しい配列の導入に 用いられる。成るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの添加により、モしてｄＮＴ Ｐｓの利用のもとに反応（７）　においてｔ！４２ＤＮＡ連鎖（６）合成される 。その結果ｆＲ１１（２ａ）　−ｆ２ｈ）　／／（Ｒ２１ｆ６ａｌ　−ｆ６ｈｌ 　よりなるｄｓＤＮＡ　ｆ２１／／（６１が生ずる。

変形型１↓においては反応（５ａ）において変形型Ｉで用いたプライマーの代わ りにそのｃＤＮＡの短縮された３゛末端に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチド　 （Ｒ２１（６ｅｌ　ｆ６ｄｌが第１段階から出発したｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１； こ部分的にハイグリッドされる。その３゛末端におかれた個性ハイブリッド化配 列（６ｄ）はそのｃＤＮＡの（２ｅ）に対して相補性を有し、そしてその遍んだ 転写プロモータの（Ｐ−）−配列を同時に含４Ｊｎこのハイブリッド化配列はそ の転写プロモータの配列は両側において重なりあっていることができるやその５ ゛側末端におかれた（６ｃ）は非偏性であり、そのｃＤＮＡに対して全（相補性 を持たず、そしてそのｃＤＮＡの中にまだ存在していないある新しい配列を導入 するのに用いられる。成るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを添加することによ り、モしてｄＮＴＰｓの利用のもとにその第２Ｉ）ＮΔ連鎖（６）が反応（７） 　において合成される。結果として、（Ｒ１１ｆ２ａｌ　−（２ｆｌ　／／　（ Ｒ２１（６ｃ）　−（６ｈｌ　よりなるｄｓＤＮＡ　（２１／／　ｆ６１が生ず る。　ｆ６ｄｌ　がその３°末端において少なくともヌクレオチ１３個分だけそ のポリメラーゼプロモータ配列の３°末端を越えて伸び出している場合には、そ のプライマーｆＲ２１ｆ６ｃｌ　ｆ６ｄｌのｃＤＮＡへのアニーリングによって 既にそのＲＮＡポリメラーゼのための１個の官能性プロモーターが生ずる。この 場合にはそのＲＮハ合成（８ａ）のためにもはや反応（７）　は不必要となる。

ｌ玉１ＬＪＩ−においては反応（５ａ）においてそのｅＤＮＡのさらに短縮され た３°末端に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマー（Ｒ２１（６ｃｌ　 （６ｄｌ　ｆ６ｅｌ　がそのｃＤＮＡ　（２）　に部分的にハイブリッドされる 。このプライマー（Ｒ２１ｆ６ｃｌ　ｆ６ｄｌ　ｆ６ｅｌの３°末端におがれた 偏性ハイブリッド化配列（６ｅ）はそのｃＤＮＡの（２ｄ）に対して相補性を有 する。（６ｃ）及び（６ｄ）は変形型エエにおけると同じである。成るＤＮＡ依 存性ＤＮＡポリメラーゼの添加により、モしてｄＮＴＰｓの利用のもとに反応（ ７）においてその２つのＤＮＡ連鎖の両方の３゛末端が延長される。結果として 、　ｆＲｌｌ　（２ａｌ　−［２ｆｌ　／／　ｆＲ２１（６ｃ）　−（６ｈｌ　 よりなる成るｄｓＤＮＡ　ｆ２）／／ｆ６１が生ずる。

すべての変形態様においてこの時までに再びそのＤＮＡの、以下の諸反応におけ る安定性を保証するような反応条件が作り出される必要がある。これに用いられ る方法は第８図におけるそれと同じである。

すべての３つの変形態様の（２ｅｌ　／／　（６ｄｌの中に、選んだＲＮＡポリ メラーゼのための成る官能性プロモーターを含んでいるような、その反応混合物 中に加えられるａｓＤＮＡ　ｆ２１／／ｆ６１がら、反応（８ａ）においてその ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、そしてｒＮＴＰｓの利用のもとに、ｆ ｌＯａｌ　ｆｌｏｂｌ　（１０ｃｌ　（１０ｄｌ　を含む成る５ｓＲＮＡ種（１ ｏ）の合成が行われる。このｓ　ｓ　ＲＮ　Ａ　（１０１は３つのすべての変形 型において第２ＤＮＡ連鎖（６）　またはそのテンプレート核酸＋１１　と同じ ボラリディを有する。（１０ａｌ　、　ｆｌｏｂｌ及び（１０ｃｌ　はそれら種 々のテンプレートＲＮＡ　（１１の（ｌｅ）　、（ｌｆｌ　および（Ｉｇｌ　と 同一である。これに対してｆｌＯｄｌ　は（２ａ）より導かれており、そしてこ れに対して相補性である。

！ヱ胆箔 その５ｓＲＮＡ　（１０１はこの増幅方法に加えられる。成るアニーリング反応 （５ｂ）においてその第１増幅プライマー（Ｒ３１（ｌｌａ）　ｆｌｌｂｌ　［ １１ｃｌはその３°末端に置かれたハイブリッド化配列（ｌｌｃｌ　によってそ の５ｓＲＮＡの（１０ｃｌ　にハイブリッドされる。ｔｌｌｂ）は転写プロモー ターのＰ（−）−配列であり、ｆｌｌａ）は側面画定性配列である。ｆｌｌｂｌ 　と　（ｔｉｃｌどは不必要であり、（ｌｌａｌ及びその官能基（Ｒ３）は非偏 性である。その反応混合物中に存在するＲＴによってｄＮＴＰｓの利用のもとに 反応（３ｈ）　においてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ３１ｆｌｌａ）　ｆｌｌｂｌ　（ ｌｉｅ）　ｆｌｌｄｌ　１ｌｌｅｌ　が合成される。そのＲＴのＲＮアーゼ■（ 作用により、又は必要の場合、追加的に添加されたＲＮアーゼＨの作用によって 反応（１２）においてそのｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２重体からＲＮＡ　ｆ１０＋ が反応（５ｃ）において第２増幅ブラ、イｖ　−（Ｒ４１［１３ａｌ　（１３ｂ ｌのｃＤＮＡの（ｌｌｅｌ　へのアニーリングを起こすことができるまで分解さ 第１る。この増幅プライマーはその３°末端において　ｉｌ　ｌｅｌ　に対して 相補性の個性ハイブリッド化配列（１３ｈｌよりなる。その上流に非偏性の側面 画定性配列（１３ａ）　が存在する。

（Ｒ４）　も同様に非偏性である。そのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの改め ての作用により、モしてｄＮＴＰｓの利用のもとに反応（７）　において成るｄ ｓＤＮＡ　ｆｉｌｌ／／（１３）が生じ、このものから反応（８ｂ）において成 るＲ　Ｎ　Ａポリメラーゼにより、ｒＮＴＰｓの利用のもとに成るＳＳ、ＲＮＡ 　（１４１が合成され、これは配列（１４ａｌ、（１４ｂｌ及び（１４ｃｌにお いてそれぞれ（１０ｄｌ、（１０ｅｌ及びｆｌＯｂｌ　に対して相補的である。

ＲＮＡ　（１４１より出発して成るｄｓＤＮＡ　ｆｉｌｌ／／（１３）の改めて の構築が行われる。アニーリング反応（５ｃ）においてその第２増幅プライマー （Ｒ４）　ｆ１３ａｌ　ｆ１３ｂｌがそのＲＮＡ　ｆ１４ｃｌ　にハイブリッド される。その反応混合物中に存在するＲＴによって反応（３ｂ）においてｄＮＴ Ｐｓのｆり用のもとにそのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ４１ｆ１３ａｌ　ｆ１３ｂｌ　 ｆ１３ｃｌ　ｆ１３ｄｌが合成される。

そのＲＴのＲＮアーゼＨ作用により、又は必要の場合追加的な添加されたＲＮア ーゼＨの作用によって反応（１２）においてそのｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２重体 からＲＮＡ　（１４１が、反応（５ｂ）において第１増幅プライマーｆＲ３１ｆ ｌｌａｌ　［１ｌｂｌ　［１１ｃｌ　のそのｃＤＮＡの［１３ｄｌ　へのアニー リングを起こすことができるまで分解される。そのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ ーゼの改めての作用により、そしてｄＮＴＰｓの利用のもとに反応（７）　にお いて再びｄ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｉｌｌ／／　ｆ１３１が生じ、このものから反 応（８ｂ）において成るＲＮＡポリメラーゼにより、そしてｒＮＴＰＳの利用の もとにその５ｓＲＮＡ　（１４１が合成される。

夏１覗当 その増幅過程からもたらされるｓ　ｓ　ＲＮ　Ａ　ｆ１４ａｌ　（１４ｂ）　（ １４ｃ）　ｆ１４ｄｌは後続の第３段階についての一般的に従って分析のために 用いられる。

衆形形盾 用いたすべての核酸の、非偏性として上げた官能性配列および官能基（Ｒ）は単 独で、又は可能な種々の組み合わせにおいて脱落することができる。そのＲＴプ ライマーの５゛末端に位置する官能性配列（２ａ）が欠落することはすべての変 形態様においてその５ｓＲＮＡ　（１０）のｆｌＯｄｌが欠落するいう結果をも たらす。これに対して、その第２ＤＮＡ連鎖のためのプライマーの５゛末端にお がれた官能性配列［変形型工における（６ａ）、変形型ＩＮ及びＩＩＩにおける 　（６ｃｌ　］の欠落することは、第２段階において合成される５ｓＲＮＡ　（ １０）の組成に関して何等の作用も持たない。第１増幅プライマーの（ｌｌａｌ 　が欠落することはその５ｓＲＮＡ　ｆ１４１の組成に対して何等の影響も持た ないが、一方そのｄｓＤＮＡ　ｆｉｌｌ／／（１３１から転写された５ｓＲＮＡ 　ｆ団におけるｆ１３ａｌ　が欠落した場合には配列（１４ｄｌ　が欠落する。

反応（４）　において（Ｒ１１の存在することが有利な場合がある。

そのテンプレート核酸の中で要素（１ｔ）と（１ｅ）との間に、その第２のＤＮ Ａ連鎖のためのプライマーにおいて（６ｄ）と（６ｅ）との間に、及び／又は第 ２増幅プライマーにおいて（ｌｌｂｌとｆｌｌｃｌ　との間に、それぞれ−個の 追加的なスペーサ要素を挿入することができる。

変形型ＩＩＩにおいてはテンプレート核酸（１）においてその３゛末端に入れら れた側面確定性配列（１ｈ）は任意の塩基配列を有することができる。これは天 然起源のＲＮＡ分子をテンプレート核酸ｆｉ＋　として用いることを可能にする 。

この基準から離れて、ある−個の官能性配列又はい（つかの官能性配列の一つの 組み合わせが一つよりも多い機能に用いられることができる。すなわちすべての 変形態様においてその第１増幅プライマーｆＲ３１ｆｌｌａｌ　ｆｌｌｂｌ　ｆ ｌｌｃｌがそのＲＴプライマーの機能をも行うことができる。（ｌｌｃｌによる ＲＴプライマーのアニーリングはその場合にそのテンプレート核酸（１）の（Ｉ Ｇ）のところで行われる。

そのＲＴプライマー及びその第１増幅プライマーのための種々の異なった分子を 用いることは他方においてそのＲ７反応に対してＲＮＡプライマーの使用を可能 にし、それによりこのＰＥＲ７分析法の感度及び／又は特異性に影響を与えるこ とができる。

この基準から離れて、種々異なった官能性配列に対して同一の塩基配列を使用す る可能性が存在し、その際これもホモポリマーであることができる。これはすべ ての変形態様においてそのテンプレート核酸（１）の側面画定性配列及びスペー ス配列について当てはまり、その際これらはホモポリマーであることができ、及 び／又は互いに同一であることができる。

もう一つの可能性として、第１段階において、両端にそれぞれ一個の官能性転写 プロモーターを備えている一個のｄｓＤＮＡ　（２１／／（６１を構築すること ができる。この場合には５ｓＲＮＡｓの異なった二つの種が作り出され、これら は部分的に重畳しており、そして反対向きのポラリティーを有している。

変形型ＩＩに基づいて、そのテンプレートＲＮＡに加えて一個のテンプレートＤ ＮＡを含む成るテンプレート核酸を使用することにより強く単純化した方法に達 することができる。あるテンプレート核酸（ｌｃ）　ｆｌｄｌ　（ｌｅｌ　（ｌ ｆｌ　ｆｌｇｌ　ｆｌｈｌを用い、その１（Ｉｄｌと、及び（１ｅ）の少な（と も最初の３つのヌクレオチドがＤＮＡよりなるが、残りの（１ｅ）及び（１ｆ） はＲＮＡよりなる。その他の官能性配列においてはそれらがＤＮＡよりなるかＲ ＮＡよりなるかは等価である。そのＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂ） を用いてそのＲ７反応において２重鎖の核酸が合成され、これはＰのｄ　ｓ　Ｄ 　Ｎ　Ａ　ｆｌｄｌ　／／　（２ｅｌの中に一個の官能性転写プロモーターを有 しており、これによってその第２段階において用いる反応混合物の中にその増加 されるべき核酸を加えた後でＲＮ　Ａ　（１０ａ）　（ｌｏｂｌ　ｆｉｎＣｌ　 （１０ｄｌを直接合成することができる。しかしながらこの変形態様においても そのテンプレート核酸を第２段階において用いた反応混合物の中に加えるに先立 って脱離しなければならない。

第１Ｏ図は成るレポーターゾンデを用いる増幅を示す。

第土伐諧 テンプレート／プライマー複合物、Ｒ７反応（３）及びその生成物は第３図にお けるそれらとすべての様相において同一である。反応（４）においてその存在し ているテンプレート核酸すなわちＲＮ　Ａ　（１１をそのアニーリング反応（５ ａ）において本来の反応物として前記のいくつかの方法の一つにより脱離させる 。そのｃＤＮＡに反応（５ａ）においてレポーターゾンデ（６）がハイブリッド される。これに対する各条件及び可能性はＰＳ−ＥＰ　０４０８２９５　におけ るそれと同じである。ＤＮＡレポーターゾンデまたはＲＮＡレポーターゾンデを 使用することができる。その前提条件は、そのレポーターゾンデ（６）のひとつ のハイブリッド化配列がそのｃＤＮＡ（２）のハイブリッド化配列（２ｄ）に対 して相補性を有し、そしてそれによってアニーリングがこれに行われるというこ とである。遅（ともこのレポーターゾンデ（６）のそのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ２１ へのハイブリッド化の後でこれを官能基（Ｒ１１によっであるキャリヤに結合さ せ、そして結合しなかったレポーターゾンデは第３図について記述したように、 変性しない条件のもとでその反応混合物から完全に除去する。もっとも遅（とも 反応しなかったレポーターゾンデを完全に洗浄除去した後で第８図について述べ たようにそのレポーターゾンデ（６）の少なくとも一部の増幅がＰＳ−ＥＰ　０ ４０８２９５に従い許容させるような反応条件を再び作り出す。この増幅の主生 成物として、ある５ｓＲＮＡが生ずるが、これは第８及び第９図についての記載 に従って分析される。

塞形聾拝 そのテンプレート核酸及びＲＴプライマーの選択に関して第３図について述べた それぞれのすべての可能性が該当する。しかしながら、テンプレート核酸も８丁 プライマーも、配列の相同性あるいはそのレポーターゾンデに対する配列の相補 性を持たないように注意しなければらない。ただひとつの例外はそのレポーター ゾンデのハイブリッド化に用いられる配列である。

ＲＮＡの最初の合成の効率を高める一つの可能性は、そのテンプレート核酸ｉｌ ＋のハイブリッド化配列（ｌｂｌが同時にある転写プロモーターのＰ（＋）−配 列を含むということよりなる。レポーターゾンデとしてはそのハイブリッド化配 列がその転写プロモーターのＰ（−）−配列である（２ｄ）のみならず（２ｅ） もハイブリッドするように形成されている核酸が用いられる。

この２重鎖になったハイブリッド化配列の上流においてこのレポーターゾンデは まず一個のスペーサ配列及びもう−個のハイブリッド化配列を含む。これら３つ の官能性配列はすべてＤＮＡよりなり、それによってこのレポーターゾンデのｃ ＤＮＡのハイブリッド化によっである転写プロモータが生じ、このものから出発 してＲＮＡポリメラーゼの添加のあとでその増加させるべき５ｓＲＮＡの合成が 行われる。

ネ　ＲＮＡに基づ（ｊ　−法を　いた　ＡのＰＥＲＴ　法の　み立てこのＰＥＲ Ｔ変法は一次複製ＲＮＡの増幅のために試験管内複製系を用いる。

その複製に必要なＲＮＡの官能性配列を、ここでバタテリオファージＱβの最も よく表わされている複製系の例について説明する。このＱβレプリカーゼのため のテンプレート核酸として用いるために、その−次ＲＮＡの３°末端はシチジン に冨んだ領域（定義によれば３−ＲＮＡ−ｏｒｉ　（＋）−配列１を有する必要 があり、これがＲＮＡ複写の開始に用いられる。この１次複写ＲＮＡの５゛末端 はグアニルに冨んだ配列〔定義により５”　ＯＲＩ　（−）−配列］を含む必要 があり、これはその相補的配列ではシチジンに富んだ領域であり、そして相補的 連鎖のＲＮＡ合成の開始をもたらす。その両端のそれぞれ複製開始配列の間に存 在するＲＮＡ区画はさらにもう一つのＮブレカーゼ結合ドメイン、すなわちその ＲＮＡＮプレカーゼの結合に必要な不連続配列要素を有する必要がある。このよ うな型のＲＮＡがＱβレプリカーゼ及びその必要なｒＮＴＰｓとの組み合わせに おいて反応混合物の中に存在することはそのＲＮＡ分子の１分間以下の倍増時間 での自触媒的増加をもたらす。このＱβ複製系に加えて同様に他のＲＮＡファー ジの複製系も同様に用いることができる。それらの例として、それらのみに限る ものではないが、ファージＭＳ２、ｆ２　及びＲ１７のそれををあげることがで きる。

このＢＥＲＴ分析法のこのような複製系への適合化は一方において次のようなテ ンプレート核酸すなわち複製ＲＮＳから導かれており、及び／又は塩基配列を少 なくともその１次複製ＲＮＡの中に流入させるような核酸であってこれが次に第 ２段階においであるＲＮＡＮブレカーゼによって増加されるようなテンプレート 核酸を用いることによって行うことができる。他方においてそのＲ７反応におい て合成されたｃＤＮＡを、あるレポーターゾンデによりその増加させるべき核酸 としである１次複製ＲＮＡを準備調整するために用いることもできる。以下の説 明的変形態様においては特記しない限り好ましくはテンプレート核酸として純粋 なＲＮＡが用いられる。

複製ＲＮＡより導かれているテンプレート核酸を用いる場合にはその第１段階に おいてまず少なくとも部分的に２重鎖になったＤＮＡが合成され、このものはあ る複写プロモーターに直接接続して複写ＲＮＡのすべての必要な官能性配列を含 む。この少なくとも部分的に２重鎖になったＤＮＡより出発して次にＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼにより第２段階においてこのＲＮＡに対応する複製系を用 いて増加されるような複製ＲＮＡが合成される。このテンプレート核酸配列及び プライマー配列の選択を次のように、すなわちその酵素反応の進行がその第１段 階において被検物の中に存在しているＲＴ活性がｃＤＮＡを、あるｃＤＮＡを合 成してしまったとき初めて増加させることのできるＲＮＡの合成をもたらすよう に行われる。第２段階においてそのテンプレート核酸の複製を、また従って誤っ たプラスの、あるいは誤ったマイナスの結果を（これは両方ともその増幅生成物 の種類や方法に従って可能である）不可能とするように注意しなければらない。

以下に上げる変形態様（第１１ないし１７図）、そのような反応原理に従ってＰ ＥＲＴＥ分析法が進行できるような多くの可能性を示すために上げる。

ＬＬ上区はそのようなＰＥＲＴＥ分析法の最初の可能な反応の進行を示す。後で のＲＮＡの合成及びその利用のために必要な各官能性配列はそのレプリカーゼ結 合ドメインを除いて５ｓＤＮＡＳによってＤＮＡの中に組み込まれる。その転写 プロモーター配列は、そのＲＴプライマーを介してそのｃＤＮＡの５°末端の近 傍に導入される。第１段階の最後に合成される１次複製系ＲＮＡはそのテンプレ ート核酸に対して反対向きのポラリティーを有する。

第上段層 あらかじめ用いられるテンプレート核酸ｆｉｌは下記のいくつかの官能性配列よ りなる：ハイブリッド配列（１ｂ）の、５゛末端の所の側面画定性配列（ｌａ） 、そのレプリカーゼ結合ドメイン（１ｄ）の２つのスペサ配列ｆｌｃｌまたはｆ ｌｅｌ、そのＲＴプライマーのアニーリングのための第２のハイブリッド化（１ ｆ）、及びその３゛末端における側面画定性配列ｆ１ｇｌである。側面画定性配 列（ｌａｌ及び（１ｇ）並びにスペサ配列（ｌｃｌ及び［ｔｅｌは非偏性である 。他のすべての配列は必要である。

あるｓ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂｌ　（２ｃｌ　（２ｄｌ　 ｆ２ｅｌ、中でもオリゴヌクレオチドＲＴプライマーの役目をする。この５ｓＤ ＮＡは（２ｂ）中に転写プロモーターのＰ（−）−配列を、そしてこれに引き続 いて５’−ｏｒｉ（−）−配列（２ｃ）及びその３゛末端の所の、そのテンプレ ート核酸（１）を（Ｉｆ）へハイブリッドさせるためのハイブリッド化配列（２ ｅ）を含む。（２ａ）及び（２ｄ）は側面画定性の又はスペサ用の配列である、 　（２ｂｌ、　（２ｃ）及び（２ｅ）は必要であり、（２ａ）および（２ｄ）は 普遍性である。（Ｒ１）も非偏性である。

その処理される被検物の中に含まれるＲＴ活性は、反応（３）において（Ｒ１１ ｆ２ａｌ（２ｂ）　（２ｃｌ　（２ｄ）　ｆ２ｅｌ　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌ　ｆ２ ｈｌ　ｆ２ｉ１　（２ｊｌを含むｃＤＮＡｆ２１　を合成する。このo ＥＲ７分析法を発揮するためにそのＲ７反応において少なくとも（２ｇ）までの 官能性配列を合成する必要がある。

この反応（３）から出てくる種々の核酸の混合物は反応（４）においてこれらの 成分のいずれも望ましくない管種でそれ以降の反応の最適の経過を阻害しないこ とを確実にできるように修飾させる。中でも、そのテンプレート核酸（１）及び ／又はそのテンプレート／プライマー複合物ｆｉｌ／／　（Ｒ１１（２ａｌ　（ ２ｂｌ　（２ｅ）　（２ｄｌ　［２ｅｌが第２のプライマー　（Ｒ２）　（６ａ ｌ　ｆ６ｂｌ　ｆ６ｃｌのそのｃＤＮＡ（２１へのハイブリッド化に競合するこ と及び第２段階においてそのＲＮ　Ａ　ｌ、ブリカーゼの、複写ＲＮ　Ａ　（９ １に変わってのその大過剰で存在するテンプレート核酸（１）への結合が起こる ことを阻止する必要がある。それらは両方とも検出の感度の低下あるいは誤った マイナスの結果を押さえ導く。このような理由から反応（４）においてＲＮＡか らなるそれらテンプレート核酸（１）を前述したいくつかの方法の一つによって 除去する。

反応（５）において第２のｓ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆＲ２１ｆ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　 （６ｃｌ、好ましくはオリゴヌクレオチドのアニーリングが行われる。このＤＮ Ａは必要な配列として５°末端に３°−ｏｒｉ（）配列（６ａ）及びその３°末 端にそのｃＤＮＡｆ２１を官能性配列（２１）にハイブリッドさせるためのハイ ブリッド化配列（６ｃ）を有している。スベサ配列（６ｂ）及び官能基（Ｒ２） が非偏性の様相である。反応（７）においであるＤＮＡポリメラーゼの作用によ り、そしてｄＮＴＰｓ利用のもとに連鎖（２）及び（６）よりなるｄｓＤＮＡが 合成され、その際［２ｂ）　／／　（６］の区画がそのＲＮＡポリメラーゼのた めの活性転写プロモーターである。遅くともこの時までに、第８図について記述 したように、ＲＮＡのそれ以下の反応における安定性を保証するような反応条件 を再び作り出す必要がある。その転写プロモータに相当するＲＮＡポリメラーゼ を添加した後でそれが必要なＲＮＴＰＳ利用のもとに反応（８）においてその増 加させべき核酸１次複製ＲＮ　Ａ　（９１が合成され、これはその選んだ複製系 における増加のために必要なすべての機能を有している。この場合にその各部分 （９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）及び（９ｇ）はそれぞれテンプレート 核酸の（１ｆ）、（ｌｅｌ、（１ｄ）、（１ｃ）及び（ｌｂｌに対して相補的で ある。

！Ｚ段部 層のＲＮ　Ａ　（９１は次にそのＲＮＡ複製系（ｌＯ）の中に入れられる。この 物は適当な緩衝液の中でそのＲＮＡの複製に必要なすべての酵素及びたとえばＲ ＮＴＰＳなどのような他の薬剤を含んでいる。この複製系の中でそのＲＮＡが増 加され、その際両方のポラリティの１重鎖のＲＮＡ分子が形成され、これは第３ 段階において適当な方法により検出される。

第１７図は、あとでのＲＮＡ合成及びその増幅に必要なすべての配列がそのテン プレート核酸の中に存在しているような場合の反応の進行を示す。その転写プロ モータ配列はここでもそのｃＤＮＡの５°末端の近傍に存在している。第１段階 １の最後に合成された１次複製ＲＮＡはそのテンブレー１−核酸に対して逆向き のポラリティを有する。

第上段層 用いるテンプレート核酸（１）は（ｌａｌ　（ＩＪ）の官能性配列を含んでいる 。一般的に該当する原理と異なって、ここで記述する変形態様においては官能性 配列（ｌｂｌまたは（６ａ）に２つの官能性が従属している。

第１１図のものと異なって、その用いたテンプレート核酸（１）はＲＮＡ転写及 びＲＮＡ？３［製に必要なすべての機能をコードする。（１ｂ）は３°−ＲＮＡ −ＯＲＩ（−）配列を含み、そして同時にハイブリッド化配列であって、その際 そのハイブリッド化に用いられる配列はその複製のために最小限必要なＲＮＡ− ＯＲＩ配列よりも長くてもよい。その前提条件は、ＲＮＡ−ＯＲＩ配列が（１ｂ ）の５゛末端を形成するということである。（ｌｃｌ、（ｌｅｌ及び（１１）は スペサ配列であり、ｆｌ）はそのレプリカーゼ結合ドメインであり、そして（１ ｆ）は５°−ＲＮＡ−ＯＲＩ　（＋）である。（Ｉｇｌは転写プロモータのＰ（ ＋）配列であり、そして（ＩｇｌはそのＲＴプライマーのためのハイブリッド化 配列である。（１ａ）及び（ｌｈｌは側面画定性配列である。その側面画定性配 列のみならずそのスペサ配列も非偏性である。残りのすべての官能性配列はこの 変形態様に必要である。

ＲＴプライマーｆＲ１１（２ａｌ　（２ｂｌは核酸であり、中でもＤＮＡオリゴ ヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、そして非偏性の官能基（ Ｒ１１、同様に省略できかつ、ハイブリッド化そしてハイブリッドしたい側面画 定性配列（２ａ）並びに（Ｉｇｌへのハイブリッドに用いられる必要なハイブリ ッド化配列（２ｂ）より成る。

その被検物の中に含まれているＲＴ活性は反応（３）において最大で官能性配列 （２ａｌ　（２ｂｌ　［２ｃｌ　（２ｄｌ　ｆ２ｅ）　ｆ２ｆ）　（２ｇｌ　（ ２ｈｌ　ｆ２ｉ１　（２ｊｌを含むｃＤＮＡを合成する。こ■o ＥＲ７分析法の機能の発揮のためにはそのＲ７反応において少なくとも（２１） までの官能性配列を合成しなければならない。

第１１図の場合と同様に反応（４）においてそのテンプレート核酸（１）分解さ れる。次に反応（５）においてＤＮＡオリゴヌクレオチド第２のプライマー（Ｒ ２１ｆ６ａｌのアニーリングが行われる。これは（２ｇ）に対して相補的なハイ ブリッド化配列（６ａ）よりなり、そしてその５°末端に３°−ＲＮＡ−ＯＲＩ 　（−）配列を含む。その官能基（Ｒ２）は非偏性である。

反応（７）において連鎖（２）及び（６）よりなるｄｓＤＮＡのＤＮＡポリメラ ーゼによる合成が開始される。さらに、最も遅くともこの時点までに第８図に記 載したように、そのＲＮＡのそれ以下における種々の反応での安定性を保証する ような反応条件が再び作り出される必要がある。次に反応（８）においてその転 写プロモータに対応するＲＮＡポリメラーゼによって１次複製ＲＮ　Ａ　（９１ の合成が行われる。この場合にその官能性配列（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、 （９ｄ）及び（９ｅ）はそれぞれテンプレート核酸の（１ｆ）、（１ｅ）、（１ ｄ）、（ｌｃｌ及び（ｌｂｌに対して相補的である。

第旦伐脂 このＲＮ　Ａ　ｆ９１は次にそのＲＮＡ複製系（１０）に加えられ、そしてその 中で増加され、その際両方のポラリティの１重鎖ＲＮＡ分子が形成され、これは 第３段階において適当な方法で確認される。

里土旦区は、そのテンプレート／プライマー複合物のもう一つの変形態様を示す 。そのＲＮＡ合成及びその増加のために必要な官能性配列はそのレプリカーゼ結 合ドメインを除いて再びもっばらオリゴヌクレオチドによってそのＤＮＡの中に 組み込まれる。しかしながらその転写プロモータ配列は第２プライマーを介して そのＤＮＡの中に導入される。第１段階の最後に合成される１次複製ＲＮＡはそ のテンプレート核酸と同じポラリティを有する。

！１穏当 用いられるテンプレート核酸（１１は下記の、この変形態様のそれぞれの機能発 現のために必要な官能性配列より成る：そのテンプレート核酸（１）の５°末端 におかれた（ｌａｌはハイブリッド化配列である。（ｌｃｌはレブリカーゼ結合 ドメインである。（ｌｅｌはそのそのＲＴプライマーのアニーリングに用いられ るハイブリッド化配列である。各スペサ配列（１ｂ）及びｆｌｄｌ並びに側面画 定性配列（ｌｆｌは非偏性である。

そのＲ７反応（３）のためのプライマーはｓ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ１１（２ａ ｌ　ｆ２ｂｌ　ｆ２ｃｌ、中でもオリゴヌクレオチドである。このものは［Ｒ１ １，３°−ＲＮＡ−ＯＲＩ　（−）配列（２ａ）、スペサ配列（２ｂ）及びその ３“末端の所の（１ｃ）に対して相補性のハイブリッド化配列（２ｃ）よりなる 。両方の配列（２ａ）及び（２ｂ）はこの方法に必要であり、その他の２つは省 略することができる。

その被検物の中に含まれているＲＴ活性は、反応（３）において（Ｒ１１（２ａ ｌ　（２ｂｌ　ｆ２ｃｌ　ｆ２ｄｌ　（２ｅｌ　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌの部分を含 むあるｃＤＮＡを合成する。このＰＥＲ７分析法の機能発揮のためにそのＲ７反 応において（２ｇ）までのすべての官能性配列が合成される必要がある。

第１１図の場合と同様に、反応（４）においてテンプレート核酸、ＲＮ　Ａ　ｆ ｉｌが分解される。この変形態様においてはＲＮＡを分解する別な理由としてそ のテンプレート核酸ｆｌ）がその遊離の形〔すなわちプライマー（２ａ）と結合 されていない形】においてＮプレカーゼ結合ドメイン（Ｉｇｌ及びその３°末端 の所に３°−ＲＮＡ−ＯＲＩ　（＋）配列（１１）の存在することによりそのＲ ＮＡＮプレカーゼに対する基質となるという事情による緩衝が表れる。反応（５ ）において次に、好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドの一つであるその第２プ ライマーｆＲ２１ｆ６ａｌ　ｆ６ｂ）のアニーリングが行われる。このものは、 （２ｆ）に対して相補的な必要ハイブリッド化配列（６ｂ）よりなり、そしてそ の５°末端に非偏性の側面画定性配列（６ａ）を含む。

その官能基（Ｒ２）も非偏性である。　。

反応（７）において各連鎖（２）及び（６）よりなるｄｓＤＮＡの合成がＤＮＡ ポリメラーゼによって行われる。更に第８図について記述したように、遅くとも この時点までにそのＲＮＡのそれ以降の諸反応における安定性を保証するような 反応条件を再び作り出す必要がある。転写反応（８）においてその増加されるべ き核酸である１次複写ＲＮＡの合成が行われる。この場合にその官能性配列（９ ａ）、各官能性配列（９ａ）、（９ｂ）、（９Ｃ）、（９ｄ）及び（９ｅ）はそ のテンプレート核酸のそれぞれ（１ｅ）、ｆｌｆｌ、（１ｇ）、（１ｈ）及び（ １１）と同一である。

員ス戊措 第１２図における１次複製ＲＮＡと同じ官能性配列を有しているその１次複製Ｒ Ｎ　Ａ　ｆ９１は第１２図におけると同様に増幅し、そして次に第３段階におい て検出される。

寒形悪橿 ある変形態様の枠内で非偏性として上げた各官能性配列及び官能基は個別に、又 は可能な種々の組み合わせにおいて欠落することができる。

第１１．１２．１３及び１４図に上げた変形態様はそれぞれ２つの可能な両極端 を表わすが、これはＮプレカーゼ結合ドメインを除いてそのＲＮＡ合成及びＲＮ Ａ複製に必要な官能性配列と同じ態様でそのｄｓＤＮＡの中に導入される。ここ ではその転写プロモータ配列もそのＲＮＡ−ｏｒｉ配列ももっばらその用いたオ リゴヌクレオチドの上に完全にコードされているか、又はそのテンプレート核酸 の上に完全にコードされている。この区別は必須ではな（て単に例示として理解 すべきである。種々の組み合わせを用いることももちろん可能である。その上に 、そのテンプレート核酸をある特定の必要な官能性配列の部分のみがその中に存 在し、そしてその欠落している部分はそれらプライマーの１つによって導入され るように構成する事も可能である。このような可能性はすべてレブリカーゼ結合 ドメインについても当てはまる。

また、第１１ないし１４図に指名したその各ハイブリッド化配列をそのＲＮＡ合 成及びＲＮＡ複製に必要な反応性配列と明確に分離することは強制的ではない。

あるハイブリッド化配列はＲＮＡ−ｏｒｉ配列とレブリカーゼ結合ドメインと転 写プロモータ配列と、あるいは又隣り合った２つのこのような官能性配列とも部 分的に重なり合うことができ、またはこれをその中に完全に含むことができ、あ るいは更に第１２図及び１４図においてその３°　ＲＮＡ−ｏｒｉ配列について 示しであるようにそれらの１つと同一であることができる。

すなわち例えば第１４図に上げた変形態様はその第２ＤＮＡ連鎖のためのプライ マーがハイブリッド化配列（６ｂ）として転写プロモータのＰ（−）−配列並び にそのｃＤＮＡに対して相補的な更に少なくとも３つのヌクレオチドを含むよう に単純に変形するができる。この場合にそのプライマーはそのｃＤＮＡの官能性 配列（２ｆ）とハイブリッドし、その際ＲＮＡポリメラーゼのためのある官能性 転写プロモータｆ６Ｂ）　／／　（２ｆｌとともに部分的ｄｓＤＮＡが生ずる。

その複製ＲＮ　Ａ　（９１は従ってこの部分２重鎮Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ２）　／／　 ｔ６１から合成（８）されることができる。それによってＤＮＡポリメラーゼ（ 力による２重鎖ＤＮＡの合成は省略することができる。

同様に、そのテンプレート核酸（１）の官能性配列（１ａ）・・・（ｌＣ）もも はや必要ではなくそして欠落することができる。

以上述べたように、そのテンプレートＲＮＡの他に一個のテンプレートＤＮＡを も含んでいるテンプレート核酸を用いることはある条件において有利な場合があ り、その際１次複製ＲＮＡの合成は極めて単純化される０例えばもし第１２図に 示したテンプレート核酸ｆｉ＋　においてその側面画定性配列（１１が除かれ、 ＤＮＡの中のｆｉｂ）　ｆｌｃｌ　ｆｌｄｌ　ｆｌｅｌ　（ｌｆｌ　ｆｌｇｌ及 びその残りの官能性配列の内に少なくともこの場合に必要な（１ｈ）がＲＮＡの 中に入れられた場合には（Ｉｇｌ　／／　ｆ２ｄｌの中にそのＲ７反応（３）に おいである官能性転写プロモータが生じ、このものから出発して対応するＤＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼ並びにその必要なｒＮＴＰＳを添加した後でｆ９ａｌ 　（９ｂ）　ｆ９ｃｌ　（９ｄｌ　ｆ９ｅｌの組成の１次複ＲＮ　Ａ　ｆ９１の 合成が行われる。もし第１４図に示したテンプレート核酸ｆｉｌにおいて転写プ ロモータ（１ｔ）の（Ｐ−）配列並びにその直接下流に続＜　（ｌｅｌの３つの 最初のヌクレオチドをＲＮＡの中に入れた場合には、そのＲ７反応（３）におい て同様に一個の官能性転写プロモータが生じ、これがその１次複製ＲＮ　Ａ　（ ９］の直接の合成を可能にし、これはそのｃＤＮＡ（２）の各官能性配列ｆ２ｅ ｌ　ｆ２ｄｌ　（２ｃｌ　（２ｂｌ　ｆ２ａｌに対して相補的に合成させる。こ の場合にそのｃＤＮＡｆ２１の種々異なった大きな量をＲＴプライマーの形で予 め入れたおくことができ、その際重要なことはそのテンプレート／プライマー複 合物がある複製ＲＮＡのすべての官能性配列を正しい配置において含んでいるこ と及びそのテンプレートＤＮＡとＲＴプライマーのためのハイブリッド化配列と の間に充分な長さのテンプレートＲＮＡ片が存在しているということである。

次に上げる各変形態様（１５ないし１７図）はそのＲ７反応（３）において合成 されたｃＤＮＡをそれ自信第２段階において増幅されるレポーターゾンデ（１５ 図）を選ぶか或いは又まず最初１次複製ＲＮＡを、これが引き続いて第２段階に おいて増幅されるに先立って合成するために用いられるレポーターゾンデ（第１ ６．１７図）を選ぶためだけにそのＲ７反応（３）において合成されたｃＤＮＡ を用いる。

第１Ｕはレポーターゾンデとしである複製ＲＮＡをその合成されたｃＤＮＡにハ イブリッド化させる変形態様を示す。結合しなかった複製ＲＮＡを洗浄除去した 後でその特異的に結合したＲＮＡをそのｃＤＮＡから離脱させて引き続いて増幅 する。

黒土段歯 テンプレート核酸＋１１の必要な非偏性官能性配列及びＲＴプライマー（Ｒ１１ ｆ２ａｌ　（２ｂ）もその官能基（Ｒ１）に対する要求条件並びに可能性も第３ 図に示したそれと同一である。他にはそのｃＤＮＡのハイブリッド化配列（２ｄ ）が単独でかつもっばらレポーターゾンデとして用いられたその複製ＲＮＡのハ イブリッド化配列と反応するという条件が該当する。そのテンプレート核酸＋１ １　ＲＴプライマー（Ｒ１１ｆ２ａｌ　ｆ２ｂ）またはそのｃＤＮＡ（２１のい かなる他の配列もそのレポーターゾンデとして用いた複製ＲＮＡと特異的な相互 作用をすることができてはならない。

そのＲ７反応（３）から得られた種々の核酸の混合物は反応（４）においてその 成分のいずれも中でもテンプレート核酸（１）及び／又はそのテンプレート／プ ライマー複合物もそれ以降のレポーターゾンデ（６）のそのｃＤＮＡ（２１との ハイブリッド化反応（５ａ）において特異的な競合物として表れることができる 。そしてそれによってその検出の感度を低下させたり、又は誤ったマイナスの結 果に導かないことを確かめるように修飾される。従って反応（４）においてその テンプレート核酸（１１は前述したいくつかの方法の１つによって除かれる。

テンプレート核酸ｆｉｌ除去のために分解的条件を用いた場合には、ここでもう 一度、第８図について記述したように、そのＲＮＡのそれ以降の諸反応における 安定性が保証されるような反応条件を作り出す必要がある。そのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 　（２１にまず最初反応（５ａ）においてレポーターゾンデ（６）として官能性 配列ｆ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　ｆ６ｃｌ（６ｄｌ　（６ｅｌ　（６ｄｌ　ｆ６ｇｌよ りなる完全な複製ＲＮＡをハイブリッドさせる。これらのうち（６ａ）は５°− ＲＮＡ−ｏｒｉ　（−）配列であり、（６ｂ）、（６ｄ）及び（６ｆ）はスペサ 配列であり（６ｃ）はそのｃＤＮＡの（２ｄ）にハイブリッドさせるためのハイ ブリッド化配列であり、（６ｅ）はレブリカーゼ結合ドメインであり、そして（ ６ｇ）はその３゜末端におかれた３°−ＲＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（＋）配列である 。（６ａ）、（６Ｃ）、（６ｅ）及び（６ｇ）はこの方法に必要であり、そして 各スベサ配列は非偏性である。

遅くともこのレポーターゾンデ（６）がそのｃＤＮＡｆ２１にアニーリングされ た後でそのｃＤＮＡを官能基（Ｒ１１によっであるキャリアに結合させ、そして 結合しなかったレポーターゾンデを変性しない条件のもとて完全にその混合物か ら除去する。激しく洗浄できるように、そのキャリアに結合されたｃＤＮＡ（２ １とレポーターゾンデ（６）との間に強い結合が必要である。これら両方の核酸 のハイブリッドイｌ二領域（２ｄ）又は（６ｄ）は従って充分な長さと適当な性 質とをもっている必要があり、そしそのレポーターゾンデ（６）のアニーリング は最適の反応条件のもとで行わなければならない。同様に、そのｃＤＮＡ（２１ のキャリアへの結合は保たれたままに止まることに注意しなければならない。

結合しなかったレポーターゾンデ（６）を完全に洗浄除去した後でその特異的に 結合した複製ＲＮ　Ａ　（６＋をそのｃＤＮＡ（２１から変性によって引きはず しく４ｂ）、そして第２段階において対応するＲＮＡ複製系の中で増幅し、次い で第３段階において適当な方法で検出する。

支ユ聾梯 そのレポーターゾンデのハイブリッド化配列（６Ｃ）はそのレプリカーゼ結合ド メインとほぼ一緒になって、ＲＮＡ−ｏｒｉ配列又は２つの隣り合った必要な官 能性配列と重なり合っておかれることができ、これらの配列の１つと同一である ことができ、あるいは又これらの１つ、但し特にＲＮＡ−ｏｒｉ配列ではないも のを完全にその中に含んでしまうことができる。

！上旦図は、第１段階において合成されたｃＤＮＡの検出に用いるレポーターゾ ンデをある複製ＲＮＡの合成に用いる変形態様を示す。

夏工段備 用いるテンプレート核酸（１）はその５°末端にハイブリッド化配列（ｌａ）を 含んでいる。このものは同時にある転写プロモータのＰ　（−１配列並びに５’ −ＲＮＡ−ｏｒｉ（＋）配列の少なくとも最初の３つのヌクレオチドを含んでい る。それに続いてスベサ配列ｆｌｂｌが存在する。ＲＴプライマー（ｌｃｌのた めのハイブリッド化配列及び側面画定性配列（１ｄ）が後続する。（ｌａｌ及び （ＩＣ）はこの変形態様の機能発揮のために必要であり、一方ｔｉｂ＋及び（ｌ ｄｌは欠落してもよい。そのＲＴプライマー−ｆＲｌｌ　ｆ２ａｌ　ｆ２ｂｌは 第３図に示したものと同一であるが、但しその官能基（Ｒ１１は今度はジ［偏性 であることが異なる。その他に、そのｃＤＮＡのハイブリッド化配列（２ｄ）が レポーターゾンデ（６）のハイブリッド化配列と単一かつ排他的に反応すること が要求される。ＲＴダブラ′マー（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂｌのテンプレート核 酸（１）またはそのｃＤＮＡｆ２１　を他のいかなる配列もそのレポーターゾン デとして用いた複製ＲＮＡと特異的な緩１１を起こすことをできないようにしな ければならない。レポーターゾンデ（６）はそれ自身ではそのＲＮＡポリメラー ゼに対する基質とはならないので、この変形態様ではテンプレートＲＮＡの除去 は不必要である。従ってそのｃＤＮＡ（２１にまず最初反応（５ａ）においてレ ポーターゾンデ（６）を部分ハイブリッド化させる。これは５ｓＤＮＡであり、 そして下記の各反応性配列を含んでいる：　（６ａｌは５°−ＲＮＡ−ｏｒｉ　 （−）配列であり、（６ｂ）及び（６ｄ）はスペサ配列であり、（６ｃ）はレプ リカーゼ結合ドメインであり、（６ｅ）は３°−ＲＮＡ−。

ｒｉ、（＋）配列であってその３゛末端の所の少なくとも３つのヌクレオチドに よってそのハイブリッド化配列に関与しており、（６ｆ）は転写プロモータのＰ （＋）−配列であって同時にそのハイブリッド化配列の１部分であり、そして（ ６ｇ）は側面画定性配列である。（６ａ）、（６ｃ）、（６ｅ）及び（６ｆ）は この方法に必要である。（６ｇ）、（６ｂ）及び（６ｄ）は非偏性である。レポ ーターゾンデ（６）のそのｃＤＮＡ（２１のハイブリッド化によって反応（５ａ ）において活性の転写プロモータ（２ｄｌ　／／　（６ｅ一部分的）（６ｆ）が 生じ、これによって反応（８）においてＲＮＡポリメラーゼにより、ｒＮＴＰＳ の利用のもとに１つの１次複製ＲＮ　Ａ　＋９１が合成される。

第λ部活においてその１次複製ＲＮＡは対応するＲＮＡ複製系の中で増幅され、 そして次に第３段階において適当な方法で検出される。

衆形聾梯 上に記述した種々の変形態様を次のようにすなわちハイブリッド化配列がレポー ターゾンデに対して転写プロモータのＰ　（４１−配列の下流に存在するように 修飾する可能性が存在する。そのテンプレート核酸のハイブリッド化配列（１ａ ）はこの場合にＲＮＡ−０ＲＩ　（＋）配列部分及び転写プロモータのＰ（−） −配列をまったく含まない。次に活性の転写プロモータの作成を追加的な５ｓＤ ＮＡオリゴヌクレオヂドのアニーリングによって達成し、その際このオリゴヌク レオヂドは転写プロモータ（６ｆ）のＰ（＋）−配列に対して相補的ないくつか の配列及びそのＲＮＡ−０ＲＩ　（＋）配列の少なくとも最初の３個のヌクレオ チドを含む。この場合にもう１つの変形としてそのテンプレート核酸（１）その ５°末端に１個の側面画定性配列を含むことができる。しかしながらこれがすべ ての場合に、最も遅くともそのレポーターゾンデ（６）がそのｃＤＮＡ（２１に アニーリングされた後でこれをあるキャリアに結合させ、そして過剰のレポータ ーゾンデの洗い落とす必要があり、そしてその後でそのＲＮＡを安定性を保証す るような反応条件を作り出す必要がある。

重上ヱ田はＲＴ活性によって形成されたｃＤＮＡの検出をＰＳ−Ｎｏ　９０８０ ３４４５に記述されているように、ある複製ＲＮＡの「スマートプローブ」によ り開始された合成を用いて行うこのＰＥＲＴ分析法の変形態様を示す。

筆↓伐脂 テンプレート核酸ｆｌ＋及びＲＴプライマー（Ｒ１１［２ａｌ　ｆ２ｂｌの必要 な、及び省略できる官能性配列もまた官能基（Ｒ１１についての種々の可能性や 要求条件についても第３図について上げたそれと同じである。その他には、その ｃＤＮＡのハイブリッド化配列（２ｄ）が単独でかつ排他的に、その「スマート プローブ」の特異的ハイブリッド化に対して定められた配列と反応するけれども 但しこの「スマートプローブ」の他の官能性配列やその複製ＲＮＡをコードする ５ｓＤＮＡ−レポーターゾンデのそれとは反応しないということが要求される。

テンプレート核酸（１）、ＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂｌあるいは そのｃＤＮＡ（２）のいかなる他の配列もその複製ＲＮＡの合成のために用いら れた両方の核酸の一方と特異的な緩衝を生ずることができないようにしなければ ならない。

第１５図について記述したのと同じ理由に基づき、そしてそれと同じ態様で、テ ンプレート核酸（１）を除去する（４）。その他の諸反応はその１次複製ＲＮＡ の合成に至るまでこの場合にはＰＳ−ＷＯ９０１０３４４５に開示されいる方法 に従いそのｃＤＮ１２１の中にだけ存在している配列（２）の検出によって行う 。反応（５ａ）においてはまず最初「スマートプローブ」（６）をそのＣＤＮＡ （２）の（２ｄ）に（２）、及びあるレポーターゾンデ（６°）にそれぞれハイ ブリッドさせる。この「スマートプローブ」は下記の各成分よりなる５ｓＤＮＡ である：５゛末端から進めて、このものはまず最初側面画定性配列（６ａ）、こ れに続いて転写ブローモータ（６ｂ）のＰ（＋１−配列が存在する。更にこれは それに後続して一個の中間配列（６Ｃ）、そのｃＤＮＡの（２ｄ）に対して相補 的な配列（６ｄ）及び第２の中間配列（６ｅ）を含んでいる。これに続いて同じ 転写プロモータのＰ（−）−配列（６ｆ）及びその３°末端の所のなお少なくと も３個のヌクレオチドを包含する配列（６ｇ）が存在している。それら２つの中 間配列（６ｂ）及び（６ｅ）は互いに相補的ではなく、そしてｃＤＮＡのハイブ リッド化配列（２ｄ）に対して相補的なハイブリッド化配列（６ｄ）をそれらプ ロモータ配列（６ｂ）及び（６ｆ）と隔てている。５ｓＤＮＡの１つであるレポ ーターゾンデ（６゛）はその官能性配列（６１°ｌ　（６ｈ’）　ｉ６ｇ’ｌ　 （６ｊ’ｌ　（６に’ｌの中に複製ＲＮＡについての情報を含んでおり、その際 （６に’ｌは３’　−ＲＮＡ−ｏｒｉ　（−）配列を、（６ｊ　’　ｌは非偏性 スベサ配列を（６ｙ’ｌはレプリカーゼ結合ドメインを（６１ｔ　’　ｌはもう １つの非偏性スペザ配列を（６ｇ’ｌ　−ＲＮＡ−ｏｒ　ｉ　（＋）配列を表わ し、そしである転写プロモータをＰ（＋）−配列が（６ｆ’ｌ配列の中に存在し ている。そのｃＤＮＡのグーゲット配列（２ｄ）が存在しない場合にその［スマ ートプローブ」はそれら両方の互いに相補的な転写プロモータ配列（６ｂ）及び （６ｆ）分子内ハイブリッド化により第１７図の左側に示すような幹／ループ構 造を２次構造として形成する。しかしながらもしこの「スマートプローブ」の（ ６ｄ）がｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋２１の（２ｄ）にハイブリッド化された場合にはそ の「スマートプローブ」の（６ｆ）及び（６ｇ）は（６ｆ’ｌ　、及び１重鎮の レポーターゾンデ（６°）の（６ｇ　’　ｌの部分へのハイブリッド化に利用で きるようになる。このハイブリッド化によって官能性転写プロモータ（６ｆｌ　 ｆ６ｇｌ／／ｆ６ｆ’ｌ　（６ｇ“の最初の３つのヌクレオチド）が生じ、そし て対応するＲＮＡポリメラーゼの添加及び必要なＲＮＤＥＰＤの添加の後でその １次複製ＲＮ　Ａ　（９１が合成させる（８）。

もしもそのテンプレート核酸ｆｉｌの反応（４）の除去のために分解的な条件を 用いた場合には、第８図について記述したように最も遅くともその１次複製ＲＮ Ａの合成のためにＲＮＡポリメラーゼを添加する直前までにそのＲＮＡのそれ以 降の反応における安定性を保証するような反応条件を再び作り出す必要がある。

そのＲＮＡポリメラーゼによって（８）において合成された１次複製ＲＮＡ（９ １は第２段階において対応するＲＮＡ複製系の中で増幅し、そして次に第３段階 において適当な方法において検出される。

レポーターゾンデを用いるすべての変形態様について、テンプレート核酸（１） の上、ＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂ）の上及びレポーターゾンデ（ ６）の上で非偏性として上げた官能性配列を単独的にまたは可能な種々の組み合 わせにおいて脱落させることができる。

ｕＤＲＡに基づくｊ　′２を　いた　ＡのＰＥＲＴ　ンの　み立てこのＰＥＲＴ 法においてはその被検物中のＲＴ活性の検出は、そのｃＤＮＡから導かれた少な くても部分的に２重鎖になったＤＮＡ又はｃＤＮＡ−テンプレート２重体の部分 をある試験内ＤＮＡ複製系を用いて増加させ、そして次に検出することにより行 われる。このような複製系の例はバクテリオファージΦ２９であり、これは蛋白 質ｐ２（ＤＮＡＮプレカーゼ）及びｐ３で（いわゆる末端蛋白質）、ｄＮＴＰｓ 及びある適当な緩衝系包含する。その複製されるべきＤＮＡは両端に１個のＤＮ Ａ−ｏｒｉを有し、これは最少で塩基対１２個の長さを有し、特定的で少なくと も部分的に２重になった連鎖のものである。末端蛋白質ｐ２はｄＡＴＰの存在の もとてそのＤＮＡ−ｏｒｉに共有結合的に結合しておりそれによってそのＤＮＡ Ｎプレカーゼはある蛋白質で開始させた（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｇｅｐｒｉｐｔ１反 応においてその複製を開始し、そしてこれをその複製されなかった連鎖の押しの けのもとに行う。

その増幅には他の、類似の原理で作動するＤＮＡ複製系も用いることもできる、 すなわち例として、但しそれに限るものではないが、バクテリオファージＭ２９ 、ＮｆまたはＣｐｌのそれ並びに真核性アデノウィルスが上げられよう。

このＰＥＲＴにおいては、その被検物の中に存在するＲＴ活性によりあるプライ マーを付したテンプレート核酸に基づいであるｃＤＮＡを合成する。特記しない 限りテンプレート核酸としては好ましくは純水のＲＮＡが用いられる。次にこの ｃＤＮＡより出発して少なくとも部分的に２重鎖になったＤＮＡを構築するが、 これは少なくともその一方の末端に１個のＤＮＡ−ｏｒｉを、そしてもう一方の 末端に少なくとも一個の、特定のＤＮＡ複製系のためのＤＮＡ−ｏｒｉ配列を備 えている。この１次複製ＤＮＡをその対応する複製系に添加したのち第２段階に おいてそのＤＮＡの何度も繰り返される複製系その増幅が行われる。その第３段 階においてこのｄｓＤＮＡを検出する。第１８ないし２０図にこの原理によって 行われるいくつかの変形態様を示す。他の増幅方法におけると同様にここでもそ のＲ７反応（３）において合成されるｃＤＮＡをもっばらその複製があるレポー ターＤＮＡより出発して開始されるようにするために用いるという可能性が存在 する。第２１及び２２図はこの可能性を説明する。

第１８図は、それら必要な官能性配列をそのＤＮＡ複製の後での開始のためにも っばらプライマーによってｄｓＤＮＡの中に組み込む最初の可能な反応形態を示 す。

！上段歯 用いられるテンプレート核酸（１）は下記の官能性より配列よりなる：その５゛ 末端の所の１個の側面画定性配列［１１，１個のハイブリッド化配列＋ｌｂｌ、 １個のスペサ配列（１ｃ）、そのＲＴプライマーをアニーリングするための１個 の第２のハイブリッド化配列（１ｇ）及びその３′末端の所のもう１個の側面画 定性配列＋１１である。ｆｌａｔ及び（１ｅ）は非偏性であり、その他のすべて の配列は必要配列である。

そのＲＴプライマー（Ｒ１１ｆ２ａｌ　（２ｂｌ　ｆ２ｃｌは５ｓＤＮＡであり 、好ましくはオリゴヌクレオチドである。このものは（２ａ）の中に１個のＤＮ Ａ−ｏｒｉ　（−）配列、それに後続して１個のスペサ配列（２ｂ）及びその３ ゛末端にそのテンプレート核酸ｆｉｌの［１ｄｌへのハイブリッド化のための１ 個のハイブリッド化配列（２Ｃ）を含んでいる。　（２ａ）及び（２Ｃ）は必要 であり、（２ｂ）及びｆＲｌｌは非偏性である。その処理される被検物の中に含 まれているＲＴ活性は反応（３）においてｆＲｌｌ　［２ａｌ　ｆ２ｂｌ　ｆ２ ｃ）　（２ｄｌ（２ｅｌ　ｆ２ｆｌの組成のｃ　ｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１を合成 する。このＰＥＲ７分析法の機能発揮のためにはそのＲ７反応において少なくと も（２ｅ）までの官能性配列を合成しなければならない。

反応（３）より得られる、反応しなかったテンプレート／プライマー複合物（１ ）／／　ｆＲｌｌ　ｆ２ａ）　ｆ２ｂｌ　（２ｃｌ　、遊離のプライマー分子ｆ Ｒ１１（２ａｌ　ｆ２ｂｌ　ｆ２ｃ）、プライマーのついていないテンプレート 核酸分子（１１及びｃＤＮＡ−テンプレート２重体分子（１１／／１２１よりな る核酸の混合物は反応（４）において、これらの成分のいずれもがそれ以降の諸 反応の最適の進行を望ましくない態様で緩衝しないということが確認されるよう に修飾される。特にその大量に存在するテンプレート核ｒｊ１（１）及び／又は そのテンプレート／プライマー複合物ｆｉｔ　／／ＩＲＩＩ　（２ａｌ　（２ｂ ｌ　ｆ２ｃｌがその第２のオリゴヌクレオチドブライマーｆＲ２１ｆ６ａｌ　ｆ ６ｂｌ　ｆ６ｃ）のそのｃＤＮＡ（２１へのハイブリッド化（５）と競い合うこ とを防止しなければならない。これは検出の感度の低下又は誤ったマイナスの結 果にさえ導（。

従って、反応（４）においてその存在するテンブート核酸すなわちＲＮＡｆｌ＋ をそのアニーリング反応において本来の反応物として除去することが必要である 。

最高の感度に到達すべきでないときは、その反応混合物からのそのテンプレート 核酸の除去を省略してもよい。

反応（５）において第２の５ｓＤＮＡ−プライマー、もしくはオリゴヌクレオチ ドのアニーリングが行われる。このプライマーは必要な配列としてその５°末端 に１個ＤＮＡ−ｏｒｉ　（−）配列（６ａ）及びその３°末端にそのｃＤＮＡ　 （２１の（２）へのハイブリッド化のために１個のハイブリッド化配列（６Ｃ） を含んでいる。

スペーサ配列（６ｂ）及び官能基ｔ６ｂｌ　（Ｒ２１は非偏性である。反応（力 においであるＤＮＡ依存性ポリメラーゼの作用によって、それによりｄＮＴＰｓ の利用のもとに連鎖（２）及び（６）よりなる部分的に２重鎖になったＤＮＡが 合成される。

員Ｚ玖朧 両端にそれぞれ１個のＤＮＡ−ｏｒｉ配列を備えているその平行２重鎖のＤＮＡ 　［２）　／／　（６１は１次複製ＤＮＡであり、そして対応する複製ＤＡＮの 中に加えられる。この複製系のＤＮＡＮプレカーゼ（８）作用によってその活性 の２重鎖ＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（２ａ　／／（６ｇｌ　に出発して複製によって 安全に２重鎖のＤＮＡ生成物（Ｒ２）＋６）／／＋２１が生ずる。この場合にそ のＤＮＡＮプレカーゼの連鎖分離活性によってそのｆＲｌｌを備えたｃＤＮＡ（ ２１が遊離される。２個の活性ＤＮＡ−ｏｒｉ、すなわちｆ２ａｌ　／／　ｆ６ ｇｌ及び［６ａｌ　／／　（６ａ　’　ｌを有する２重鎖ＤＮＡ生成物ｆ８２１ 　Ｆ６１／／（２１は次に何度も繰り返される複製（８）によって増幅される。

工λ段部 上記の複製反応の生成物としてｄｓＤＮＡｆ６１／／ｆ２１が、これは適当な方 法で検出される。

五形慧梯 テンプレート核酸（１）の不必要としてあげた官能性配列及び官能基並びにオリ ゴヌクレオチドブライマー（Ｒ１１［２ａ）　（２ｂ）　ｆ２ｃｌ及びｆ２ｄ） 　ｆＲ２１ｆ６ａ）　（６ｂｌ　ｆ６ｃｌは単独で又は可能な種々の組み合わせ において脱落することができる。

それぞれの官能性配列の中の異なった液配列の原理と離れて、そのテンブレー１ ｍ酸（１）の側面画定性配列（１）及び＋ｌｂｌ並びにスペサ配列（ＩＣ）及び そのプライマーのスベサ配列（２ｂ）及び（６ｂ）を単独で、又は組み合わせて 、これがこの試験の品行をいかなる態様においてでも緩衝しないという条件前提 条件のもとに同一に形成することが可能である。またそのオリゴヌクレオチドブ ライマーのハイブリッド化配列（２ｃ）及び（６ｃ）が［また従ってそのテンプ レート核酸のハイブリッド化配列（１ｂ）及びｆｌｄｌの］同一の、但しそれら の側面画定性配列及びスペサ配列については異なっているＤＮＡ配列を有するこ とも可能である。

！ＬＬｕは、後でのＤＮＡ複製の為に必要なりＮＡ−ｏｒｉ配列がそのテンプレ ート格差の中に既に完全にコードされて存在している反応の形態を示す。

用いるテンプレート核酸（１）は下記の各官能性性配列よりなる：その５゛末端 の所の１個のハイブリッド化配列（１ａ）、１個のスペサ配列（１ｂ）、そのＲ Ｔプライマーのアニーリングの為の１個のハイブリッド化配列（ＩＣ）、及びそ の３°末端の所の１個の側面確定性配列（１ｂ）である。両方のハイブリッド化 配列（ｌａｌ　（ｌｃｌはさらにそのＤＮＡ複製の為に２個のＤＮＡ−ｏｒｉ配 列を次のようにコードする：即ち（１ａ）はその５゛末端の所に１個のＤＮＡ− ｏｒｉ　（−）配列を、そしてハイブリッド化配列（１ｄ）はその３°末端の所 に１個のＤＮＡ−ｏｒｉ　（＋）配列を含んでいる。その側面画定性配列（ｌｄ ｌは非偏性でありそして他の全ての配列は必要配列である。

そのＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａｌはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。この ものは１個の必要ハイブリッド化配列（２ａ）を含み、これは同時にＤＮＡ−ｏ ｒｉ　（−）配列であってそのテンプレート核酸＋１１の（ｌｄｌへのハイブリ ッド化のために用いられる（Ｒ１１は非偏性である。

その処理される被検物の中に含まれているＲＴ活性は反応（３）においてｆＲｌ ｌ　ｆ２ａｌ　（２ｂｌ　ｆ２ｃｌの組成の１個のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋２１を合 成する。このＰＥＲ７分析法の機能発揮のためにはそのＲ７反応（３）において 少なくとも（２Ｃ）までの官能性配列を合成する必要がある。第１８図に示した と同じ理由から、存在するテンプレート核酸すなわちＲＮＡ（１１を前に述べた ようにそのアニーリング反応（５）の本来の反応物として除去することが必要で ある。最大の感度に到達する必要のない時は、場合によってはそのテンプレート 核酸のその反応混合物からの除去を省略してもよい。次に反応（５）において第 ２のＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマーのアニーリングが行われる。このプラ イマーはそのｃＤＮＡ（２］の（２Ｃ）へのハイブリッド化のための必要ハイブ リッド化配列（６ａ）を含んでいる。（６ａ）は同時にＤＮＡ−ｏｒｉ（）配列 でもある。（Ｒ２）は非偏性である。そのオリゴヌクレオチド（６ａ）のアニー リングによって１個の活性ＤＮＡ−０ｒ　ｉ　ｆ２ｃ）／／ｆ６ａｌを有する１ 次複製ＤＮＡが生ずる。このものはその増加されるべき核酸である。

気ス凰惑 両端に１個のＤＮＡ−ｏｒｉ配列を有しているその平行２重鎮のＤ　Ｎ　Ａ　ｆ Ｒｌｌ　ｆ２）／／（６ａｌは対応する増幅系の中に加えられる。その複製系の ＤＮＡＮブレカーゼ（８）の作用によってまず完全に２重鎖のＤ　Ｎ　Ａ　（Ｒ １１ｆ２１　／／　ｆ６１が生ずる。この２つの活性ＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　ｆ２ ａ）／／（６ｃｌ及びｆ６ａｌ　／／　ｆ２ｅ）を有する２重鎖の、（Ｒ１）を 有するＤ　Ｎ　Ａ　ｆ２１　／／　ｆ６１は次に繰り返し行われる複製（８）に よって増幅される。

第旦伐脂 生成物としてｄｓＤＮＡｆ６）／／（２１が生じ、これは適当な方法で検出され る。

塞形嬰径 そのテンプレート核酸（１）の不必要として上げた側面画定性配列（１ｂ）も欠 落することができる。

それぞれの官能性配列の中の異なった塩基配列という原理から離れて、そのテン ブレー１〜核Ｍ（１１の側面画定性配列（１ｄ）及びスペサ配列（ｌｃ）を、こ れがこの試験の進行をいかなる対応においても緩衝しないという前提条件のもと に同一に形成することが可能である。

この記述した変形態様においてその最低限必要なりＮＡ−０ｒｉ（−）配列を包 含する２つのプライマー（Ｒ１１［２ａ）及び（６ａ）はそれらがその３°末端 においてこれらよりも短いように或いはそれらがこの最少のＤＮＡ−ｏｒｉ　（ −）配列の３°末端を超えて延び出すように変形することができる。

そのｃＤＮＡ（２１もこの変形態様において複製ＤＮＡの１つであり、その際あ る「斡／ループ」構造を形成してその両方のＤＮＡ−ｏｒｉ配列（２ｃｌ　（２ ａｌが互いにハイブリッドイ［ルである官能的ＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　（２ａ）／ ／１２ｃｌを形成する。そのオリゴヌクレオチド（６ａ）の添加は従って省略す ることができる。いずれにしてもそれによって最初のＤ　Ｎ　Ａ複製の効率は低 下することになる。

筆λ旦区は、プライマーとしてそしてそのＤＮＡ−ｏｒｉ配列の導入のために１ 重鎖のオリゴヌクレオチドの変わりに種々のアダプターを用いる変形態様な示す 。

第上伐穫 その用いるテンプレート核酸（１）は下記の官能性配列よりなるすなわち５゛末 端の所の側面画定性配列よりなる：すなわちその５°末端の所の１個の側面画定 性配列（１ａ）、１個のハイブリッド化配列（１ｂ）、１個のスベサ配列（ＩＣ ）、そのＲＴプライマー（Ｒ１１ｆ２ａｌ　ｆ２ｂｌ　（２ｃｌをアニーリング のための第２のハイブリッド化配列＋ｌｄｌ及びその３°末端の所の１個の側面 画定性配列ｆｉｅ）である、　（ｌａ）及び（１ｂ）は非偏性である。他のすべ ての官能性配列は必要配列である。

そのＲＴプライマー（Ｒ］、）　ｆｏａｌ　ｆ２ｂｌ　ｆ２ｅｌ　／／　（６ｇ ｌはい（つかの部分よりなるアダプターであり、そしてＤＮＡ−オリゴヌクレオ チド（Ｒ１１（２ａｌ　（２ｂｌ　（２ｃ）よりなりこのものはその（２ａ）ハ イブリッド化されている第２のオリゴヌクレオチド（６ｇ）と共に平行２重鎖の ＤＮＡを形成する。このアダプターはその３゛末端にハイブリッド化配列（２ｃ ）を含むが、これはそのテンプレート核酸（１）の（１ｄ）とハイブリッドされ ている。これに引き続いて１個のスペサ配列（２ｂ）が存在し、これには１個の ＤＮＡ−ｏｒｉ（−）配列（２ａ）が後続している。そのオリゴヌクレオチド（ ６ｇ）は（２ａ）に対して相補性のＤＮＡ−ｏｒｉ　（＋）配列を含んでいる。

官能性配列（２ａ）及び（２ｃ）は必要配列であり、その残余及びｆＲｌｌは非 偏性である。

第２の、そのテンプレート核酸（１１のハイブリッド化配列（１ｂ）にハイブリ ッドしているアダプターｆ２ｅｌ　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌ／／　（Ｒ２１（６ａ） はＤＮＡオリゴヌクレオチド（２ｅｌ　（２ｆ）　（２ｇｌ及び（Ｒ２１（６ａ ｌよりなり、その際そのオリゴヌクレオチドｆ２ｅ）　（２ｆ）　ｆ２ｇｌはそ の５′末端においてホスホリル化されている。（２ｅ）は（１ｂ）へのハイブリ ッドのために用いられるハイブリッド化配列を含んでいる。（２ｆ）はスベサ配 列であり、（２ｇ）は１個のｄＤＮＡ−ｏｒｉ　（＋）配列であってこれは同時 にハイブリッド化配列である。　ｆ２ｇｌにそのＤＮＡオリゴヌクレオチド（６ ａ）が部分ハイブレッド化されており、このものは（２ｇ）に対して相穂性のＤ ＮＡ−ｏｒｉ　（−）配列を含んでいる。スベサ配列（２ｆ）は非偏性であり、 他のすべての配列はこの試験に必要である。非偏性の要素としてそのオリゴヌク レオチド（６ａ）は又１個の官能基（Ｒ２）を有している。その処理される被検 物の中に含まれているＲＴ活性は反応（３）においてｆＲｌｌ　ｆ２ａｌ　（２ ｂｌ　ｆ２ｃｌ　（２ｄ）／／　ｔ６ｇ１組成の１個のｃＤＮＡ（２１を合成し 、このものはそのテンプし・−１・核酸（１）と共に平行なｃＤＮＡ／テンプレ ート２重体ｆ２１／／（ｌｌ／／の形で存在し、そしてそのテンプ１／−ト核酸 （１）のハイブリッド化配列（ｌｌ））にハイブリッド化されている第２のアダ プターｆ２ｅｌ　ｆ２ｆ）　（２ｇｌ／／　ｆＲ２１（６ａ）の５゛末端とただ １個のニックによってのみ隔てらねている。反応（１１）においてそれぞれ１個 のニックにより互いに隔てられている２つのＤＮＡ連鎖すなわちそのｃＤＮＡの （２ａｌ　（２ｂｌ　（２ｃ）　（２ｄｌとその第２のアダプターの（２ｅｌ　 ｆ２ｆｌ　ｆ２ｇｌとはｒｌＮＡ／ＲＮＡヘテロ２重体の基質の上でも活性であ るＤＮＡリアーゼで例え１ｆＴ４−ＤＮＡリアーゼによって結合されて１個の連 なったＤＮＡ分子になる。

反応（４）においてその存在するテンプレート核酸、すなわぢＲＮＡ（１１は引 き続く増幅反応の前に除去される。最大の感度に達することが必要でない時は場 合によりそのＲＮＡの反応混合物からの除去も省略することができる。ＲＮＡの 除去は必要であり、というのは第２段階においてその複製系の中に存在するＤＮ Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼの連鎖分離活性によってそれぞれ１重鎖のＤＮＡ分 子ｔ２ａｌ　ｆ２ｂ）　（２ｅｌ　（２ｄ）　（２ｅｌ　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌが 生じこれがそれら両方の相補性をＤＮＡ−ｏｒｉ配列（２ａ）及び（２ｇ）の分 子内ハイブリッド化によって１個の官能性ＤＮＡ−ｏｒｉを形成し、これがその 複製系によってその１重鎖分子（２）をｄｓＤＮＡ（２１／／８６）へ移行させ るために利用されるからである。このテンプレート核酸ｆｉｌはその反応混合物 中に大量に存在するので、その部分的に相補性の５ｓＤＮＡ分子（２）とハイブ リッドすることができ、そして官能性のＤＮＡ−ｏｒｆの効率的増幅に必要な分 子内での形成に障害をもたらしつる。

皐λ伐脂 両端にそれぞれ１個の２重鎖のＤＮＡ−ｏｒｉ配列を含んでいてその他の部分は １重鎖であるそのＤ　Ｎ　Ａ　（６ｇｌ／／　ｆＲ１９（２ａｌ　（２ｂｌ　ｆ ２ｃｌ　（２ｄｌ　（２ｅｌ　ｆ２ｆｌ　ｆ２ｇｌ　／／@ｆＲ２）　ｆ６ａｌ は１次複製ＤＮＡであり、そして対応する増幅系の中に加えられる。この増幅系 のＤＮＡＮブレカーゼ（８）の作用によって（Ｒ１）及び（Ｒ２）を含んだ完全 に１重鎖のＤ　Ｎ　Ａ　ｆ６１　／／　ｆ２＋が生ずる。このものはその両端に ２個の活性のＤＮＡ−ｏｒｆ［６ａｌ　／／　（２ｇｌ及びｆ２ａｌ　／／　ｆ ６ｇｌを含んでおり、次に繰り返し行われる複製によって増幅される。

！旦段脂 増幅反応の生成物としてｄｓＤＮＡ（６１／／ｆ２１が生じこれが適当な方法に よって検出される。

変形態様 そのテンプレート核酸（１）及びそれらアダプターｆＲ１１ｆ２ａｌ　（２ｂｌ 　ｆ２ｃ）／／　（６ａｌ及び（２ｅ）　（２ｆｌ　ｆ２ｇｌ／／（６ａｌの非 偏性として上げた各官能性配列及び各官能基は単独に又は可能な種々異なった組 み合わせにおいて脱落することができる。

各官能性配列の中の１個の異なった塩基配列という原理から離れてそのテンプレ ート核酸＋１１の側面画定性配列（ｌａｌ及びスベサ配列（１ｃ）及びそれらア ダプターのスベサ配列（２ｂｌ　（２ａ）それらがこの試験の進行にいかなる態 様においても緩衝をもたらさないという前提条件のもとで単独で又はある組み合 わせにおいて同一に形成することが可能である。

ここに記載する変形態様においてＤＮＡ−ｏｒｉ配列のそれと定義される２つの アダプターと両方の短い方のオリゴヌクレオチド（６ａ）および（６ｇ）の長さ は３゜末端においてその　最小ＤＮＡ−ｏｒｉよりも短くても長くてもよい。

１重鎖のオリゴヌクレオチドブライマーを用い、そしていくつかのアダプターを 用いる各変形態様における違いは強制的なものではない。第１８ないし２０図に 示した各変形態様のそれぞれの合理的混合形態を破棄することも全（可能である 。

同様に、第１８ないし２０図について記述した、官能性配列あたりただ１個の機 能を従属させることもこのＰＲＴ分析法にとって強制的ではない。１個のハイブ リッド化配列は、第１９図にハイブリッド化配列およびＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　ｆ −１配列並びにＤＮＡ−ｏｒｉ　（＋１配列にって記述したように、他のもう一 つの官能性配列と完全に重複し、または完全にその中に包含させ、あるいはそれ と同一であることができる。上述したように、テンプレートＲＮＡの他に１個の テンブレー１−ＤＮＡをも含んでいるようなテンプレート核酸（１１の使用はあ る特定の場合に有利であり、その際−次複製ＤＮＡの合成が強（単純化される。

たとえば第１９図に示したテンプレート（１）においてＤＮＡの中のＤＮＡ−ｏ ｒｉｆ−１配列［１ａｌをＲＮＡに変えて用いた場合にには、ＲＴ反応（３）の 結果としである活性のＤＮＡ−ｏｒｉ（２ｃｌ−ｆｌａ）を含んだ一次複製ＤＮ Ａが生ずる。このものはその増加されるべき核酸であり、そして対応的な複製形 において直接増加させることができる。

第２１および２２図にあげた変形態様はテンプレート核酸として再び好ましくあ る純粋なＲＮＡを用る。ここではそのＲＴ活性によって合成されたｃＤＮＡはあ る部分的に相補性のレポーターゾンデの特異的な部分的ハイブリッド化のために のみ用いられ、これはそれ自身第２段階において増幅される（第２１図）か、ま たはこれはその存在を引き続いて検出されるような目的ＤＮＡとして用いられる （第２２図）。

第２１図は、レポーターゾンデとして第２段階において増幅反応のために直接基 質を形成するような一次複製ＤＮＡを用いる反応形態を示す。

第１段階 テンプレート核酸（１）およびＲＴプライマー（Ｒ１１［２ａｌ　ｆ２ｂｌの不 可欠及び欠落できない、欠落できる官能性配列も、（Ｒ１１についての種々の可 能性や要求条件についても第３図に示したそれと同一である。その他に、そのｃ ＤＮＡのハイブリッド化配列（２ｄ）がそのレポーターゾンデとして用いられる ＤＮＡの、その特異的なハイブリッド化に対して定められた配列と単独でかつ独 占的に反応することが必要である。

そのＲ７反応（３）からでてくる種々の核酸の混合物は反応（４）において、そ のレポーターゾンデ（６）のｃＤＮＡｆ２１のハイブリッド化反応（５）におい ていかなる核酸も特異的な競合物として現れてそれによりその検出の感度を低下 させまたは誤ったマイナスの結果をすら招くことがないのを確かめるように修飾 される。

したがって反応（４）　においてそのテンプレート核酸（１）は前に上げたい（ つかの方法の一つによって除かれる。その非Ｄ　Ｎ　Ａ　（２１にまず反応（５ ａ）においてレポーターゾンデ（６）−（９ａｌ　として−次複製ＤＮＡが部分 的にハイブリッドされる。このレポーターゾンデｆ６１−（９ａｌは下記の官能 性配列を含んでいる：　（６ａｌはＤＮＡ−ｏｒｉ（−１配列である。（６ｂ） は（６ａ）をその非ＤＮＡの（２ｄ）の特異的なハイブリッド化のために用いら れるハイブリッド化配列（６Ｃ）と隔てているスペーサ配列を表す。（６ｄ）は 第２のスペーサ配列である。その３゛末端に置かれた（６ｅ）はＤＮＡ−ｏｒｉ （＋ｌ配列である。（９ａ）は（６ｅ）とハイブリッドされるＤＮＡオリゴヌク レオチドであってこれはハイブリッド化配列であって同時にＤＮＡ−ｏｒ　ｉ　 ｆ−１配列よりなる。スペーサ配列＋６ｂｉ　ｔ６ｄｌは非偏性であり、その他 のすべての配列はこのＰＥＲ７分析法の機能発揮にとって必要である。

レポーターゾンデ（６１−（９ａｌのｃＤＮＡｆ２１のアニーリングの後で結合 しなかったレポーターゾンデは第３図に記載したように非個性的条件のもとでそ の反応混合物から完全にに除去される。

第２段階 ｃＤＮＡ（２１のっその部分ハイブリッドされるレポーターゾンデとの複合物（ Ｒ１）　＋２１−−　＋６１−−　（９ａｌは第２段階における複製のための基 質であり、その際そのレポーターゾンデ（６１−（９ａｌはその増加されるべき 核酸である。その複製形のＤＮＡＮプレカーゼ（８）の作用によって完全２重鎖 のＤ　Ｎ　Ａ　（６１−（９１が生じ、そしてそのＤＮＡＮブレカーゼの連鎖分 離活性によってそのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｒ１１（２１は遊離される。そのｄｓＤ ＮＡ（６）−（９１は次に何度も複製（８）によって増幅される。

第３段階 その増幅主生成物ｄ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（６１−（９１であり、これは適当な方 法で検出される変形態様 テンプレート核酸（１１の、ＲＴプライマー（Ｒ１１（２ａ）　ｆ２ｂｌの、お よびレポーターゾンデ（６１−（９＋の非偏性として上げた各官能性配列および 官能基は単独で、または可能な種々の組み合わせにおいて脱落することができる 。

テンプレート核酸はレポータゾンデのための多数のハイブリッド化配列（ｌｂｌ およびまたはＲＴプライマーのための多数のハイブリッド化配列（１ｄ）を含む ことができる。

Ｒ７反応のためのプライマーはＤＮＡの１つであるか、ＲＮＡであるか、さらに はまた両方の部分との組み合わせであることができる。

レポーターゾンデに部分ハイブリッドされるオリゴヌクレオチド（９ａ）はその 長さにおいて変化することができる。これは最小限そのＤＮＡ−ｏｒｉ配列の最 初の６個のヌクレオチドを含む必要があるが、ただしその３゛末端において長さ がより長くてもよく、それによってこれは（６ｄ）に対して相互的な追加的いく つかの塩基を含む。このオリゴヌクレオチド（９ａ）の長さは、そのＤＮＡ＋６ １への結合の安定性がその結合しなかったレポーターゾンデｆ６１−ｆ９ａｌの 洗浄除去に際しても維持されたままに留まるほどに大きいように選ばなければな らない。

レポーターゾンデとしてＤ　Ｎ　Ａ　ｉ６１のみをそのｃＤＮＡにハイブリッド させ、そしてそのオリゴヌクレオチド（９ａ）が結合しなかった（６）の洗浄除 去の後で初めてもう１つのアニーリング反応においてそのＤＮＡ＋６１に付加さ れるように一次複製ＤＮＡを作り出すことも可能である。

１個の官能性配列の中にただ１つの機能が従属するという原理と異なって、その ＤＮＡ−ｏｒｉ配列（６ａ）をレポーターゾンデｆ６）−（９ａｌをそのｃＤＮ Ａ（２１にハイブリッドさせるのに用いたハイブリッド化配列の中に部分的に、 または完全に組み込むことも可能である。この場合にはスペーサ配列（６ｂ）は 欠落する。レポーターゾンデの上に少なくとも１つ以上のスペーサ配列が存在す ることはこの場合にいずれにしても必要である。

各官能性配列の中の１個の異なった塩基配列という原理と異なって、テンプレー ト核酸（１）、プライマー（Ｒ１１（２ａｌ　ｆ２ｂｌの、およびレポーターゾ ンデ（６１−（９ａｌのそれぞれの側面画定性配列およびスペーサ配列を、この 試験の進行にいかなる対応においても緩衝を及ぼさないという前提条件のもとて 個別に、またはすべての可能な組み合わせにおいて同一に形成することも可能で ある。

第２２図は、そのｃＤＮＡのハイブリッド化のためにＤＮＡレポーターゾンデを 用い、ここから出発して一次複製ＤＮＡを合成する変形態様を示す。

第１段階 テンプレート核酸＋１１およびＲＴプライマーｆＲ１１ｆ２ａｌ　ｆ２ｂｌの必 要な、および欠落してもよい各官能性配列のみならず（Ｒ１１についての種々の 可能性および要求条件についても第３図に示したそれと同一である。

第１８図について記述したと同じ理由から、まず最初反応（４）においてそのテ ンプレート核酸、即ちＲＮ　Ａ　（１＋を前述したいくつかの方法の１つによっ て取り除く。次にｃＤＮＡ（２１に反応（５）おいてレポーターゾンデとして平 行に２重鎖のＤ　Ｎ　Ａ　１６ａｌ　（６ｂｌ　ｆ６ｃ）　（６ｄｌ　（６ｅｌ 　−−（９ｃｌ　（９ｂｌ　（９ａｌを部分ハイブリッドさせる。このレポータ ーゾンデは下記の官能性配列を含んでいる：　ｆ６ａｌはＤＮＡ−ｏｒｉ（−］ 配列である。（６ｂ）はスペーサ配列である。（６Ｃ）はｃＤＮＡの特異的なハ イブリッド化のためのハイブリッド化配列である。（６ｄ）はもう１つのスペー サ配列である。

（６ｅ）はＤ　Ｎ　Ａ　ｆ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　ｆ６ｃｌ　（６ｄｌ　（６ｅｌを Ｄ　Ｎ　Ａ　（９ｃｌ　ｆ９ｂｌ　ｆ９ａ）とハイブリッド■■■ ためのハイブリッド化配列である。（９ｂ）はスペーサ配列であり、そして（９ ａ）はＤＮＡ−ｏｒｉ（−１配列である。スペーサ配列（６ｂ）、（６ｄ）およ び（９ｂ）は非偏性である。他の全ての官能性配列はこのＰＥＲＴ機能発揮のた めに必要である。

最も遅くともｃＤＮＡ（２１へのこのレポーターゾンデのアニーリングの後でこ のものを官能基（Ｒ１）によっであるキャリアに結合させてそして結合しなかっ たレポーターゾンデを非変性的な条件のもとてその反応混合物から完全に除去す る。

第２段階 ｃＤＮＡとその部分ハイブリッド化されたレポーターゾンデとの複合物（叫（２ １−−ｆ６ａｌ　（６ｂｌ　（６ｃｌ　（６ｄｌ　［６ｅｌ−（９ｃｌ　（９ｂ ｌ　（９ａｌは第２段階のＤＮＡＮプレカーゼのための基質である。その複製形 ＤＮＡＮプレカーゼ（８）の作用によってまず最初完全に２重鎖の複製Ｄ　Ｎ　 Ａ　（６１−＋９１が生じ、そしてそのＤＮＡＮプレカーゼ連鎖分離活性によっ てその非ＤＮＡ（Ｒ１１ｆ２１が遊離される。ｄｓＤＮＡ（６１−（９１は次に 何度も繰り返される（８）によって増幅される。

第３段階 その増幅のｄｓＤＮＡ生成物は適当な方法で検出される。

変形態様 テンプレート核酸（１）の、ＲＴプライマー（Ｒ１１（２Ａｌ　（２ｂｌの、お よびレポーターゾンデ（６ａｌ　（６ｂｌ　（６ｃｌ　ｆ６ｄ）　ｆ６ｅ）−ｆ ９ｃｌ　（９ｂｌ　（９ａｌのそれぞれの、非偏性として上げた要素は単独でま たは可能な種々異なる　組み合わせにおいて脱落することができる。そのＲ７反 応のために用いるプライマーはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。

１個の官能性配列の中にただ１個の官能性という原理と異なって、そのレポータ ーゾンデｔ６ａｌ　ｆ６ｂｌ　（６ｃｌ　ｆ６ｄｌ　ｆ６ｅｌ−（９ｃｌ　ｆ９ ｂｌ　（９ａｌをｃＤＮＡ（２１ヘハイブリツドさせるために用いるハイブリッ ド化配列（６Ｃ）がＤＮＡ−ｏｒｉ（−１配列（６ａ）と部分的に、または完全 に重なり合うようにあるいはまた両者が同一であるように形成することも可能で ある。そのハイブリッド化配列（６Ｃ）とＤＮＡ−ｏ　ｒ　ｉ　ｆ−１配列との 間のスペーサ配列はこの場合に欠落する。

各官能性配列の中の１個の異なった配列という原理から離れて、そのテンプレー ト核酸（１）、そのプライマーｆＲ１１ｆ２ａｌ　（２ｂｌ及びそのレポーター ゾンデ（６ａｌ　（６ｂｌ（６ｃｌ　（６ｄｌ　（６ｅｌ／／　（９ｃｌ　ｆ９ ｂｌ　ｆ９ａｌのそれぞれの側面画定性配列及びスペーサ配列を、これがこの試 験の進行にいかなる対応においても干渉を及ぼさないという前提条件のもとに、 単独で、またはすべての可能な組合せにおいて同一に形成することが可能である 。

１次複製ＤＮＡの製造は第２段階において、ＤＮＡＮプレカーゼによる代わりに 第１段階においであるＤＮＡポリメラーゼによって、すでに行っておくことがで きる。

第２段階において「ポリヌクレオチド分析の為の増幅方法」（米国特許４９９４ ３６８１を用いる場合のＰＥＲＴ法の組立。

！本図は、第２段階において増幅のために米国特許Ｐ　Ｓ　−Ｕ　Ｓ　４９９４ ３４８に記述されている方法を採用した場合のＰＥＲＴ分析法の、反応の態様を 示す。

第二段階 好ましくは、純粋なＲＮＡであって官能性配列ｆｌａｔ　（ｌｂｌ　（ｌｅｔ　 （ｌｄｌを含んでいるテンプレート核酸を用いる。　（ｌａｌは、ＤＮＡから成 っていてはならない必要ハイブリッド化配列である。これから導かれた配列（２ ｄ）は１反応（５ａ）においてレポーターゾンデの結合の為に用いられる。　（ ｌｃｌは同様に、必要なハイブリッド化配列であってＲＴプライマー［Ｒ１）　 ｆ２ａ）　１２ｂ）の結合に用いられる。　１ｌｂｌは、スペーサ配列であり、 そし−ｒ　ｆｌｄｌは側面画定性配列である。この最後の二つは非偏性である。

　ＲＴプライマー　１Ｒ１１（２ａｌ　（２ｈｌは、−重鎮の核酸、好ましくは ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、そして非偏 性の官能基（Ｒ１）、同様に欠落可能な側面画定性配列（２ａ）及び、そのテン プレート核酸ｆｉｌの（１ｃ）へのハイブリッド化に用いられる必要なハイブリ ッド化配列（２ｂ）より成る。

その処理される被検物の中にＲＴ活性が存在する場合に反応（３）において、必 要なｄＮＴＰｓの組み込みのもとに、ｃＤＮＡ（２）が合成される。このＰＥＲ Ｔ分析法の機能発揮のために、（２ｄ）までのすべての官能性配列が、このｃＤ ＮＡの中に存在していなければならない。

このｃＤＮＡの（１ａ）に対して相補性のハイブリッド化配列（２ｄ）を除いて 、そのテンプレート核酸ｍ及びＲＴプライマー（Ｒ１１［２ａｌ　ｆ２ｂｌのす べての官能性配列並びにこれらから導かれた全ての配列について、これらがその レポーターゾンデといかなる特異的な相互作用も生じてはならないという要求条 件が該当する。ハイブリッド化配列（２ｄ）がこの結合に立ち入る事のできるた だ一つの物である。

反応（３）から出てくる、反応しなかったテンプレート／プライマー複合物ｆｌ ）／／（Ｒ２）　（２ａ）　ｆ２ｂｌ、遊離のプライマー分子（Ｒ１１（２ａｌ 　（２ｂｌ、プライマーの付けられでいないテンプレート核酸の分子（１１及び ｃＤＮＡ／テンプレート二重体分子（１）／／（２１より成る核酸の混合物は、 反応（４）において次のように、すなわちこれらの成分のいずれも、中でもその テンプレート核酸（１）または、そのテンプレート／プライマー複合物ｆｉｌ　 ／／　（Ｒ１１（２ａｌ　ｆ２ｂｌがそれ以降の各反応において、レポーターゾ ンデ（６）に対する特異的な競合物として表れて、それにより誤ったマイナスの 結果に基づく事ができないということを確実に出来るように修飾される。

従って反応（４）においては、その存在するテンプレート核酸すなわちＲＮＡ（ １１は、前に述べたようにそのアニーリング反応（５ａ）における本来の反応物 として除去される。もし、最高の感度に到達する必要がない場合には、場合によ りそのテンプレート核酸の反応混合物からの除去を省略することが出来る。

箪ヱ伐脂 第２段階において用いたＤＮＡレポーターゾンデ（６）並びに、その増幅の為の 個々の反応段階は、米国特許Ｐ　Ｓ　−Ｕ　Ｓ　４９９４３６８に開示されてい る方法に相当する１反応（５ａ）においてｃＤＮＡ（２１のハイブリッド化配列 （２ｄ）に、官能性配列ｆ６ａｌ　ｆ６ｂ）　（６ｃｌ　ｆ６ｄｌ　（６ｅｌよ りなる一重鎖のＤＮＡレポーターゾンデ（６）が部分的にハイブリッドされ、そ の際（６ｂ）は前後に同じ順序で反復している。（６ｄ）は、必要なハイブリッ ド化配列であり、これはｃＤＮＡｆ２１のＲＴ反応（３）において構成さねた、 ハイブリッド化配列（２ｄ）と特異的にハイブリッドされる。このレポーターゾ ンデ（６）の他の全ての官能性配列は、そのｃＤＮＡｆ２１　とハイブリッドし てはならず、あるいは又、このものの部分と配列の同一性を許してはならない。

その何度も繰り返される配列（６ｂ）も必要である。このものは、その二重鎖の 形（６ｂ）／／＋２ｆｌでその増加されるべき核酸であり、またその増幅生成物 でもある。それぞれ隣り合った官能基の移行部にこのものは、特定の制限Ｊ、ン ドヌクレアーゼの識別配列を有する（矢印で示しである）。（６ｃ）は、非偏性 のスペーサ配列であり、そして（６ａ）及び（Ｇｅｌは、非偏性の側面画定性配 列である。官能基（Ｒ２）は、非偏性である。

レポーターゾンデ（６）のハイブリッド化（５ａ）の後で、ある反応（７）にお いて今やこの反応の為のプライマーとして用いられるその反応（３）において合 成されたｃＤＮＡ（２１の３゛末端より出発して、あるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ メラーゼ（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリポリーゼＩのＫｌｅ口ＯＷフラグ メント）により、モしてｄＮＴＰｓの関与のもとに、その官能性配列（６ｃｌ　 ｆ６ｂｌ　ｆ６ａ）に対して、相補的なり　Ｎ　Ａ　（２ｅｌ　ｆ２ｆｌ　（２ ｇｌが合成される。それによって生ずるｄｓＤＮＡは、次にその結合領域に対し て特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され（８）、それによってそれ ぞれその二重鎖断片（６ｂｌ　／／　ｆ２ｆｌの多数の分子が生ずる。次にハイ ブリッド化（５ａ）、ＤＮＡ合成（７）及び制限エンドヌクレアーゼによる消化 する（８）よりなる反応サイクルの何回もの繰り返しによって大量の二重鎖断片 ｆ６ｂ）　／／　（２ｆ）が作り出される。

工且段順 この二重鎖生成物（ｅｂｌ　／／　（２ｆｌは、適当な方法で検出される。

庶形慧律 テンプレート核酸ｆｉｌ　、ＲＴプライマーｆＲＩｌ　ｆ２ａＪ　ｆ２ｂｌ及び レポーターゾンデ（６）のそれぞれの、非偏性的として挙げたそれぞれの官能性 配列及び官能基は、個別に、または可能な種々異なった組合せにおいで脱落する ことができる。しがしながら、側面画定性配列を含むレポーターゾンデを使用す る可能性は、線状の分子のみならず、環状の分子をもレポーターＤＮＡとして使 用することを許容する。

ある一つの配列の中のただ一つの官能性という原則から離れて、そのテンプレー ト核酸（１）の（Ｉａｌから導かれたへ−イブリッド化配列（２ｄ）が、レポー ターゾンデへのハイブリッド化を行うばかりでな（、同時に（６ｂ）に相補性の 配列を含んでそれにより第２段階において、その特異性増幅生成物の中に入り込 むようにすることができる。１ノボ−ターゾンデのスベ〜す配列（６ｃ）及び、 それから導かれた配列（２ｅ）は、この場合に欠落している。これら二つの官能 基の完全な同一性の他に、これら両方の配列の部分的な重畳或はまた、それら両 方の配列の短い方が他方の長い方の中に完全に合体されているということも、可 能である。

この基準から離れて、テンプレートｉ酸（１）及びレポーターゾンデ（６）の側 面画定性配列及びスペーサ配列は、そわぞれ対になって、又は可能な種々の組合 せにおいて同一であることができる。

このＰＥＲＴ分析法の変形態様の機能が発揮される為には、そのｃＤＮＡのハイ ブリッド化および合成開始に用いられたハイブリッド化配列（２ｄ）は、その３ ゛末端に存在している必要がある。第２３図においてはこれが、そのテンプレー ト核酸Ｔｌｌの（２ｄ）に対して相補性のハイブリッド化配列（ｌａ）が、その ５°末端に存在している事によって達成される。しかしながら又、テンプレート 核酸（１）を、その５゛末端において配列−個分だけ延長し、そしてそのハイブ リッド化配列をそのｃＤＮＡの内部に位置させることも可能である。このために は、そのテンプレート核酸（１１はそのハイブリッド化のために用いられる官能 性配列（２ｂ）の末端に、ある制限エンドヌクレアーゼの識別配列を有していな ければならない。相補性ＤＮＡオリゴヌクレオチドの部分ハイブリッド化及び、 対応する制限エンドヌクレアーゼによる引き続く消化によって、このハイブリッ ド化配列はそのｃＤＮＡ（２）の３゛末端を形成する。この３゛末端を形成する ｃＤＮＡの配列は、次のように、すなわちテンプレート核酸ｆｉｌの除去の後で 、ある１＃／ループの構造を取り、その幹の中で制限エンドヌクレアーゼが存在 するように選ぶこともできる。対応する酵素による消化によって、３°末端が生 じ、これはハイブリッド化の後で反応（力の開始のために使用する事ができる。

反応生成物の検出（第３段階）の為の分析方法このＰＥＲＴ分析法の第２段階が 終了した後で、そのＰＣＲ，ＬＣＲ及び複製ＤＮＡに基づく増幅方法に際して、 さらに分析する為のｄｓＤＮＡが存在する。

転写法に基づく増幅方法および複製ＲＮＡに基づく増幅方法において一重鎖ＲＮ Ａｔ　５ｓＲＮＡ）をその分析段階において、検出することが重要である。この 場合にいかなる方法を選ぶかは、種々の因子に左右され、例えば選んだ方法の変 形態様、装置、採用できる作業能力などによって左右される。従ってＰＥＲ７分 析法のすべての変形態様の為に対象とするすべての分析方法を挙げることは不可 能であり、また不必要である。それぞれの関連の条件に対して最適の分析方法を 選ぶ事は、当業者の自由裁量に任される。

第２段階からの増幅生成物を検出する為に用いる事のできる広い範囲の技術の完 全な描写ではなくて、説明だけの意味で下記の種々の可能性を挙げられよう：ａ ）その増幅方法におけるＤＮＡ合成あるいは、ＲＮＡ合成の検出ｂ）クロマトグ ラフ的または、電気泳動的分析による５ｓＲＮＡ増幅生成物、またはｄｓＤＮＡ 増幅生成物の検出 Ｃ）特殊なゾンデを用いるハイブリッド化による５ｓＲＮＡ増幅生成物、または ｄｓＤＮＡ増幅生成物の検出 ｄ）上記ａ）〜Ｃ）の種々の要素の組み合わせによる検出。

このような可能性については下記の方法的要素が利用される：電気泳動： ○ゲル電気泳動（天然または変性した）アガロース、ポリアクリルアミド、他の ゲル材料 ○毛管電気泳動 ○ＨＰＬＣ ハイブリッド化： ○溶液内ハイブリッド化 ○固相のハイブリッド化：膜、ビーズ、板一般的にＤＮＡ及び／又はＲＮＡを表 示する試薬類：Ｏ蛍光物質、エチジュウムブロミド、アクリジンオレンジ、ヘキ スト社染料など 種々のゾンデに標識するための試薬類：○種々のゾンデを標識するためのヌクレ オチド類：放射性物質： ｄＮＴＰ及びｒＮＴＰに取り入れた１１８工、　１１１）、５ｌａｐ％ｓｓＳ、 ３Ｈ１１４Ｇ非放射性物質： ビオチンーｄＵＴＰ、ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ ○種々のゾンデに標識するためのヌクレオチド以外の試薬類：感光性ビオチン、 感光性ＤＩＧ、アミノ反応性ビオチン、アミノ反応性ＤＩＧ、スルフヒドリル反 応性ビオチン、スルフヒドリル反応性ＤＩＧ、蛍光染料（ローダミン、ＦＩＴＣ なと） 合成（第２段階での）の間にＤＮＡ／ＲＮＡを標識する試薬類：○合成（第２段 階）の間に標識するためのヌクレオチド：放射性物質：　ｄＮＴＰ及びｒＮＴＰ の中に取り入れた１２１１、＋ｓｌ■、ｓａｐ、ｓｓＳ、−Ｈ％１４Ｃ 非放射性物質 ビオチン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ 実施伝上 Ｕ図にＰＥＲ７分析法の従来のＲＴ試験に比して、高められた感度を示す。

第７口に示した変形態様に従うＰＥＲＴ分析法分析法唯 １段階７分析法においてＲ７反応のためのテンプレート核酸として、バクテリオ ファージＭＳ２　（マンハイムのベーリンガー社）。

ブライ７−Ａ、！：、して塩基配列５°−ｄ　（ＣＡＴＡＧＧＴＣＡＡＡＣＣＴ ＣＣＴＡＧＧＡＡＴＧ）−３°を有する合成的につくったオリゴヌクレオチドを 用いた。テンプレート／プライマー複合物の製造にはひとつの反応につき２２０ ｎｇのプライマー（２７ｐｍｏｌ）を含むｊＬＬｇのテンプレート核酸（０，８ ５ｐｍｏｌ）を４μｌの水の中で混合し、そして次に９５℃において５分間、そ して３７℃において３０分間、４℃において５分間、インキュベーションした。

その新しく作られたテンプレート／プライマー複合物を反応用緩衝液、ｄＮＴＰ ｓ、ジチオスレイトル、ＲＮアーゼインヒビター並びに子牛結成アルブミンを含 む溶液にピペットで加えた。ＲＴとしてはモロニーマウス白血病ウィルスとして にニーイングランドのＢｉｏｌａｂｓ社）の組替体酵素を用いた。まず最初０． ５　Ｍ　ＫＣＬ、１７−のトリス−ＣＩ　ｐＨ７，５，３，３−田Ｔ、０．３％ トリトンＸ−１００および３３％のグリセリンの溶液の中の、１０２〜ＩＱ−１ ｏの単位（Ｕ）の範囲の、１０倍ずつの一連の希釈率範囲のものを作った。対応 する活性を有するこの溶液のそれぞれ２．５μｍを次に前表で２５μｌの反応溶 液にピペットで加えた。反応条件は次のようであった：　５０−トリスーＣＬ　 ｐＨ８，３、５０ｍＭ　ＫＣＬ、８ＩＩＩＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ｍＪディチオ スレイトール、ＩＵ／μｌＲＮアーゼインヒビター〔ＲＮａｓｉｎ商［）　］　 、　０．１２　ｕｇ　／ｕｌ　、子牛結成アルブミン、０．０３２％トリトンＸ −１００、およびそれぞれ１−の、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰ、 反応は３７℃において３時間にわたり、インキュベーションした。

このＲ７反応に引き続いて、そのＲＮアーゼインヒビターを９５℃における７分 間のインキュベーションによって失活させた。そのテンプレート核酸の分解のた めに次にそれぞれの反応において３７℃で３０分間にわたり、２．Ｏｎｇ　のＲ ＮアーゼＡ（米国ビオケミカル社）で処理した。

第λ段風 第１段階において合成した、その増加されるべきＭＳ−２／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの 増幅をブライ７−Ａ（上記）を用いるＰＣＲならびに塩基配列５’　−ｄ　（Ｔ ＣＣＴＧ（ＴＣＡＡＣＴｒＣ（ＴＧＴＣＧＡＧ）−３°を含むプライマーＢによ って行った。この反応にそれぞれＲＮアーゼＡで処理したＲ７反応の生成物のそ れぞれｌＯμｌ　（４０％）を全容積１００μｌの中に入れて１００ｕｌの好油 で被覆した。その反応条件は次のようであった：５０　ｍｕ　ＫＣｌ　、　１４ 　ｍＭ　トリス−ＣＬ　ｐＨ８，３，２，１ｍＭ　ＭｇＣＬ−１０，０１％　ゼ ラチン、３５０　ｎＭ　プライマーＡ、２５０　ｎＭ　プライマーＢ、３００μ ｌの、それぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび２．５ＵＴａｑ 　ポリメラーゼ。増幅のために、それぞれ、９４℃は３０秒間の変性、５５℃は １分間のハイブリッド化７２℃は４２秒間の合成反応及びプログラム可能なＴｈ ｅｒｍｏｂｌｏｃｋ　（Ｔｅｃｈｎｅ　ＰＨＣ−２）の上での５０秒間になる２ ５サイクルを行った。

箋ユ部上 分析：その反応生成物の検出はサザンブロツドハイブリッド化方法によって行っ た。このために各増幅反応からのＤＮＡの１０％を１．５％のアガロースゲルの 上で分離し、そしてナイロン膜の上に移した。ハイブリッド化のためには５°− ｄ（ＴｒＡＡＴＧＴＣＴＴｒＡＧＣＧＡＧＡＣＧＣ）　−３°塩基配列のオリゴ ヌクレオチドを用いたが、これはその５°末端においてＳｉｐを含む燐酸基でラ ベルされていた。その放射能信号の定量はＣｅｒｅｎｋｏｖ　’８１射線の測定 によって行った。

従来Ω重工試塘 従来のＲＴ試験における緩衝液条件はこのＰＥＲ７分析法と同じであった。それ ぞれ１０μｌの中に記載の量の酵素が含まれていた。テンプレート／プライマー の複合物としては、５μｌポリ（ｒＡｌオリゴ（ｄＴｌを用いｆ　Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ社）、デオキシリボヌクレオチドモノマーとして３Ｈでラベルしたチミジ ントリホスファ−トを用いた。３７℃におけるインキュベーション２２時間行っ た。その反応生成物の中で用いた放射能の分析はナイロンフィルターの上でのト リクロル酢酸沈澱に引き続きシンチレーションカウンタを用いて行った。

第２４図は、両方の方法についての信号強度を用いたＲＴ活性に対して最大信号 強度のパーセントで示した。ＰＥＲＴ試験が従来のＲＴ試験法の検出限界（斜線 を示した部分）をはるかに下までなお最大信号強度を示すこと及び１０−”　Ｕ を用いるＰＲＴ分析法の検出限界が従来のＲＴ試験のそれよりもオーダーで１０ ７も低いことが明らかに見られる。

！施医λ 第２５図はＨＩ　Ｖに感染した人の血漿の中及びＨＩＶに感染した細胞の培養上 澄液の中の粒子に組み合わされたＲＴ活性の存在を示す。

ＥＤＴＡで凝固阻止させた血液から得られた各１ｍｌ　の血漿を１４０００　Ｇ において３０分間遠心分離し、そして引き続いて０．２μＭのフィルタを通過さ せた。

次にこの容積を燐酸塩で緩衝された等張塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ＧＩＢＣＯ社） で２．２５ｍ１に調節し、そして粒状の物質（ウィルス粒子）を８２０００　Ｇ において超遠心分離器で２時間沈降させた。そのペレットを、５０＋ＴＩＭ　の ＫＣＩ、２５ｍＭ　のトリス−Ｃ１ｐＨ７，５，５ｆｆＩＭのジチオスレイトー ル、０．２５ｍＭの　ＥＤＴＡ、０．０２５％のトリトンＸ−１００並びに５０ ％のグリセリンよりなる緩衝液４０ｕｌの中に再び懸濁させた。次におそらく含 まれていると考えられるウィルスを１．５Ｍ　のＫＣＩ　及び０９％　のトリト ンＸ−１００の溶液２０μｌを加えることにより溶解させた。

この溶解液２．５＋ｔｌ　（４％）を次にＲＴ反応させた。

このＲＴ反応の反応条件及び用いたテンプレート／プライマー複合物は実施例１ におけるそれと同じであった。反応を３７℃において５時間行なわせた。次に９ ５　℃で７分間処理することによってそのＲＮアーゼ−インヒビターを失活さセ た。そのＲＮＡよりなるテンプレート核酸の加水分解を０．８ｎｇのＲＮＮアー ゼを用いて増幅反応の介しの直前に、そのＰＣＲ反応混合物の中で３７℃３０分 間インＡノーベーションすることによって行なった。ＰＣＲ反応溶液、サイクル 数及び温度挙動は実施例１におけるそ第１と同じであった。増幅されたＤＮＡの 分析は実施例１について記述したと同様にオリゴヌクレオトチドＣを用い、サザ ンブロッ１−ハイブリダイゼーショ〉法によって行なった。その結果を次にオー トラジオグラフによりＸ線フィルムの上に固定した。

第２５図は５人の健康な献血者（スプールエないし５）の血漿の中にまっな（Ｒ Ｔ活性が確認されず、−万全てのＨＩＶ感染者の血漿（スプール６ないし１０１ の中では明らかに検出できることを示す。また、ＨＩＶに感染した細胞の培養上 澄液（スプール１１ないし１３）において１　：　１，０００，０００　の稀釈 率までＲＴ活性が確認できる。

ＰＥＲ１分析法の応用 ＰＥＲ１分析法はＲＴ活性の検出のための超高感度評価法の一つである。これは また種々のレトロエレメントについての特徴の１つである。これにはそれらレト ロウィルスに加えてレトロトランスポゾン、バラレトロウィルス（コーリモウイ ルス及びヘパドナウィルス）及びＬ　Ｉ　Ｎ　Ｅ　（ｌｏｎｇ　１ｎｔｅｒｓｐ ｅｒｓｅｄ　ｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ）等の種々のサブユニットを含め てレトロウィルス類似の種々のエレメント、更にミトコンドリアプラスミド或い はｍ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ　ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｅｄ 　ＤＮＡ）がこれらに含まれる〔レトロエレメントについての簡単な展望につい てはＲｉｃｃｈｅｔｔｉ　Ｍ、　：　”Ｂｕｌｌ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕ ｒ”　８９．１４７−５８　ｆ１９９１１　を参照されたい］。従ってレトロエ レメントはひれが重症の、ときには致死性の疾病を引き起こし、そして動物や植 物においては生産高の低下を招くことがあるような部分的に感染性の病原体の広 い範囲を方眼紙、それは人の医学。獣医学、或いは植物育種において成る役割を 演するようなものを包含する。従って本発明は、活性ＲＴを含むか、又は発現す るような全てのレトロウィルス並びに全ての他のレトロエレメントの超高感度検 出のための方法にも関する。自明のように、ＰＥＲ１分析法は人、動物又は植物 においてそのようなレトロエレメント自身の検出のため。或いはこれらと組み合 わされた種々の疾病の診断のために利用される。

人の場合にはこれらのレトロエレメントには大病原性の種々のオンコ１／トロウ ィルス、人工−細胞白血病ウイルス１型及び２型（ＨＴＬＶ−１又は−２）並び にエイズ及びその前段階と組み合わされたひと免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１又 は−２）等がこれに属する。伯の種々の疾病に対しては種々のレトロウィルスと の関連が推定されており、すなわち、多発性硬化症、川崎症候群、慢性疲労症候 群、シェーグレン症候群、甲状腺機能亢進症、多血症又は血小板血症の才うな血 液の特定の増殖性疾病、特定の皮膚Ｔ細胞り〉・バ騰又は乳癌において推定され ている。ひと病原性バラレトロウィルスの群には急性又は慢性の肝炎並びに肝臓 癌が関連するＢ型肝炎ウィルスがこれに属する。

動物の場合にはレトロエレメントには多数のレトロウィルスが含まれ、ＲｌＷｅ ｉｓｓ　、　Ｎ、　Ｔｅ１ｃｈ、　Ｖａｒｍｕｓ、　Ｊ、　Ｃｏｆｆ１ｎ　５ｌ ｉｔ集のＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏ窒凵@１９８４ 年及び１９８５年刊行の°’ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ”　第２版の 槽準的研究に記述されているそれら全てがこれに属する。これには、例えばとり 白血病ウィルス及びとり内挿ウィルス（ＡＬＶ又はＡＳＶ）、マウスレトロウィ ルス（ＭＬＶ／ＭＳＶ／ＭＭＴＶ）、ねこ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、うま感 染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウィルス、ひつじ関節／脳炎ウィルス（ ＣＡＥＶ）、うし白血病ウィルス（ＢＬＶ）等がこれに属する。これらの名称が 示すように、多くのこのようなウィルスは悪性増殖性疾病、そしてしばしば造血 系又はリンパ系のそれを引き起こす。他のものは神経系、関節又はその他の器官 の慢性的炎症や変質性疾病を引き起こす。その上に、近年見出された種々の型の 、シミニアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ねこ免疫不全ウィルス（Ｆ　Ｉ　Ｖ ）及びうし免疫不全ウィルス（Ｂ　Ｉ　Ｖ）があげられる。バラレトロウィルス には動物ヘパドナウィルス類、例えばマーモット肝炎ウィルス（ＷＨＶ）、りす 肝炎ウィルス及びあひる肝炎Ｂウィルス（ＤＨＢＶ）が含まれる。

レトロウィルス類似エレメントには既に述べた、植物が罹患するカリフラワモザ イクウイルスにより代表されるコーリモウイルスがそれに属するようなバラレト ロウィルスに加えて、なかでもＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　５ｌｌ１１．、　ｃｏｐ ｉａ、　ｇｙｐｓｙ、　１７．６．２９７゜４１２の種々の伝染可能なエレメン ト或いはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ並びにＬＩＮＥの 伝染可能エレメント或メントトロトランスポゾンがそれに属する。これらのレト ロウィルス類似エレメントの他に更にミトコンドリアプラスミド及びｍ５ＤＮＡ を含むレトロウィルス非類似のエレメントの群が存在する。

それらレトロエレメントには更に、天然の組換えにより既に存在している種々の レトロエレメントから出発するもの或いは遺伝子操作によって作り出されるよう な全ての病原エレメントが属する。このＰＥＲ１分析法を他のレトロエレメント の検出及び特性類別に利用することは自明であり、そして研究にとって大きな意 義がある。

更にこのＰＥＲ１分析法を用いて原核性細胞又はその断片、細胞性又は亜細胞は エレメント、ウィルス類或いは全ての種類の粒子と組み合わされたＲＴ活性、す なわち全ての起源からのＲＴ活性を検出することができる。

このＰＥＲ１分析法を診断的に使用することはスクリーニング法又は典型化分析 法の形で行なうことができるが、この後者は耐性試験の機能をも有する。中でも 重要なのは献血者又は器官提供者のスクリーニングである。この場合に、ただ１ つのスクリーニング検査法によって全てのレトロエレメントを把握できることは 大きな意義があり、これは一連の形態特異性及び配列特異性の試験に比して本質 的に簡単であり、経済的である。

またこのＰＥＲ１分析法の定量的な利用も重要であり、これは感染の程度、すな わち「ウィルス負荷」についての情報を与える。この関連において、このＰＥＲ １分析法によって作用的により高いＲＴ活性を有するエレメントのみを検出する のが有利である。成る感染の転位又は伝染に無関係なＲＴ不活性のエレメントは 検出されない。

もう１つの重要な応用の可能性は、生物学的生成物、すなわち少なくとも部分的 に生物学的物質からなるか、又はそれから作られ、そして大または家畜の医学に おいて、又は植物育種において治療、予防又はその他の目的に用いられる種々の 生成物のスクリーニングである。限定的でない例示的な例として、血清、血漿調 剤又は血漿分画、凝固因子、ワクチン類、細胞抽出物、ホルモン調剤、細胞キー ネ、並びに組換え体の遺伝子工学により製造された生成物をあげることができる 。このＰＥＲＴ法によればこれらの生成物を介していかなる感染性のレトロエレ メントも転移しないように制御することができる。

種々の生物学的製品は今日では化学的、酵素的及び／又は物理的手段によってど こででも失活されている。ＰＥＲＴ法を用いればその失活手段が所望の結果に達 したかどうかを非常に感度よ（制御することができる。

ＲＴ由来の種々の医薬はレトロエレメントによる感染及びそれによって引き起こ された疾病を処理するのに重要な役割を果す。しかしながら種々の抗生物質の場 合と同様に、耐薬品性のウィルス変種が発現する。ＨＩＶの場合にはＲＴ阻害剤 アチドヂミジン（ＡＺＴ）を用いた２年間の治療の後で全ての患者がＡＺＴ耐性 のウィルス変種を持ったことが示されている。ＰＥＲＴ法によれば試験管外なお いて直接、すなわち成る感染物を取り入れてしまった被検物の検査によって、成 る特定の時点において存在している活性レトロエレメント集団についてそのＲＴ 活性阻害物質の作用を調べることができる。

総括すれば、このＰＥＲＴ法は研究、診断、診療及び製品制御において提起され る多くの問題に対して利用することができる。

ＰＥＲＴ法の簡単な実施のためのキット木発明の重要なアスペクト１つはＰＥＲ Ｔによる被検物の中のＲＴ活性の検出のためのキットである。ここで用いる「キ ット」の概念は、簡単に小さな包みに分けてあって使用の容易な、ＰＥＲＴ法を 実施するための助剤及び薬剤類を表わオ。成るキットの内容物は主としてその使 用目的及びその用いるＰＥＲＴ法の変形態様又は変形型によって決定される。こ の「キラｌ−Ｊの概念は一方において、成る被検物の中にＲＴ活性が存在するか 否かの疑問を解明するのに用いられ、そ１５で検査結果が陽性である場合にその 情報についてのなんらの証言も許容しないような、いわゆる［スクリーニング用 キット」を含む。この「キット」の概念は（也方１こおいて１つの「スクリーニ ング用キット」を用いて検出されたＲＴ活性の由来又は原因についての質問の解 明に用いられるか、又はどのレトロエレメントによ−〕て、又は互いに近親的な どの群のレトロエレメントによってこの活性がもｔ二らさねたかについて解明を 与えるような「典型化キット」をも包含する。種々胃なっ！、−典型化キットの 薬剤組成はなかでもその被検物の属する生物種、並びに、二の生物種の中の、又 は特定の検体集団から知られてい態様で由来するレトロエＬ・メントの類別や頻 度によって決定される。

ＲＴ活性検出用キット（スクリーニング用キット）このようなキラ１−の１つは 下肥を含むことができる。

旦旦重工迭卑第↓伐脂に２い工： １）　被検物から望ましくない粒状物質を除去するための適当なフィルタ調被検 物を更に処理１−るために定められた被検物の分画又は相の中のＲＴ活性を富化 させるための適当な試薬又は助剤３）　更に処理するために定められた分画又は 相からＲＴ活性を注意深く抽出するための適当な薬剤 ４）　ＲＴ活性を例外として、成る適当な緩衝溶液の中に適当な濃度でそのＲＴ 反応に必要な全ての薬剤を含んでいる、１つ又は多くの溶液から構成されるＲＴ 基本混合物：この基本混合物の中にはなかでも第２段階において用いられる増幅 方法に対応して選ばれた適当なテンプレート／プライマー複合物、必要なｄＮＴ Ｐｓ、適当な２価カチオン（Ｍｎ”及び／又はＭｇ”　）及び最適の特異性及び 感度の意味において　その反応に好都合な影響を与える物質類が含まれている。

５）　酵素的に活性のＲＴを含む溶液からなる陽性のＲＴ標準剤６）　酵素活性 的ＲＴを全く含んでいない陰性のＲＴ標準剤７）　第２段階において用いた核酸 増幅方法の条件に基づいて必要であるか、又は望ましい場合に用いるＲＮＡの酵 素的及び／又は化学的分解に適した１つ以上の試薬二更にｃＤＮＡの成るキャリ ヤの上への結合が洗浄過程を許容する場合のこのものの洗浄除去のための適当な 洗浄液、或いはその後でｐＨ１塩濃度、分解した試薬類に関して再びこのＰＥＲ Ｔ法の種々の変形態様又は変形型に従い必要な下肥の種々の反応を実施するのを 許容するような反応条件を作り出すための中和溶液８）　このＰＥＲＴ法の選ば れた変形態様又は変形型に従って、第２段階からの遊離物である核酸の中のｃＤ ＮＡの形質転換のため、又は第２段階において遊離物として用いられるか又はそ れから出発して成る蛋白質を作り出すようなレポーターゾンデのｃＤＮＡへの特 異的なハイブリッド化のために必要な、例えば酵素類、プライマー又は他のオリ ゴヌクレオチド類、レポーターゾンデ、ｄＮＴＰｓ又はｒＮＴＰｓ並びにこのよ うな場合におけるそのハイブリッドしなかった過剰のレポーターゾンデを洗浄除 去するための洗浄溶液 旦上ＲＴ法の第２Ｐ　について： ９）　そのＰＥＲＴ法の変形態様又は変形型に従ってなお追加的に必要なプライ マーや他のオリゴヌクレオチド、酵素、ｄＮＴＰｓ、ｒＮＴＰｓを含む１つ以上 の溶液 旦旦重工珠少第旦我門について： １０）　第２段階から得られた増幅生成物を分析するための、その用いたＰＥＲ Ｔ法の変形態様又は変形型に適した薬剤及び薬剤容器ＲＴ活性の典型化のための キット １−のキラ１−はこのＰＥＲＴ法において検出されたＲＴ活性を成る特定のしｌ ・ロエレメント又は互いに近親の１７トロエレメントの群に帰属させるのに用い る。こねはＲＴを有する特定のしトロエレメント又はそのようなレトロエレメン トの１肝の特は的な決定子と特異的に反応することのできる薬剤によって行われ る。

この典型化Ａツ１へは下肥を含むことができる。

１）　典型化試薬：これは特定のレトロエレメント又は互いに近親のレトロニレ （ントのｉｆｆに少なくとも１つの決定子に対して充分な親和性及び特異性を有 する少なくとも１つ以上の適当な薬剤を含む。

この典型化試薬と反応した特性的な決定子はＲＴと関連している粒子又は断片の 構成成分であるか、又はそれらはその酵素自身の上に偏在している。後者の場合 にはこの典型化試薬は直接その酵素の「活性化部位」に対して、或いはその隣接 位置に指向されていて酵素活性を阻害することができる。それら特性的決定子又 はその典型化試薬はいずれにしてもその典型化試薬のそれら決定子との相互作用 がそのＲＴとの相互作用（直接的又は間接的）をも意味するように選ばなければ ならない。

この典型化試薬はそねら特性的な決定子の少なくとも１つに対する特異性を有オ るモノクローナル又はポリクローナル抗体から、或いは他の蛋白質、薬理学的物 質又はその対象とする決定子の少なくとも１つと特異的に結合する全ての種類の 分子からなることができる。

直接そのＲＴに対して指向された各薬剤は、好ましくはその被検物の処理の後で 、但し第１段階の反応（３）　にそれを導入するのに先立ってその被検物に添加 し、そしてその混合物を適当な時間にわたってインキュベーションしなければな らない。

他の決定子に指向された種々の薬剤はその被検物の処理の間それに最適な時点に おいて添加しなければならない。

この典型化試薬は、特にこれが直接酵素阻害性（中和性）活性を有するときには 溶解した形で添加することができる。中和しない典型化試薬は成るキャリヤに結 合させて用いることができるか、又はもし溶解した形で存在するときはその技術 分野に知られたいずれかの分画方法によってそのＲＴ活性をこのＰＥＲＴ法に対 して定めらねたフラクションの中で濃厚化させるか又は希薄化させることを可能 にするような反応性基を備えていることができる。

２）　陰性の標準試薬：典型化試薬にできるたけ類似しているけれどもその典型 化試薬によって識別される決定子と、又はもう１つの、その対象とするＲＴに直 接又は間接的に組み合わされている決定子と全く結合しないような少なくとも１ 種類の適当な試薬：この陰性の標準試薬はその典型化試薬の種類に従って同様に モノクローナル又はポリクローナル抗体、他の蛋白質類、薬理学的物質、又は他 の対応する種類の分子よりなり、そしてその分画の挙動に関して典型化試薬と同 様である。

３）　陽性のＲＴ標準試藁：これは成る特定の、その典型化試薬によって決定さ れたレトロエレメントのＲＴの適当な濃度の酵素活性的調剤を含む。

４）　陰性のＲＴ標準試薬：これはその典型化試薬に相当せず、またこれと反応 しない適当なＲＴを含む。

５）　分画用試薬二分画することが必要なときにそれに要する全ての他の成分を 含む。この分画用試薬はその典型化剤との相互作用によってこわに結合されたＲ ＴをこのＰＥＲＴ法に対して定められたフラクションの中で濃厚化するか又は希 薄化するのを可能にする。この分画用試薬は、例えば典型化試薬がそれに結合さ れているか、又は反応性の基によって結合されるようなキャリヤであることがで きるが、これはまた典型化試薬を沈殿させる免疫学的試薬であることもできる。

また、その陰性標準試薬もこの分画用試薬と相互作用し、それによってはＲＴの みが影響を受けず、と言うのはこれは陰性の標準試薬とは結合しないからである 。

典型化試薬は種々のレトロエレメントの上記１）ないし４）の反応試薬をその任 意の組み合わせで含むことができる。これらの試薬は好ましくは適当な組み合わ せで組み合わされており、それによって特定の検査グループの中で現れる最も重 要なレトロエレメントの検出がただ１つのキットによって可能である。例えば人 の種々のしトロエレメントを検出するための典型化キットは下記の典型的な薬剤 を含んでいることができる：ＨＩＶの群に対する特異性を有するもの、及びこの 中でＨＩ　Ｖ　１かＨＩＶ２かに対して特異性を有するようなもの、ＨＴＬＶの 群に対して特異性を有するもの、及びその中でＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶ２に対し て特異性を有するもの。更にＢ型肝炎ウィルスに対して特異性を有するもの。

発明に本質的なことは、このＰＥＲＴ法が逆転写酵素活性の検出のための超高感 度の３段階法であることである。

第１段階においてその被検物が準備調整されるが、その際、成る反応混合物の中 にテンプレート／プライマー複合物を入れておき、そしてその処理される被検物 の中に存在しているＲＴ活性を成る特定の核酸増幅方法において増加されるべき 核酸の準備調整のために次のように、すなわちそのようなものの１つがもっばら 被検物の中にＲＴ活性の存在しているときに準備調整されるように利用する。

第２段階においてその増加されるべき核酸が増幅されるが、その際増幅生成物が 作り出され、これは第３段階において分析され、同定される。

従来のＲＴ分析法に比してこのＰＥＲ７分析法を用いればおよそのオーダーで数 百万倍の感度上昇が達成される。本発明はＲＴ活性、また従って活性のＲＴを含 むか、又は発現する全てのレトロウィルス及び全てのレトロエレメントのＲＴ活 性を超高感度で検出することを可能にするものであり、そして人、動物及び植物 に引き起こされる種々の感染症及び疾病の診断のために重要である。ＰＥＲ７分 析法は研究や診断術においてスクリーニング試験又は典型化試験或いは確認試験 として用いられる。本発明は対応するそれらのキットを包含する。

第１図 第２図 第３図 第６図 第７図 第１０図 第１１図 第１３図 第１５図 第１６図 第１７図 第１８図 第１９図 第２０図 第２１図 第２２図 第２３図 第２４図 第２５図 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＴ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、ＮＯ，ＮＺ、　ＰＬ、ＰＴ、　Ｒ Ｏ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）被検物の中の、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌ クレオシドトリホスファート：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラー ゼ）の型の酵素の活性を定性的及び定量的に検出する方法において、第１段階に おいてその被検物を処理し、その際反応混合物の中に予め或るテンプレート／プ ライマー複合物を入れておき、そしてその処理された被検物の中に存在する逆転 写酵素活性を次のように、すなわち成る特定の核酸増幅方法において増加される べき核酸を準備調整するために、被検物の中に逆転写酵素活性が存在するときに だけその増加されるべき核酸が準備調整されるように利用し、その際、そのテン プレート／プライマー複合物より出発して、そのテンプレートのＲＮＡの少なく とも１部が逆転写されるように少なくとも１つのｃＤＮＡが合成され、第２段階 においてその増加されるべき核酸を増幅し、その際増幅生成物が作り出され、そ して第３段階においてこの増幅生成物を分析して同定することを特徴とする方法 。 ２）この方法において用いられる核酸の全てが少なくとも１つの官能性配列より なり、それらのうち少なくとも１つがハイブリッド化配列であることを特徴とす る、請求の範囲１の方法。 ３）この方法において用いられる、核酸の官能性配列及び官能基、その他の種々 の試薬及びその選んだ反応条件の全てが、この方法の予め与えられた特異性と感 度とが保証されるように、相互に、及び被検物に対して適合化されていることを 特徴とする、請求の範囲１ないし２の方法。 ４）テンプレート／プライマー複合物が少なくとも、ヘテロポリマーのテンプレ ート核酸と、及び少なくとも１つの、核酸の一つである逆転写酵素プライマーと よりなり、そのテンプレート核酸が少なくともその最も下流に存在するハイブリ ッド化配列により逆転写酵素プライマーにハイブリッド化されており、そしてこ の逆転写酵素プライマーが３′末端において或るハイブリッド化配列を含んでい て、これによりこのプライマーがテンプレート核酸にハイブリッド化されている ことを特徴とする、請求の範囲１ないし３の方法。 ５）テンプレート核酸の１区画がＲＮＡよりなり、その際この区画がテンプレー トＲＮＡであって好ましくはその最も下流にあるハイブリッド化配列の５′末端 に直接隣接しており、このテンプレートＲＮＡはこれが逆転写酵素反応の特異性 及び感度のレギュレータとして働くように構成され、そしてそのテンプレート核 酸の最も下流に存在するハイブリッド化配列が好ましくはＲＮＡよりなることを 特徴とする、請求の範囲１ないし４の方法。 ６）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート／プライマー複合 物がその増加されるべき核酸の準備調整及びその増幅に必要な全ての官能性配列 を含むように行ない、その逆転写酵素プライマーと反応条件とを、そのｃＤＮＡ もこれらの官能性配列を含むように選び、そしてこのｃＤＮＡがその増加される べき核酸を完全に含んでおり、その際、その増加されるべき核酸の少なくとも或 る部分はその逆転写酵素の活性によって合成されたものであることを特徴とする 、請求の範囲１ないし５の方法。 ７）その増加されるバき核酸の準備調整を、そのテンプレート／プライマー複合 物がその増加されるべき核酸の準備調整及びその増幅に必要な官能性配列の少な くとも１部を含むように行ない、その逆転写酵素プライマーと反応条件とを、そ のｃＤＮＡがこれらの官能性配列を少なくとも部分的に含むように選び、そして 少なくとも部分的にその逆転写酵素の活性によって合成された、その核酸混合物 の中に存在するｃＤＮＡの少なくとも或る部分が、少なくともその増加されるべ き核酸へ導く或る反応又は或る１連の反応の遊離物を形成し、その際なお欠けて いる官能性配列は更に別な核酸によって導入されることを特徴とする、請求の範 囲１ないし５のいずれかの方法。 ８）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート／プライマー複合 物がその増加されるべき核酸の準備網歴とその増幅とに必要な官能性配列の全て を含むように行ない、そのテンプレート核酸はテンプレートＲＮＡの上流で、必 要な少なくとも１つの官能性配列を有するテンプレートＤＮＡを含み、その逆転 写酵素プライマーと反応条件とはそのｃＤＮＡもこれらの官能性配列を含むよう に選ばれ、そのＤＮＡはそのテンプレート核酸と共にそのｃＤＮＡ／テンプレー ト重複体の形で存在し、そしてこのｃＤＮＡ／テンプレート重複体がその増加さ れるべき核酸を含んでいることを特徴とする、請求の範囲１ないし５の方法。 ９）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート／プライマー複合 物がその増加されるべき核酸の準備調整とその増幅とに必要な官能性配列の全て を含むように行ない、そのテンプレートＲＮＡの上流のテンプレート核酸はテン プレートＤＮＡを含み、その逆転写酵素プライマーと反応条件とはそのｃＤＮＡ がこれらの官能性配列を少なくとも部分的に含むように選ばれ、そのｃＤＮＡは テンプレート核酸と共にそのｃＤＮＡ／テンプレート重複体の形で存在し、そし てこのｃＤＮＡ／テンプレート重複体がその増加されるべき核酸に導く或る反応 又は或る１連の反応の遊離物を形成することを特徴とする、請求の範囲１ないし ５の方法。 １０）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート核酸が少なくと ももう１つのハイブリッド化配列を含むように行ない、そのｃＤＮＡを或るキャ リヤに結合させ、少なくとも１つのレポーターゾンデの選択を特異的なハイブリ ッド化及び結合されていないレポーターゾンデの洗浄除去によって直接的又は間 接的に行なわせ、そしてそのレポーターゾンデがその増加されるべき核酸を含む ことを特徴とする、請求の範囲１ないし５の方法。 １１）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート核酸が少なくと ももう１つのハイブリッド化配列を含むように行ない、そのｃＤＮＡを或るキャ リヤに結合させ、少なくとも１つのレポーターゾンデの選択を特異的なハイブリ ッド化及び結合されていないレポーターゾンデの洗浄除去によって直接的又は間 接的に行なわせ、そしてそのレポーターゾンデがその増加されるべき核酸に導く 或る反応又は或る１連の反応の遊離物を形成することを特徴とする、請求の範囲 １ないし５の方法。 １２）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート核酸が少なくと ももう１つのハイブリッド化配列を含むように行ない、少なくとも１つのレポー ターゾンデの選択を特異的なハイブリッド化により直接的又は間接的に行なわせ 、そしてそのレポーターゾンデがその増加されるべき核酸へ導く或る反応又は或 る１連の反応の遊離物を形成することを特徴とする、請求の範囲１ないし５の方 法。 １３）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート核酸がその５′ 末端にもう１つのハイブリッド化配列を含むように行ない、ｃＤＮＡをその３′ 末端に置かれたハイブリッド化配列により或るレポーターゾンデにハイブリッド させてそれにより少なくとも部分的に二重鎖ＤＮＡを生じさせ、そしてこの後者 がその増加されるべき核酸へ導く或る反応の遊離物を形成することを特徴とする 、請求の範囲１ないし５の方法。 １４）その増加されるべき核酸の準備調整を、そのテンプレート核酸がその５′ 末端にもう１つのハイブリッド化配列を含むように行ない、そのｃＤＮＡを或る キャリヤに結合させ、少なくとも１つのレポーターゾンデの選択をそのｃＤＮＡ の３′末端に置かれたハイブリッド化配列の特異的ハイブリッド化及び結合され ていないレポーターゾンデの洗浄除去によって行なわせ、それにより少なくとも 部分的に二重鎖ＤＮＡを生じさせ、そしてこの後者がその増加されるべき核酸へ 導く或る反応の遊離物を形成することを特徴とする、請求の範囲１ないし５の方 法。 １５）段階１において準備調整されるその増加されるべき核酸が第２段階におい て或るＲＮＡ複製系により増幅される複製ＲＮＡであり、その際その複製ＲＮＡ についてその安定性が保証されるように反応条件を選ぶことを特徴とする、請求 の範囲１ないし５、７、９、１０、１１、１３及び１４の方法。 １６）段階１において準備調整されるその増加されるべき核酸が第２段階におい て成るＤＮＡ複製系により増幅される複製ＤＮＡであることを特徴とする、請求 の範囲１ないし８、１０、１１及び１３の方法。 １７）その増加されるべき核酸が成るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は或る リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）或いはＬＣＲとＰＣＲとの組み合わせによって増幅 されることを特徴とする、請求の範囲１ないし６及び１０の方法。 １８）テンプレートＲＮＡが逆転写酵素反応によって脱離され、そのその増加さ れるべき核酸が転写に基づく多重酵素的方法によって増幅され、そしてテンプレ ートＲＮＡの脱離が行なわれた後にその反応条件をＲＮＡの安定性が保証される ように選ぶことを特徴とする、請求の範囲１ないし１１及び１３の方法。 １９）その増加されるべき核酸が二重鎖ＤＮＡの合成及びこのものの制限酵素に よる消化を含むサイクル的方法によって増幅されることを特徴とする、請求の範 囲１ないし５、１２及び１４の方法。 ２０）逆転写酵素反応が行なわれた後にそのテンプレートＲＮＡを反応物として 脱離させることを特徴とする、請求の範囲１５ないし１７及び１９の方法。 ２１）逆転写酵素活性が、或る、天然に存在するか、組換えにより生じたか、又 は遺伝子操作によって作られてその宿主が人、動物又は植物起源の、或いは単細 胞生物の原核細胞又は真核細胞であるようなレトロエレメントと組み合わされて いるか、又は細胞性の、或いは非細胞性の諸エレメント、ウイルス又は全ての種 類の粒子と組み合わされていることを特徴とする、請求の範囲１ないし２０の方 法。 ２２）被検物が少なくとも部分的に生物各的物質よりなるか又はそれから作り出 され、或いはそれから変性され、そしてこれが液態であるか、又は可溶性の形又 は懸濁液にされる物質であることを特徴とする、請求の範囲１ないし２１の方法 。 ２３）彼検物の処理を溶解的方法、中でもウィルス粒子の界面活性剤による溶解 によって行なうことを特徴とする、請求の範囲１ないし２２の方法。 ２４）種々の疾病の診断のために請求の範囲１ないし２３の方法を利用する方法 において、逆転写酵素の活性をそれらの疾病と関連させてあり、その際これらは この方法に用いられた種々の薬剤と関連されているか、又はそれらにより惹起さ れるものであることを特徴とする方法。 ２５）「ウイルス負荷」の定量化のために請求の範囲１ないし２３の方法を利用 する方法において、或る定量的方法によって或る一定量の被検物の中に存在する 逆転写酵素の活性を定量的に決定することを特徴とする方法。 ２６）生物学的な種々の産生物のスクリーニングのために請求の範囲１ないし２ ３の方法を利用する方法において、それらの生物学的産生物を逆転写酵素活性の 存在又は非存在について調べるか、又は逆転写酵素活性の測定によって、種々の レトロエレメントと関連させた、逆転写酵素活性の失活に用いられた方法の有効 性を制御することを特徴とする方法。 ２７）或る物質の阻害作用を検査するために請求の範囲１ないし２３の方法を利 用する方法において、その彼検物中に存在する逆転写酵素活性を用いてその逆転 写酵素活性を阻害する物質の作用を調べることを特徴とする方法。 ２８）研究特色のある種々の検査の枠内で逆転写酵素活性を決定するために請求 の範囲１ないし２３の方法を利用する方法。 ２９）少なくとも１種類の典型化試薬と、少なくとも１種類の正の、及び少なく とも１種類の負の調節用試薬とを含む、請求の範囲１ないし２８の方法を実施す るための典型化キット。 ３０）少なくとも１種類の典型化試薬と、少なくとも１種類の正の、及び少なく とも１種類の負の調節用試薬とを含む、請求の範囲１ないし２８の方法を実施す るための典型化キット。 ３１）人を宿主として持つＨＩＶ、ＨＴＬＶ、Ｂ型肝炎ウイルス又は他の種々の レトロエレメントと関連させた逆転写酵素活性を同定するための種々の試薬を含 む、請求の範囲１ないし２８、及び３０に従う、人の医薬のための典型化キット 。 ３２）それぞれ特定の動物種を宿主として持つようなレトロエレメントと関連さ せた逆転写酵素活性を同定するための種々の試薬を含む、請求の範囲１ないし２ ８、及び３０に従う、獣医薬用典型化キット。 ３３）植物を宿主として持つコーリモウイルス又はその他のレトロエレメントと 関連させた逆転写酵素活性を同定するための種々の試薬を含む、請求の範囲１な いし２８、及び３０に従う、農業生物学のための典型化キット。 ３４）この方法の第３段階において第２段階の生成物を検出するために粒子凝集 評価法を用いること、及び反応性の基と、又はこの方法の第２段階からの増幅さ れた生成物に対して特性的な配列と選択的に結合したときに粒子の可視的な凝集 反応をもたらすように少なくとも１種類のリガンド又は１種類の核酸で覆われて いる適当な粒子が含まれていることを特徴とする、請求の範囲１ないし３３に従 うキット。