CN105039538B - 一种用于血液直接荧光pcr扩增的反应液及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液及其试剂盒，所述PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij‑58、Tween20、甲酰胺。所述血液直接荧光PCR试剂盒，包括用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。该用于血液直接荧光PCR扩增的反应液可将未经提取、纯化处理的血液样本直接用于PCR扩增，从而避免了提取过程中的核酸损失和有毒试剂的使用，使得血液荧光PCR省时、简单方便、成本低廉且扩增效率高。

Description

一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液及其试剂盒。
背景技术
近年来，随着生物、医学、法医学等各相关领域的发展，荧光PCR技术得到了越来越广泛的应用。特别是对于血液遗传病，感染性病毒及疾病和遗传背景分析，荧光PCR技术已经成为不可或缺的基本技术。而血液作为一种重要的生物分析样本,其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂肪等。因此，基于现有技术，无法实现荧光PCR方法直接对血液中的核酸进行扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。目前血液基因组提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、柱提取法和磁珠法。尽管具体的提取方式不一样，但是都包括以下三个过程：一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增失败的可能。此外，由于提取过程耗时长，成本高，且需借助苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增效率高、成本低的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，旨在解决现有技术对血液进行PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题。
本发明的另一目的在于提供一种血液直接荧光PCR试剂盒。
本发明是这样实现的，一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween 20、甲酰胺。
以及，一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括上述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。
本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，通过对PCR反应液中进行合理配制，添加了特异的协同组分，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等DNA聚合酶抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用；同时，促进DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增能直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液的使用，省去了对血液样本进行荧光PCR扩增时进行核酸提取纯化的步骤，避免了核酸的损失，显著提高了荧光PCR扩增的效率和成功率；同时，避免了核酸提取纯化中交叉污染的可能和有毒试剂的使用，复合环保理念。
附图说明
图1是本发明提供的1份人血液样本在不同寡肽浓度的PCR反应液的扩增荧光扩增曲线图；
图2是本发明提供的1份人血液样本在不同dNTP浓度的PCR反应液的扩增荧光扩增曲线图；
图3是本发明提供的1份人血液样本在不同Brij-58浓度的PCR反应液的扩增荧光扩增曲线图；
图4是本发明提供的1份人血液样本在不同Tween 20浓度的PCR反应液的扩增荧光扩增曲线图；
图5是本发明提供的1份人血液样本在不同甲酰胺浓度的PCR反应液的扩增荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例1提供的10份不同来源的人血液样本的进行平行PCR的扩增荧光扩增曲线图；
图7是本发明实施例1提供的第1份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲线图；
图8是本发明实施例1提供的第2份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲线图；
图9是本发明实施例1提供的第3份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲线图；
图10是本发明实施例2和对比例1分别提供的PCR反应液对10份不同来源的血液样本进行平行PCR扩增的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了攻克血液荧光PCR扩增时需对血液样本进行核酸提取、以及血液内含物严重抑制DNA聚合酶活性的血液抑制物问题，发明人意在开发一种避开核酸提取步骤、直接用血液样本进行荧光PCR扩增的方法-即以全血作为模板直接扩增目的基因的血液直接荧光PCR扩增法。该方法主要依赖于选择合适的PCR反应液来实现，具体的，如何研发一种针对血液抑制物及增强DNA聚合酶酶活性的PCR反应液成为了本课题亟待解决的问题。本发明实施例发明人立足于使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等物质变性，同时又能促进DNA聚合酶活性、且对PCR扩增效率无影响、对操作者安全，通过反复的分析研究、经过多次试验，研究出了本发明实施例用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。
本发明实施例提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween 20、甲酰胺。其中，所述寡肽能结合DNA聚合酶，在PCR反应中起保护作用，使所述DNA聚合酶的酶活性不下降；所述Brij-58和所述Tween 20都是非离子去污剂，两者共同使用能够增加血液细胞的通透性，通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中；所述甲酰胺也能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，同时提高PCR反应的特异性。
本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液中，所述寡肽组分能保护DNA聚合酶的酶活性，所述Brij-58和Tween 20组分能增加细胞的通透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用，所述甲酰胺组分除了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高PCR反应的特异性，此外还能够促进DNA聚合酶活性的活性，使得荧光PCR扩增能避开核酸提取纯化过程，直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。因此，不仅简化了荧光PCR扩增的步骤，节省了操作时间，同时降低成本、避免样本间的交叉污染和减小了操作者感染的风险，实现高效率、高成功率扩增检测的目的。
作为优选实施例，所述寡肽为六肽，所述六肽的组成形式为AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6，本发明实施例提供的所述六肽，由于具有相对确定的肽长和结构，对保护DNA聚合酶的酶活性明显优于其他寡肽，其血液扩增效果好。作为进一步优选实施例，通过发明人反复研究发现，所述的PCR反应液中的寡肽为Ser-Phe-Lys-Arg-Gly-Thr时，其特定的空间结构、基团等，对保护DNA聚合酶的酶活性具有最佳效果。
作为一个优选实施例，所述寡肽的浓度为3-20mg/ml，所述寡肽浓度过高，会影响DNA聚合酶的酶活性，从而抑制PCR反应，如图1所示，从左至右寡肽的浓度分别为18mg/ml、12mg/ml、6mg/ml和24mg/ml的4条扩增曲线；所述寡肽浓度过高，则起不到保护DNA聚合酶的作用。以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.05-5％、Tween 20：0.5-0.8％、甲酰胺：2-10％，在该浓度下，3组分能破坏血液细胞膜，使血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，浓度过低，变性不彻底，浓度过高，Brij-58、Tween 20和甲酰胺都会对PCR反应起抑制作用，如图2为从左至右Brij-58浓度分别为0.3％、0.1％和0.6％的3条扩增曲线；如图3为从左至右Tween20浓度分别为0.7％、0.5％和0.9％的3条扩增曲线；如图4为从左至右甲酰胺浓度分别为2％、6％和10％的3条扩增曲线。
进一步地，所述寡肽的浓度为14-16mg/ml。以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.2-0.4％、Tween20：0.7-0.8％、甲酰胺：2-4％。
作为最优实施例，所述寡肽的浓度为15mg/ml，以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.25％、Tween20：0.8％、甲酰胺：3％。
作为本发明另一个实施例，所述PCR反应液中还包括下述组分：Tris-HCl、硫酸铵、氯化镁、dNTPs。其中，所述Tris-HCl能提供一个稳定的反应环境；所述硫酸铵中的NH4 +在高温条件下可以生成NH3和H+，所述NH3有生成氢键的条件，可以破坏非特异退火的引物和模板间的不稳定氢键，提高了退火的特异性；所述氯化镁的Mg2+为DNA聚合酶的辅助因子，增加Taq酶活性，提高扩增效率；所述dNTPs为PCR反应DNA链的合成提高原材料。优选的，下列各组分的浓度分别为：Tris-HCl：10-50mmol/L，pH9.1；硫酸铵：10-50mmol/L；氯化镁：2-5mmol/L；dNTPs：100-600μmol/L。
本发明实施例中，所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为：dATP:dCTP:dGTP:dTTP＝1:1:1:1:1，所述dNTPs的浓度优选为300-600μmol/L，四种所述dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。在PCR反体系中所述dNTP终浓度过高会抑制Taq酶的活性，并且易产生错误掺入，使用低浓度所述dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，而浓度太低，则会降低反应物的产量，如图2所示，3条扩增曲线从左至右dNTPs浓度分别为350μmol/L、450μmol/L和550μmol/L，实验结果显示dNTP浓度为350μmol/L最优。进一步的，所述dNTPs的浓度优选为350μmol/L。
作为进一步优选实施例，所述PCR反应液中下述组分的浓度为：Tris-HCl：15-25mmol/L，pH9.1、硫酸铵：20-30mmol/L、氯化镁：3.5-4.0mmol/L和dNTPs：320-370μmol/L。
作为本发明一个优选实施例，所述血液直接荧光PCR反应液包括Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、dNTPs：350μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％。
作为本发明另一个优选实施例，所述血液直接荧光PCR反应液包括Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.5mmol/L、dNTPs：330μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％。
本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，通过添加特定的添加剂，可促使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等DNA聚合酶抑制物变性，同时提高DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增能直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。从而省去了血液样本中核酸提取纯化的步骤，不需进行除蛋白、乙醇沉淀、白血细胞分离步骤，避免了苯酚等有害试剂的使用，即可快速、高效地释放基因组DNA，降低了血液荧光PCR扩增成本。
相应地，本发明实施例还提供了一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括任一所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。
使用本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液制成的血液直接荧光PCR试剂盒，进行荧光PCR扩增时，省时、简单方便、成本低廉且扩增效率高。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，包括如下浓度或含量的下列组分：Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、dNTPs：350μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％、上下游引物：200nM、探针：200nM，及DNA聚合酶。
将所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液对外周血样本中管家基因GAPDH进行荧光PCR扩增，方法如下：在八联管的每个反应孔中加入上述荧光PCR反应液，然后在每个反应管中加入1μl的血液，在型号为ABI 7500的荧光PCR仪中进行扩增检测。所述荧光PCR扩增程序如下：
第一步骤：95℃，10min，循环1次；
第二步骤：95℃，15s；60℃，45s；循环5次，不收集荧光；
第三步骤：95℃，15s；60℃，45s；循环40次，收集荧光。
使用本发明实施例1提供的血液直接荧光PCR扩增的反应液对10份不同来源的人血液样本中的管家基因GAPDH进行荧光PCR扩增检测，结果如图6所示，所有反应孔的背景信号好、CT值都在20-23之间、各荧光PCR扩增曲线拐点和基线期、指数扩增期、线性扩增期和平台期明显即扩增曲线呈典型的S型，说明本发明实施例提供的血液直接荧光PCR扩增反应液使血液抑制物变性、从而使得PCR过程中未经处理的血液样本干扰作用小，所述PCR扩增反应液适用范围广。
分别将三份不同来源的人血液样本进行荧光PCR扩增检测，每份样本平行三次，结果分别如图7、图8、图9所示，由图可见，每个样本的平行实验，其曲CT值都很接近。表明本发明实施例提供的血液直接荧光PCR扩增反应液具有可靠的重复性。
实施例2
一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，包括如下浓度或含量的下列组分：Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、dNTPs：300μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％、上下游引物：200nM、探针：200nM，及DNA聚合酶。将所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液对10份不同来源的血液样本进行荧光PCR扩增检测，方法如下：在八联管的每个反应孔中加入上述荧光PCR反应液，然后在每个反应管中加入1μl的血液，在型号为ABI 7500的荧光PCR仪中进行扩增检测。
对比例1
使用市场中相似产品VitaNavi公司的Direct Blood PCR Kit对10份不同来源的血液样本进行荧光PCR扩增检测，具体操作过程如下：往八联管的每个孔中加入23μl的PCRMix反应液，然后再取1μl DNA聚合酶加入到PCR反应液中，最后在这PCR反应系统中加入1μl全血。于ABI 7500的荧光PCR仪中进行扩增检测。
实施例2和对比例1提供的PCR反应液对10份不同来源的血液样本进行平行PCR扩增的荧光扩增曲线图如图10所示，其中，靠近前面的10条曲线是本发明实施例2的实验结果，后10条曲线是对比例1的实验结果。实验结果显示本发明实施例2荧光扩增曲线图的扩增曲线拐点和基线期、指数扩增期、线性扩增期和平台期明显，且CT值明显比对照产品小。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，所述PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween 20、甲酰胺，所述寡肽为六肽，且所述六肽的组成形式为AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6，
所述寡肽为Ser-Phe-Lys-Arg-Gly-Thr，
所述寡肽的浓度为3-20mg/ml，
以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：
Brij-58 0.05-5％；
Tween 20 0.5-0.8％；
甲酰胺 2-10％。
2.如权利要求1所述的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，所述寡肽的浓度为14-16mg/ml，以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的重量百分含量分别为：
Brij-58 0.2-0.4％；
Tween20 0.7-0.8％；
甲酰胺 2-4％。
3.如权利要求2所述的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，所述寡肽的浓度为15mg/ml，以所述PCR反应液的总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的重量百分含量分别为：
Brij-58 0.25％；
Tween20 0.8％；
甲酰胺 3％。
4.如权利要求1-3任一所述的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，所述PCR反应液中还包括下述组分：Tris-HCl、硫酸铵、氯化镁、dNTPs。
5.如权利要求4所述的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，下列各组分的浓度分别为：
6.如权利要求4所述的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，其特征在于，所述dNTPs的组成比例为：dATP:dCTP:dGTP:dTTP＝1:1:1:1:1，所述dNTPs的浓度为300-600μmol/L。
7.一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括如权利要求1-6任一所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。
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