BRPI9713891B1 - "método de diagnóstico in vitro de um vírus hiv-1 não-m, não-o, e, método de seleção e tipagem de um vírus hiv-1 não-m, não-o" - Google Patents

Description

“MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE UM VÍRUS HIV-1 NÃO-M, NÃO-O, E, MÉTODO DE SELEÇÃO E TIPAGEM DE UM VÍRUS HIV-1 NÃO-M, NÃO-O” A presente invenção é relativa a cepas de retrovírus do grupo HIV-1, não-M não-O, especialmente uma cepa denominada YBF30, a seus fragmentos assim como a suas aplicações como reagente de diagnóstico e como agente imunogênico.

Os vírus humanos da imunodeficiência adquirida, HIV-1 e HIV-2 são retrolentivírus, vírus encontrados em numerosos primatas africanos. Todos estes vírus parecem ter um ancestral comum: é todavia muito difícil prever o período em que estes diferentes vírus se separaram deste precursor. Outros vírus mais distantes se bem que fazendo parte do mesmo grupo são encontrados em outros mamíferos (ungulados e felinos).

Todos estes vírus estão associados a infecções de longa duração; a ausência de sintomas é a regra nos macacos infectados naturalmente.

Por causa de sua forte homologia com o vírus de Sooty Mangabey (África Ocidental), a origem do HIV-2 parece clara, porém nenhum vírus próximo do HIV-1 foi encontrado nos macacos. Os vírus mais próximos são vírus encontrados em dois chimpanzés (SIV CPZGAB, SIV ANT).

Uma importante variabilidade genética é encontrada em todos os lentivírus e o estudo filogenético destas variantes obtidas a partir de numerosos pontos geográficos diferentes permitiu distinguir para HIV-1, 8 subtipos (ciados), todos igualmente eqüidistantes entre si. Os ciados são apenas uma representação matemática da expressão da variabilidade: a análise fenética, baseada não sobre os ácidos nucleicos porém sobre os aminoácidos fornece resultados diferentes (Korber e outros, 1994). A colocação em evidência de subtipos corresponde a uma análise filogenética que não tem, até hoje qualquer correlação fisiopatológica, porém, ao invés uma correspondência geográfica. Com efeito, cada subtipo é encontrado principalmente em um certo espaço geográfico. Na Europa e nos Estados Unidos, o subtipo B é majoritário, ao passa que na Tailândia, são encontrados dois subtipos E e B e que existe uma forte correlação entre o modo de transmissão que, de fato, corresponde a uma certa população e o subtipo encontrado. Todos os ciados foram encontrados na África e suas distribuições através do resto do mundo reflete uma probabilidade de encontro entre pessoas com comportamento de alto risco. O ciado majoritário, que está presente em grande proporção é o ciado A. Em alguns países da África, foi encontrada uma variabilidade muito grande (G. Myers, 1994; P.M. Sharp e outros, 1994). Diversos subtipos foram caracterizados nos países da África central ocidental, como na República Centro Africana (Murphy e outros, 1993) e na República dos Camarões (Nkengasong e outros, 1994).

Ultimamente, pacientes portadores de vírus variantes do HIV-1, cujos soros apresentavam problemas de detecção para certos kits comercializados no mercado francês e cujos western blots de confirmação eram atípicos, foram caracterizados (Loussert-Ajaka e outros; 1994; Simon e outros, 1994; Pedido Internacional PCT WO 96/27013). A análise destas variantes permitiu confirmar que os vírus HIV de tipo 1, deviam ser subdivididos em dois grupos, o grupo M (principal) e um grupo O (acessório) incluindo estes isolados, como tinham proposto Chameaou e outros, 1994. A análise da proporção das mutações sinônimas/mutações não sinônimas sobre as seqüências dos vírus do grupo O conhecidos, indica que este novo grupo é tão antigo, se este não for mais, quanto o grupo M (Loussert-Ajaka e outros; 1995). Sua fraca proporção dos casos atualmente, 8% dos pacientes infectados por HIV na República dos Camarões (Nkengasong e outros, 1994) e 18 caracterizados na França, seriam conseqüência de fatores puramente epidemiológicos.

Estes dois grupos de HIV-1 formam uma árvores de estrela dupla (figuras 9 a 19). Dois isolados, SIV CPZGAB, caracterizado a partir de um chimpanzé do Gabão (Huet e outros, 1990) e CPZANT, caracterizado a partir de um chimpanzé do jardim zoológico de Anvers têm seqüências e organizações gênicas muito próximas de HIV-1, mas não se enquadram em nenhum destes dois grupos e formam sobre a árvore filogenética duas novas ramificações. A colocação em evidência de novas variantes é importante para adaptar reagentes de identificação das infecções por HIV, suficientemente sensíveis e específicas, ou seja que não conduzam a resultados falsamente negativos ou falsamente positivos e composições protetoras em relação a subtipos que não pertençam nem ao grupo M, nem ao grupo O.

Em conseqüência, a Requerente tomou para si a tarefa com o objetivo de fornecer uma cepa não-M, não-O, assim como a seqüências provenientes desta cepa, capazes de permitir a detecção de variantes do HIV-1 não M e não-O, que permitem evitar a obtenção de resultados falsamente negativos ou falsamente positivos. Para isto, os Inventores estabeleceram especialmente um algoritmo de diferenciação e de confirmação entre as infecções HIV-1 dos grupos M e O, o que permitiu que eles selecionassem variantes não-M, não-O. A presente invenção tem por objetivo uma cepa de HIV-1 não-M, não-O, que apresenta as características morfológicas e imunológicas do retrovírus depositado na Collection Nationale de Culture de Microorganismes mantida pelo Institut Pasteur sob o número 1-1753 (denominado YBF30) em 2 de julho de 1996.

Entende-se por variante não-M, não-O, um HIV do tipo 1, que sorologicamente e molecularmente não pode ser reconhecido como pertencente a um destes grupos. A presente invenção tem igualmente por objetivo a seqüência nucleotídica completa da cepa tal como definida acima (SEQID N°. 1) assim como fragmentos de ácido nucleico de pelo menos 10 nucleotídeos, provenientes da dita cepa.

Entre estes fragmentos, pode-se citar: -LTRYBF 30 (SEQ ID N°. 2), - GAG YBF 30 (SEQ ID N°. 3) (gene gag), - POL YBF 30 (SEQ ID N°. 5) (gene ροΐ), - VIF YBF 30 (SEQ ID N°. 7) (gene vif), - VPR YBF 30 (SEQ Π) N°. 9) (gene vpr), - VPU YBF 30 (SEQ ID N°. 11) (gene vpú), - TAT YBF 30 (SEQ ID N°. 13) (gene íat), - REV YBF 30 (SEQ ID N°. 15) (gene rev), - ENV gplóO YBF 30 (SEQ ID N°. 17) (gene env), - NEF YBF 30 (SEQ ID N°. 19) (gene nef), - as SEQ ID N°. 21-57, igualmente denominadas respectivamente YLG, LPBS.l, GAG Y AS 1.1, GAG Y AS1, GAG 6, GAG Y Sl, GAG Y Sl.l, GAG Y S1.2, YRT AS1.3, YRT AS1.2, YRT AS1.1, YRT 2, YRT AS1, YRT 2.1, YRT S.S, YRT 2.3, YRT 2.4, 4481-1, 4235-1, 4235,2M 4235.3, 4235.4, SK69.6, SK69.5, SK69.4, SK69.3, SK69.2, SK69.1, SK68.1, SK68.2, SK68.3, LSI AS1.3, LSI AS1.2, LSI AS1.1, LSI Al, YLPA, assim como qualquer seqüência, que não seja idêntica a uma das seqüências nucleotídicas acima ou não seja complementar de uma destas sequências, mas seja entretanto suscetível de se hibridizar, de maneira específica com uma seqüência nucleica proveniente de um vírus HIV-1 não- Μ, não-O.

Tais seqüências encontram aplicação na identificação específica de um HIV-1 não-M, não-O, como reagente de diagnóstico, sozinhas ou em associação com outros reagentes, para a identificação diferencial de qualquer HIV-1. Estas seqüências podem especialmente ser empregadas nos testes de diagnóstico que compreendem, seja uma hibridização direta com a seqüência viral a ser detectada, seja uma amplificação da dita seqüência viral, utilizando-se como iniciadores ou como sondas, um oligonucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos, incluídos em uma qualquer das seqüências acima e especialmente uma das seqüências SEQID N°. 21-57 pré-citadas. A presente invenção tem igualmente como objetivo HIV-1, caracterizados pelo fato de que eles são distintos ao mesmo tempo do grupo M e do grupo O e apresentam as seguintes características: * pouca ou nenhuma reatividade sorológica em relação a proteínas dos grupos M e O e forte reatividade sorológica em relação a proteínas provenientes da cepa YBF30 ou da cepa SIV CPZGAB; * ausência de amplificação genômica com a ajuda dos iniciadores das regiões env e gag dos HIV-1 dos grupos M e O; * amplificação genômica na presença dos iniciadores provenientes da cepa YBF30, tais como definidas acima; e * homologia dos produtos do gene de envoltório superior a 70% em relação à cepa YBF30. A invenção tem igualmente por objetivo a utilização das seqüências descritas acima para a realização de um processo de hibridização e/ou de amplificação gênica de seqüências nucleicas de tipo HIV-1, estes processos sendo aplicáveis ao diagnóstico in vitro da infecção potencial de um indivíduo por um vírus do tipo HIV-1 não-M não-O.

Este processo de diagnóstico in vitro é realizado a partir de uma amostra biológica (soro ou linfócito circulante) e compreende: - uma etapa de extração do ácido nucleico a ser detectado, que pertence ao genoma do vírus, eventualmente presente na amostra biológica e, se for o caso, uma etapa de tratamento do ácido nucleico, com a ajuda de uma transcriptase inversa, se este último estiver sob forma de RNA, - pelo menos um ciclo que compreende as etapas de desnaturação do ácido nucleico, de hibridização com pelo menos uma seqüência de acordo com a invenção e eventualmente, se necessário, extensão do híbrido formado, na presença de reagentes convenientes (agente de polimerização, tal como DNA polimerase e dNTP) e - uma etapa de detecção da presença eventual do ácido nucleico que pertence ao genoma de um vírus do tipo HIV-1 de grupo não-M não-O.

As condições empregadas para a PCR com a ajuda dos iniciadores provenientes da cepa YBF 30 são as seguintes: - Extração do DNA linfocitário pela técnica de fenol-clorofórmio e avaliação quantitativa por espetrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm. Todas as amplificações são realizadas em Perkin Elmer thermocycler 2400.

As PCR longas (9 kb) são realizadas com o kit XL PCR (Perkin Elmer) de acordo com as condições do fabricante e com as dNTP, as soluções tamponadoras fornecidas e o "hot start" de Perkin Elmer; os ciclos de amplificação desta PCR longa são: -1 ciclo de desnaturação durante 2 minutos a 94 °C, - depois 16 ciclos: 15 segundos a 94°C, 15 segundos a 55°C, 8 minutos a 68°C, - depois 24 ciclos: 15 segundos a 94°C, 15 segundos a 55°C, 8 minutos a 68°C, adicionando-se a cada ciclo mais 15 segundos (incrementação).

As PCR aninhadas são realizadas sobre os produtos de amplificação das PCR longas. As condições de realização das PCR aninhadas são: - solução tamponadora e enzima Taq polimerase "Expand High Fidelity PCR System" de Boehringer Mannheim de acordo com as instruções do fabricante, dNTP e "hot start" de Perkin Elmer. - 200 μΜ de cada dNTP, 20 pmoles de cada iniciador de acordo com a invenção, 5 pL de DNA, 10 pL de tampão PCR 10X, 2,6 unidades de Taq polimerase em um volume de 100 pL, - amplificação: um ciclo de 2 minutos a 94°C, seguido de 38 ciclos: 15 segundos a 94°C, 15 segundos a 55°C, um tempo de elongação a 72°C variável de acordo com o tamanho do produto de PCR a ser amplificado (de 30 segundos a 2 minutos) e um último ciclo de elongação de 10 minutos a 72°C. A detecção do produto amplificado é realizada de preferência por sequenciamento direto. A invenção tem igualmente por objetivo um peptídeo ou um fragmento peptídico, caracterizado pelo fato de que ele é suscetível de ser expresso por uma cepa de HIV-1 não-M, não-0 ou com a ajuda de uma seqüência nucleotídica tal como definida antes e pelo fato de que ele é capaz: (1) de ser reconhecido por anticorpos induzidos por um HIV-1 não-M, não-O, tal como definido antes e especialmente a cepa YBF30 ou uma variante desta e presentes em uma amostra biológica obtida após uma infecção por uma cepa de HIV-1 não-M, não-0 e/ou (2) de induzir a produção de anticorpos anti-HIV-1 não-M, não-O.

Entre estes peptídeos, pode-se citar, em particular aqueles provenientes da cepa YBF30 e especialmente: aquele expresso pelo gene gag (SEQ ID N°. 4), aquele expresso pelo gene pol (SEQ ID N°. 6), aquele expresso pelo gene vif (SEQ ID N°. 8). aquele expresso pelo gene vpr (SEQ ID N°. 10), aquele expresso pelo gene vpu (SEQID N°. 12), aquele expresso pelo gene íat (SEQ ID N°. 14), aquele expresso pelo gene rev (SEQ ID N°. 16), aquele expresso pelo gene env (SEQ ID N°. 18) ou um de seus fragmentos, tal como um fragmento da região da alça V3 CTRPGNNTGGQVQIGPAMTFYNIEKIVGDIRQAYC (SEQ ID N°. 58) e aquele expresso pelo gene nef (SEQ ID N°. 20) ou um fragmento destes capazes de reconhecer os anticorpos produzidos por ocasião de uma infecção por um HIV-1 não-M não-0 tal como definido antes. A invenção tem igualmente como objetivo composições imunogênicas que compreendem um ou diversos produtos de tradução das seqüências nucleotídicas de acordo com a invenção e/ou um dos peptídeos tais como definidos acima, obtidos especialmente de maneira sintética. A invenção tem igualmente como objetivo os anticorpos dirigidos contra um ou diversos dos peptídeos descritos acima e sua utilização para a realização de processos de diagnóstico in vitro, especialmente diferencial, da infecção de um indivíduo por um vírus do tipo HIV-1, de acordo com os processos conhecidos do perito da técnica. A presente invenção engloba o conjunto dos peptídeos capazes de serem reconhecidos por anticorpos isolados a partir de um soro infeccioso obtido após uma infecção por uma cepa HIV-1 não-M não-0 e os peptídeos capazes de serem reconhecidos por um anticorpo de acordo com a invenção. A invenção tem, também, como objetivo um processo de diagnóstico in vitro de um HIV-1 não-M não-O, caracterizado pelo fato de que ele compreende a colocação em contato de uma amostra biológica retirada em um paciente, com anticorpos de acordo com a reivindicação 10, eventualmente associados a anticorpos anti-SIV CPZGAB e a detecção dos complexos imunológicos formados entre os antígenos de HIV-1, eventualmente presentes na amostra biológica e nos ditos anticorpos. A invenção tem igualmente como objetivo um kit de diagnóstico de HIV-1, caracterizado pelo fato de que ele inclui pelo menos um reagente de acordo com a invenção.

Além das disposições anteriores, a invenção compreende ainda outras disposições, que ressaltarão da descrição a seguir, que se refere a exemplos de realização do processo objetivo da presente invenção assim como aos desenhos anexos, nos quais: - as figuras 1 a 7 ilustram a localização dos diferentes iniciadores sobre o genoma da cepa YBF30; - a figura 8 ilustra a organização genômica da cepa YBF30; - as figuras 9 a 16 representam a análise filogenética dos diferentes genes da cepa YBF30 em relação ao HIV-1 de grupo M e de grupo O (figura 9: gene Itr, figura 10: gene gag, figura 11: gene tat, figura 12: gene rev, figura 13: gene vif, figura 14: gene env gpl20, figura 15: gene env gp41, figura 16: gene nef, figura 17: gene pol, figura 18: gene vpr, figura 19: gene vpu); - a figura 20 ilustra a percentagem de distância genética entre YBF30 e HIV-l/SIV CPZGAB.

Deve ser bem entendido, todavia, que estes exemplos são fornecidos unicamente a título de ilustração do objetivo da invenção, do qual eles não constituem de maneira alguma uma limitação. EXEMPLO: Obtenção de uma variante HIV-1 não-M não-0 de acordo com a invenção (YBF30) e suas aplicações.

Isto em particular foi possível estudando-se a epidemiologia da infecção pelos vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV) na República dos Camarões, que é particularmente paradoxal. Neste país, a diversidade das cepas é notável, pois a maioria destes subtipos conhecidos atualmente dos vírus HIV-1 do grupo M (Majeur) foi relatada. Foram relatados casos de infecções por vírus HIV-1 altamente divergentes do grupo Ο (Ο para outlier), quase exclusivamente em pacientes de origem da República dos Camarões. Casos de infecções por HIV-2, HTLV-1 e HTLV-2 subtipo A e B foram igualmente relatados.

Na base dos resultados das avaliações sorológicas e genotípicas anteriores, os Inventores estabeleceram um algoritmo de diferenciação e de confirmação entre as infecções HIV-1 dos grupos M e O, a fim de selecionar variantes não-M, não-O.

Estes processos foram aplicados sobre amostras enviadas ao Laboratoire National de Référence des infections à HIV de Yaoundé e permitiram caracterizar um isolado de HIV altamente divergente e definir os instrumentos de caracterização de um novo grupo HIV-1, levando em conta homologias observadas entre esta cepa humana YBF30 e a cepa simiana SIV CPZGAB. I - Meio de caracterização sorolósica da variante YBF30 por ocasião do estudo epidemiológico 1) Coleta das amostras: Todos os soros de pacientes adultos enviados ao Laboratoire de référence de Yaoundé em 1994 e 1995 para identificação ou confirmação de uma infecção HIV foram estudados (n=8831). 21 Diferenciação sorológica entre HIV-1 grupo M e grupo grupo Q e seleção das variantes: Em caso de positividade à identificação anti-HIV (EIA indireto misto HIV-1 e HIV-2 Génélavia Mist, Sanofi-Pasteur, Paris, França), um teste EIA baseado no princípio da competição em relação ao antígeno específico do grupo M (Wellcozyme Rec HIV-1, Murex, Dartford, UK), foi associado.

Em caso de positividade do teste de tipo competitivo Wellcozyme Rec HIV-1, com razão de reatividade em densidade óptica (DO) em relação ao valor limite ou cut-off (CO) superior a 5 (CO/DO >5), o soro é considerado como HTV-1 positivo, resultado que deve ser confirmado sobre uma nova retirada de amostra. A escolha de uma razão de reatividade superior a 5 para considerar o teste por competição como teste de confirmação da infecção por HIV-1 é baseado na experiência adquirida pelo laboratório de virologia do hospital Bichat: em 7200 amostras reativas com uma razão > 5, todas apresentavam um Western Blot HTV-1 (WB, New Lav Blot 1, SDP, Mames la Coquette) fortemente positiva. Fora dos casos de soroconversões HTV-1, as amostras confirmadas HIV positivas e que apresentam uma razão Wellcozyme < 5, correspondem seja a infecções por HIV-2 do grupo O ou de outras variantes.

Para eliminar as reações falsamente positivas em identificação EIA mista, as amostras que apresentam uma razão CO/DO < 5 são sistematicamente testadas por um EIA misto HIV-l/HIV-2 de terceira geração (Enzygnost Plus, Marburg, Alemanha) que inclui os antígenos dos HIV-1 dos grupos M e O (recombinante gp4) da cepa MVP5180). Em caso de positividade deste teste, são realizados um teste rápido discriminante HIV-1 e HIV-2 (Multispot, SDP, Mames la Coquette) e um Western Blot (WB, New Lav Blot 1 ou 2, SDP). 31 Confirmação sorológica das infeccões HIV-1 grupo O e variantes.

Todas as amostras que apresentam uma razão CO/DO < 5, diferenciadas positivas por WB (critérios de positividade: 2 ENV +/- POL +/-GAG ou 1 ENV + POL +/- GAG) e HIV-1, são testadas por um teste Dot-blot que utiliza antígenos peptídicos das regiões V3 e transmembranários (InnoLia, Innogenetics, Ghent, Belgium). 41 Isolamento retroviral das cepas de grupo O e das variantes.

As células mononucleadas sanguíneas periféricas (PBMC) dos pacientes soropositivos foram isoladas por gradiente de Ficoll-Hypaque na República dos Camarões, conservadas e transportadas para Paris em nitrogênio líquido.

Após descongelamento, as PBMC dos pacientes foram co-cultivadas com linfócitos de doadores caucasianos soronegativos. A replicação viral nos sobrenadantes de cultura foi posta em evidência pela detecção da atividade transcriptase inversa e pela pesquisa do Antígeno p24 (Elavia p24 policlonal, SDP) durante um período de um mês. 5) Seqflências Os produtos das PCR são visualizadas sobre géis de agarose de 1 a 1,45% de acordo com o tamanho dos fragmentos, precipitados em acetato de sódio 3M (1:10) e 3 volumes de etanol absoluto, incubados durante 30 minutos a -80°C, centrifugados durante 20 minutos a 13.000 rpm. O resíduo é seco depois retomado com 10 pL de água destilada (Sigma). A purificação é realizada sobre "Qiaquick Gel Extraction kit" (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante; os produtos são sequenciados com o Kit Dye Terminator Applied Biosystem sobre um automate DNA Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster Cit, CA), como descrito anteriormente (Loussert-Ajaka e outros; 1995); as seqüências nucleotídicas são analisadas no programa de computador Séquence Navigator (Applied Biosystems), alinhados com o programa de computador Gene Works (Intelligenetics Inc.). 6) Análises filogenéticas: As seqüências foram alinhadas com o programa de computador CLUSTAL para os alinhamentos múltiplos, considerando como matriz de referência os alinhamentos da compilação das seqüências HIV do laboratório de Biologia e de Biofísica Teórica de Los Alamos, New México, 87545 USA.

As análises filogenéticas foram feitas com o programa de computador PHYLIP; em um primeiro tempo, as distâncias foram calculadas com DNADIST, depois a análise filogenética foi realizada em seguida com NEIGHBOR JOINING ou FITCH; enfim, as árvores foram desenhadas com DRAWTREE (figuras 9 a 19). As percentagens de distância genética estão igualmente ilustradas na figura 20.

Para as análises de "bootstrapping", a princípio foi utilizado SEQBOOT, seguido de DNADIST e NEIGHBOR JOINING ou FITCH. Enfim foram obtidos os valores de bootstrap com CONSENS. II - Resultados da enquete de colocação em evidência dos grupos HIV grupo Q e variante: 174 amostras, entre 3193 amostras positivas na identificação, foram consideradas seja grupo O, seja grupo M com reatividade sorológica anormal, seja como variantes. III - Colocacão em evidência de uma amostra não grupo O e não grupo M que apresenta uma reatividade sorológica anormal Os 174 soros HIV-1 positivos por WB (Western Blot), porém reativos com uma razão CO/DO < 5 em EIA de tipo competitivo foram testados por dot blot LIA de diferenciação sobre os peptídeos V3 do grupo M, grupo O e SIV CPZGAB): - 7 não reagem sobre nenhum dos peptídeos (Μ, O ou SIV CPZGAB) representados. A ausência de coleta celular não permite conclusão alguma. - 82 apresentam uma reatividade em relação a pelo menos um dos peptídeos que correspondem à alça V3 das cepas do grupo 0. A freqüência das reações cruzadas é baixa e limitada aos epítopos correspondentes às regiões V3 consensus (11%) e SIV CPZ GAB (43%). - 84 soros são não reativos em relação aos epítopos do grupo O. Estas retiradas de amostra foram realizadas majoritariamente em pacientes que apresentam um AIDS (75/84). - um soro, retirado em uma paciente originária da República dos Camarões (NJ) é reativo exclusivamente com o peptídeo SIV CPZGAB. Esta reatividade isolada em relação a um antígeno SIV CPZGAB nunca foi descrita anteriormente. Tendo sido coletados linfócitos na paciente, foi prosseguida a caracterização virológica desta cepa denominada YBF30. IV - Resultados dos exames sorológicos e virológicos sobre as primeiras retiradas de amostras efetuadas nesta paciente ímaio de 19951 (N°. do soro: 95-6295): 11 Testes ELISA comerciais (Densidade óptica/valor limite) Critério de positividade: DO/CO > 1 Genelavia = >15 Wellcozyme CO/DO = 1,55 Abbott Plus = >15 Behring Plus = 4,2 21 Western blot WB New Lav 1 Pasteur: 160++, 120++, 68++, 55++, 41++, 40+/-, 34++, 24++, 18+ 31 LIA dot-Blot Innogenetics Negativo para todas as faixas grupo O e grupo M exceto V3 SIVCPZGAB

4) Resultados dos exames sorológicos de pesquisa sobre peptídeos específicos dos grupos M e O * Foi adaptada a técnica do Prof. Francis Barin do Laboratoire de Virologie do CHU de Tours (Barin F. e outros, 1996); foram utilizados peptídeos das regiões transmembranárias sintetizadas (BioMérieux), para adaptar um teste de diferenciação entre os grupos M e O. Esta técnica está baseada na competição de ligação dos anticorpos entre os peptídeos transmembranários gp41 dos grupos O e M depositados sobre a fase sólida e dos peptídeos transmembranários gp41 seja do grupo O, seja do grupo M em concentração superior em uma fase líquida de reação hiperosmolar. Os resultados são ilustrados na Tabela 1 a seguir, no qual o poço PC corresponde à testemunha de inibição 100% e o poço CSP corresponde ao controle 0% de inibição.

TABELAI

Resultados das diferenciações inter grupo O - grupo M do soro 6295 Estes resultados mostram que existe uma forte ligação em relação aos peptídeos da fase sólida (CSP), uma nítida inibição pela associação combinada dos peptídeos M e O (CP) porém não diferenciação nítida, seja pelo peptídeo M, seja pelo peptídeo O. Existe portanto uma prova sorológica que a cepa infectante não pertence nem ao grupo M nem ao grupo O. * Levando em conta uma reatividade isolada sobre o dot blot InnoLia em relação aos antígenos V3 SIV CPZGAB, sobre as mesmas bases de competição entre peptídeos, este soro foi estudado pondo em competição os peptídeos gp41 M, gp41 O e gp41 SIV CPZGAB. A utilização do soro do chimpanzé denominado Amandine' (dado por M. Peeters, que isolou a cepa SIV CPZGAB, AIDS 1992) permitiu, em um primeiro tempo validar esta técnica. Na tabela II, os valores (DO) mais baixos indicam o mais alto grau de ligação aos antígenos.

TABELA II

Resultados das diferenciações inter grupo O - grupo M - SIV cpzGab com o soro do chimpanzé Amandine e o soro 6295 A reatividade do soro "Amandine" confirma e valida o teste de acordo com a invenção e indica que o soro da paciente reage de maneira idêntica em relação aos peptídeos M e SIV CPZGAB, mas é sem reação cruzada com o peptídeo O.

Estes resultados mostram que existe uma inibição similar com o soro da paciente pelos peptídeos gp41 do grupo M e gp41 SIV CPZGAB. Os antígenos da cepa infectante portanto deram origem a anticorpos que reconhecem, de maneira similar, os gp41 do grupo M e do SIV CPZGAB. 41 Resultados obtidos a partir do isolamento linfocitário (retirada de amostra em maio de 19951 Foi isolado um retrovírus a partir de amostras de linfócitos retiradas em maio de 1995, de acordo com as técnicas clássicas. A cultura com a linhagem MT2 mostra que a cepa YBF30 não forma sincícios (NSI). V - Resultados dos exames sorológicos sobre a segunda retirada de amostra (Novembro de 1995) (N°. do soro: 95-3371) 1) LIA dot-Blot ínnogenetics Negativo para todas as faixas, exceto V3 SIV CPZGAB 21 Resultados dos exames sorológicos e pesquisa sobre peptídeos específicos dos grupos M e O. A Tabela III ilustra os resultados das diferenciações gp41 inter grupo O - grupo M - SIV CPZGAB com o soro 3371.

TABELA III

Resultados das diferenciações gp41 inter grupo O - grupo M - SIV CPZGAB com o soro 3371 Estes resultados confirmam na nova retirada de amostra (efetuada na mesma paciente, em fase terminal da doença) que existe uma inibição acentuada com o soro da paciente pelo peptídeo gp41 SIV CPZGAB.

Os antígenos da cepa infectante portanto induziram anticorpos que reconhecem de maneira preferencial a gp41 do SIV CPZGAB. 3) Resultados do isolamento linfocitário ("retirada de amostra em novembro de 95 (95-3371-YBF31)) Foi isolado um retrovírus a partir de amostras de linfócitos retiradas em novembro de 1995, de acordo com as técnicas clássicas e denominado YBF31; os elementos de seqüência são idênticos aos de YBF30. VI - Amplificação genômica e Seqüências de YBF30 O DNA para todas as manipulações de PCR é extraído a partir das células de fim de cultura positiva.

As PCR realizadas com os iniciadores HIV-1 grupo O em diferentes regiões testadas são negativas (gag, pol, env). Da mesma maneira, aquelas realizadas com os iniciadores específicos do HIV-1 grupo M são negativas.

As condições de amplificação e de hibridização para as PCR do grupo O são realizadas nas condições descritas em Loussert-Ajaka, 1995. As condições de amplificação e de hibridização para as PCR do grupo M são aquelas descritas pelos Autores citados a seguir.

Estes iniciadores grupo M estão posicionados de acordo com a seqüência HIV-1-HXB2: - No env gpl20: ED3/ED12 (posição por exemplo, 5956-5985; 7822-7792); ED5/ED14 (6556-6581; 7960-7931); ED5/ED12; ED3/ED14; ES7/ES8 (7001-7020; 7667-7647) (Delwart e outros Science 1993; 262: 1257-1261). - No env gp41: primeira PCR ED3/M29, seguida de uma PCR aninhada M28/M29 (7785-7808; 8099-8124); M28/M29 apresentam as seguintes seqüências: M28: CGGTTCTT(AG)GGAGCAGC(ACT)GGAAGCA, M29: T(CT)T(ACGT)TCCCA(CT)T(AT)(CT)A(AGT)CCA(AGT)GTCAT; SK68/SK69 (Ou e outros, Science, 1988; 239:295-297). - No gag: Amplicor Roche Diagnostics Systems; iniciadores gag aninhados (Loussert-Ajaka e outros, Lancet 1995, 346: 912-913); SK38/SK39 (Ou e outros, Science, 1988; 239:295-297). - No pol: A/NE1 (Boucher e outros, Lancet 1990; 336: 585-590); Pol3/Pol4 (Lauré e outros, Lancet 1988, ii, 538-541).

Somente as PCR realizadas com os iniciadores H Pol são positivas (4235/4538) seguida de uma PCR aninhada com os iniciadores 4327/4481 (Fransen e outros Molecular and Cellular Probes 1994; 8: 31 7-322). Este fragmento H Pol, localizado na integrase (260 pb), foi sequenciado. A amplificação com os iniciadores HPOL é tomada possível, em virtude do excesso de vírus. Com efeito, o DNA utilizado é extraído das células de fim de cultura fortemente positiva (transcriptase inversa > 100.000 cpm). A amplificação do DNA extraído das células frescas sem co-cultura é impossível por causa do grande número de desemparelhamento entre os iniciadores HPOL (sobretudo na região 3') e a seqüência do isolado YBF30. A conservação desta extremidade 3' é muito importante para a atividade de extensão da Taq polimerase. 1 - Seqüência do gene pol: a utilização de iniciadores muito degenerados para a amplificação por RT-PCR do RNA extraído do sobrenadante de cultura positiva, forneceu uma amplificação positiva. São iniciadores comuns a todos os retrovírus (Donehower e outros J. Virol. Methods 1990; 28: 33-46), situados na região da transcriptase inversa do gene pol. A análise do fragmento após seqüência permitiu gerar um iniciador específico YRT2 (SEQID N°. 32) do Isolado YBF30 e amplificar o gene pol utilizando-se o iniciador Hpol 4481 (Fransen e outros, 1994 citado antes), como iniciador anti-sentido. A seqüência do fragmento foi realizada sintetizando-se à medida dos iniciadores específicos para cada fragmento gerado (Figura 1). 2 - Seqüência do gene env: a segunda abordagem foi fazer uma PCR longa (XL-PCR, Perkin Elmer) amplificando todo o vírus (9000 pb) utilizando-se iniciadores situados no LTR : LPBS 1 (SEQ ID N°. 22); LSiGi, seguida de uma PCR aninhada com YRT2 (SEQ ID N°. 32)/SK69 de 6000 pb e sequenciar todo o envoltório seguindo-se o mesmo procedimento. A seqüência da região gp41 foi realizada utilizando-se uma PCR aninhada com os iniciadores SK68/LSiGi. 3 - Seqüência do gene gag: utilização de uma PCR aninhada , realizada por PCR longa (LPBS Ι/LSiGi), com os iniciadores Gag 5 e Gag 1 li e gerando-se à medida dos iniciadores específicos, a fim de funcionar sobre o genoma viral. VII - Resultados das seqüências A cepa YBF30 foi completamente sequenciada (ver lista das seqüências). A cepa YBF31 de novembro de 195 foi parcialmente sequenciada e a ausência de variação significativa confirma a validade das seqüências de YBF30. VIII - Síntese de peptídeos da região da alca V3 da cepa YBF30. O estudo das seqüências da região da alça V3 permitiu sintetizar o peptídeo correspondente e comparar os aminoácidos desta região da cepa YBF 30 com aqueles dos outros subtipos M e das cepas O.

As seqüências dos peptídeos são: YBF30 : SEQ N° ID 58 SIV CPZGAB : CH RPGNNTRGEVQTGPGMIIFYW1E NVYGDTRSAYC (SEQ DD N° 59) GRUPO 0: CTRPGNRTYRNLOrGPGMIFYNVEIATGDIElKAFC (ANT70) (SEQ D N® 60) GRUPO M: CTRPNNNTRKSMRIGPGQAFYATGDIIGDIKIQAHC (SS-TIPOA) (SEQ D Ne 61) O peptídeo foi sintetizado, a partir das 2 asparaginas da região 5’ da alça e utilizado de acordo com o mesmo princípio como descrito anteriormente (ver IV 4)), a saber em competição em relação aos peptídeos do grupo M, do grupo O e do SIV CPZGAB. Os resultados ilustrados na Tabela IV confirmam a originalidade desta cepa e a extensão possível destas cepas pois os resultados sorológicos são em favor de infecção do tipo YBF30 na República dos Camarões. Além disso, o estudo de 200 soros selecionados HIV-1 positivos da República dos Camarões põe em evidência um novo caso que apresenta um perfil similar ao de YBF30.

TABELA IV

Estudo da reatividade de 200 soros * soro do SIVCPZANT

Neste novo teste, foi confirmada a reatividade dos soros 953371 e 956295, correspondentes à paciente na qual foi isolada a cepa YBF30, com o peptídeo SIV-CPZ. A reatividade mais fraca em relação ao seu próprio antígeno V3 é clássica por ocasião dos estágios tardios da doença. Esta reatividade permanece entretanto superior à encontrada em relação ao peptídeo M. Um outro paciente da República dos Camarões (soro 967321) apresenta o mesmo perfil de reatividade peptídica.

Assim como ressalta do que se viu antes, a invenção não se limita de modo algum aqueles modos de execução, de realização e de aplicação que acabam de ser descritos de maneira mais explícita; ela abrange ao contrário todas as variantes que podem alcançar o espírito do técnico na matéria, sem sair do quadro, do alcance, da presente invenção.

Claims (2)

1. Método de diagnóstico in vitro de um vírus HIV-1 do grupo não-M, não-O, por hibridização e/ou por amplificação gênica, realizado a partir de uma amostra biológica (soro ou linfócito circulante), caracterizado pelo fato de compreender: - uma etapa de extração do ácido nucléico a ser detectado, que pertence ao genoma do vírus, o qual pode eventualmente estar presente na amostra biológica e, se for o caso, uma etapa de tratamento do ácido nucléico usando uma transcriptase inversa, se este último estiver sob forma de RNA, - pelo menos um ciclo que compreende as etapas de desnaturação do ácido nucléico, de hibridização com pelo menos uma seqüência como definida em SEQ ID NO: 11, e, se necessário, a extensão do híbrido formado na presença de reagentes adequados (agente de polimerização, tal como DNA polimerase e dNTP), e - uma etapa de detecção da presença eventual do ácido nucléico que pertence ao genoma de um vírus do tipo HIV-1 de grupo não-M não-O.

2. Método de seleção e tipagem de um vírus HIV-1 não-M, não-O, caracterizado por colocar em contato qualquer fragmento de nucleotídeos compreendido pela SEQ ID NO: 11 com o ácido nucléico do vírus a ser classificado, e detectar o híbrido formado.