JP5532635B2 - 核酸含有リポソームを用いた遺伝子解析方法及び遺伝子解析キット - Google Patents

Description

本発明は遺伝子解析に生じる可能性のある擬陽性、擬陰性結果を判定するための核酸含有リポソーム粒子を用いたコントロールに関する。さらに、これらの粒子を用いた核酸増幅を含む遺伝子解析の方法及び上記方法を行うためのキットに関する。

近年、遺伝子に関する研究が盛んに進められている。良く知られているようにデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列によって、遺伝情報を保持している。これらの遺伝情報を、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に代表されるような遺伝子解析技術により調査することにより、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬の開発等に活用される。

遺伝子解析うち、検査の工程では、検体から抽出された核酸が、指標となる塩基配列に一致するか否かで判定される。検査結果での陽性・陰性は、真の結果の結果だけでなく、誤検出の場合を含んでいる。誤検出の場合、擬陽性、擬陰性ということになる。以下に主な誤検出の要因と、関連する従来技術を掲げる。

・反応の失敗による誤検出
生体サンプルには核酸増幅に用いられる酵素を阻害する物質が数多く存在し、サンプル調整段階でこれらの物質の除去が不完全であると偽りの陰性結果が得られる恐れがある。また、アッセイ操作の間違った実施により偽りの陰性結果が得られる可能性がある。

これらの誤検出の可能性を排除するために、従来から試料内の核酸配列の一部を内部標準として用いる方法が知られている。例えば、検査出する標的物質がｍＲＮＡである場合、逆転写及び増幅の２つの操作のコントロールとして、標的ｍＲＮＡの他にハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）についても同時に逆転写と増幅を行う。ハウスキーピング遺伝子は細胞の分化に関係なく、一定の量を持続的に発現される遺伝子であり、常に一定量のｍＲＮＡが細胞内に存在するため、これを標準とした標的遺伝子の発現量を算出することが可能である。また、試料に存在しない別核酸を外部から添加し、これを内部標準として用いられる例の報告がある。試料に予め存在する配列より標的遺伝子に類似している配列を添加した内部標準が設けられ、増幅効率の均一さが得られるという利点がある。しかしながら、単独に標準核酸を添加した場合、例えば遠心分離などの処理工程で、標的物質から分離されてしまったり、破壊されてしまったりすることから、内部標準として用いることが困難である。この問題を解決するために、特許文献１では、リポソームによってカプセル化した核酸を用いることで、早い段階から内部標準として検体へ添加することを可能としている（リポソームについては、特許文献１〜４、非特許文献１〜８参照）。しかしながら、特許文献１では、あくまで内部標準の核酸との対比により擬陰性か否かを判定するのみであるから、複数の要因によって生じる誤検出に対応することはできない。特に、擬陽性の検出は不可能である。

・検体の取り違えによる誤検出
解析結果の真偽を判別するための標識方法で、核酸、抗体または抗原から選択した非粒子巨大分子の第一化合物（シグナル化合物）、例えば、核酸を品物又は物質の製造中にその中へ入れ、品物又は物質が本物である場合にシグナル化合物に結合することができる標識された核酸プローブをシグナル化合物が占め得る領域に接触させ、このプローブがこの領域でシグナル化合物とハイブリダイズするかどうかを判定する方法が開示されている（特許文献５）。しかし、これらの検出システムの目的は物品の真偽判定であり、製造中に或いは製造後に物品のラベル化工程を行うのが前提である。また、ある規格品或いはロットの全製品に統一のラベル種類を付加して、統一のセンサーによりこの情報の解析が行われ、個別化が必要である臨床検体や実験試料の取違え防止に適していない。

臨床検査の取違え防止策として、複数の人から採取した検体のそれぞれの成分の定性・定量分析を実行する自動分析装置では、サンプル（検体）を容器に入れ、そのサンプル容器を自動分析装置にセットすることにより分析を実行するようになっているのが一般的である。このとき、あるサンプル容器にどの人（或いはどのような種類（血清，尿等）のサンプルが入っているかを識別するため、サンプル容器毎にバーコード等の情報記録媒体を用いたＩＤを付与することが普及している。この方法によれば、サンプルの取り違えにより、サンプルの特定成分に異常がある人が異常なしと判断されるようなミスの発生が減少する。また、オペレータがサンプル容器毎に、いちいちサンプルの情報を自動分析装置に登録するという手間も省くことができる。自動分析装置において、容器に貼着されたバーコードを自動的に読み取る技術については、例えば特許文献６に記載されてある。

しかし、上記検体取違え防止システムは定性・定量分析が完全に自動化されている検査に限り有効であるが、現実的にはいずれかの工程で人間の手による工程が含まれると考えられる。検体検査操作に手動工程が混合している場合、オペレータがバーコードを読み取る方法では検体の取違えが生じる可能性がある。

・キャリーオーバーによる誤検出
対象の分析工程の前に行った反応の生成物（キャリーオーバー）を検出してしまうことで、誤検出が発生するおそれがある。前段階で行った反応生成物のキャリーオーバーによる汚染を解除するために、ＰＣＲ反応組成にデオキシウラシルトリフォスフェート（ｄＵＴＰ）を用いて増幅して、検出終了後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）で増幅産物の分解処理を行う方法がある。試料の核酸に影響は最小限でありながら、ＰＣＲ生成物を１０^７倍減少することができる（非特許文献９）。しかし、ＵＮＧ処理のために全体の検査時間が長くなる欠点がある。また、検出反応を開始する前にＵＮＧ処理を行う場合、室温での処理になるため、ホットスタートＰＣＲ対応が用いられない場合、非得意的増幅の可能性が高まる。

特表２００４−５１３６２４号公報 特表平８−５１０７４８号公報 ＷＯ００／０３６８３ ＷＯ０２／１８６３５ ＷＯ８７／０６３８３ 特公平８−６４０７０号公報

Ｎｉｃｏｌａｕ Ｃ， Ｌｅｇｒａｎｄ Ａ， Ｓｏｒｉａｎｏ Ｐ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ， １９８４； １０３： ２５４−２６７ 平成１６年度特許流通支援チャート 独立行政法人工業所有権情報研修館 ２００５年５月 Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ ｅｔ ａｌ． Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ： ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８７； ８４： ７４１３−７４１７ Ｓｅｎｉｏｒ Ｊ． Ｉｓ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ？ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９８２； １４５： １０９−１１４ Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ ＭＬ， Ｄｏｓｉｏ Ｆ， Ｃａｔｔｅｌ Ｌ． Ｓｔｅａｌｔｈ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ， ｒａｔｉｏｎａｌｅ， ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄ ２００６； １４５： ２９７−３１５ Ａｌｌｅｎ ＴＭ， Ｈａｎｓｅｎ Ｃ， Ｍａｒｔｉｎ Ｆ， Ｒｅｄｅｍａｎｎ Ｃ， Ｙａｕ−Ｙｏｕｎｇ Ａ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｓｈｏｗ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ。 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９； １０６６（１）：２９−３６． Ｋａｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９１； ２６６（５９）： ３３６１−３３６４ Ｂｅｒｇ ＥＳ， Ｓｋａｕｇ Ｋ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ， ２００３； ５５： ３０３−３０９ Ｐａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ （ＵＮＧ） ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ． １９９２ Ｊｕｎ；６（３）：２５１−６

上述のように、遺伝子解析において、様々な要因で生じる擬陰性、擬陽性を判定するのは非常に困難である。本発明はこのような問題を鑑みて、種々の要因で生じる擬陰性、擬陽性を判定することができる遺伝子解析方法を提供することを目的とする。

本願の第一の発明は、内部標準として標準核酸含有リポソームを用いた標的遺伝子の検出を行なう遺伝子解析法であって、検体に互いに配列の異なる２種類以上の標準核酸を含むリポソームを添加する工程と、検体に含まれる細胞及び標準核酸を含むリポソームから検体由来核酸及び標準核酸を精製する工程と、精製した検体由来核酸及び標準核酸を含む溶液に所定の増幅反応を行うための試薬を混合し、核酸増幅反応を行なう工程と、 核酸を検出する工程と、検出結果から検出の成否を判定する工程とを含み、前記検出の成否判定には、検出結果が擬陽性、偽陰性の判定を含むことを特徴とする遺伝子解析法である。この発明によれば、標準核酸含有リポソームを用いた誤検出の判定が可能となる。標準核酸含有リポソームを用いることにより、検体の採取した早い段階から内部標準を導入することができ、検体取り違え等に起因する誤検出を防ぎ、遺伝子解析の信頼性を向上させることができる。

また第二の発明は、当該遺伝子解析法において、前記試薬には、少なくとも標的遺伝子を増幅するための試薬と、標準核酸を増幅するための試薬を含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析法である。
また第三の発明は、当該遺伝子解析法において、前記試薬には、他の検体に用いた標準核酸含有リポソームの標準核酸を増幅するための試薬を含むことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子解析法である。
また第四の発明は、当該遺伝子解析法において、前記リポソームが核酸結合タンパク質を含んでいることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第五の発明は、当該遺伝子解析法において、前記リポソームは、検体溶液に添加して３日経過したときにその９０％以上は安定であることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第六の発明は、当該遺伝子解析法において、検体の細胞から遊離された核酸と同条件で標準核酸を精製する工程を含む遺伝子解析法である。
また第七の発明は、前記標準核酸含有リポソームを複数用いることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第八の発明は、当該遺伝子解析法において、前記標準核酸の長さは４０〜２００ｍｅｒであることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第九の発明は、当該遺伝子解析法において、前記標準核酸がプラズミド核酸であることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第十の発明は、当該遺伝子解析法において、前記標準核酸は解析する検体に存在しない配列を有する遺伝子増幅産物であることを特徴とする遺伝子解析法である。
また第十一の発明は、当該遺伝子解析法において、上記発明のいずれかに記載の遺伝子解析法を用いる遺伝子解析キットである。

本発明によれば、臨床検査現場で起きる可能性のある検体や試料の臨床検体の取り違えミスを減少させることが可能となる。また、検体からの核酸精製や増幅反応、分析が正常に行われているかどうかを確認することができる。更に、解析機内に以前解析した別検体からの反応産物のキャリーオーバーを検出することができる。従って、臨床サンプルから核酸を精製して増幅工程を含む解析の全プロセスに共通のコントロールを用いることにより擬陽性及び擬陰性の検出が可能となり、低コストで遺伝子解析の信憑性を大幅に上昇することが可能となる。

本発明を用いた遺伝子解析の一例の説明図 本発明を用いた遺伝子解析の一例の説明図 本発明を用いた遺伝子解析の一例の説明図 本発明を用いた遺伝子解析の一例の説明図

本発明の遺伝子解析方法は、内部標準として１種類以上の標準核酸を含む１種類以上のリポソームを臨床検体や実験試料に混合し、分析の過程で該標準核酸を公知の方法により検出して、反応の失敗やサンプルの取違え、キャリーオーバー等に起因して生じる誤検出（擬陽性を含む）が生じていないか確認することを可能とするものである。
以下、遺伝子解析工程の手順に従って説明する。

・第一段階／リポソームの準備
まず、内部標準として標準核酸を導入するためのリポソームを用意する。リポソームとは水溶液層に存在するコロイド粒子を結成している脂質二重層を指す。電荷を持たない脂質のみで構成されたリポソームの形成は可能であるが、負電荷を持つ核酸が分子同士で反発し、リポソームへ導入効率は好ましくない。このため、カチオン性残基を修飾した脂質を用いることが、核酸の導入率の上昇が得られると考えられるため好ましい。また、血液検体での安定性を増すためにポリエチレングリコールを修飾した脂質を用いることが好ましい。また、検体内細胞を破壊するために使用される条件と同等な条件でリポソームが破壊されることが好ましい。例えば、検体処理にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ ０．５％以上含有の細胞破壊液を用いる場合、リポソームはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ ０．５％以下の条件では破壊しないための組成を有しなければならない。つまり、細胞を破壊し細胞内の核酸を遊離するため一般的に化学処理（界面活性剤やタンパク質分解酵素、等）が用いられるが、リポソームはこの化学処理に対する耐久性は細胞と同等であることが望ましい。リポソームに用いられる脂質やタンパク質、添加物の組み合わせにより適度な化学的耐久性をもたらすことが可能である。また、リポソームに用いる脂質類は後工程の核酸精製や、核酸増幅、遺伝子検出の反応の阻害をしないものを選択する。

さらに用いるリポソームの特性として、臨床検体の生体内で安定であることが望まれる。その指標としては、臨床検体（例えば、全血や、血漿、唾液、尿、精液、膵液等の体液）にリポソームを添加し、３日経過時点で添加したリポソームの９０％以上が変質せずに安定であることである。

血液に注入されるリポソームの代謝速度は様々な要因により変更する。一つ目の要因としてリポソームの大きさが挙げられる。リポソームが大きいほど代謝が早い傾向を示す（非特許文献４）。リポソームの血中代謝速度のもう一つの因子として、リポソームの電荷が報告されている。電荷を持たないリポソームは負の電荷を持つリポソームより安定性が高いが、親水性物質の導入率は低い。一方、カチオン性リポソームは核酸の導入率は高いが、毒性も高く、血液からの排除は早い。これらの問題を回避するために、リポソームの外面に血清に存在するアルブミンやＩｇＡ等、或いはコレステロール（ＣＨＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾することにより血中での安定性を増すことが可能である（非特許文献５）。特にＰＥＧ修飾は有効な方法であり、幅広く使用されている（特許文献２、非特許文献５、非特許文献６）。

リポソームの外面の電荷はカチオン性であると毒性が高いが、リポソーム内にカチオン性物質を核酸と結合し、凝縮させることによりリポソームの細胞内取り込み後、エンドヌクレアーゼ等核酸分解酵素から核酸を保護し、安定性が増す。カチオン性凝縮剤として、抗生物質であるグラミシジンＳやｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ， ｃａｓｃａｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，カチオン化変動アルブミン、ポリリジン、ポリアルジニン、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）、スペルミジン、スペルミン、また、自然核酸結合物質であるヒストンやプロタミン、ＨＭＧ１等が挙げられる（特許文献２、非特許文献７）。

このように生体的に安定なリポソームを用いることで、臨床検体や実験試料に標準核酸導入したリポソームを混合し、分析の過程に混合標準核酸を検出して検体の取違えが生じていないか確認することにより、検体の取り違えを防止できることができる。

仮に核酸分子を単独で検体に添加した場合と比較すると、リポソームを用いた内部標準は、１）試料内に存在する核酸分解酵素活性から内部標準の保護することができるため、試料採取直後に内部標準の添加が可能である、２）試料調整操作として遠心工程等は珍しくないが、リポソームに封入されることにより内部標準は細胞と同等な動きを示し（特許文献２参照）、内部標準のみが上澄みとともに廃棄されることが無くなる、という作用効果をもつため、内部標準を用いた検体の取り違え防止が可能となる。判定方法の詳細については、後述する。

・第二段階／標準核酸の選択
リポソームに導入する標準核酸としては、解析する検体由来のゲノムに存在しない配列であり、且つ、解析の標的である遺伝子と同等な増幅効率を示す標準核酸の選択を行う必要がある。そのために、各標準遺伝子配列は下の工程により選択する：
（１） 標準核酸の配列の設計
まず標準核酸の配列を設計する。標準核酸としては、入手が容易な人工合成核酸が好ましい。核酸の長さとしては、核酸の安定性、検出容易性、増幅効率の観点から４０〜２００ｍｅｒとするのが好ましく、より好ましくは、５０〜１２０ｍｅｒである。
（２） 増幅プライマーの設計
解析の標的である遺伝子を増幅するためのプライマーと同等なＴｍ等を有する標準遺伝子を増幅プライマーの設計を行う。このようなプライマーの設計を行なうことにより、標準核酸についても標的遺伝子と同じ条件で増幅することができる。
例えば：人工ＤＮＡ配列１（標準核酸１）に対して、人工ＤＮＡ配列２（Ｆプライマー１）及び人工ＤＮＡ配列３（Ｒプライマー１）を設計する
人工ＤＮＡ配列１：
３‘ｃｃａａｃｇｔｃａｔｃｃａｔｃａｇｇｔｇｃｔａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ ａａａａａｇａｔｇａｃｇｔｔｇｇａｇｃａｃｃｔｇａｔｇｇ ５’（１０５塩基）
人工ＤＮＡ配列２： ５’ ａｇｃａｃｃｔｇａｔｇｇａｔｇａｃｇｔｔｇｇ ３’ （２２塩基、Ｔｍ＝５７℃）
人工ＤＮＡ配列３： ５’ ｇａｔｇａｃｇｔｔｇｇａｇｃａｃｃｔｇａｔｇｇ ３’ （２３塩基、Ｔｍ＝５８℃）
（３） 検体との相補性検査
ＧｅｎｅＢａｎｋ等のデータベースにＢＬＡＳＴ相補性検査を行い、検体由来のゲノムに同配列の不存在を確認する（データベースとしては、例えばｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照）。即ち、最小Ｅ ｖａｌｕｅは１以下であるか確認をする。Ｅ （ｅｘｐｅｃｔｅｄ） ｖａｌｕｅは、ある長さの塩基配列を検索した場合、“偶然”により同配列がデータベースに存在する可能性を示し、低いほど特異性が高い。

本発明に用いる核酸としては、ＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）やペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いることができ、また、１本鎖の核酸を用いることも、２本鎖の核酸を用いることもできる。本発明の標準核酸に含まれる核酸は、通常は１種類の核酸であるが、互いに配列の異なる２種類以上の核酸を含ませることもでき、この２種以上の核酸を含む標準核酸を、１サンプルに混合することにより使用することもできる。標準核酸に２種類の核酸を含ませた場合には、混合された２種類の核酸のそれぞれを検出することにより、信頼性の程度を、１種類の標準核酸を用いた時よりも向上させることができる。

核酸は、化学的又は酵素的に合成し、あるいは、天然物から抽出したＤＮＡを分解するなどして得ることができる。化学的に合成する方法としては、固相合成法および液相合成法が挙げられる。固相合成法とは、樹脂やガラス製のビーズ、チップ等の支持体上で、ホスホアミダイト法、ホスホトリエステル法等によりＤＮＡを化学合成する方法である。例えば、ホスホアミダイト法によりＤＮＡを合成する場合には、固相である担体粒子の表面に、アミノ基等の活性基を介して、オリゴヌクレオチドの配列における一番目の塩基に対応するホスホアミダイトを結合させ、ホスホアミダイトのトリチル基を脱離（脱トリチル）させてヒドロキシル基を露出し、次に結合させる塩基に対応するホスホアミダイトを、露出したヒドロキシル基との間で縮合反応させる、というホスホアミダイトの縮合反応を繰り返すことによりＤＮＡを合成する方法である。液相合成法では、縮合反応を行うごとに、反応生成物を単離生成し、次のヌクレオチドを縮合する。

酵素的に合成する方法としては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、１対のプライマー及び鋳型ＤＮＡを含む反応溶液の温度を昇降させることにより、鋳型ＤＮＡの所望の部分を増幅させるＰＣＲ法が挙げられる。また、ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡからＲＮＡを合成し、逆に、逆転写酵素によりＲＮＡからＤＮＡを合成することもできる。

また天然物から抽出したＤＮＡを分解することにより、本発明で用いる核酸を得る方法としては、動物細胞、植物細胞、ミトコンドリア、葉緑体、細菌、ウイルス等を使用し、除蛋白処理をした後、ＤＮＡ又はＲＮＡを精製して、制限酵素又はリボザイム、或いは、ジメチル硫酸などの化学的試薬により分解する方法が挙げられる。

本発明の標準核酸に、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を用いる場合には、ペプチド核酸モノ
マーを用いて、通常のペプチド合成法であるＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法によりペプチド
核酸を合成することができる。

本発明では、複数の標準核酸を用いて、これを内部標準とすることができることを特徴とすることから、各内部標準となる標準核酸で配列が異なり、また核酸の種類が異なっても良い。

本発明本発明に用いる標準核酸は、核酸を標識したものであってもよい。核酸を標識するものとしては、蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、電気化学的標識、アフィニティー標識、エピトープ標識が挙げられる。
本発明において、蛍光標識とは、蛍光を発する化学構造を持つ物質による標識であり、例えば、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィン、クマリン、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ及びＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム ファルマシア バイオテク社）等による標識が挙げられる。本発明において、ラジオアイソトープ標識とは、自ら放射線を発する放射性同位体による標識で、例えば、炭素又はリンの放射性同位体を標識として用いることができる。本発明において、電気化学標識とは、電気化学的に活性な物質による標識で、例えば、フェロセン、フェリシアナイド、金属ビピリジン錯体等による標識が挙げられる。本発明において、アフィニティー標識とは、特定の他の化学物質との親和性を有する化学物質による標識をいい、例えば、ビオチン、アビジン、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などによる標識が挙げられる。エピトープ標識とは、抗体に認識される抗原となる物質による標識をいい、例えば、抗原となる化合物や蛋白質により標識することができる。
これらの標識は、サンプル（臨床検体又は実験試料）に混合した核酸を検出するために使用するものである。すなわち、これらの標識を用いて、蛍光検出、放射線検出、電気化学的検出、免疫学的検出等を行うことができる。アフィニティー標識で核酸を標識した場合には、このアフィニティー標識を介してさらに他の標識、例えば、酵素標識などを結合させることができ、酵素標識等により核酸を検出することもできる。酵素標識としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。

また本発明に用いる標準核酸は、リポソームによって保護されているが、これとは別に保護基により修飾されたものであってもよい。保護基としては、核酸分子に結合して天然の核酸とは異なる化学構造とするものであればよいが、例えば、トリチル骨格、アシル骨格、カルバメート骨格、アミジン骨格を有する保護基が挙げられる。これにより、標準核酸を保護し、核酸分解酵素により分解されることを防ぐことが可能となる。

・第三段階／標準核酸の増幅条件の選択
標準核酸の増幅速度及び増幅効率は検体由来核酸と同等である必要がある。検体由来核酸より高い効率を示した場合、例えば、精製工程が不十分であり、阻害物質が多く含有したとすると、増幅工程の効率が標準より減少して、標準核酸のみが増幅し、検体由来の核酸増幅が起きない可能性がある。この場合、標準核酸の一連の増幅反応や検出は正常に行われるが、検体由来の核酸の増幅効率が悪いため数が少なく検体は陰性であるという解析結果が得られる可能性が生じる。従って、例えばリアルタイムＰＣＲでモニタリングし、検体由来の核酸とほぼ同等なサイクル数で標準核酸の増幅の検出が可能な標準核酸濃度を選定する。

・第四段階／核酸含有リポソームの作成
前述の標準核酸を導入するリポソームとしては、核酸結合タンパク質添加リポソームであることが好ましい。核酸結合タンパク質はヒストンやラミン、ＮＨＮＰ（Ｎｏｎ−ｈｉｓｔｏｎｅ核たんぱく質）等を含むタンパク質群から選択される。リポソームの核膜は二重の脂質二重幕構造をとり、外膜は小胞体とつながっている。内膜はラミン（タンパク質）からなる中間径フィラメントが格子状に裏打ち構造を形成し核の形態を保っている。核酸（染色体）はこのラミンや核タンパク質（ヒストン、等）に結合していて、これらのタンパク質の除去状態により精製効率は異なる。リポソームに含む標準核酸を予めタンパク質と結合させた核酸結合タンパク質添加リポソームを用いることで、検体由来核酸と同等な条件でリポソームに含まれる標準核酸の精製を行うことが可能である。負の電荷を持つ核酸との結合率を上げるために正の電荷（カチオン性）を持つタンパク質を用いるのが望ましい。また、これらのタンパク質は増幅反応や検出の阻害を起こさないものを選択する。一つの核酸含有リポソームには複数の核酸を複数種類の標準の核酸を含んでいてもよく、また異なる標準核酸配列を有する複数種類の核酸含有リポソームを用意しても良い。このように様々なパターンを用意することによって、後述するように、様々なパターンの誤検出を特定することが可能となる。

・第五段階／検体からの核酸の抽出
検体（例えば、全血や、血漿、唾液、尿、精液、膵液等の体液）に１種類以上の個別配列を有する標準核酸を含むリポソームを添加し、核酸精製試薬を用いて両検体由来核酸及びリポソーム由来の標準核酸を分離精製して抽出する。このとき複数のる標準核酸含有リポソーム添加しても良い。混合された２種類の核酸のそれぞれを検出することにより、信頼性の程度を、１種類の標準核酸を用いた時よりも向上させることができる。

まず検体の細胞から核酸を遊離させるために、細胞を破壊する必要がある。細胞を破壊するとしては、界面活性剤や尿素、グアニジウム塩、タンパク質分解酵素、細胞壁分解酵素、等を含む試薬群から選択される１以上を含む細胞破壊試薬を用いる方法、蒸留水等を用いて浸透圧ショックを与えて破壊する方法、超音波処理、加熱処理、レーザー処理、凍結融解等の物理処理により破壊する方法、を挙げることができる。いずれの方法においても、リポソームは検体の細胞と同じ条件で破壊されることが重要である。

次に、ガラス（シリカ）や樹脂、金属性等の核酸吸着担体、あるいはゲルろ過担体、タンパク質吸着担体等を含む担体により検体の細胞から遊離された核酸及び標準核酸を精製する。

・第六段階／精製核酸増幅工程
次に、精製核酸の増幅を行なう。本発明では、所定核酸領域に対して増幅反応させるための試薬を混合するが、これは複数の増幅反応サンプルを用意し、それぞれに各所定核酸領域に対して増幅反応させるための試薬を混合してもよく、あるいは一つのサンプル内で複数の増幅試薬を混合してもよい。例えば、検体由来の核酸及びリポソーム由来の標準核酸を含む精製核酸を複数のサンプルとして分注した後、試薬として標的遺伝子を増幅するためのプライマーの組を混合し、増幅反応させる一つのサンプルと、試薬として標準核酸を増幅するためのプライマーの組を混合し増幅反応させる一つのサンプルを用意する。これらのサンプルは、増幅に必要な組成、例えば緩衝液、塩、ポリメラーゼ酵素、プライマー等を含んでいる。

さらに、異なる配列を持つ複数の核酸含有リポソームを検体に添加していた場合には、これらについても増幅反応させるための試薬を混合することが好ましい。例えば、複数の標準核酸を増幅するためのプライマーの組を含んで増幅反応を行なう別のサンプルを作成する。このように複数の標準核酸を用いることにより、特定の検体特有の擬陰性・擬陽性原因の特定が可能である。またさらに、検体由来核酸及び標準核酸に存在しない核酸領域を増幅するためのプライマーの組を含んだサンプルを一又は複数作成する。ここで選択するプライマーの組は、例えば直線に解析した別の検体に添加した核酸含有リポソームの核酸を増殖させるプライマーである。このよう別の検体に含まれる標準核酸についても増幅反応させるための試薬を混合しておくことで、それぞれ検体に別々の核酸含有リポソームを添加しておけば、後述のようにキャリーオーバーや検体取り違えが判明する。

本発明では、内部標準である標準核酸が、検体に添加された時点ではリポソームによって保護されていることから、検体試料採取直後に内部標準の添加が可能である。さらに、これに加えて精製処理の後に標準核酸を添加されたサンプルとの比較により、精製操作の信憑性の判定が可能となる。

核酸増幅反応は、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）や、ＬＡＭＰ （Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）等の方法を用いて核酸増幅反応を行うことができる。

・第七段階／増幅産物を用いた遺伝子検出試験
増幅した核酸を検出するために様々な方法が存在する。例えば、電気泳動法や、ＴａｑＭａｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎを用いたインタカレータ法、固相に固定化しているプローブとのハイブリダイゼーション検出、濁度法等などが挙げられる。例えば、上記ＰＣＲ反応で増幅した核酸の検出法として、電気泳動法を用いることができる。ＰＣＲ産物の電気泳動を行うために必要な試薬と混合し、電気泳動を行うと標的遺伝子が検体由来核酸に存在する場合、容器１に相当する反応液では、増幅領域の大きさの泳動距離を示すバンドの検出ができる。

また、遺伝子の存在に限らず、遺伝子型の分析が必要な場合、上記ＰＣＲ産物をＴａｑＭａｎ法やＩｎｖａｄｅｒ法の鋳型として用いることも可能である。例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ反応を行うための試薬をさらに添加し、必要な温度条件を与えることにより遺伝子型（多型）の解析が可能である。また、遺伝子型の分析に必要な試薬類はＰＣＲ反応開始時に充填しても良い。

・第八段階／解析
検体由来の核酸に標的遺伝子が存在する場合、上記例で示した検出試験により各サンプルの陰性、陽性結果が得ることができる。当該検出結果から検出の成否を判定することが可能である。

本発明の遺伝子解析法を用いた例として、以下の表１に示したサンプル群からなる遺伝子解析キットを用いて遺伝子解析を行なった場合の判定の例を説明する。検体由来核酸及び標準核酸に存在しない標準核酸Ｂ及びＣは、例えば、解析検体の前に処理した検体に添加された核酸含有リポソームに含まれるものである。

図１〜４に検出までの流れ及び正常反応の場合と、擬陰性・擬陽性が生じている場合の各ケースを示した。
例えば電気泳動法により検出試験を行なったとすると、増幅産物に相当するバンドの検出が可能であり、バンドに該当すれば当遺伝子に関しては解析に用いた検体は陽性であることが分かる（図１）。一方、サンプル２の標準核酸増幅反応液でもバンドの検出が得られたら、核酸抽出や増幅反応は正常に起きたことが分かる（図２）。サンプル３及びサンプル４は本試験に存在しない核酸配列を増幅するための反応液に相当するために、バンドは得られない（図３、図４）。また、上記と異なる結果が得られた場合、各ケースの解釈は以下の表２の通りとなる：

上記ケース２と３は解析検体の前に処理された検体に添加されていたリポソームの種類が明らかになり、例えばそれにＣという標準核酸が必ず含まれていた場合、解析検体の検査結果に例えばサンプル３は陽性であるが、サンプル４が陰性であると、この前の検体からのキャリーオーバーが起きていないと分かる。従って、サンプル取り違えの可能性が高くなる。この様に、同遺伝子検査機器等を用いて前に処理した検体に用いられたリポソームの情報と照らし合わし、ケース２と３の区別を明確にし、使用する標準核酸の種類を２〜２０に制限し、これらの組み合わせを用いるのが好ましい。

以上のように、上記の例では複数の核酸含有リポソームを用いて、これに対応する複数のサンプルを用意することにより、様々な誤検出の原因を推定することができる。

本発明は、臨床検体或いは実験試料の取違え防止や反応の正当性検査、核酸増幅産物のキャリアーオーバーのモニタリングをするための統一したツールとして有用である。

Claims (11)

1. 内部標準として標準核酸含有リポソームを用いた標的遺伝子の検出を行なう遺伝子解析法であって、
   検体に互いに配列の異なる２種類以上の標準核酸を含むリポソームを添加する工程と、
   検体に含まれる細胞及び標準核酸を含むリポソームから検体由来核酸及び標準核酸を精製する工程と、
   精製した検体由来核酸及び標準核酸を含む溶液に所定の増幅反応を行うための試薬を混合し、核酸増幅反応を行なう工程と、
   核酸を検出する工程と、
   検出結果から検出の成否を判定する工程とを含み、
   前記検出の成否判定には、検出結果が擬陽性、偽陰性の判定を含むことを特徴とする遺伝子解析法。
2. 前記試薬には、少なくとも標的遺伝子を増幅するための試薬と、標準核酸を増幅するための試薬を含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析法。
3. 前記試薬には、他の検体に用いた標準核酸含有リポソームの標準核酸を増幅するための試薬を含むことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子解析法。
4. 前記リポソームが核酸結合タンパク質を含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子解析法。
5. 前記リポソームは、検体溶液に添加して３日経過したときにその９０％以上は安定であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子解析法。
6. 検体の細胞から遊離された核酸と同条件で標準核酸を精製する工程を含む請求項１〜５のいずれかに記載の解析法。
7. 前記標準核酸含有リポソームを複数用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の解析法。
8. 前記標準核酸が人工合成核酸であり、その長さは４０〜２００ｍｅｒであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の解析法。
9. 前記標準核酸がプラズミド核酸であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の解析法。
10. 前記標準核酸は解析する検体に存在しない配列を有する遺伝子増幅産物であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の解析法。
11. 前記請求項１〜１０のいずれかに記載の遺伝子解析法を用いる遺伝子解析キット。

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