CN112574971A - Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明公开的Taq DNA聚合酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒。
背景技术
目前不孕不育症困扰着全球约10％-15％的育龄夫妇，其中男性因素约占50％(Bushnik T et al.,Hum Reprod,2012,27:738-746)。引起男性不育的因素众多，除了内分泌激素紊乱、生殖道炎症、精索静脉曲张、免疫异常和理化等因素外，约30％以上由遗传缺陷导致的精子发育障碍而引起(Bhasin S et al.,J Clin Endocrinol Metab,1994,79:1525-1529；Chang P L et al.,Human Reprod,1999,14:2689-2694)，而Y染色体微缺失是主要的遗传学因素之一(Luddi A et al.,N Engl J Med,2009,360:881-885)。
因此，对Y染色体AZF微缺失进行检测具有重要的临床意义：①可为临床上一些病因不明的男性不育患者找出病因；②可为男性不育患者的临床诊疗提供依据和指导。
目前，对Y染色体微缺失检测的方法主要包括原位杂交法、基因测序法、PCR凝胶电泳法和实时荧光PCR法。实时荧光PCR法具有操作简便、灵敏度高和自动化程度高，不需要电泳检测和杂交等步骤等优点，是一种高效简单的检测方法。但是，实时荧光PCR法对PCR反应体系要求较高，并且当该方法用于同时检测多位点时，不仅对引物和探针的设计要求较高，而且对Taq DNA聚合酶的特异性、扩增能力和稳定性要求较高，具体而言，传统野生型TaqDNA聚合酶在75-80℃时活性最高，但是在温度较低时，该聚合酶的活性依然存在。这就使得在PCR反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，很容易出现引物互搭或引物与模板中的一些非靶点错配的现象，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，形成引物二聚体和非特异性产物。这些引物二聚体和非特异性产物又可以作为引物或模板在以后的PCR循环中继续扩增，使非特异产物不断扩增和累积，如果PCR的循环数较多、扩增子的GC含量较高以及多重PCR体系，也很容易产生引物二聚体和非特异性产物，既降低了目的产物的扩增效率，又影响PCR在检测等方面的应用。
针对上述问题，中国专利CN201711391569.5公开了一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用，所述核酸组合及试剂盒在用于Taqman探针多重荧光PCR检测Y染色体微缺失时具有灵敏度高和特异性强的优点。但进一步研究发现上述核酸组合及试剂盒还可从以下方面进行进一步优化：(1)检测样本为EDTA抗凝全血提取的人类DNA样本，检测前需商业化的试剂盒提取人类基因组DNA，不仅增加了试剂成本及时间成本，而且提取过程中存在因操作不当引起交叉污染或样本混淆的风险，因此有必要进一步优化PCR反应液，以达到无需提取基因组DNA、可直接以血液样本为模板实现Y染色体微缺失准确检测的目的；(2)其Taqman探针多重荧光PCR反应体系中的DNA聚合酶为常规改造的DNA聚合酶，在Taqman探针法荧光PCR反应中，Taq DNA聚合酶需同时具有很好的聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，以保证扩增效率以及荧光信号释放的效率，而常规Taq DNA聚合酶改造和修饰方案因专注于提高聚合酶性能而忽视了对外切酶性能的考察，从而抑制其外切酶活性，不利于进行Taqman探针法荧光PCR检测，因此，有必要进一步优化和改造DNA聚合酶，以达到更好的检测效果。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种Taq DNA聚合酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。
本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体由来源于嗜热水生菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶突变所得，其相较于野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO.28)包含以下28个突变：P6R、P40R、D120A、L156M、P158R、D222G、E267V、E289V、P302H、A335E、A341D、D355V、G396A、V433G、N485T、L498H、E537D、K542T、D625R、E641K、T642I、V669E、Q698E、E708Q、L780R、E790V、P816L和K831R。本发明的发明人通过对野生型Taq DNA聚合酶的研究对其进行合理的突变改造，在提高其聚合酶性能的同时注重其外切酶活性，使得采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应，其扩增延伸速率高于市场上普通的Taq DNA聚合酶，可大大节约PCR扩增时间，其对血液抗性和PCR抑制剂抗性较高，可直接以血液样本为模板进行高效检测，该Taq DNA聚合酶突变体可用于任意类型的PCR反应(如普通PCR、荧光定量PCR、数字PCR等)，无需核酸提取步骤，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、特异性强、准确率高等优点。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上所述的Taq DNA聚合酶突变体。
在本发明公开了Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列基础上，本领域技术人员容易获得编码该突变体的核酸序列，这对本领域技术人员来说是容易实现的，因此，任意编码上述突变体的核酸序列都属于本发明的保护范围。
可选的，在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子的如SEQ ID NO.27中的第1-2496位所示。本发明通过对密码子的科学优化和创造性的思考，得到上述核酸分子，采用该核酸分子借助基因工程技术可以获得更高表达水平的Taq DNA聚合酶突变体，提高生产或制备Taq DNA聚合酶突变体的效率。
另一方面，本发明提供含有上所述的分离的核酸分子的载体。
可选的，在本发明的一些实施方案中，上述载体为原核表达载体例如pET-28a。
需要说明的是，在本发明的其他实施方案中，载体的类型是可以根据需要选择的，并不限于本发明所述的pET-28a载体。无论何种载体，均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供含有上所述的载体的重组细胞。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞为原核细胞，例如为大肠杆菌，例如大肠杆菌细胞E.coli BL21(DE3)。
需要说明的是，在本发明的其他实施方案中，重组细胞的类型是可以根据需要选择的，并不限于本发明所述的E.coli BL21(DE3)。无论何种细胞，均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供一种制备如所述Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述Taq DNA聚合酶突变体。
在本发明提供了Taq DNA聚合酶突变体的基础上，本领域技术人员可以采用本领域常规的技术如基因工程技术或化学合成技术获得该Taq DNA聚合酶突变体，无论采用何种技术，其属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种用于PCR反应的DNA聚合酶试剂，其含有上所述的TaqDNA聚合酶突变体或其复合物。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述复合物包括所述Taq DNA聚合酶突变体和结合至抗所述Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体和/或DNA结合蛋白。
本发明实施例的研究显示，采用Taq DNA聚合酶突变体可以实现直接以血液样本为模板成功扩增的目的；另外，利用上述复合物也可以实现直接以血液样本为模板成功扩增的目的，但同时还可以缩短扩增检测时间，提高特异性和灵敏度，提高检测效率，该结果是发明人不曾预料的。
例如，上述的Taq DNA聚合酶突变体复合物可以是Taq DNA聚合酶突变体与相应纳米抗体通过抗原抗体反应形成的复合物(a)。纳米抗体具有体积小、亲和力高、对热和pH有较强的抵抗力、构象更稳定的特点，且通过直接免疫可制备得到Taq酶纳米抗体，其特异性强、纯度高、亲和力高。凭借以上特点，由Taq DNA聚合酶突变体与相应纳米抗体(抗Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体)通过抗原抗体反应形成的复合物能进一步提高PCR扩增的灵敏度和扩增效率，并能在很大程度上减少克隆错配，大大提高PCR扩增的特异性，能有效地提高检测的灵敏度、特异性，缩短检测时间。
上述的Taq DNA聚合酶突变体复合物也可以是Taq DNA聚合酶突变体与DNA结合蛋白融合的复合物(b)。DNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶突变体融合重组，构建出的Taq DNA聚合酶突变体融合蛋白在保留原Taq DNA聚合酶突变体各种功能同时，其对DNA分子亲和力提高，使其能在模板浓度很低的情况下或存在复杂干扰分子(如蛋白质、脂类等生物大分子以及有机和无机污染分子)的情况下实现PCR扩增，有效地提高了检测的灵敏度和稳定性。
上述的Taq DNA聚合酶突变体复合物还可以是Taq DNA聚合酶突变体与DNA结合蛋白融合后再与相应纳米抗体通过抗原抗体反应形成的复合物(c)。复合物(c)兼具复合物(a)和(b)的特点。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述纳米抗体的来源包括但不限于羊驼、小羊驼、亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼或原驼。
需要说明的是，适用于本发明的纳米抗体可以来自任何能够产生纳米抗体的动物，对具体的纳米抗体氨基酸序列并不作要求，只要其能够特异性结合Taq DNA聚合酶突变体即可。此外，在本发明的提供了Taq DNA聚合酶突变体的基础上，通过本领域常规的技术如免疫学技术也是很容易地获得可特异性结合该Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述DNA结合蛋白的来源包括但不限于古细菌。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述DNA结合蛋白源自硫化叶菌属。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.26所示。
需要说明的是，基于本发明公开的内容，本领域技术人也可以选择其他非SEQ IDNO.26所示的DNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶突变体融合用于PCR扩增提高检测效率，这是本领域技术人员不需要再付出创造性的劳动即可实现的，因此，采用任意序列的DNA结合蛋白与本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体融合用于PCR反应均属于本发明的保护范围。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述DNA聚合酶试剂中，所述Taq DNA聚合酶突变体或其复合物的浓度为1-2U/μl。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述DNA聚合酶试剂还含有：18-22mM Tris-HCl、80-120mM KCl、1-3mM二硫苏糖醇、以及30％-50％甘油。
另一方面，本发明提供一种用于PCR反应的试剂组，其包括如上所述的DNA聚合酶试剂以及PCR反应液。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有如下组分中的至少一者：Tris-HCl、dNTPs和金属离子。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述金属离子为K+和/或Mg2+。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有：5-50mM Tris-HCl、30～60mM KCl、2～6mM MgCl2、以及100～600μM dNTPs。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液还含有如下组分中的至少一者：BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20以及甲酰胺。
其中，所述BSA在高温下能和样本中的血红素、糖类、脂类形成大分子复合物沉淀下来，从而缓解此类物质对PCR反应的抑制作用；所述寡肽能够结合DNA聚合酶，在PCR反应中起保护作用，使DNA聚合酶的酶活性不下降；所述Brij-58和所述Tween-20都是非离子表面活性剂，两者共同使用不仅能够增加血液细胞的通透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，从而实现核酸游离在裂解体系中，还可使血液中的血红素、蛋白质和脂类等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR反应的抑制作用；所述甲酰胺也能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白质变性和释放，同时还能提高PCR反应的特异性、促进DNA聚合酶活性。因此，在常规PCR反应液的基础上增加了适量BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20以及甲酰胺中的一种或几种组分不仅可使血液样本中的血红素、蛋白质和脂类等DNA聚合酶抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用，同时还可促进DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增可直接以血液为模板实现高效和高特异性的检测。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述寡肽为六肽。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述寡肽的氨基酸序列为：S-F-K-R-G-T。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有：0.1～10mg/ml BSA、10～20mg/ml寡肽、0.001％～0.5％(w/v)Brij-58、0.005～1％(w/v)Tween-20以及1％～5％(v/v)甲酰胺。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有：8～12mM Tris-HCl(pH8.0)、40～60mM KCl、3～5mM MgCl2、300～600μM dNTPs、0.5～2mg/ml BSA、14～16mg/ml寡肽、0.005％～0.015％(w/v)Brij-58、0.01％～0.02％(w/v)Tween-20、以及2～4％(v/v)甲酰胺。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有：10.9mM Tris-HCl、54.3mM KCl、4.3mM MgCl2、543μM dNTPs、1.1mg/ml BSA、15.2mg/ml寡肽、0.01％(w/v)Brij-58、0.015％(w/v)Tween-20、以及3％(v/v)甲酰胺；
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液的pH为7.5-10，进一步优选为8-9。
本发明提供的试剂组，通过上述PCR反应液和上述DNA聚合酶试剂的配合使用，省去了对血液样本在进行荧光PCR扩增前进行核酸提取纯化的步骤，避免了核酸提取纯化过程中的核酸损失，从而显著提高了荧光PCR扩增的效率和成功率；同时，避免了核酸提取纯化过程中的交叉污染可能性或样本混淆的风险，从而有效地保障了荧光PCR扩增检测结果的准确性。此外，本发明的PCR反应液和DNA聚合酶试剂的配合使用，有效地将核酸裂解与扩增“合二为一”，需要的试剂少，操作步骤简单，操作时间短，大大节省了人力物力。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液还含有检测目标序列的引物。
可选的，在本发明的一些实施方案中，在所述PCR反应液中，所述引物的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液还含有检测所述目标序列的探针。
可选的，在本发明的一些实施方案中，在所述PCR反应液中，所述探针的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述荧光报告基团选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述PCR反应液含有如下核酸组中的至少一者：由SEQ ID NO.1-3组成的核酸组、由SEQ ID NO.4-6组成的核酸组、由SEQ ID NO.7-9组成的核酸组、由SEQ ID NO.10-12组成的核酸组、由SEQ ID NO.13-15组成的核酸组、由SEQID NO.16-18组成的核酸组、由SEQ ID NO.19-21组成的核酸组、以及由SEQ ID NO.22-24组成的核酸组。
当PCR反应液存在上述核酸组时，本发明的试剂可实现直接以血液样本为模板进行高效和准确的人类Y染色体微缺失检测的目的。
需要说明的是，在其他的一些实施方式中，上述引物和探针是本领域技术人员根据所检测的目标核酸序列进行合理选择设计的，并不限于上述的核酸组的序列。因此，在上述反应液中添加任意其他的引物或探针序列也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种基于PCR反应的检测试剂盒，其含有如上所述的TaqDNA聚合酶突变体、如上所述的DNA聚合酶试剂、或如上所述的试剂组。
本发明提供的检测试剂盒具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、特异性强、准确率高等优点，能够实现直接以血液样本为模板进行高效和准确的PCR检测目的。
采用本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应的试剂组和检测试剂盒进行PCR检测时，所用样本包括但不限于人EDTA抗凝全血。但需要说明的是，虽然本发明提供了可直接检测血液样本的Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应的试剂组和检测试剂盒，但本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应的试剂组和检测试剂盒也能用于检测非血液样本如核酸样本的PCR，因此，将本发明提供的，Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应的试剂组和检测试剂盒用于非血液样本的检测也属于本发明的保护范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例及对比例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1提供的Taq DNA聚合酶突变体(SEQ ID NO.25)与来源于嗜热水生菌(Thermus aquaticus)的野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO.28)的氨基酸序列比对结果。
图2为本发明实验例1中实验组1-4针对样本X4通过PCR反应液2检测结果对比图。
图3为本发明实验例1中实验组1针对样本X4通过PCR反应液1检测结果图。
图4为本发明实验例1中实验组2针对样本X4通过PCR反应液1检测结果图。
图5为本发明实验例1中实验组3针对样本X4通过PCR反应液1检测结果图。
图6为本发明实验例1中实验组4针对样本X4通过PCR反应液1检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种Taq DNA聚合酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。
本实施例还提供上述Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，其包括如下步骤：
(1)进行序列优化，合成Taq DNA聚合酶突变体的基因片段(与SEQ ID NO.27中的第1-2496位所示的核苷酸序列相同)，在该基因片段3’端添加组氨酸标签(如SEQ ID NO.27中的第2695-2724位所示)。
(2)将步骤(1)所得的核苷酸片段连接到基因表达载体pET-28a中，构建重组质粒。
(3)将重组质粒转化到宿主细胞即大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组细胞。
(4)对步骤(3)中重组细胞进行诱导表达，收集菌体；具体操作如下：
挑取步骤(3)中重组细胞阳性单克隆，在含有20mM葡萄糖、0.5‰的硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基中于37℃、220rpm的条件下培养5～8小时，然后将培养物1％接种比例接种于含有20mM葡萄糖、0.5‰的硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，于37℃、220rpm的条件下震荡培养至OD600约为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和1％的无水乙醇，于16℃、220rpm的条件下培养16～18小时。
(5)破碎步骤(4)中菌体，过滤，收集裂解粗产物；
(6)利用镍亲和层析采用三步层析纯化所述裂解粗产物，得到初次纯化产物；所用层析缓冲液如下：
第一次层析缓冲液含有：20mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2以及1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH值为8.3；第二次层析缓冲液含有为：20mM Tris-HCl、500mM KCl、1.5mMMgCl2以及1mM PMSF，pH值为8.3；第三次层析缓冲液含有：20mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mMMgCl2以及1mM PMSF，pH值为8.3。
(7)对步骤(6)中得到的初次纯化产物进行离子交换纯化，其中，选用GE公司生产的HiPerp 26/10Desalting进行缓冲液更换，选用GE公司生产的HiTrap Q Sepharose FF作离子交换；得到本实施例的Taq DNA聚合酶突变体，并进行蛋白定量和质检分装。
(8)使用酶储存液调节酶的浓度至适当浓度。其中，酶储存液含有：20mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM KCl、1mM二硫苏糖醇以及40％甘油。
本实施例涉及的相关序列如下所示：
SEQ ID NO.25(下划线标记为突变氨基酸)：
MRGMLRLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGERVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADAVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVMHREGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLGRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRVRLRAFLERLEFGSLLHEFGLLVSPKALEEAPWPPHEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHREPEPYKDLRDLKEARGLLAKVLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGAEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREGERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLTSRDQLERVLFDEHGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRDLTKLTSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGRENLIRVFQEGRDIHTKIASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGELYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFESFPKVRAWIQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMRLQVHDELVLVAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVLLEVEVGIGEDWLSARE。
上述Taq DNA聚合酶突变体(SEQ ID NO.25)与来源于嗜热水生菌(Thermusaquaticus)的野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.28)的比对结果如图1所示。
SEQ ID NO.28：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE。
实施例2
本实施例提供一种Taq DNA聚合酶突变体复合物，其由实施例1的Taq DNA聚合酶突变体与SEQ ID NO.26的DNA结合蛋白融合而成。
SEQ ID NO.26：
MVKVKFKYKGEEKEVDTSKIKKVWRVGKMVSFTYDDNGKTGRGAVSEKDAPKELLDMLARAEREKK。
该Taq DNA聚合酶突变体复合物采用SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列(下划线为组氨酸标签，编码SEQ ID NO.26所示DNA结合蛋白的核酸序列为第2497-2694位)，参考实施例1的方法制备。使用酶储存液调节复合物的浓度至适当浓度。其中，酶储存液含有：20mMTris-HCl(pH 8.0)、100mM KCl、1mM二硫苏糖醇以及40％甘油。
SEQ ID NO.27：
atgcgtggtatgttacgattatttgaaccaaaaggtcgtgttttattggttgatggtcatcatctggcctatcgtacctttcatgcactgaagggattgacaacctcccgtggcgaacgcgtccaggcagtgtatggattcgcaaagtcgctgcttaaagcgcttaaagaagacggagatgcagtcatcgtcgtattcgacgcaaaggcgccgtcctttcgtcatgaagcatatggtggctataaggccggtcgcgctccaacgccggaggactttcctcgtcagcttgcccttattaaagagttagtcgacctgctgggtttggctcgccttgaagtgccaggctacgaagcggacgctgtattagcctcgttagcgaaaaaggcggaaaaggaggggtatgaagtgcgtatcctgacagccgacaaggacctttaccaacttttatcagaccgcattcatgtcatgcaccgtgaaggctacttgattacgccagcctggctttgggaaaagtatgggttgcgtccagaccaatgggctgattaccgtgcacttactggcgacgaaagtgataatttgccgggcgtcaaaggcattggtgaaaagacggcccgcaaattacttgaggaatggggtagcttagaggcccttttgaagaacctgggccgccttaaacctgcaatccgtgaaaaaatcttggctcacatggatgatttaaaattatcatgggatcttgctaaggttcgcacagacttgccactggaagtcgatttcgcgaaacgtcgtgaacctgatcgcgtgcgccttcgtgcgttcttagaacgtcttgaatttggctcgcttctgcatgagtttggactgttagtgtctccaaaagcgctggaggaggcgccatggccaccgcatgagggagcatttgtgggttttgttttatcgcgtaaagaaccaatgtgggcggatcttctggcactggctgctgcacgcggtgggcgtgtacaccgcgagccagagccctataaagacttgcgcgatttgaaagaggcgcgcggcttgcttgccaaggtcctttccgtccttgcattacgtgagggtttgggtttaccgcccggagacgatccgatgctgttagcgtatttgttagacccaagcaacacgacaccagaaggagtggcacgccgttacggggcagagtggactgaagaagcaggcgagcgcgccgcattatctgaacgtttgtttgccaatctttgggggcgcttggagggtgaggagcgtcttttatggctgtatcgtgaaggcgaacgcccgttgagtgctgtattagcgcatatggaagcgaccggagtccgccttgacgtagcttatttgcgcgccctttcactggaagtggccgaggagatcgcacgtttggaagcggaggtgtttcgtctggccggtcaccccttcaatctgactagtcgcgaccagttggaacgcgtattattcgatgagcatggtcttccggccatcggcaagactgagaagactggaaagcgtagcaccagtgccgcggtgttggaagccctgcgcgaagcacatcctattgtcgaaaagattcttcaatatcgcgatttgaccaagttgacgtcgacttacattgatccacttcctgaccttattcatcctcgcacaggccgtcttcatactcgctttaatcaaaccgcaacagcgaccggacgtttgagtagtagcgaccctaaccttcaaaatattccggtacgtactccgttaggtcaacgcattcgtcgcgcattcatcgccgaagaagggtggttattagtagcattggactatagccaaattgagttacgtgtattagctcacttaagtggtcgcgaaaacttaattcgcgtatttcaggagggtcgcgacatccacactaagattgcgtcgtggatgtttggggtaccgcgcgaggccgtggatccgcttatgcgtcgcgcggcaaaaaccatcaattttggggaattatacggcatgagtgctcaccgcttaagccaagaattagctatcccttatgaggaggcccaggccttcattgagcgttatttcgagtcgttcccgaaagtgcgcgcatggatccagaaaacattggaggaaggtcgccgtcgtggttacgtcgagaccttatttgggcgtcgccgctatgttcccgatctggaagcccgtgttaagtcagttcgtgaggcagcagagcgtatggcattcaatatgcctgttcaaggaaccgcagcagatttgatgaaacttgctatggtcaagctgttcccgcgcttggaagaaatgggcgcacgtatgcggcttcaggtccatgacgagttggtcttggtagcgccaaaggagcgcgccgaagcagtcgcgcgcctggcaaaggaagtgatggagggagtctatcccctggctgtccttttggaggttgaagtagggattggagaggactggttaagcgcaagagagatggtgaaggtaaagttcaagtataagggtgaagagaaagaagtagacacttcaaagataaagaaggtttggagagtaggcaaaatggtgtcctttacctatgacgacaatggtaagacaggtagaggagctgtaagcgagaaagatgctccaaaagaattattagacatgttagcaagagcagaaagagagaagaaacaccatcaccatcaccaccatcaccattaa。
实施例3
本实施例提供另一种Taq DNA聚合酶突变体复合物，其由实施例1的Taq DNA聚合酶突变体与抗Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体通过抗原抗体反应形成。
上述纳米抗体的制备方法可参考如下步骤：
(a)取适量实施例1得到的Taq DNA聚合酶突变体作为抗原，加入佐剂，本实施例采用费氏佐剂，注射免疫可产生纳米抗体的羊驼，待抗体产量稳定时停止免疫，采血，使用亲和层析法或吸附剂法分离得到抗血清，测定抗血清的特异性和效价后，分离纯化抗血清，得到抗Taq DNA聚合酶突变体纳米抗体；
(b)制备抗原抗体复合物：将实施例1的抗Taq DNA聚合酶突变体和步骤(a)得到的抗Taq DNA聚合酶突变体纳米抗体，按比例(本实施例的比例为摩尔比，酶:抗体＝1:1，其他的实施例中也可以是0.8-1.2:1)混合在30～40℃孵育1～2小时，使两者形成抗原抗体复合物，即得到本实施例的Taq DNA聚合酶突变体复合物。
(c)使用酶储存液调节复合物的浓度至适当浓度。其中，酶储存液含有：20mMTris-HCl(pH 8.0)、100mM KCl、1mM二硫苏糖醇以及40％甘油。
实施例4
本实施例提供另一种Taq DNA聚合酶突变体复合物，其由实施例2的Taq DNA聚合酶突变体复合物与抗Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体通过抗原抗体反应形成。
制备方法参考实施例3。本实施例中，实施例2的Taq DNA聚合酶突变体复合物与抗Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体混合的摩尔比为1:1，其他的实施例中也可以是0.8-1.2:1。
实施例5
实施例1的Taq DNA聚合酶突变体、实施例2-4的Taq DNA聚合酶突变体复合物的在PCR检测中的应用。
本实施例提供一种人类Y染色体微缺失检测试剂盒，其包括PCR反应液1、PCR反应液2和PCR反应液3，反应酶，以及阳性质控品和空白对照。
以下对试剂盒的各组分进行说明：
1.PCR反应液1、PCR反应液2和PCR反应液3
所述PCR反应液1、2和3均为在常规PCR反应液的基础上优化而来，为可用于血液直接荧光PCR的反应液，均含有以下组分：引物和探针、Tris-HCl(pH 8.0)、KCl、MgCl2、dNTPs、BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20、甲酰胺和无核酸酶水(DEPC水)。
但是，所述PCR反应液1、2和3的引物和探针序列及对应检测位点有所不同，其中，所述PCR反应液1的引物和探针包括用于检测AZFa区sy84位点缺失的特异性引物和探针、用于检测AZFa区sy86位点缺失的特异性引物和探针以及用于检测ZFX/Y内标基因的引物和探针；所述PCR反应液2包括用于检测AZFb区sy127位点缺失的特异性引物和探针、用于检测AZFb区sy134位点缺失的特异性引物和探针以及用于检测sy14内标基因的引物和探针；所述PCR反应液3包括用于检测AZFc区sy254位点缺失的特异性引物和探针、用于检测AZFc区sy255位点缺失的特异性引物和探针以及用于检测sy14内标基因的引物和探针；所述每种PCR反应液中的每种探针的5’端标记有荧光报告基团，选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX，3’端标记有荧光淬灭基团，选自DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，同一种PCR反应液中的不同探针的荧光报告基团互不相同。本实施例中，所述试剂盒的引物和探针序列具体如表1所示。
表1试剂盒引物和探针序列
本实施例所述PCR反应液1、2和3的配制步骤如下：
(a)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物和探针，将引物和探针分别溶解配制成100μM的引物溶液和探针溶液备用；
(b)准备500mM Tris-HCl(pH 8.0)、500mM KCl、25mM MgCl2、25mM dNTPs、25mg/mlBSA、350mg/ml寡肽、Brij-58、Tween-20、甲酰胺、无核酸酶水。本实施例中寡肽为六肽，氨基酸序列为：S-F-K-R-G-T。
(c)按照以下PCR反应液配制方案进行配制：
表2 PCR反应液配制方案
上述配制方案仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小上述PCR反应液体积及其中各组分含量。
2.反应酶
该反应酶为实施例1的Taq DNA聚合酶突变体溶液或者是实施例2-4任一项的TaqDNA聚合酶突变体复合物溶液，本实施例中，浓度为1.25U/μl。
3.阳性质控品和空白对照
所述阳性质控品为9种质粒DNA的混合物，所述9种质粒DNA分别包括：sy84序列、sy86序列、sy127序列、sy134序列、sy254序列、sy255序列、sy14序列、ZFX/Y序列和PUC57-NTC序列，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2000copies/mL；所述空白对照为10mM Tris-HCl缓冲液。
本实施例还涉及上述人类Y染色体微缺失检测试剂盒的使用方法，主要包括以下步骤：
(1)配制Taqman探针多重荧光PCR反应体系，该Taqman探针多重荧光PCR反应体系中包括PCR反应液、反应酶以及样本；该PCR反应液为以上任一所述的人类Y染色体微缺失检测试剂盒中的PCR反应液1或PCR反应液2或PCR反应液3；样本包括但不限于人EDTA抗凝全血。
(2)荧光PCR反应，检测荧光信号。
其中，所述步骤(1)中Taqman探针多重荧光PCR反应体系配制方案如下：
表3 Taqman探针多重荧光PCR反应体系配制方案
步骤(2)中荧光PCR扩增仪的荧光通道选择FAM、VIC和ROX通道；荧光PCR反应条件为：95℃预变性4分钟，1个循环；95℃变性10秒，60℃退火/延伸10秒，40个循环，并采集荧光信号。
试剂盒的检测结果根据检测到荧光信号的Ct值来判断：
(1)若阳性质控品FAM、VIC和ROX通道Ct值>34或无Ct值，和/或，空白对照FAM、VIC和ROX通道Ct值≤34，和/或，样本中内标基因对应的ROX通道Ct值>34或无Ct值，说明本次检测结果无效；
(2)若阳性质控品FAM、VIC和ROX通道Ct值≤34，空白对照Ct值>34或无Ct值以及样本中内标基因对应的ROX通道Ct值≤34，说明本次检测结果有效，则：
(i)若FAM和VIC通道均Ct值≤34，则检测结果为Y染色体不存在缺失情况；
(ii)若FAM和VIC任一通道Ct值>34或无Ct值，则检测结果为Y染色体存在缺失情况。
具体的结果判定方法如表4所示。
表4结果判定
实验例1
不同反应酶的使用效果比较。
为了评估不同反应酶的使用效果及对试剂盒检测效果的影响，设计对照组和实验组1-4，具体设计如表5所示。
表5各实验组所用的反应酶
本实验例选用2例已知不存在Y染色体微缺失情况的男性(编号1-2)和4例已知存在Y染色体微缺失情况的男性(编号3-6，缺失类型依次为：AZFa区sy84和sy86缺失，AZFb区sy127和sy134缺失，AZFc区sy254和sy255缺失，AZFa、b、c区全缺失)的血液样本(编号X1-X6)和DNA样本(编号D1-D6，20ng/μl)进行实验。采用上述实施例5设计制备的试剂盒，按实验例5所述试剂盒的使用方法对样本X1-X6进行检测，设立阳性质控品(P)和空白对照(N)。同时采用上述对照组设计制备的试剂盒，按常规荧光PCR反应条件对样本D1-D6进行检测，设立阳性质控品(P)和空白对照(N)。常规荧光PCR反应条件如下：95℃预变性4分钟，1个循环；95℃变性15秒，60℃退火/延伸35秒，40个循环，并采集荧光信号。根据检测结果分析不同反应酶的使用效果及对试剂盒检测效果的影响。具体检测结果见表6和图2-图6。
表6试剂盒选用不同反应酶的检测结果
从上述检测结果可知，当使用常规Taq DNA聚合酶、以DNA样本为模板按常规荧光PCR反应条件进行检测时可实现准确检测，与已知临床结果吻合率达到100％；但当使用常规Taq DNA聚合酶、以血液样本为模板进行检测时，所有血液样本中都未检测到荧光信号，所有检测位点Ct值为0，无法实现准确检测。当使用实施例1的Taq DNA聚合酶突变体以及实施例2-4的酶复合物时，直接以血液样本为模板均可实现准确检测，与已知临床结果吻合率达到100％；并且其检测到的Ct值相较于使用常规Taq DNA聚合酶、以DNA样本为模板按常规荧光PCR反应条件进行检测时的Ct值要低，说明实施例1-4提供的酶及其复合物的使用效果和试剂盒的检测效果更好。
其中，实施例2和3的酶复合物检测到的Ct值均低于实施例1的反应酶，说明两者的使用效果和试剂盒的检测效果均优于实施例1的反应酶，推测可能原因在于：实施例2的酶复合物在保留原Taq DNA聚合酶突变体各种功能同时，其对DNA分子亲和力提高，因此有效地提高了检测的灵敏度和稳定性，而实施例3的酶复合物具有特异性强、亲和力高等特点，因此能够提高PCR扩增的灵敏度和扩增效率，并能在很大程度上减少克隆错配，大大提高PCR扩增的特异性；实施例4的反应酶检测到的Ct值最低，说明实施例4的反应酶的使用效果和试剂盒的检测效果最好，推测可能原因在于：实施例4的反应酶兼具实施例2和3的酶复合物的特点，因此能进一步提高检测的灵敏度和稳定性。可见，本发明最优选酶为实施例4的反应酶。
此外，对比常规PCR反应条件和实施例1-4反应酶的荧光PCR反应条件发现，实施例1-4的反应酶的荧光PCR反应时间更短，说明实施例1-4的反应酶的使用有助于缩短检测时间。可见，实施例1-4的反应酶(尤其是实施例4的反应酶)应用于人类Y染色体微缺失荧光PCR检测，可直接以血液样本为模板，并具有灵敏度高、特异性强、检测时间短的特点。
实验例2
实施例4的反应酶与市售同类酶比较。
为了比较实施例4的反应酶与市售同类酶，设计实验组1-7，具体设计如表7所示。
表7各实验组所用的反应酶的选择和PCR条件
本实验例选用2例已知不存在Y染色体微缺失情况的男性(编号1-2)和4例已知存在Y染色体微缺失情况的男性(编号3-6，缺失类型依次为：AZFa区sy84和sy86缺失，AZFb区sy127和sy134缺失，AZFc区sy254和sy255缺失，AZFa、b、c区全缺失)的血液样本进行实验。采用上述表7设计制备的试剂盒，按上述荧光PCR反应体系和条件对样本1-6进行检测，设立阳性质控品(P)和空白对照(N)。根据检测结果分析比较本发明实施例4的反应酶和市售同类酶。具体检测结果见表8，扩增时间见表9。
表8试剂盒选用不同品牌反应酶的检测结果
表9不同品牌反应酶的扩增时间
从上述检测结果可知，当使用本发明实施例4的反应酶按照本发明实施例5所述荧光PCR反应体系和条件进行检测时可实现准确检测，与已知临床结果吻合率达到100％；当使用3种市售同类酶分别按照本发明实施例5所述荧光PCR反应体系和条件进行检测时均无法实现准确检测，与已知临床结果吻合率分别为50％、33％和0％；当使用3种市售同类酶分别按照参考各自产品说明书设置的荧光PCR反应体系和条件进行检测时均可实现准确检测，与已知临床结果吻合率均达到100％，但其检测到的Ct值要低于本发明反应酶；说明3种市售同类酶的使用效果和反应效率要低于本发明反应酶。此外，对比本发明实施例4的反应酶的荧光PCR反应条件与3种市售同类酶参考各自产品说明书设置的荧光PCR反应条件发现，本发明实施例4的反应酶的理论扩增时间和实际扩增时间要低于3种市售同类酶的扩增时间(表9)。可见，相较于市售同类酶，本发明实施例4的反应酶具有更好的酶活性，其应用有助于提高荧光PCR反应效率，缩短检测时间。
针对本发明实施例1-3的反应酶与市售同类酶比较的实验设计和结果与上述实验设计和结果类似，具体数据省略。结果显示，相较于市售同类酶，本发明实施例1-3的反应酶也具有更好的酶活性，其应用有助于提高荧光PCR反应效率，缩短检测时间。
实验例3
PCR反应液试剂组分浓度对试剂盒检测效果的影响。
为了考察本发明实施例5的PCR反应液试剂组分浓度对试剂盒检测效果的影响，以寡肽为例，设计实验组1-7，具体设计如表10所示。
表10寡肽浓度的选择
| 实验组 | 寡肽浓度的选择 | PCR反应液配制方案 |
| 实验组1 | 9mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽0.60μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
| 实验组2 | 10mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽0.66μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
| 实验组3 | 14mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽0.92μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
| 实验组4 | 15.2mg/ml | 如本发明实施例5所述 |
| 实验组5 | 16mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽1.06μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
| 实验组6 | 20mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽1.32μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
| 实验组7 | 21mg/ml | 每反应需350mg/ml寡肽1.38μl，其余组分用量如本发明实施例5所述 |
本实验例选用2例已知不存在Y染色体微缺失情况的男性(编号1-2)和4例已知存在Y染色体微缺失情况的男性(编号3-6，缺失类型依次为：AZFa区sy84和sy86缺失，AZFb区sy127和sy134缺失，AZFc区sy254和sy255缺失，AZFa、b、c区全缺失)的血液样本进行实验。采用上述表10设计制备的试剂盒，按实施例5所述试剂盒的使用方法对样本1-6进行检测，设立阳性质控品(P)和空白对照(N)。检测时所用的反应酶可以为实施例1-4任一项的反应酶，本实验例中，选用实施例4的反应酶进行实验。根据检测结果与样本已知临床结果的吻合率以及检测到的Ct值来分析PCR反应液寡肽浓度对试剂盒检测效果的影响，确定适宜的寡肽浓度范围。具体检测结果见表11。
表11试剂盒选用不同寡肽浓度的PCR反应液的检测结果
从上述检测结果可知，使用寡肽浓度为10～20mg/ml的PCR反应液均可实现准确检测，与已知临床结果吻合率达100％，但当寡肽浓度为14～16mg/ml时，检测到的Ct值更低，说明PCR反应液的使用效果和试剂盒的检测效果更好，其中，当寡肽浓度为15.2mg/ml时，PCR反应液的使用效果和试剂盒的检测效果最好。当使用寡肽浓度为9mg/ml的PCR反应液时，由于寡肽浓度过低不仅使其无法在PCR反应中起到保护反应酶的作用还可能破坏PCR反应液各组分间的平衡，进而使PCR反应液的使用效果变差，PCR反应效率明显下降，导致不存在Y染色体微缺失的样本某些检测位点以及存在Y染色体微缺失的样本的内标基因和/或未缺失位点的Ct值大于34，造成样本检测结果与已知临床结果不符或检测失败，无法实现准确检测。当使用寡肽浓度为21mg/ml的PCR反应液时，由于寡肽浓度过高会影响反应酶的酶活性，从而抑制PCR反应，进而致使PCR反应液的使用效果变差，PCR反应效率明显下降，导致不存在Y染色体微缺失的样本某些检测位点以及存在Y染色体微缺失的样本的内标基因和/或未缺失位点的Ct值大于34，造成样本检测结果与已知临床结果不符或检测失败，无法实现准确检测。
另外，针对本发明PCR反应中寡肽浓度的选择实验，选用实施例1-3任一项的反应酶进行检测的检测结果与上述选用实施例4的反应酶进行检测的检测结果类似。因此，本发明PCR反应液中寡肽浓度为10～20mg/ml；为保障试剂盒检测结果的准确性，优选地，寡肽浓度为14～16mg/ml；更优选地，寡肽浓度为15.2mg/ml。
针对本发明PCR反应液中其它试剂组分如引物、探针、Tris-HCl(pH 8.0)、KCl、MgCl2、dNTPs、BSA、Brij-58、Tween-20和甲酰胺的浓度以及PCR反应液pH值的选择实验设计和结果与上述实验设计和结果类似，具体数据省略。
实验例4
本发明与市售同类产品对比
本实验例中收集5例正常男性(编号1-5)、10例非Y染色体微缺失导致的少精或无精的男性(由精索静脉曲张、生殖系统感染、内分泌紊乱或免疫异常等原因造成，编号6-15)以及35例已知存在Y染色体微缺失情况的男性(编号16-50)的血液样本作为待测样本。分别用本发明实施例5所述试剂盒(反应酶选用实施例4的反应酶)和市售同类产品S(上海透景生命科技股份有限公司的Y染色体缺失检测试剂盒，医疗器械注册证编号：20153400024)对上述待测样本进行检测，设立阳性质控品(P)和空白对照(N)。市售同类产品的检测方法和检测过程按照其产品说明书进行。将本发明试剂盒检测结果、市售同类产品检测结果与已知临床结果进行对比，分析本发明试剂盒的准确性。
同时，将本发明试剂盒的操作步骤与市售同类产品的操作步骤进行对比。具体结果见表12、表13和表14。
表12两种试剂盒的检测结果
表13两种试剂盒检测结果与已知临床结果对比
表14两种试剂盒操作步骤对比
从上述检测结果可知，本发明实施例5试剂盒的检测成功率为100％，与已知临床结果进行对比发现，本发明实施例5试剂盒检测的阴性符合率、阳性符合率和总体符合率均为100％；而市售同类产品S的检测成功率为98.0％，与已知临床结果进行对比发现，该市售同类产品S检测的阴性符合率为93.3％，阳性符合率为97.1％，总体符合率为96.0％；说明相较于市售同类产品S，本发明实施例5试剂盒具有更好的临床灵敏度和临床特异性，证明了本发明试剂盒的检测准确性。此外，根据表14可看出，与市售同类产品S相比，本发明实施例5试剂盒省去了核酸提取、核酸浓度测定和核酸稀释步骤，因此操作简便、时间短、污染少。
针对本发明实施例5所述试剂盒选用实施例1-3的反应酶进行同类产品比较的实验设计和结果与上述实验设计和结果类似。
综上可知，本发明实施例5试剂盒通过采用Taq DNA聚合酶突变体作为反应酶，可直接以血液样本为模板，省去了荧光PCR前进行核酸提取纯化的步骤，有效地将核酸裂解与扩增“合二为一”，避免了核酸提取纯化过程中的核酸损失、交叉污染或样本混淆的风险，有效地提高了检测的成功率和准确率，简化了操作步骤，缩短了操作时间，节省了大量人力物力；因此，本发明试剂盒具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、特异性强、准确率高等优点，实现了直接以血液样本为模板进行高效和准确的人类Y染色体微缺失检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcctggttt ccctatttg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcctacagca gactaag 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctggtggct ctacctcctt c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtctttgg gatttctttg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacacattgt ttctcatcag 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagccattac caagtctctg tcct 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acctctgtac tgactgtgat tacac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcacgtcttt ggtatctgag aaagt 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agacaaatgt cacacttgaa tggcatc 27
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctcacaaac gaaaagaaaa ag 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctgcaggca gtaataag 18
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctaccaaag cccactgtgt tca 23
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcacttcaga aacttagc 18
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aggtcaaagg aaataaatag atg 23
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aacatctgga acattctact tgaagcg 27
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaatattccc gctctccgga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gctggtgctc cattcttgag 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctcttccttc ctttgcactg aaagc 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgaggtggaa atttctcc 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tggtggaatt gatgctag 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgaatgacca gcagcccttt 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgtcctttgg tagttaatc 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtaggtttca gtgtttgg 18
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcctcctcca ccacagtttc ag 22
<210> 25
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Met Arg Gly Met Leu Arg Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Arg Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Ala Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Met His Arg Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Gly Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Val Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Val Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro His Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Glu Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Asp Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Val Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Ala Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Gly Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Thr Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu His Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Asp Leu Thr Lys Leu Thr Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Arg Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Lys Ile Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Glu Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Gln Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Arg Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Val Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Leu
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Arg Glu
820 825 830
<210> 26
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Met Val Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp
1 5 10 15
Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe
20 25 30
Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys
35 40 45
Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu
50 55 60
Lys Lys
65
<210> 27
<211> 2724
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atgcgtggta tgttacgatt atttgaacca aaaggtcgtg ttttattggt tgatggtcat 60
catctggcct atcgtacctt tcatgcactg aagggattga caacctcccg tggcgaacgc 120
gtccaggcag tgtatggatt cgcaaagtcg ctgcttaaag cgcttaaaga agacggagat 180
gcagtcatcg tcgtattcga cgcaaaggcg ccgtcctttc gtcatgaagc atatggtggc 240
tataaggccg gtcgcgctcc aacgccggag gactttcctc gtcagcttgc ccttattaaa 300
gagttagtcg acctgctggg tttggctcgc cttgaagtgc caggctacga agcggacgct 360
gtattagcct cgttagcgaa aaaggcggaa aaggaggggt atgaagtgcg tatcctgaca 420
gccgacaagg acctttacca acttttatca gaccgcattc atgtcatgca ccgtgaaggc 480
tacttgatta cgccagcctg gctttgggaa aagtatgggt tgcgtccaga ccaatgggct 540
gattaccgtg cacttactgg cgacgaaagt gataatttgc cgggcgtcaa aggcattggt 600
gaaaagacgg cccgcaaatt acttgaggaa tggggtagct tagaggccct tttgaagaac 660
ctgggccgcc ttaaacctgc aatccgtgaa aaaatcttgg ctcacatgga tgatttaaaa 720
ttatcatggg atcttgctaa ggttcgcaca gacttgccac tggaagtcga tttcgcgaaa 780
cgtcgtgaac ctgatcgcgt gcgccttcgt gcgttcttag aacgtcttga atttggctcg 840
cttctgcatg agtttggact gttagtgtct ccaaaagcgc tggaggaggc gccatggcca 900
ccgcatgagg gagcatttgt gggttttgtt ttatcgcgta aagaaccaat gtgggcggat 960
cttctggcac tggctgctgc acgcggtggg cgtgtacacc gcgagccaga gccctataaa 1020
gacttgcgcg atttgaaaga ggcgcgcggc ttgcttgcca aggtcctttc cgtccttgca 1080
ttacgtgagg gtttgggttt accgcccgga gacgatccga tgctgttagc gtatttgtta 1140
gacccaagca acacgacacc agaaggagtg gcacgccgtt acggggcaga gtggactgaa 1200
gaagcaggcg agcgcgccgc attatctgaa cgtttgtttg ccaatctttg ggggcgcttg 1260
gagggtgagg agcgtctttt atggctgtat cgtgaaggcg aacgcccgtt gagtgctgta 1320
ttagcgcata tggaagcgac cggagtccgc cttgacgtag cttatttgcg cgccctttca 1380
ctggaagtgg ccgaggagat cgcacgtttg gaagcggagg tgtttcgtct ggccggtcac 1440
cccttcaatc tgactagtcg cgaccagttg gaacgcgtat tattcgatga gcatggtctt 1500
ccggccatcg gcaagactga gaagactgga aagcgtagca ccagtgccgc ggtgttggaa 1560
gccctgcgcg aagcacatcc tattgtcgaa aagattcttc aatatcgcga tttgaccaag 1620
ttgacgtcga cttacattga tccacttcct gaccttattc atcctcgcac aggccgtctt 1680
catactcgct ttaatcaaac cgcaacagcg accggacgtt tgagtagtag cgaccctaac 1740
cttcaaaata ttccggtacg tactccgtta ggtcaacgca ttcgtcgcgc attcatcgcc 1800
gaagaagggt ggttattagt agcattggac tatagccaaa ttgagttacg tgtattagct 1860
cacttaagtg gtcgcgaaaa cttaattcgc gtatttcagg agggtcgcga catccacact 1920
aagattgcgt cgtggatgtt tggggtaccg cgcgaggccg tggatccgct tatgcgtcgc 1980
gcggcaaaaa ccatcaattt tggggaatta tacggcatga gtgctcaccg cttaagccaa 2040
gaattagcta tcccttatga ggaggcccag gccttcattg agcgttattt cgagtcgttc 2100
ccgaaagtgc gcgcatggat ccagaaaaca ttggaggaag gtcgccgtcg tggttacgtc 2160
gagaccttat ttgggcgtcg ccgctatgtt cccgatctgg aagcccgtgt taagtcagtt 2220
cgtgaggcag cagagcgtat ggcattcaat atgcctgttc aaggaaccgc agcagatttg 2280
atgaaacttg ctatggtcaa gctgttcccg cgcttggaag aaatgggcgc acgtatgcgg 2340
cttcaggtcc atgacgagtt ggtcttggta gcgccaaagg agcgcgccga agcagtcgcg 2400
cgcctggcaa aggaagtgat ggagggagtc tatcccctgg ctgtcctttt ggaggttgaa 2460
gtagggattg gagaggactg gttaagcgca agagagatgg tgaaggtaaa gttcaagtat 2520
aagggtgaag agaaagaagt agacacttca aagataaaga aggtttggag agtaggcaaa 2580
atggtgtcct ttacctatga cgacaatggt aagacaggta gaggagctgt aagcgagaaa 2640
gatgctccaa aagaattatt agacatgtta gcaagagcag aaagagagaa gaaacaccat 2700
caccatcacc accatcacca ttaa 2814
<210> 28
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
Claims (10)
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体。
3.含有权利要求2所述的分离的核酸分子的载体。
4.含有权利要求3所述的载体的重组细胞。
5.一种制备如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求4所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述Taq DNA聚合酶突变体。
6.一种用于PCR反应的DNA聚合酶试剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体或其复合物。
7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶试剂，其特征在于，所述复合物包括所述Taq DNA聚合酶突变体和结合至抗所述Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体和/或DNA结合蛋白；
优选地，所述纳米抗体源自羊驼、小羊驼、亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼或原驼；
优选地，所述DNA结合蛋白源自古细菌；
优选地，所述DNA结合蛋白源自硫化叶菌属；
优选地，所述DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；
优选地，所述DNA聚合酶试剂中，所述Taq DNA聚合酶突变体或其复合物的浓度为1-2U/μl；
优选地，所述DNA聚合酶试剂还含有：18-22mM Tris-HCl、80-120mM KCl、1-3mM二硫苏糖醇、以及30％-50％甘油。
8.一种用于PCR反应的试剂组，其特征在于，其包括权利要求6或7所述的DNA聚合酶试剂以及PCR反应液。
9.根据权利要求8所述的试剂组，其特征在于，所述PCR反应液含有如下组分中的至少一者：Tris-HCl、dNTPs和金属离子；
优选地，所述金属离子为K+和/或Mg2+；
优选地，所述PCR反应液含有：5-50mM Tris-HCl、30～60mM KCl、2～6mM MgCl2、以及100～600μM dNTPs；
优选地，所述PCR反应液还含有如下组分中的至少一者：BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20以及甲酰胺；
优选地，所述寡肽为六肽；
优选地，所述寡肽的氨基酸序列为：S-F-K-R-G-T；
优选地，所述PCR反应液含有：0.1～10mg/ml BSA、10～20mg/ml寡肽、0.001％～0.5％(w/v)Brij-58、0.005～1％(w/v)Tween-20、1％～5％(v/v)甲酰胺；
优选地，所述PCR反应液含有：8～12mM Tris-HCl、40～60mM KCl、3～5mM MgCl2、300～600μM dNTPs、0.5～2mg/ml BSA、14～16mg/ml寡肽、0.005％～0.015％(w/v)Brij-58、0.01％～0.02％(w/v)Tween-20、以及2～4％(v/v)甲酰胺；
优选地，所述PCR反应液含有：10.9mM Tris-HCl、54.3mM KCl、4.3mM MgCl2、543μMdNTPs、1.1mg/ml BSA、15.2mg/ml寡肽、0.01％(w/v)Brij-58、0.015％(w/v)Tween-20、以及3％(v/v)甲酰胺；
优选地，所述PCR反应液的pH为7.5-10，进一步优选为8-9；
优选地，所述PCR反应液还含有检测目标序列的引物；
优选地，在所述PCR反应液中，所述引物的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM；
优选地，所述PCR反应液还含有检测所述目标序列的探针；
优选地，在所述PCR反应液中，所述探针的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM；
优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3；
优选地，所述PCR反应液含有如下核酸组中的至少一者：由SEQ ID NO.1-3组成的核酸组、由SEQ ID NO.4-6组成的核酸组、由SEQ ID NO.7-9组成的核酸组、由SEQ ID NO.10-12组成的核酸组、由SEQ ID NO.13-15组成的核酸组、由SEQ ID NO.16-18组成的核酸组、由SEQ ID NO.19-21组成的核酸组、以及由SEQ ID NO.22-24组成的核酸组。
10.一种基于PCR反应的检测试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体、权利要求6或7所述的DNA聚合酶试剂、权利要求8或9所述的试剂组。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112725301A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-04-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | Taq DNA 聚合酶突变体及其应用 |
| WO2023098035A1 (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 广州达安基因股份有限公司 | Taq酶突变体及其制备方法和用途 |
| WO2023232075A1 (zh) * | 2022-06-02 | 2023-12-07 | 上海吉量医药工程有限公司 | 一种rna聚合酶融合蛋白及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039538A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 深圳联合医学科技有限公司 | 一种用于血液直接荧光pcr扩增的反应液及其试剂盒 |
| CN105907734A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-08-31 | 天根生化科技（北京）有限公司 | Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用 |
| US20170292144A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods, and kits for synthesis and detection of nucleic acids |
| CN107502600A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-12-22 | 李桂秋 | 一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶及pcr扩增检测方法 |
| CN108048552A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用 |
| CN109943549A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-28 | 苏州译酶生物科技有限公司 | 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶 |
| CN111690626A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-09-22 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011598882.8A patent/CN112574971A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039538A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 深圳联合医学科技有限公司 | 一种用于血液直接荧光pcr扩增的反应液及其试剂盒 |
| US20170292144A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods, and kits for synthesis and detection of nucleic acids |
| CN105907734A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-08-31 | 天根生化科技（北京）有限公司 | Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用 |
| CN107502600A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-12-22 | 李桂秋 | 一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶及pcr扩增检测方法 |
| CN108048552A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用 |
| CN109943549A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-28 | 苏州译酶生物科技有限公司 | 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶 |
| CN111690626A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-09-22 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112725301A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-04-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | Taq DNA 聚合酶突变体及其应用 |
| CN112725301B (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | Taq DNA聚合酶突变体及其应用 |
| WO2023098035A1 (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 广州达安基因股份有限公司 | Taq酶突变体及其制备方法和用途 |
| WO2023232075A1 (zh) * | 2022-06-02 | 2023-12-07 | 上海吉量医药工程有限公司 | 一种rna聚合酶融合蛋白及其应用 |
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