ES2225179T3 - Kit de ensayo de transcriptasa inversa, su utilizacion y procedimiento de analisis de la actividad rt en muestras biologicas. - Google Patents

Abstract

Kit de ensayo de la transcriptasa inversa (RT) que comprende uno o más paquetes que contienen molde(s) de ácido poliriboadenílico (prA) y/o ácido polidesoxiadenílico (pdA) fijados a una fase sólida que se pueden obtener poniendo en contacto una fase sólida de poliestireno con una disolución de acoplamiento que comprende 1- metilimidazol, y prA y/o pdA, seguido de incubación, lavado con un tampón de lavado, secado y envasado, componentes del ensayo de tipo RT adaptados envasados de manera separada seleccionados del grupo que consiste en una mezcla de o, de manera separada, un tampón, pH7-8, un ion de un metal divalente, quelante, poliamina, inhibidor de ARNasa, agente reductor, sal, agente estabilizador, y detergente, y una mezcla de o, de manera separada, desoxinucleótido trifosfato liofilizado, cebador, agente protector y un tampón de lavado concentrado.

Description

Kit de ensayo de transcriptasa inversa, su utilización y procedimiento de análisis de la actividad RT en muestras biológicas.

La presente invención se refiere a un kit de ensayo de transcriptasa inversa (RT) para analizar la actividad de RT en muestras biológicas. La invención también se refiere a la utilización del kit de ensayo de RT para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad RT en una muestra biológica seguido, de manera opcional, de la evaluación del estado de un trastorno o enfermedad relacionado con la actividad RT en base al resultado del análisis de la actividad
RT.

Antecedentes de la invención

La transcriptasa inversa (RT) es la enzima crucial responsable de la síntesis de ADN a partir de ARN vírico en todos los retrovirus, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Baltimore-70, Temin-70, Barre-Sinoussi et al-83). Este proceso implica tres actividades enzimáticas diferentes: síntesis de la primera cadena de ADN, degradación de la cadena de ARN vírica en el híbrido ADN/ARN, y síntesis de la segunda cadena de ADN (para una revisión véase Goff).

Los retrovirus pueden existir en formas exógenas o endógenas o en ambas. La diferencia principal es que un retrovirus endógeno ha entrado en la línea germinal y, por lo tanto, su ADN está presente en todas las células del organismo, a diferencia de un retrovirus exógeno que sólo es capaz de entrar en las células a través del receptor apropiado para ese virus específico. Los retrovirus endógenos (ERV) en los seres humanos se denominan HERV. La forma provírica integrada de un retrovirus endógeno tiene la misma estructura fundamental que la del retrovirus exógeno. Se piensa que la integración de algunos HERV en la línea germinal se ha producido hace 35 a 45 millones de años. Estas secuencias retrovíricas constituyen el 1% del genoma de los mamíferos, y por lo tanto, también del genoma humano. Por lo tanto, están presentes en todas las células humanas y se heredan de acuerdo con las leyes Mendelianas.

Muchas familias de HERV están presentes en el genoma humano. El número de copias de HERV por genoma humano haploide varía entre un única copia hasta miles de copias para las diferentes familias. La mayor conservación en la secuencia de nucleótidos se encuentra en el gen pol. Esta característica se ha utilizado para obtener una relación entre las familias de HERV. Aunque muchos de los HERV y de sus ORF son defectuosos, se han detectado los transcritos de ARNm de la mayoría de las familias de HERV en muchos tipos de tejidos (revisado en Wilkinson et al 1994, Leib-Mösch y Seifarth 1996). Además, se han observado partículas de viriones con actividad polimerasa y proteasa en placentas humanas normales, oocitos, teratocarcinomas, tejidos de carcinoma mamario y en las glándulas salivares de algunos pacientes autoinmunes (revisado en Wilkinson et al., 1994, Umovitz y Murphy 1996, Tönjes et al., 1997). Las condiciones de estrés como anoxia e irradiación con luz UV también pueden inducir la expresión de HERV como se ha observado con los retrovirus infecciosos (revisado por Duvic 1995).

Muchos HERV se han localizado en puntos de rotura de cromosomas dentro del genoma (Di Cristofano et al., 1995, Meese et al., 1996). La recombinación entre secuencias de HERV localizadas en diferentes sitios de los cromosomas puede producir reordenaciones genómicas que incluyen traslocaciones, inversiones, duplicaciones y deleciones. Estos eventos de recombinación son los responsables de generar inestabilidad genómica que es una característica importante de la evolución. Además, muchos tumores se caracterizan por reordenaciones genómicas específicas que se piensa que juegan un papel crucial en la tumorogénesis. La relación entre la presencia de retrovirus infecciosos y el desarrollo de tumores en el anfitrión sugiere que los HERV están asociados con el cáncer. Los antígenos relacionados con las partículas de viriones y con los retrovirus se observan frecuentemente en muestras de tumores primarios también en ausencia de virus infecciosos (Weiss 1984, Faff et al., 1992). Además, se ha demostrado la presencia de anticuerpos frente a proteínas retrovíricas en los sueros de pacientes con cáncer (Weiss, 1984). Más aún, se ha visto que las secuencias de HERV se expresan mucho en determinadas líneas celulares derivadas de tumores (revisado en Löwer et al., 1996).

Los provirus endógenos también pueden recombinarse con variantes exógenas (Martinelli et al., 1990). Los recombinantes nuevos reciben un fenotipo alterado. Esto puede contribuir a la rápida evolución de los retrovirus infecciosos nuevos. El gen env se afecta especialmente porque las mutaciones en otras partes pueden resultar dañinas y no ser compatibles con la formación de partículas. Se ha visto que algunas cepas de retrovirus son simbióticas en una especie y patógenas en otra. Estos descubrimientos indican que existe un problema grave en los xenotransplantes. Los ERV simbióticos proporcionados por los tejidos transplantados pueden ser patógenos en el anfitrión nuevo. Pueden ser capaces de interaccionar con receptores de la superficie celular presentes en las células del anfitrión nuevo que son necesarios para la fusión retrovírica. Además, se puede producir la recombinación con secuencias retrovíricas endógenas en el genoma del receptor que puede crear retrovirus infecciosos nuevos que se pueden extender en la población. Tanto los retrovirus endógenos como los exógenos pueden contribuir a la transmisión vertical y horizontal de material genético dentro de y entre especies y pueden proporcionar mecanismos para la evolución de agentes patógenos
nuevos.

Se ha visto que tanto los retrovirus infecciosos como los ERV exhiben funciones de regulación inmune (revisado en Krieg et al., 1992). Estos efectos se han estudiado principalmente en ratones pero existen algunas observaciones que apoyan la existencia de mecanismos similares para los HERV. Si las secuencias de HERV pueden desregular una respuesta inmune pueden producir enfermedades autoinmunes. Estos efectos pueden estar modulados directamente por las proteínas de los HERV o indirectamente mediante la influencia en la expresión de moléculas implicadas en la respuesta inmune. Las proteínas de los HERV pueden estar expuestas en la superficie celular. La pérdida de la tolerancia propia frente a las secuencias de estas proteínas puede producir reacciones autoinmunes frente a las células en las que están expuestas. Los anticuerpos producidos después de una infección retrovírica pueden reaccionar de manera cruzada con las proteínas codificadas por los HERV y ser responsables de la pérdida de tolerancia. Este fenómeno se ha observado en ratones transgénicos (Zinkemagel et al., 1990). Además, la pérdida de tolerancia frente a las proteínas env codificadas por ERV se ha observado en ratones que desarrollaron de manera espontánea una glomerulonefritis autoinmune (revisado en Krieg et al., 1990 y 1992). Algunas observaciones en seres humanos pueden apoyar la existencia de anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con las proteínas retrovíricas endógenas y exógenas. Se han detectado anticuerpos frente a proteínas retrovíricas en los sueros de pacientes autoinmunes (revisado en Krieg et al., 1992, Umovitz y Murphy, 1996). En determinados casos, se vio que los sueros también reaccionaban con retrovirus exógenos. Las infecciones retrovíricas se han asociado con el comienzo de enfermedades autoinmunes (revisado en Krieg et al., 1990 y 1992). Más aún, las proteínas retrovíricas infecciosas presentan una similitud parcial con antígenos propios que son dianas habituales de los autoanticuerpos (revisado en Krieg et al., 1992). Éstas pueden iniciar respuestas autoinmunes frente a estas dianas, un mecanismo referido como mimetismo molecular. Sin embargo, todavía no se han detectado similitudes entre las proteínas HERV y los antígenos propios conoci-
dos.

Los ensayos para determinar la actividad RT se han convertido en técnicas aceptadas para la detección y cuantificación de retrovirus en cultivos celulares. Son utilizados, junto a los ensayos con el antígeno p24, como ensayos de confirmación para el aislamiento de VIH (Jackson-88, Gupta-87). RT también en una de las dianas principales en el intento de encontrar agentes antivíricos frente a VIH. Un ensayo de RT convencional se lleva a cabo utilizando un ensayo con una enzima soluble con un molde artificial-construcción de cebador y con desoxinucleótido trifosfato tritiado como el sustrato de nucleótido (Baltimore- 71, Lee et al.,- 87). Este primer sistema estaba basado en la detección de la incorporación de radiactividad en híbridos ARN/ADN que precipitaban con ácido tricloroacético (TCA). La utilización de nucleótidos que emiten radiación beta requiere la utilización de líquidos de centelleo para la detección de la radiactividad, lo que habitualmente resulta en una reproducibilidad pobre debido a problemas de extinción. Este método es relativamente engorroso y no se adapta fácilmente a un rastreo a gran escala de un gran número de muestras. También es muy sensible a los efectos de factores perturbadores de las muestras.

Durante la última década de investigación intensiva en VIH, el ensayo RT se ha mejorado utilizando diferentes técnicas. La introducción de sustrato marcado con ^{125}I ha proporcionado una sensibilidad mayor y ha eliminado la extinción y la utilización de líquidos de centelleo (Neumüller et al.,-90). La introducción de moldes o de cebadores unidos a fases sólidas simplifica la separación entre el sustrato y el producto, eliminando la necesidad de precipitaciones con TCA y ha resultado en un "ensayo de RT en un tubo") (Gronowitz et al., -90, EP 0 447 442 B1).

Más recientemente, se ha eliminado la utilización de radiactividad como marcador en el ensayo RT mediante la utilización de bases de nucleótidos modificadas que contienen bien epítopos antigénicos o estructuras con una afinidad alta para ligandos definidos. La presencia de estos epítopos o estructuras en el híbrido ARN/ADN nuevo sintetizado se utiliza después para la unión de anticuerpos o ligandos conjugados con, por ejemplo, enzimas ELISA. Se determina entonces la cantidad de enzimas ELISA unidas en un ensayo enzimático secundario.

Porstmann et al., 1991, utiliza 5-bromo-desoxiuridina (BrdU) trifosfato como sustrato de nucleótido en el ensayo RT. La cantidad de BrdUMP incorporada se determina en una etapa secundaria en un inmunoensayo utilizando anticuerpos monoclonales anti-BrdU conjugados con fosfatasa alcalina.

Eberle y R. Seibl, 1992, determinan la incorporación de dUTP marcado con digoxigenina en ADN sintetizado nuevo en lugar de dTTP marcado radiactivamente. Para lograr llevar a cabo la separación de nucleótidos que no se han incorporado del ADN sintetizado nuevo, se añade también dUTP marcado con biotina a la mezcla de reacción. Después de la transcripción inversa, el ADN sintetizado nuevo doblemente marcado se inmoviliza en pocillos ELISA recubiertos con estreptavidina y se evalúan fotométricamente mediante la unión de anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con peroxidasa. Este procedimiento ha sido la base de un kit de ensayo de RT que está disponible comercialmente en Boehringer Mannheim.

Urabe et al., 1994, ha desarrollado un ensayo RT no radiactivo basado en la incorporación de dUTP-biotina en una construcción odT/prA inmovilizada. Se determina la cantidad de sustrato de nucleótido incorporado fotométricamente después de la adición de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. Muy poco antes de la presente invención Ekstrand et al., 1996, desarrolló un ensayo en el que poli (rA) unida covalentemente a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos sirve como molde para la incorporación de BrdUMP durante la etapa de la transcripción inversa. Después se determina la cantidad de BrdUMP incorporada en el ADN inmunológicamente de acuerdo con un procedimiento similar al utilizado por Porstmann et al., 1991. El método está disponible como kits de determinación de RT de Cavidi Tech, Uppsala, Suecia.

Otro principio para la detección de la actividad RT, explotado comercialmente por NEN (New England Nuclear, EEUU), es la utilización de sondas de secuencia específica para la detección de ADNc sintetizado nuevo. La reacción enzimática utiliza una molécula de ARN heteropolimérica con un cebador de oligonucleótido de 20 bases complementario a las secuencias de ARN próximas al extremo 5'. Durante la reacción de la RT se produce una cadena completa de ADNc. Después de la hidrólisis del molde de ARN, el ADNc se hibrida con dos sondas de oligonucleótidos diferentes, la sonda de captura y la sonda de detección. La sonda de captura se utiliza para unir el ADNc a un pocillo de una microplaca. La sonda de detección se conjuga con peroxidasa de rábano, que después de lavar para eliminar el sustrato de nucleótido que no ha sido utilizado y las sondas libres, da lugar a una reacción de color.

La sensibilidad de la detección en el último tipo de ensayo puede incrementarse mediante la amplificación del ADNc producido en la reacción de la RT mediante una reacción en cadena de la polimerasa. El ADN amplificado puede detectarse posteriormente con diferentes tipos de sondas marcadas (Silver 93, Heneine 1995, EEUU 5817457, EEUU 5849494).

Para algunas aplicaciones del conocimiento de la actividad RT en muestras biológicas, es deseable utilizar un ensayo de RT que de lugar a resultados cuantitativos. Estas aplicaciones comprenden la evaluación de enfermedades o trastornos en los que se van a comparar los resultados del ensayo de RT obtenidos a partir de determinaciones realizadas a diferentes tiempos, o el diagnóstico de enfermedades o trastornos en los que el nivel de la actividad RT comparado con niveles estándar indica si el paciente presenta riesgo de padecer o de hecho está padeciendo la enfermedad o trastorno en cuestión.

En algunos casos, es deseable utilizar un ensayo tan sensible como sea posible en muestras biológicas, por ejemplo, capaz de determinar las menores cantidades de actividad RT como sea posible, de manera que se pueda relacionar la presencia y la magnitud de la actividad RT con enfermedades o trastornos en etapas tempranas.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un ensayo de RT que es fácil de utilizar para fines de rastreo y que es muy sensible para la actividad RT.

Más concretamente, la presente invención está dirigida a un kit de ensayo de la transcriptasa inversa (RT) que comprende uno o más paquetes que contienen molde(s) de ácido poliriboadenílico (prA) y/o de ácido polidesoxiadenílico (pdA) fijado(s) a una fase sólida que se obtienen poniendo en contacto una fase sólida basada en poliestireno con una disolución de acoplamiento que comprende 1-metilimidazol, y prA y/o pdA, seguido de incubación, lavado con un tampón de lavado, secado y envasado. El kit también comprende componentes adaptados al tipo de ensayo RT envasados por separado seleccionados del grupo que consiste en una mezcla de o de manera individual, un tampón, pH\cong7-8, un ion de metal divalente, un quelante, poliamina, inhibidor de ARNasa, agente reductor, sal, agente estabilizador, y detergente, y también puede incluirse una mezcla de o de manera individual, desoxinucleótido trifosfato liofilizado, cebador, agente protector y tampón de lavado concentrado, instrucciones escritas para la utilización del kit de ensayo. De manera opcional, el kit comprende enzima(s) de referencia liofilizada(s). De manera opcional, el kit también puede comprender componentes de un sistema de detección que comprenden anticuerpo anti-BrdU monoclonal conjugado con fosfatasa alcalina liofilizado, tampón del sustrato de la fosfatasa alcalina y sustrato de la fosfatasa alcalina, tal como comprimidos pNPP.

En una realización preferida del kit de ensayo de RT de acuerdo con la invención, la fase sólida es una placa de microtitulación y se añade a cada pocillo una alicuota de la disolución de acoplamiento, que comprende 100 mM 1-metilimidazol, pH\cong5-7, y 0,5-2 mg/ml prA y/o pdA, seguido de la incubación a una temperatura de 10-60ºC durante 0,5 a 10 horas y de lavado de cada pocillo con el tampón de lavado, que comprende Bis-Tris propano, pH\cong5-7, para eliminar el 1-metilimidazol.

En una realización particularmente preferida del kit de ensayo de RT de acuerdo con la invención, se añaden a cada pocillo 100 \mul de la disolución de acoplamiento que comprende 100 mM 1-metilimidazol, pH\cong6,25, y 1 mg/ml prA y/o pdA, seguido de la incubación a temperatura ambiente durante \cong2 horas, de lavado de cada pocillo con 2x300 \mul de tampón de lavado, que comprende 10 mM Bis-Tris propano, pH\cong6,25, de secado de las placas a 37ºC durante \cong25 minutos y de poner las placas en bolsas de papel de aluminio y de sellar las bolsas en vacío.

En una realización adicional del kit de ensayo de RT de acuerdo con la invención, los componentes del ensayo se seleccionan del grupo que consiste en los tampones Tris y Hepes, pH\cong7-8, los iones de metales divalentes Mg^{2+} y Mn^{2+}, los quelantes ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) y ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetiléter)N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) y las poliaminas espermina y espermidina, los inhibidores de ARNasa sulfato de heparina y sulfato de dextrano, los agentes reductores ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), y glutation, las sales NaCl y KCl, los agentes estabilizadores suero bovino de neonato (NCS) y albúmina de suero bovino (BSA), los detergentes Tween 20 y Triton X-100, el desoxinucleótido trifosfato BrdU, el cebador oligo dT u oligo dN, donde N es otro análogo de T tal como U, y los agentes protectores ATP, GTP y CTP.

La presente invención también está dirigida a la utilización de un kit de ensayo de acuerdo con la invención, para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad RT en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica que se selecciona de extractos celulares y líquidos biológicos, tales como plasma, suero, líquido espinal, líquido sinovial y líquido pleural.

En una realización preferida la utilización de acuerdo con la invención es seguida de la evaluación del estado de una enfermedad o trastorno relacionado con la actividad RT en base al resultado del análisis de la actividad RT.

De manera adicional, la presente descripción se refiere a un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad RT en una muestra biológica que comprende las etapas de utilizar y seguir las instrucciones escritas del kit de ensayo de RT de acuerdo con la invención para la determinación de la actividad RT en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica que se selecciona de extractos celulares y líquidos biológicos, tales como plasma, suero, líquido espinal, líquido sinovial y líquido pleural.

El mencionado método es seguido de la evaluación del estado de una enfermedad o trastorno relacionado con la actividad RT en base al resultado del análisis de la actividad RT.

Ahora la presente invención se ilustrará mediante referencia a los dibujos y a una descripción más detallada de las realizaciones, pero estas realizaciones no deben considerarse como limitantes del ámbito de protección definido en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1. Se determinó la actividad RT en un medio de un cultivo de la línea celular PK 15 mediante dos métodos. Se representaron los valores de absorbancia obtenidos frente a la cantidad de medio añadida a la mezcla de re-
acción.

Figura 2. Determinación directa de RT en muestras de líquido sinovial obtenidas de pacientes que padecen artritis reumatoide. Los valores representados se obtuvieron de muestras de 1 \mul y después de una reacción de RT durante toda la noche.

Figura 3. Se determinó la actividad RT en un extracto de un cáncer de mama mediante dos métodos. Se representan los valores de absorbancia obtenidos frente a la cantidad de extracto añadido a la mezcla de reacción.

Figura 4. Determinación directa de la actividad RT en extractos de biopsias de cáncer de mama. Los valores de absorbancia representados frente a la concentración de proteína en cada muestra se obtuvieron de 1 \mul de extracto y de una reacción de RT durante toda la noche.

Figura 5. La actividad RT se determinó mediante dos métodos en A) medio de un cultivo de células transformadas con HTLV-1 y en B) medio de un cultivo infectado con BLV. Se representaron los valores de absorbancia obtenidos frente a la cantidad de muestra añadida a la mezcla de reacción.

Figura 6. Determinación directa de la actividad RT en el suero de macacos infectados con SIV. Se representaron los valores de absorbancia obtenidos en un ensayo de RT de 4 horas frente al día en el que se tomó la muestra de
suero.

Descripción detallada de las realizaciones de la invención

El kit de ensayo de RT de la invención comprende tres tipos de componentes diferentes, concretamente

1)

Un molde que consiste en ácido poliriboadenílico (prA) o ácido polidesoxiadenílico (pdA) fijados a una fase sólida.

2)

Mezclas de reacción que permiten a las enzimas polimerizar una nueva cadena de ADN de manera dependiente del cebador utilizando el polinucleótido molde fijado.

3)

Componentes de un sistema de detección para la detección inmunológica de la cadena de ADN sintetizada in vitro.

1) Molde fijado a la fase sólida

Se ha desarrollado un método mediante el cual se puede fijar prA o pdA a determinados tipos de placas de microtitulación de manera que se permite a los polinucleótidos servir como moldes para la incorporación dependiente del cebador de dNTP por polimerasas de ADN víricas y celulares dependientes de ARN y ADN (transcriptasas inversas, RT). Se ha demostrado que funciona en dos placas de microtitulación disponibles comercialmente, CavaLink™ y NucleoLink™ de Nalge Nunc International. Las placas de microtitulación acopladas con prA utilizadas en los kits de ensayo de acuerdo con la invención se producen a partir de tiras NucleoLink™. El procedimiento y los tampones se describen en la Tabla 1. No se conoce el mecanismo de la unión porque el procedimiento no se corresponde con los métodos recomendados o sugeridos por el fabricante ni aparece de manera explícita en la literatura. Un mecanismo posible de reacción implica grupos reactivos introducidos durante el proceso de fabricación distintos de los de la utilización conocida de esa superficie específica. Se espera obtener resultados similares con otras placas de microtitulación basadas en poliestireno de otras fuentes comerciales. Se ha publicado un método para activar químicamente poliestireno para obtener una superficie con unas propiedades iguales a las de las placas CovaLink™ (Zammatteo et al., 1996). También se han publicado muchos otros métodos para fijar polinucleótidos a superficies de plástico (Zammatteo et al., 1996, Gregorius et al., 1995, Niveleau et al., 1993, Rasmusson et al., 1991, Ghosh y Musso, 1987).

2) Mezclas de reacción de tipo RT adaptadas

Las condiciones generales para obtener la incorporación de nucleótidos por las polimerasas de ADN dependientes de ARN y ADN en sistemas solubles utilizando enzimas purificadas son simples y conocidas. Incluyen un tampón que mantiene el pH alrededor de 7,5, un ion de metal divalente Mg^{2+} o, de manera ocasional Mn^{2+}, una sal para ajustar la fuerza iónica, para algunas enzimas un agente reductor y un poco de detergente. Con en este tampón de reacción sencillo las enzimas serán capaces de utilizar el molde, el cebador y los desoxinucleótidos trifosfato añadidos para sintetizar una cadena de ADN. Este concepto general no tiene en cuenta las diferencias en las condiciones óptimas de la reacción o especialmente adaptadas que se requieren para las diferentes clases o tipos de transcriptasas inversas. Otro aspecto importante es la capacidad deseada de la mezcla de reacción para tolerar la adición de líquidos biológicos o de extractos celulares sin tratar como fuente de la actividad enzimática RT.

El ensayo sistemático utilizando tanto muestras crudas, tales como sobrenadantes de cultivos celulares, como enzimas purificadas revela otros componentes de la reacción que se utilizaron para crear mezclas de reacción optimizadas o especialmente adaptadas para transcriptasas inversas específicas.

La Tabla 2 contiene un resumen de los componentes utilizados para componer las mezclas de reacción de tipo RT adaptadas. Las composiciones de las mezclas de reacción típicas se presentan en la Tabla 3.

El método del ensayo de la transcriptasa inversa utilizando el kit de la invención, se lleva a cabo como se describe más abajo. La primera etapa del ensayo consiste en añadir 100 \mul de la mezcla de reacción a cada pocillo de la placa de microtitulación acoplada con prA, seguido de una preincubación de 20-60 minutos a 33ºC. Se añade después la muestra que contiene la transcriptasa inversa en 50 \mul de tampón, lo que da lugar a un volumen de ensayo final de 150 \mul, y la placa de microtitulación se incuba entonces a 33ºC. Cada muestra se añade a placas de microtitulación duplicadas para permitir dos tiempos de ensayo que están estandarizados en 3 horas y toda la noche, lo que significa 16-20 horas. Se proporciona un procedimiento paso a paso en las instrucciones escritas o en el manual del usuario incluido en cada kit. Contiene sugerencias o instrucciones de cómo adaptar los componentes genéricos del ensayo de la transcriptasa inversa a alguna o todas las aplicaciones siguientes: 1) Cuantificación de la actividad RT. 2) Rastreo de la actividad RT en extractos celulares, sobrenadantes celulares y/o líquidos biológicos que incluyen pero no están limitados a plasma, suero, líquido espinal, líquido sinovial y líquido pleural. 3) Determinación del anticuerpo que bloquea la actividad RT. 4) Determinación de valores CI_{50} para las sustancias que inhiben la actividad
RT.

Utilizando estas mezclas de reacción y los moldes fijados a la fase sólida diseñamos los ensayos reivindicados que fueron más sensibles en las determinaciones directas de la actividad RT que los ensayos descritos previamente basados en moldes fijados a fases sólidas o que permitieron la detección de actividades de transcriptasa inversa desconocidas previamente.

3) Detección inmunológica de la cadena de ADN sintetizada in vitro

La polimerasa de la muestra sintetiza una cadena de ADN utilizando el Bromodesoxiuridina trifosfato (BrdUTP) que se proporciona en la mezcla de reacción.

El BrdUMP incorporado se detecta mediante un anticuerpo monoclonal que une BrdU conjugado con fosfatasa alcalina. Después se cuantifica la actividad fosfatasa alcalina del anticuerpo unido mediante la adición de una disolución del sustrato que contiene para-nitrofenilfosfato, pNPP. La disolución del sustrato se vuelve amarilla cuando el pNPP se rompe por la acción de la fosfatasa alcalina. Se determina la densidad óptica (DO) en un lector de ELISA estándar a una longitud de onda de 405 nm. El valor de DO corregido con el valor de fondo es proporcional a la actividad RT de la muestra.

La etapa de detección se lleva a cabo como se describe más abajo. En las instrucciones escritas o en el manual del usuario incluidos en cada kit se proporciona un procedimiento paso a paso. Las composiciones de las disoluciones tampón aparecen en la Tabla 4.

Después del ensayo de la transcriptasa inversa, la placa de microtitulación se lava utilizando uno de los lavadores de placa de ELISA disponibles comercialmente o mediante la inmersión seriada de la placa en recipientes con tampón de lavado. El anticuerpo conjugado se proporciona, de manera opcional, en el kit en forma liofilizada. Después de la reconstitución con 1% Triton X-100 en agua destilada, se añaden 100 \mul de la disolución del anticuerpo a cada pocillo y la placa de microtitulación se incuba a 33ºC durante 90 minutos. Para eliminar el exceso de anticuerpo, la placa se lava posteriormente una segunda vez de la misma manera. La disolución del sustrato se prepara a partir de comprimidos de tampón y pNPP proporcionados, de manera opcional, con el kit. Después se determinan los valores de DO a intervalos de tiempo adecuados.

La relación lineal entre la cantidad de enzima fosfatasa alcalina unida y la concentración del producto amarillo desaparece a valores de DO altos. Mediante la determinación de la DO a diferentes tiempos, es posible obtener valores útiles, es decir, valores de DO dentro del intervalo de lectura lineal del instrumento particular, para muestras tanto con altas como con bajas cantidades del producto formado durante la etapa del ensayo de la transcriptasa inversa. Las enzimas RT de referencia que se incluyen, de manera opcional, en algunos pero no en todos los kits están calibradas para dar curvas de titulación con valores de DO útiles cuando la DO se determina después de 30 minutos, 2 horas y 16-20 horas, es decir, toda la noche.

La eficacia mejorada obtenida con los kits de ensayo de RT de la invención, se demuestra en la Tabla 5. Las curvas de titulación de RT de VIH-1 se obtuvieron con el kit RT Lenti conocido previamente de Cavidi Tech AB y con un kit de ensayo de la presente invención. Los valores de DO pueden representarse frente a la concentración de enzima RT y ajustarse a una línea recta utilizando un ajuste de mínimos cuadrados. Los valores k de la Tabla 6 son las pendientes de las líneas rectas calculadas y son una medida de la sensibilidad del ensayo. Puede observarse que los kits de ensayo de la invención tienen valores k que son un orden de magnitud mayores. En términos prácticos, esto se traslada a determinaciones útiles para muestras que contienen una concentración de transcriptasa inversa de VIH-1 mucho más baja y/o a un ahorro de tiempo. Los tiempos más cortos necesarios para el ensayo de la transcriptasa inversa y/o un tiempo de lectura más corto para la fosfatasa alcalina significa una inversión de tiempo menor para los usuarios de los kits de la presente invención.

Componentes típicos del kit de la invención

A.

Dos placas de microtitulación de 96 pocillos con prA y/o pdA fijadas.

B.

Un tampón de dilución de la muestra y un tampón de reacción que contiene una mezcla de componentes I-IX adaptada de tipo RT listados en la Tabla 2.

C.

Componentes de reacción liofilizados X-XII mezclados o proporcionados en viales separados.

D.

Enzima de referencia liofilizada bien recombinante, natural purificada o partículas víricas.

E.

Tampón de Lavado Concentrado.

F.

Anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizado, denominado "Rastreador del Producto de la RT".

G.

Tampón del sustrato de la fosfatasa alcalina y comprimidos de pNPP.

H.

Instrucciones escritas o Manual.

Ejemplos Ejemplo 1 Detección mejorada de RT de PERV (retrovirus endógeno porcino) en sobrenadantes celulares

Se sabe que la línea celular porcina PK-15 (riñón porcino) produce de manera continuada pequeñas cantidades de PERV. Se diluyeron de manera seriada sobrenadantes de un cultivo de células PK-15. Se ensayó la capacidad del ensayo de RT del tipo C de Cavidi Tech AB y del ensayo Mn^{2+} de la presente invención para detectar actividad RT a cada dilución. Los datos que se muestran en la Figura 1 son de un ensayo de RT de toda la noche.

El kit de ensayo de la invención exhibe una sensibilidad incrementada aproximadamente 25 veces en relación con el ensayo conocido previamente en el campo. No resultó posible utilizar más muestra para compensar la diferencia en la sensibilidad de la detección debido a que el ensayo del tipo C presentaba unos niveles basales incrementados y desviaciones de la linealidad con el tiempo y/o con la cantidad de muestra con concentraciones de sobrenadante más altas (>2 \mul/pocillo).

El kit de ensayo de la invención puede utilizarse en estudios relacionados con la posible transferencia de retrovirus exógenos y/o con la activación de retrovirus endógenos conjuntamente con el xenotransplante.

Ejemplo 2 Determinación directa de la transcriptasa inversa en líquidos sinoviales

Experimentos de hibridación recientes han sugerido la asociación entre determinados trastornos reumáticos y la presencia de secuencias asociadas a retrovirus. Se obtuvieron muestras congeladas de líquidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide del departamento de Reumatología de Karolinska sjukhuset, Estocolmo, Suecia. Las muestras se habían limpiado de células y de restos celulares antes de la congelación mediante una centrifugación a baja velocidad. Las muestras se descongelaron, se diluyeron de manera seriada y se investigó su actividad RT.

Las actividades obtenidas se volvieron a calcular en DO_{405}/h. La Figura 2 presenta las actividades RT encontradas utilizando 1 \mul de muestra y una reacción enzimática durante toda la noche con el ensayo de RT de líquido sinovial de la invención. No se detectó actividad RT en ninguna de las muestras investigadas utilizando el ensayo de RT de tipo C o Lenti de Cavidi Tech AB.

Ejemplo 3 Detección de la actividad RT en extractos de cáncer de mama humano

Un homólogo humano endógeno o exógeno del MMTV (virus de tumor de mama de ratón) ha sido implicado en la etiología del cáncer de mama humano. Utilizando RT de MMTV recombinante para optimizar las condiciones del ensayo, se pudo detectar la actividad RT en extractos de cánceres de mama sin una concentración o purificación previa. Se obtuvieron extractos congelados de cánceres de mama humanos del departamento de Oncología de Akademiska sjuhuset, Uppsala, Suecia. El tejido tumoral había sido homogeneizado y suspendido en un tampón estándar (pH 7,4). Se recogieron los sobrenadantes después de clarificar mediante una centrifugación a baja velocidad. Las muestras se descongelaron, se diluyeron de manera seriada y se investigó la presencia de actividad RT en el ensayo de RT Mg^{2+} de la invención y en el ensayo de RT de tipo C o Lenti de Cavidi Tech AB.

La Figura 3 muestra un ejemplo representativo de los resultados obtenidos utilizando una reacción de RT durante toda la noche combinada con una reacción de AP de 2 horas. La diferencia en la sensibilidad de la detección entre el ensayo RT de Mg^{2+} de la invención y el ensayo de RT Lenti de Cavidi Tech AB fue de aproximadamente 400 veces. No se detectó actividad en el ensayo RT del tipo C de Cavidi Tech AB.

La Figura 4 ilustra la variación de las actividades RT detectadas mediante el ensayo RT Mg^{2+} en extractos de tumores de diferentes pacientes.

El kit de ensayo de la invención puede utilizarse en relación al posible papel de retrovirus exógenos o endógenos en la etiología del cáncer de mama así como para fines diagnósticos.

Ejemplo 4 Detección de virus semejantes a HTLV (virus de la leucemia de células T humana) en sobrenadantes de cultivos celulares

Algunos individuos infectados con HTLV desarrollan trastornos oncológicos o mielopáticos. En determinadas partes de Japón y del Sur de Asia se describió por primera vez la enfermedad asociada, leucemia de células T del adulto. Un trastorno neurológico, paraparesis espástica tropical, se describió inicialmente en pacientes del Caribe. Son deseables métodos capaces de detectar la exposición al virus y/o la presencia continuada de bajos niveles de actividad vírica.

Un virus bovino muy relacionado, el virus de la leucemia bovina (BLV) es un patógeno para las vacas que tiene grandes consecuencias económicas para las industrias lácteas y de cría de ganado vacuno. BLV se ha utilizado para optimizar un ensayo para detectar la actividad RT de BLV/HTLV.

La Figura 5 A ilustra la diferencia en la sensibilidad de la detección entre el kit de ensayo de la invención y el ensayo de RT Lenti de Cavidi Tech AB. Se diluyeron de manera seriada los sobrenadantes de cultivos celulares de la línea celular transformada con HTLV 1, MT-2, y se utilizaron los dos ensayos de RT para determinar la cantidad de actividad RT en cada muestra. El tiempo de reacción utilizado para la reacción de RT fue de toda la noche (14
horas).

La Figura 5B muestra los datos correspondientes a un conjunto de diluciones de sobrenadantes de células FLK-BLV (esta línea celular está infectada de manera crónica con BLV).

La ganancia total en la sensibilidad de la detección fue de aproximadamente 25 veces para la enzima de HTLV y de 30 veces para la enzima de BLV, respectivamente. El incremento de la sensibilidad resultó esencial para obtener una señal significativa en el sobrenadante de las células MT-2.

Ejemplo 5 Determinación directa de actividad RT en sueros crudos de monos infectados con SIV

La cuantificación de la actividad RT en el suero puede utilizarse para la detección de la replicación del virus durante la infección aguda por el virus lenti. Posteriormente, la actividad RT en el suero es inhibida por la producción de anticuerpo que inhibe RT.

Un grupo de cuatro monos cinomolgus (Macaca fascicularis) incluidos como controles sin tratar en un estudio de tratamiento se infectaron con diez dosis infecciosas para monos (MID50) de SIVsm. Las muestras de suero tomadas a determinados tiempos después de la infección se diluyeron de manera seriada y se ensayaron para determinar la actividad RT utilizando el ensayo RT Lenti de la invención. Se incluyeron muestras de suero de cinco \mul en una reacción de RT de cuatro horas y los valores de absorbancia obtenidos se volvieron a calcular en DO_{405}/h y se representaron frente a los días después de la infección, véase la Figura 6.

El ensayo de RT Lenti de la invención es lo suficientemente sensible como para detectar la replicación del virus mediante el análisis de muestras de suero tomadas durante la etapa aguda de la infección. Los ensayos utilizados actualmente para el rastreo de positividad de VIH entre donantes de sangre humanos se basa en la detección de anticuerpos frente a proteínas de VIH-1 y no detecta personas infectadas durante la etapa aguda de la infección. Estos ensayos están suplementados, en algunos países, con la detección de antígeno vírico mediante ELISA o del genoma vírico por PCR. Ambos tipos de ensayos pueden no detectar cepas de virus diferentes debidas a la gran variación genética e inmunológica entre los virus VIH. RT tiene una función indispensable en la replicación de todos los retrovirus y el presente ensayo ofrece una alternativa atractiva para la detección de infecciones agudas.

TABLA 1

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1

TABLA 2

2

TABLA 3 Componentes del ensayo optimizado de transcriptasa inversa Lenti de la invención

3

TABLA 3 (continuación) Componentes del ensayo optimizado de transcriptasa inversa de BLV/HTLV de la invención

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4

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Componentes del ensayo optimizado de transcriptasa inversa Mg^{2+} de la invención

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5

TABLA 3 (continuación) Componentes del ensayo optimizado de transcriptasa inversa Mn^{2+} de la invención

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7

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Componentes del ensayo de transcriptasa inversa en líquido sinovial de la invención

8

TABLA 4

9

TABLA 5

11

TABLA 5 (continuación)

12

TABLA 6

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13

Referencias

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Claims (10)

1. Kit de ensayo de la transcriptasa inversa (RT) que comprende uno o más paquetes que contienen molde(s) de ácido poliriboadenílico (prA) y/o ácido polidesoxiadenílico (pdA) fijados a una fase sólida que se pueden obtener poniendo en contacto una fase sólida de poliestireno con una disolución de acoplamiento que comprende 1-metilimidazol, y prA y/o pdA, seguido de incubación, lavado con un tampón de lavado, secado y envasado,

componentes del ensayo de tipo RT adaptados envasados de manera separada seleccionados del grupo que consiste en una mezcla de o, de manera separada, un tampón, pH\cong7-8, un ion de un metal divalente, quelante, poliamina, inhibidor de ARNasa, agente reductor, sal, agente estabilizador, y detergente, y

una mezcla de o, de manera separada, desoxinucleótido trifosfato liofilizado, cebador, agente protector y un tampón de lavado concentrado.

2. Kit de ensayo de RT de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además enzima(s) de referencia liofilizada(s).

3. Kit de ensayo de RT de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además componentes de un sistema de detección que comprende anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizado, tampóndel sustrato de la fosfatasa alcalina y sustrato de la fosfatasa alcalina.

4. Kit de ensayo de RT de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el molde fijado a la fase sólida envasado es un molde fijado a una placa de microtitulación que se obtiene poniendo en contacto cada pocillo de la placa con una alicuota de la disolución de acoplamiento, que comprende 100 mM 1-metilimidazol, pH\cong5-7, y 0,5-2 mg/ml prA y/o pdA, seguido de incubación a una temperatura de 10-60ºC durante 0,5-10 h, y de lavado de cada pocillo para la eliminación del 1-metilimidazol con el tampón de lavado, que comprende Bis-Tris propano, pH\cong5-7, seguido de secado y envasado de la placa.

5. Kit de ensayo de RT de acuerdo con la reivindicación 4, donde el molde fijado a la placa de microtitulación envasado, se obtiene poniendo en contacto cada pocillo de la placa con 100 \mul de la disolución de acoplamiento, que comprende 100 mM 1-metilimidazol, pH\cong6,25, y 1 mg/ml prA y/o pdA, seguido de incubación a temperatura ambiente durante \cong2 horas, de lavado de cada pocillo con 2x300 \mul de tampón de lavado, que comprende 10 mM Bis-Tris propano, pH\cong6,25, secado de las placas a 37ºC durante \cong25 minutos y de poner las placas en bolsas de papel de aluminio y de sellar las bolsas en vacío.

6. Kit de ensayo de RT de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde los componentes del ensayo se seleccionan del grupo que consiste en los tampones Tris y Hepes, pH\cong7-8, los iones de metales divalentes Mg^{2+} y Mn^{2+}, los quelantes ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetiléter)N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) y las poliaminas espermina y espermidina, los inhibidores de ARNasa sulfato de heparina y sulfato de dextrano, los agentes reductores ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), y glutation, las sales NaCl y KCl, los agentes estabilizadores suero bovino de neonato (NCS) y albúmina de suero bovino (BSA), los detergentes Tween 20 y Triton X-100, el desoxinucleótido trifosfato BrdUTP, el cebador oligo dT y los agentes protectores ATP, GTP y CTP.

7. Utilización de un kit de ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad RT en una muestra biológica.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, donde la muestra biológica se selecciona de líquidos biológicos y extractos celulares.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, donde el líquido biológico se selecciona de plasma, suero, líquido espinal, líquido sinovial y líquido pleural.

10. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 para la evaluación del estado de un trastorno o enfermedad relacionado con la actividad RT de la muestra biológica, en base al resultado del análisis de la actividad RT.