JPS61502637A - ヒトｔ−細胞白血病ウイルスタイプ３のインシトウ検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＴ−細胞白血病ウィルスタイプｍの仁シトウ検出発明の背景 本発明は、感染した個体から取り出した初代の、未培養の組織中のＨＴＬＶ−ｍ 　ＲＮＡ　ｔ−示す、少数の細胞（数の少く関するものである・本方法は他の公 知の方法よりも。

検出感度を著しく高める０例えば、本発明のＲＮＡプローブは、ニックトランス レーションによシ標識された従来のＤＮＡグローブよシも、高い効率でのハイブ リッド形成およびよシ大きなオートラジオグラフィー効率を可能にする＠高い比 活性を示すこれらの新しいグローブは、高活性前駆体を含有する新しい鎖合成に よシ生成されるＯこの結果化じた非対称のグローブ（−重鎖）が、一部はプロー ブ再配列の除去によシ高い効率での／１イブリッド形成を生じる・さらに、非ハ イブリットー重鎮グローブ上のりボヌクレアーゼ合成は、低レベルの非特異的結 合を生じる◇ さらにｓｓＢ標識の混入は、ｓＭまたはｔｍ工で標識されたプローブよりもオー トラジオグラフィー効率を高め、ノ（ツクグラウンドの標識の減少または除去を 可能にする。

また、崩壊の半減期（９０日）は、標＠ＲＮＡのよシ長期間の使用を可能にする ０ 後天性免疫不全症（エイズ）は、ヘルパーＴリンパ球（ＯＫＴＡ＋）の数の減少 と関係する。過酷な未解明の免疫不全を示す０この疾病は、通常多種多様な日和 見主義的な感染および／または悪性を伴い、後者はカボジ腫瘍タイプ（Ｋａｐｏ ｓｉ’ｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｚｙｐｅ）が優位であるＯ前駆症状期（以前、前エ イズと呼ばれ、現在はＡＢＣまたはエイズ関連コンプレックスと呼ばれているｏ ）において、その他の臨床上の徴候は、非常に頻繁に原因不明の慢性のリンパ節 疾患またはヘルパーＴリンパ球を含む白血涼減少を起こす。

新しく発見されたヒトのウィルス、ヒトＴ−細胞白血病（向リンパ性）ウィルス タイプｌ［（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）はエイズ発病の中心であることが解っているＯ このウィルスは、類似のゲノム構成、ウィルスのエンコードされたポリペプチド のトランス活性活動度（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ ）、向Ｔ　−ＩＪンパ球性および遠距離の核酸相同性を含めて。

ＨＴＬＶタイプ！および■と多くの生物学的および物理化学的特性を共有する０ 多数の情報からなる証拠は、エイズを引き起こす原因としてＨＴＬＶ−１１１を 示唆している。

これらは、エイズまたはＡＲＣの大多数の患者、並びにエイズの危険のある大多 数の人々からＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスの分離およびほとんど全てのエイズおよ びＡＢＣ患者並びに血友病患者のエイズの場合、エイズの子どもおよび輸血に関 連した献血者−輸血者のエイズの場合においてＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原に対する抗 体反応の検出を含むＯ現在１分子的にクローン化することおよびＨＴＬＶ−ｆｉ ｔゲノムＲＮＡ、　ＨＴＬＶ−ＩＩＩの不完全直線（複製中間ン型およびＨＴＬ Ｖ−Ｉ［１の全長が完全なプロウィルスのＤＮＡ型に対するｃＤＮＡを分析する ことが可能である０これらの研究は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムはおおよそ長さが １０キロベース（ｋｂ）であシおよび通常のヒ）ＤＮＡに存在する核酸配列を欠 いていることを示した。これらのクローンを新鮮−ｍウィルスのＤＮＡがエイズ またはＡＲＣの少数ではあるが何人かの患者からの新鮮なリンパ組織中に低レベ ルで検出された◎ 同時にｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成実験がエイズまたはＡＲ，Ｃ患者からの 新鮮な組織中のＨＴＬＶ−［［［ウィルス。

ＲＮＡを検出するために始められた。ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は、Ｈ ＴＬＶ−ＤＩ配列のスクリーニング方法として種々の利点を提供する・この方法 は直接的で定量的であり、そして非常に少蓋の組織しか必要としない０さらに、 感染した細胞のタイプに関する。およびＨＴＬＶ−ＩＩＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ 配列の組織分布並びに特定の組織内のＨＴＬＶ−Ｉｌｌ配列を示す細胞の分布を 示す情報が得られる。

従来のＲＮＡ　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成の方法は比較的低感度を示し、 比較的多量に存在するＲＮＡｔ−検出できるのみだった０初代組織中のＨＴＬＶ −１ｌ［ＲＮＡを検出するためのｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法の新しい方 法論を開発することがそれゆえに必要だった。

本発明は、初代の未培養の細胞中のＨＴＬＶ−１［の検出用の簡便な診断上の検 定としての特定の用途を有する。

さらに、この検定は処理手順の間中およびのちの処理の進行または成功の決定を 可能にする。高感度ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は、形質転換および／ま たは腫瘍進展において重要な遺伝子から転写されたメツセンジャー几ＮＡ（ｍＲ ＮＡ）の検出に適用されても良い。例えば、１ｎｓｉｔｕハイブリツド形成法は 、変化した状態を意味する特定の腫瘍遺伝子のｍＲＮＡ発現が増加した細胞を検 出しても良い◎この様な結果は、例えば、悪性を探り、治療の養生法を検定しま たは回復および再発を検出することに使用されても良い。

発明の要約 ウィルスのＲＮＡまたはＤＮＡの検出のためのｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成 法は、簡潔には下記のとおりである。初代の、未培養の細胞を顕微鏡のスライド 上に二方法のうち一つの方法によシ置く。細胞懸濁液を容易につくることのでき る組織を、単核細胞の分離のためにフィコール−ハイバーク（ｆｉｃｏｌｌ　− ｈｙｐａｑｕｅ　）を通して遠心分離する。

これらの細胞の懸濁液を次にスライド上で遠心分離する。

固体組織を凍結し、クリオスタットを使用し、切片に切断する０これら切片を顕 微鏡のスライドに乗せる０ある場合には、スライドをパラホルムアルデヒドで１ 分間固定し、次にエタノール中１ｃ６ケ月またはそれ以上まで延長された期間貯 蔵する◇ハイブリッド形成の直前に、反応基金ブロックするためにスライドを種 々の処理により前処理する０標本を５ｓＢ−標識したＨＴＬＶ−ＩＩＩ几ＮＡプ ローブで３時間ハイブリッド形成させ１次に２時間すすぐＯスライドに写真乳剤 を塗布し、２時間感光させ、銀粒子の視覚化のために現像し、ライト染色版で定 着し、そして光学顕微鏡で分析する０ 上記した様にｉｎ　ｖｉｔｒｏの過程では、より正確な検定であシ、凡ＮＡプロ ーブは公知の検出方法よシ改善された基礎を提供する０このグローブは初代の未 培養の組織試料中のＨＴＬＶ−１１１を検出し、高感度であり、そして比較的迅 速な操作である（典型的に２日）。このＲＮＡグローブは、適当な転写ベクター に挿入されたクローン化ＨＴＬＶ−ＩＩＩＤＮＡから合成される。

エイズ患者または健常人から得たヘパリン化した末梢血液をリンパ球分離媒体（ リドン　バイオネテイツクス）（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）ｉ通し単 核細胞分離のために遠心分離する。細胞を几ＰＭ１１６４０媒体で２度すすぎ、 １０チウシ胎児血清を含む媒体中に１０＠ｃｅ１１ｓ／−に再び懸濁する０これ らの細胞を次に顕微鏡のスライド（あらかじめ７０チエタノールで洗浄した）上 に、１スライドにつき細胞懸濁液２００μｔの細胞遠心分離によシのせる。スラ イドを５分間風乾し１次にスライドに固定する。この目的の為に、ＰＢＳ　（Ｃ ａ、　Ｍｇ　を含有しない）中の４％バラホルムアルデヒド（ペイカー）　（Ｂ ａｋｅｒ）にスライドを１分間のみ浸し、次に７０チエタノールに移す◇調製物 をハイブリッド形成に使用するまで４℃で貯蔵する〇”５−４１［ＲＮＡプｅｌ 　−７’（ＤｇＪ！４製１）ＳＰ　６４−几３（Ｒ，３）は、転写ベクターｐｓ Ｐ６４　（市販されておりプロメガ　バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈ）から得られるン上で３／−５／に挿入したクローンＢＨ１０の９、５　ｋ ｂ（１り　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｍ入物カラナル。Ｒ３ＤＮＡｅｉｉｉｉ状のＤＮ Ａ鋳型分子を生成するためにＥｃｏＲＩ　、、（ウィルスのゲノムの中程を切断 する）で消化する０これらのｆ）ＮＡ分子をフェノール−クロロホルム抽出し、 転写の前にエタノール沈殿する０１マイクログラムのＲ３鋳型ＤＮＡ１゜”５− ＵＴＰ　（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｔ：二ｚ−イングランド　ヌクｖ７−　（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ））　２５μＭ、　ＡＴＰ、　ＣＴＰおよ びＧＴＰ　５００　μＭ、　）リス−ＨＣｚ　（ｐＨ７，５）　４０　ｍＭ。

ＭｇＣｌ２６　ｍＭ、　スベルミジｙ　２　ｍＭ、　ＭｇＣｌ２０　ｍＭ　、　 ＤＴＴｌ　０　ｍＭ、　ＲＮａｓｉｎ　（プロメガ　バイオチク）　（Ｐｒｏｍ ｅｇａＢｉｏｔｅｃ　）　１５ユニツト、およびＳＰ６ボリメラーゼにューイン グランド　ヌクレアー）１５ユニツトを含有する反応溶液１０μを中で転写させ る０４０℃で３０分間培養後、追加のＳＰ６ポリメラーゼ１５ユニットを加え、 非標識のＵＴＰを最終濃度５００μＭになる様に加える◎反応を４０℃でさらに ３０分間続ける。ＤＮＡ鋳型を次に３７℃で１０分間ＤＮａｓｅ（７−シンブト ｙ　）　（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　）２０μｇ／ｍｌによシ消化し、”５−Ｒ ＮＡをジョンノンおよびジョンノン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ ）、１９８）に従って精製する。典型的には、７０ないし９０％のｘｓＢ−ＵＴ Ｐがこの方法を利用して組み込まれる。精製ＲＮＡを使用のときまで一９０℃で 分けて貯蔵する。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成 スライド標本を２ＸＳＳＣ（塩化物およびクエン酸塩の標準塩溶液）中で手短か にすすぎ、ｐＨａｏの無水酢酸−トリエタノールアミン中でアセチルイどする０ スライドを次に２ＸＳＳＣ中で手短かにすすぎ、　ＰＢＳ　（Ｃａ、　Ｍｇ　ｔ −含有しない）ですすぎ、そしてα１Ｍ）リス−ＨＣｔ　（ｐＨ７，０）。

１１Ｍグリシン中に３０分間浸す０スライド＠２Ｘｓｓｃ中ですすぎ、　ＲＮＡ グローブの施用の直前に５５℃で５０チホルムアミド−２ＸａＳＣ中に置く。ハ イブリッド形成混合物は、”５−ＲＮＡプローブ１０”（ｐｍ／μｔ、５０チホ ルムアミド、２ＸＳＳＣ，ＤＴＴｌｏｍＭ、　切断されたサケノ精子ＤＮＡ１ｄ ／ｄ、Ｅ、Ｃ免り−を几ＮＡ１−／＊およびウシ血清アルブミン２−／−を含有 していた。混合物ｆ：９０℃で１５分間加熱して変性させ１次に５５℃に冷却し た０過剰な溶液をスライドから除去し、１スライドにつきハイブリッド形成混合 物１０ｔを施用する。カバーグラス（１８Ｘ　１８　ｗ　）　ｔ−ゴムのシで乗 せ、ハイブリッド形成ヲ５０℃で５時間行なう。スライドを次に５２℃で５０係 ホルムアミド−２ＸＳＳＣ中徹底的にすすぎ１次に２ＸＳＳＣ中数回すすぐ。２ Ｘ８ＳＣ中几Ｎａ５ｅ　Ｔ１　（ペーリンガー）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）　 １　ｔｔｇ／　ｙｄと共にＲＮａｓｅ　Ａ　（シグマ）（Ｓｉｇｍａ）　１００ ３ｇ７．１でリボヌクレアーゼ処理を５７℃で５０分間行なう０スライドを５２ ℃で５０チホルムアミド−２ＸＳＳＣ中で再びすすぎ１次に２ＸＳＳＣ中ですす ぎそしてエタノール中で脱水する。ハイブリッド形成した調製品を水で１＝１に 希釈してＮＴＢ２ヌクレアートラック　エマルジョン（イーストマン）　（Ｅａ ｓｔｍａｎ　）でオートラジオグラフィーをする０４℃で２日間の感光ののちに 、スライドをデクドール（Ｄｅｋｔｏｌ　）　（イーストマンン中で現像し乾燥 させ、ライト染色液（ハーレコ）（Ｈａｒ−１ｅｃｏ　）で染色する＠ この方法は、非常に低いパーセンテージの細胞（典型的にα０１チ）および短期 間（２ないし５日）におけるＨＴＬＶ−１ｉｔウイルスのＲ，ＮＡのｉｎ　５ｉ ｔｕ検出を可能とする◇エイズ、Ａ）ＬＣまたは高い危険性含有する個人からの 初代の細胞を培黛なしに検出することができ、る。試料（初代の細胞）のタイプ は末梢血液、骨髄、リンパ節および細胞懸濁液が得られる膵臓細胞、および固体 組織例えば脳。

肺、肝臓、す７２節およびカボジ肉腫を包含する・９、Ｏｋｂウィルスの挿入物 が得られるＨＴＬＶ−１［［クローンＢＨ１ｏは、アメリカン　タイプ　カルチ ャー　コレクシ＝ｘ　ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ）、承認＠４０１２５全通して利用できる。このクローンはＡ ＴＣＣにおいて合衆国特許および商標庁により決められた方法により、寄託物の 永続性および有用性に関して３０年間（試料の要求の後５年を加える）そして公 共の利用については制限なしに保管される。さらにとのＨＴＬＶ−ＩＩＩクロー ンについての記載は、　Ｗｏｎｇ−８ｔａａｌらアメリカ特許出願第Ｓｅｒ、Ｎ ｏ、６４！、５０６号、１９８４年８月２２日出願。

表題＠ＨＴＬＶ−［［のゲノムの分子クローン−１ｆＣ見られるＯ一般にＨＴＬ Ｖ−１［［ゲノムのクローン化は、＠縮ＨＴＬＶ−ｍウィルスでのＲ９−細胞の 感染ののちに不完全なウィルスのＤＮＡを分離すること、およ°びウィルスのｃ 　ＤＮＡで選別されるラムダ７アージライブラリー中でこのＤＮＡをクローン化 することを含む０細胞系Ｈ９／ＨＴＬＶ−ｍは大量のＨＴＬＶ−！Ｉｔウィルス を製造し、エイズ血清のウィルス特異性抗原および抗体を検出するために使用さ れる免疫学的検定用に重要な製造細胞系として働＜　ｏ　Ｈ’ｐ　／ＨＴＬＶ− １１１細胞（感染細胞）の培養物は、成長し、集められ１次に新しく感染した細 胞から低分子量のＤＮＡを抽出する。これは不完全なウィルスのＤＮＡｆ：製造 する０不完全な直線状のＤＮＡ　（プロウィルスＤＮＡ）が次に得られ。

これは完全なＨＴＬＶ−ＩＩＩのゲノム、即ち複製コンビ−テントを含む０この ＤＮＡ１次にクローンラムダＢＨ１０ｉ形成するためにベス（Ｗｅｓ　）ラムダ Ｂのプラスミドラムダ中で消化する。

上記の様に利用されるｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は。

細胞から分離および／またはｆｌ＃製されたＲＮＡまたはＤＮＡとは全く異なっ て、細胞内にそのままで核酸へハイブリッド化させる〇 加えて、放射性標識されるプローブは３）（、ＩＨｉ　、！２ｐまたは好ましく ＃１３ＳＳで標識されて良い。

国際調査報告 １ｍｓ□　Ａｓ□　＋ｍ　、、、、、、、、８．、ｏ２．。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．試験試料を３５Ｓ−標識ＨＴＬＶ−ＩＩＩＲＮＡプローブと接触させ、該試 料を写真乳剤でおおい、そして該試料を光学顕微鏡により分析することより実質 的になるヒトＴ−細胞白血病ウイルスタイブ−ＩＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）のイ ンシトウ検出の方法。
2. ２．該試験試料が初代組織培養物である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該プローブが直線状ＤＮＡ鋳型分子を形成するためにＲ３ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉで消化することによりＤＮＡ鋳型を形成し、該ＤＮＡ分子を３５Ｓ−ＵＴＰで 転写し標識ＤＮＡ鋳型を形成し、該標識ＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅで消化し、そし て３５Ｓ−ＲＮＡを得ることより実質的になる請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブを試験試料と接触させ、そして該試料を３５Ｓ で標識されたＨＴＬＶ−ＩＩＩを光学顕微鏡により分析することより実質的にな るＨＴＬＶ−ＩＩＩに特異的なＲＮＡを示すリンパ球の検出の方法。
5. ５．試験組織試料を放射性標識ＲＮＡプローブで処理しそして該プローブを分析 することより実質的になるＨＴＬＶ−ＩＩＩのインシトウ検出の方法。
6. ６．該放射性標識プローブが、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓからなる群のひ とつで標識される請求の範囲第５項記載の方法。