JPH01502637A - 細胞系統およびその調製ならびに使用 - Google Patents
細胞系統およびその調製ならびに使用Info
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- JPH01502637A JPH01502637A JP88501166A JP50116688A JPH01502637A JP H01502637 A JPH01502637 A JP H01502637A JP 88501166 A JP88501166 A JP 88501166A JP 50116688 A JP50116688 A JP 50116688A JP H01502637 A JPH01502637 A JP H01502637A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞系統およびその調製ならびに使用
本発明は細胞系統のm胞に感染可能なレトロウィルスの培養および研究に特に適
合する新規細F&系統に関する。
意図されるレトロウィルスのうちではHrV (ヒト免疫不全ウィルス)があげ
られうる。HI’Vの種々の単離物はこれまでLAV (リン/ぞ腺症関連ウィ
ルス) 、HTLV−m (ヒトTリンパ向性ウィルス■)およびARV (エ
イズ関連レトロウィルス)と呼ばれている。
エイズ(後天性免疫不全症候群)の場合、主要な免疫異常はma表面上にT4抗
原を表現するヘル/!!−T細胞サブセットの定量的欠如にあることは明白であ
る。種々の)IIv単離物の選択的なT4!胞同性はインビトロで証明されてい
る。ウィルスの複製および高い逆転写酵素活性はT4細胞の集団中においては観
察されているが対応するT8細胞中では観察されていない(11)。′r4およ
びT4A抗原に対するモノクローナル抗体を用いる阻止実験(12,15)およ
びVS’V(HTLV −nl ) シュードタイプウィルスのシンシチウム形
成阻害(3)によシ、T4抗原またはその一部分がHI’Vし七ブタ−の重要な
成分を構成することが示されている。
しかしながら幾つかの研究室からのデータでは、HIvウィルスは非Tリンノぞ
球系統の数種のS胞にも感染しうろことが示される。へイブリッド形成によシエ
イズ患者のa細胞中におけるプロウィルスDNAの存在が示されている(26)
。電子顕微鏡では濾胞樹脂状細胞中(SO)およびマクロファージ中(6)にお
けるウィルス粒子の存在が示されている。ウィルスはHIVに感染した個体の末
梢血液半球(9)および肺胞のマクロファージから単離されている。インビトロ
での単球のHIVによる感染は記載されている(34)。
種々のHIV単離物によるインビトロでの感染は(aJ R性グリオーマ細飽系
統(2)および(b)エプスタイン−・2−ルウイルスゲツムを担持するB細胞
(16,22)の場合に報告されている。グリオーマ培養物の場合感染は明らか
に潜在性であるがB細胞ではウィルスの複製が可能である。
さらに、前骨髄球細胞系統HL−60および単球系統U−937(ATCCCR
L 1593)もARV単離物で感染されている(13)。
正常な末梢血液単球の生産的なHTLV −m感染は幾度も示されている(4%
9)。HIVによシ感染されうる細胞種の範囲は短い時間内で拡大されている。
インビトロでHIVを培養するには、(1)新生物性異数体で細胞系統(35)
および(11) 9ン・ξ芽球B細胞系統(52)が用いられるべきことが特許
文献で提案されている。(1)に関しては、サブクローンH9が好ましい細胞系
統としてあ国Ill型調査報告においてスウェーデン特許庁は参考文献3.13
および34を特に関連するものとして引用している。参考文献9.33.35お
よび36は従来の一殻的状況を限定するものとして引用されている。
本発明の目的は単球様細胞に感染しうるウィルスによシ惹起される疾患の理解を
促進する手段を提供するものである。ここで意図されるウィルスのうちでは、特
にHIVのようなある種のレトロウィルスが注目されうる。
従って本発明は、問題のウィルスによジインビトロで感染されることができ、そ
の結果としてインビトロでのウィルス産生、さらになかんずくエイズ病原メカニ
ズムの細胞レベルにおける研究および薬物がその疾病の経過に影響する様式の研
究にも利用しうる可能性のあるものであるia+a系統(細胞集団)を提供する
ものである。本発明の第一の観点には細胞系統それ自体が包含され、第二の観点
にはかかる細胞系統の開発が包含されそして第三の観点にはかかる細胞系統のイ
ンビトロ感染への使用および場合によりウィルスの大規模生産への使用が包含さ
れる。もう一つの観点としては、それ自体優れた診断手段(例えばラジオイムノ
沈澱で)であシうるウィルス感染細a系統があげられうる。
本発明の細胞系統は単球様野生型の安定したサブクローンであシかつインビトロ
で無限増殖しうる。この細胞系統はT4抗厘がその集団の細胞の少くとも約5%
、例えば10%よシ多くの表面上に発現される点に特徴がある。その好ましい形
態物は生産的に感染されうる。他の特徴は、クラス■の抗原およびFcレセプタ
ーがその集団の細胞の少くとも幾つか上で細胞表面抗原として存在す明の細胞系
統を本出願の実験の部で示される条件下に研究した場合に証明されうる。
本発明の細胞系統は癌組織に由来しかつ無限増殖しうる単球様細胞系統をり一一
エングすることによシ得ることが可能でちる。例としては組織球起原のものであ
るU −957があげられうる。このものは5undstrろmおよびNi1s
sonによシはじめて記載され(2B)そしてATCCにA ATCCCRL
1593として寄託されている。本発明の細胞系統の例(クローン1.2および
16)は英国5alisburyのEuropean Co11ection
for Animal Ce1l Cu1tures に寄託されている。これ
らは以前、クローン186121901、クローン286121902およびク
ローン1686121905.で示された。再寄託が行われて現在それぞれ87
100805.87100906および87100807で示されている。これ
らは1977年のプダはスト条約によるものであるとして受託されている。U
−957は細胞遺伝学的に異常である。その核型の研究によシ、その染色体の変
化が進行性でおることが示されている。本発明の細胞系統における染色体補体の
詳細な研究は現在進行中であシそしてあらゆるクローンが明確なfa型を有する
ことが示されると予想される。
用いられるクローニング技法はそれ自体知られている。
我々は寒天ゲル中でクローニングを実施してうまく行った。クローン細胞が相互
に独立して生長できるいわゆる限界希釈法のような他の可能な技法も用いられう
る。りローユング後本発明の特徴を満たす増殖性クローンを選択する。勿論本発
明の範囲には野生型の最初のクローニングで得られたサブクローンを再クローニ
ングして得られるような細胞系統も包含される。
好ましい野生型U −937から得られうるクローンの大部分はウィルス感染後
に安定してウィルスを産生ずる系統を形成し従ってウィルス産生に関してはるか
に変動のあるH9および他のTi1l胞系統とは異なる。本発明による好ましい
クローン、すなわち高いT4含量を有するクローン(例えばクローン16)は、
ウィルス感染によシ大量のウィルスが産生され、従ってその細胞の死(=細胞変
性効果)がもたらされるものである「古典的」なウィルス細Fa系統に固有のす
べての性質を有しうる。その結果、b2大重のウィルスが放出されるか予測する
ことが可能である。これは大規模産生にとって重要な前提条件である。すなわち
細胞死の直前に翰胞が大量のウィルス抗原を有する「ウィルス工場」に変換され
、これらウィルス抗原は容易にアイソトープ標識を付けられてう・ジオイムノ沈
澱操作に使用されうる。
本発明の細a系統においては、T4抗原を有する細胞の量≦(−T4含量)は5
%から100%または100%直下、例えば95%まで変動しうる。ウィルス産
生にとって好ましい細胞系統、すなわち産生性感染を生ずるものは50%を越え
る、例えば60または70%を越えるいT4含量を有する細胞系統も使用されう
る。
本発明の1s胞系統はU −937に普通に用いられるような培地中でまたは満
足できる生長をもたらす他の何らかの培地中でインビトロで培養される。細a系
統の感染は用いられる各個々のウィルスの場合に普通に実施されるような方法で
遂行され、細胞系統は適当なウィルス接種原、例えばHIVに曝される。いくつ
かの場合には、実際上の便宜的な手段は細胞系統に第一回目のウィルス接種原を
加えた幾日か後に、未感染かつ本発明による性質を有する新鮮な細胞が添加され
ることにある。約50−60%よシ低いT4含量を有する細胞系統がウィルス−
細胞相互作用の研究にとって第一番目に適する。ウィルス産生性細胞系統から、
それ自体知られた方法でウィルスを単離し、精製しそして所望の場合はフラグメ
ント化および誘導体形成させることも可能である。得られるウィルス生成物は相
当するウィルス感染の治療および予防のための薬剤、例えばワクチン、の開発、
および/またはウィルスの免疫化学的アラ七イ用試薬および/または相当する対
応抗体の開発に用いられうる。
本発明は明細書とは一体の部分を構成する添付の請求の範囲に定義される。
本発明の基調をなす科学的操作によシ本発明をさらに説明する。
実施例 1
細胞:組織球リンパ腫(28)に由来するU−937細胞系100IU/*、ス
トレプトマイシン50β/d )を補充したRPMI 1640またはF−10
中で生育させた。この細胞系統は1976年のその樹立以来連続継代によシ保持
されておシそして未熟単球のそれに相当する基本的な表現型を保持している。こ
の細胞系統は分化を受ける正常単芽球のそれと同様に種々の薬剤によシ誘導され
て表現型の変化を生じうる(5.19.20)。かくの如(U −957は誘導
されてさらに分化した場合でも高度の正確さを以って単球細胞マーカーを表現し
、それゆえヒト単球細胞にとっての非常に有用なモデルであると思われる(19
.20)。
アガロースクローニングによるU −937クローンの樹立:細胞(IX10’
)個を35鴎のはトリ皿(Falcon 、○xnard。
Ca、米国)中に均一に塗抹した。このハトリ皿には、10%FC8(B、rB
COEUROPIC,英国)、グルタミン□mM)、はニジリン(100IU/
d)、ストレプトマイシン(150μg/―)、および最終濃度0.5%のアガ
ロースA (PharmaciaAB 、 Uppaala 、スウェーデン)
と−緒のHam’s F−10のボトム層が含有される。
細胞が拡散されるトップ層(1ゴ)には同じ培地が含有されるが、アガロースの
最終濃度はo、3裏で゛あるンこのI ) リ皿を湿度調整した雰囲気(空気中
C025%)中37℃で2〜4週間インキュベーションした。この期間した。適
当なりローンをとシ出して細胞を96−ウェルのプレートに移し、そして後程2
4−ウェルのプレート(Falcon) に移してさらに増殖させた。2つの実
験で合計16個のクローンが得られた。
T44抗原現がそれらの間で異なる5つのクローン(クローン1.2.3.4お
よび16)を選択しそして多数の他のマーカーに関してさらに特徴を調べた。T
4およびHLA−DR抗原は、問題の抗原に対するモノクローナル抗体を用いる
流動細胞計測法によシ調査された(Becton−Dickinson 、 M
onoclonal Center 、 Mountain View。
Ca、 (10) ) Fc し七ブタ−の発現はIgGで被覆された赤血球を
用いて測定された。選択された細胞質酵素マーカーは細胞化学的方法(29)に
よりm査された。
ウィルス感染: HTLV−mBで感染したH9細胞培養物から得られる細胞を
含有しない培地をウィルス源として用いた。細胞lX106個をウィルス1d中
に再懸濁し、37°Cで60分間インキュベートしそして2μIのポリブレン(
PB −1,5−ジメチル−1,5−ジアザウンデカメチレン−ポリメトプロミ
ド、Sigma、米国)および抗生物質を含有する10%RPM I培地5d中
に再懸濁した。
モノクローナル抗−T4抗体を用いる感染の阻止:用いられたIgGモノクロー
ナル抗−T4抗体(19B5D7)はマサチューセッツ州ボストンのDr El
lis Relnherz氏から提供された。細胞(2X105)を合計75μ
90RPMX培地中2.5μsまたは125μIの抗−T4抗体と37℃で20
分間インキュベートしそして前記した培地で1回洗った。次に細胞をウィルス希
釈物125μ中に再懸濁し、そして37℃で60分間インキュベーションした。
インキュベーションに続き!aをもう一度培地で洗いそして2μI/−のPBを
含有する10%RPMI培地中に細胞105/−の濃度で再懸濁させ、そして2
4−ウェルプレートで培養した。それぞれ1.25μI/ゴおよび6.2514
/sg濃度の抗−T4抗体が初めの4日間存在したが後程除去された。この培地
な82回収穫して逆転写酵素(RT)を測定した。
逆転写酵素(RT)の測定:酵素活性は培地の超遠心分離およびかくして得られ
たイレットを0.3%トリトンX−100中に溶解させることによシ得られる溶
液中で測定した。反応混合物(100μl)中には50mM )リス(pH8,
0)、150 mM KCI 、4 mMジチオトレイトール、6.2mM M
gCl2.25μC1/d 3H−TTP(50Ci/ミリモル)、100μI
/−ウシ血清アルブミン(BSA)、2.5μI/dオリゴ−dT12−Hlお
よび2μI/−ポリAが含有された。
サザンブロツテイング(27) : 染色体DNA 10 Ifを単離し、Sa
c Iで開裂させ、[18%アガロースゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜上に
プロットさせそして32p標識したプローブとへイブリッド形成させた。細胞質
DNAはH1rt法(8)を用いてgl製し、ミドフンドリアDNAに対して標
準化し、そして18%アガロースゲル上で操作し、とハイブリッド形成させた。
ハイブリッド形成は厳格な条件下に68℃で3X SSc (水11当k) N
a(J 175.31およびクエン酸ナトリウム88.2.9. pH7)およ
び標識されたプローブ5 X 106 cpm/ldを用いて行われた。洗浄条
件はすべてのプロットにつき68℃で0.lX5SCであった。用いられたプロ
ーブはDr RCGa1lo(NIH、Bethesda 、米国)氏によシ提
供されたpBH1O−R3(7)であった。
親細胞系統およびサブクローンの細胞マーカープロフィL:もとの細胞系統U−
937およびそのサブクローンはHLA−DR,T 4抗原、FC−レセプター
および酵素の相対的な発現に関して異なっていた(第1表)。親系統(野生型)
、クローン4およびクローン16がT4発現に関し極端であることは特に注目に
値する。親系統およびクローン4培養物はT4陽性細胞を10%未満の童でしか
含有しないが一方クローン16095%がT4Iii性でおった。他のすべての
クローン系統はT4@性細胞50〜70%を有していて中間に位置すると考えら
れた。
HLA−DRおよびFcレセプターは同時発現する傾向を示した。1Ial胞が
HLA−DRおよびFcレセプターの両方について陽性である頻度はクローン1
と2で最高であシ、一方この両マーカーは親a胞系統’U−957およびクロー
ン16集団で比較的頻度が低かった。増殖性質、形態、食細胞活性、抗体依存性
′Ma性細胞毒アツ七イにおけるキラー細胞としての機能容量、およびM3およ
びOKM1モノクローナル抗体によシ限定される単球関連表面抗厘の発現に関し
、用いられた培養条件下に調査された細胞系統間には何らの相異も示され得なか
った。
親系統およびサブクローンのEiTLV−1[Hによる感染:すべでのam系統
はHTL’V−mB単離物で感染できた(第2表)。しかしながら、これら系統
はウィルス産生に要する時間に関し、およびウィルスの細胞変性効果(シンシチ
ウム形成およびma死)に対するそれらの感受性の点で大きな相異を示した。
親U −957およびクローン4は同様の/ζターンを示した。ウィルス感染に
続く最初の6週間はU−937の培養液体中においては何らRT活性が検出され
なかった。事実、培養物は感染2か月後にはじめてRTS1性となシそして以後
培養を継続した全期間(1年以上)にわたシ陽性を保っていた。
クローン4細胞の感染は親系統紅胞の感染より困難である。何故なら他のすべて
の?a胞糸系統ウィルス産生性感染を招来するウィルスの量(RT活性において
150X105cpm )ではクローン4を産生性感染させることができなかっ
たからである。全観察期間(3か月)中クローン4はRT陰性のままであった。
しかしながら、10倍多量のウィルス(RT活性1800xI Q3cpm )
は1週間以内でウィルス産生体培養物を生じた。従ってクローン4細胞は親系統
よシ感染困難であるが、しかしこの困難は感た。親系統とクリーン4は感染され
た培養物中において細胞変性効果が全く観察されないか、わずかにしか観察され
ず、場合によシシンシチウム形成が観察される点で類似していた。
U −937サブクローンのうち、りH−ン16がHTL、V−mBでの感染に
対し最も感受性であった。RT活性および細胞変性効果は感染6日後には早くも
示され得た。しかしながらウィルスvI製および細胞溶解が著明なので培養物は
完全に死滅した。たとえ感染した培養物に新鮮な未感染msが反復して添加され
た場合でもウィルス産生性細胞系統を得ることはできなかった。HTLV−m
B感染に対する感受性に関しては、クローン1.2および3は2つの極端、すな
わち親系統とクローン160間にある中間物でおる。クローン2細胞の培養物中
においては、fa胞変性効果およびRT活性は感染後10日以内に現われた。ク
ローン16と興なシ、未感染クローン2kd胞を添加すると1か月後に安定した
ウィルス産生体ml胞系統が樹立された。クローン2は前年の間に再クローニン
グされそして得られた?SS糸系統1種(クローン2a)が1(IVのさらに良
好な産生体であって、最小限の細r!を変性効果しか示さない。クローン1およ
び3はウィルスの細胞変性効果に対してクローン2よシ感受性が少ない〇一時的
な細胞変性効果はその培養物がすでにウィルスを産生じている場合(RT陽性培
養プロス)に感染5〜4週後に観察された。クローン1の場合新鮮な未感染細胞
な付加することは安定してウィルス産生ずる細胞系統を樹立するには必要でない
が、一方クローン3は細胞死を補償するためにかかる付加を必要とした。クロー
ン16を除くすべての系統が6か月を越え1年以上までの期間安定したウィルス
産生体のまま存続した。これらのうちどれもこの期間中何ら細胞変性効果を示さ
なかった。
U −937細胞およびサブクローン中のHTLV−mB DNA (7)ると
、すべての感染された細胞系統が線状形の朱組み込みプロウィルスHTLV−m
B DNAを含有していることが示された。その上いくつかの?J胞糸系統クロ
ーン16および4)はさらに他の種頑のプロウィルスDNA 、恐うくハ単位長
さの環状DNA (単位長さの珊)からなる超らせん(スー・ξ−フィル)を含
有した。予想されるバンドに加え幾つかのかすかなバンドが見られた。これらは
長時間の露出後にのみ出現した。恐らくこれらはHTLV−mBプロウィルスの
欠損形または変異体であろう。
細胞系統は感染された細胞の細胞質中に存在する遊離のゲノムコピーの故が異な
る。コピー数の概算は、pBHI。
−R3中にSac Iによシ挿入された9kbフラグメントの連続希釈物を感染
された細胞の高分子量Sac I 7ラグメントとあるbはEirt溶解物DN
Aと比較することにょシ行うことができた。クローン16細胞は1細胞当シ約1
00コピーを含有するが、一方親系統はTNJ胞陽性対しか含有しなかった。他
の細胞系統はコピー含量に関して中間であった。最も分子量の高いバンド(>1
2kb)は恐らくミトコンドリア中に浸透したHTLV−mB DNAであろう
。プロウィルスDNAは未感染クローン16細胞中には存在が示され得なかった
。
Sac Iで消化された高分子DNAは、HTLV−mBから組み込まれたDN
Aを表わす主に2つのバンドを示した。感染された各細胞系統は、HTLV−m
Bからの組み込まれたプロウィルスDNAコピー約1〜5個を含有していた。そ
れぞれ5.5および3.5′Kbの2個の7ラグメントは内部Sac I部位な
らびにプロウィルスLTRかラノSac I 5 位を含有するプロウィルスD
NAに相当した。これらのバンドすべては対照として吊込られた感染されたT細
胞系統中にも見出される筈であった(Molt−3)。未感染クローン16細胞
はプロウィルスDNAの組み込まれた形態に関しては陰性であった。
つHTLV−[33による溶解に対し極度に感受性が高いゆえに阻止実験に選択
された。H9細胞系統がT細胞対照として用いられた。2つの実験の結果を第3
表に示す。阻止効果を得るには、細胞を抗体で処理した直後にウィルス感染が続
くことが非常に重要であった。H9細胞はウィルスの1:100希釈物で感染3
2日後にウィルスを産生じ始めた。ME胞を12,5μIの抗−T44抗で予め
インキュイージョンすると完全に感染を阻止した。他方2.5μlの抗体は何の
効果もなかった。クローン16細胞培!物をH9細胞に用いられたと同じ量で感
染させたならば(1100希釈物)、それらは第158目には早くもウィルスを
産生じた。よシ大量のウィルス(1:100希釈物または未希釈)では第88目
に早くもウィルス産生を生じた。抗−で4抗体12.5μIを用いると、未希釈
ウィルスでの感染は遅延されうるのみで完全には阻止できなかった。一方それよ
シ少量のウィルスを用いる感染は抗体2.5μ9によってすらも完全には止でき
た。従ってこれらの結果によシ、この特定の抗体によシ認識されるエピトープが
ウィルスによる4胞表面の認識にとって重要であることが示される。
実施例 2
ラジオイムノ沈澱アッセイ(RIPA) :ウイルス関連タン、5り質に対する
抗体をRIPAによシ同定した(抗原は感染された細胞からの558−システィ
ン標識された溶解物)(17)。 クローン16およびヒトT細胞系就HUT−
78が抗原の調製に用いられた。かくしてクローン16(Ni胞107個) ニ
RCGALLO氏から得られたHTLV−mB (逆転写酵素活性300x10
’cpm )を感染させた。この感染された培養物を細胞変性性変化、逆転写酵
素活性(1)およびウィルス抗原発現についてp24およびp19に対するモノ
クローナル抗体を用い、続いてこれをフルオライドgGによ少検出することによ
る免疫螢光にょシ監視した(Dakopatts、 Glostrup、タンマ
ーク)。培養物は感染7日後に著明な細胞変性効果が明白でl)かつ約90%の
細胞力;ウィルス抗原を発現したところでアイソトープ標識した。
標識培地(システィン不含RPMI 1640)中で30分間R#!、させたの
ちクローン16mFmおよび未感染対照細胞を新たに添加されたシスティン不含
の培地Std中の0.5mC1の55Bシステイン(New England
Nuclear Re5earchProciucts 、 Boston 、
米国)に6時間、あるいはグルコース不含(7) RPMI 1640培地中の
1.0 mciのD(6−3H)−グルコサミン(New England N
uclear Re5earch Products)に12時間露出させた。
HUT−:i’s Na胞の標識は同様の方法で行われ、標識時間は12時間で
ちった。代謝による標識後細胞を水冷PBS中で3回洗い、そして可溶性細胞溶
解物は細胞なRIPA緩衝液(25)(0,14M Na(J、0.001Mジ
チオトレイトール、0.01M)リスHct (pH8,0)、0.035%フ
ェニルメチル−スルホニルフルオライド、およヒO,S% NP 40 ) i
−を用Lnで崩壊させ続イテ1500CIIiで15分間遠心分離することによ
シ生成させた。
前記上澄み液からの一部分10〜30p/(105cpmに相当)を血清試料4
μjと一夜インキユベーションした。免疫複合体はもしそれが形成された場合−
夜装置して低温で6μ9のタンツク質入−セファロース(5epharose■
)(Pharmacia AB、 Uppsala、スウェーデン)に結合させ
、次に注意深く洗浄しく 0.5 M NaC/ s a 001 M EDT
A % 0.02M )リスHCI (pH7,6)% 1%デオキシフール酸
ナトリウムおよび30%スクロース中で3回、そして0.01M)リスHCJ(
pH7,6>中で1回)、乾燥し、試料緩衝液(pH6,8のIM)リスーH5
POa中の3%SDS、1M尿素および3%α−メルカプトエタノール)中に再
懸濁させ、そして3分間沸騰させた。これら試料を9〜16%ポリアクリルアミ
ドグラジェントゲル上2.25%の試料添加用ゲルを用いPAGEによシ分析し
た・。このゲルを30%メタノールおよび10%酢酸を含有する溶液中で1時間
固定し、Amplify (Amersham、 Buckinghamshi
re、英国)中に20分間浸漬し、乾燥しそしてフィルム(XAR−50,Ko
dak )に3〜7日間露出させた。14(標識されたタン/ξり質混合物(ホ
xzlt!Jラーゼ1)97,000、BSA69,000、卵7A/ブミン4
6,000、カルボニックアンヒドラーゼ30,000、ラクトグロブリンAI
8,500) を分子量標準物として各ゲル上で平行操作した。
結果
6種のウィルス特異的なタンパク質はHT L V −mB陽性の血清を用いて
明確に同定できた。これらはgp60sgp120゜pr55 、gp41、p
24、p19であった。pr55に関しては、このタン/ぞり質は種々のパッチ
で定まらない量で存在しておシ従ってこのものはそれ以上研究されなかった。未
感染細胞溶解物の免疫沈澱によってもあるいはHIV−特質も検出できなかった
。HTLV−mBにょシコーディングされた数種の生成物に対し反応性を有する
抗体−陽性対照血清はクローン16およびHUT −78のウィルス感染細胞か
ら相当するタンパク質を沈澱させた。バンドの数は2種の細胞のそれぞれについ
て同じであったが、最良の品質の沈澱はクローン16で得られた。何故ならこの
クローンからの細胞性タン・ξり質は非常に小規模にしか標識されてないからで
ある。
この現象に関する説明は、HUT−78の感染は継続的にウィルスを産生ずるN
i胞系絖を生ずるがクローン16M1胞にとってこのウィルスは致命的であると
いうことであろう。3H−グルコサミンで標識された抗原を用いると、分子量1
60Kdおよび120Kdを有する2種のタン・ぞり質を沈澱させることができ
た。この物質で標識された抗原においては、gp41の存在は陽性血清によって
は証明できなかった。しかし一方ではかかる証明はgp41 に対するモノクロ
ーナル抗体(RCGallo氏からの贈物)を用いて容易に遂行できた。p19
、p24およびそれらの前駆物質(pr 55およびp24についてのgp41
)の同定もモノクローナル抗体を用いて検査された。
上に論議された6種のタンパク質に加え、患者血清の幾つかは25Kdおよび2
7Kdのタン/ξり質を沈澱させた。
これらはsor遺伝子およびorf遺伝子の産物である。
論 議
実施例 1
我々の結果は、ヒト単球様起原の細胞がHTLV−mBで感染されうろことおよ
び長時間産生体細胞系統が樹立されうることを示している。T4抗原はHTLV
−mBが単球様細胞の表面に結合しうるために決定的に重要であると思われる。
何故ならサブクローンの1種(クローン16)の感染はその細胞を抗−T4抗体
とブレインキュベーションすることによシ阻止されうるからである。興味深いこ
とに、T細胞白血病細胞系統H9は感染を狙止するのに単球様細胞系統が必要と
するよシも高濃度の抗−T4抗体を必要とする。たとえレセプター密度が単球様
細胞系統においてはT細胞系統におけるよシも低いとしても、前記した結果はリ
ン・ξ球と単球様細胞上の)(TLV−IIIBレセプターの間の密接な相似性
を示している。我々の結果はまた、細胞培養物中におけるT4−陽性細胞の%が
高くなればなる程、HTLV−m B @染に対する感受性が高くなるであろう
ことをも示している。感受性はウィルス産生が開始する前の潜伏期間の短かさお
よび細胞培養物中における細胞変性効果の強さに反映される。親系統(U−93
7)とクローン4における低いT4発現と完全に一致して、産生性感染を確立す
るには2か月を要するか、あるいはまた大量のウィルス種苗が使用されねばなら
なかった。これら培養物のいずれも常に何ら!s胞変性効果を示さなかった。他
方クローン16は溶解に対して非常れ得なかった。興味深いことに、クローン1
.2および3はT4発現が同様であるが(1および3の場合50〜60%、2の
場合60〜70%)、溶解作用およびウィルス複製の程度はクローン2において
最も著明である。
U −937のサブクローンは単球分化の種々のレベルで凍結された細胞を表わ
すと思われるので、それらはウィルス感染後のT4発現を調節する能力において
も相異しうる。
実施例 2
得られた結果から、本発明の舗胞系統がHIV陽性血清の検出に有用なウィルス
抗原の生産にとって大きな利点を提供しうろことが推論されうる。
第 1 表
U −937およびその5種のサブクローンについて選択されたマーカー細 胞
HLA−DR” T4” Fc−レセプター”酵素活性0親 十 く10%
35% +
クローン1 ++ 50−60% 100% +++クローン2 ++ 60−
70% 100% +++++−ン3 + 50−60% 50% +クローン
4 + <10% 50% +クローン16 + >95% 15% 十4#H
LA−DRデータはFAC’S中のBD−抗−DRFITCを用いて得られた。
+十−すべての細胞が高度に陽性、十−平均的な+子細胞と同じ強度の陽性細胞
少数、しかし大多数は陰性。T4に関する数字は抗−○KT4抗体を用いる膜螢
光における陽性細胞%として表わす。
→ IgGについてのFcし七ブタ−はIgGで被覆された5RBCで強力で明
確なロゼツトを形成する細胞の%とじて表わす。
一二ステラーーt/ (NASDAE)、コラーゲナーセ、エラスターゼ、リゾ
チーム。組織化学的染色の強度は光学顕微鏡中で−1+、++および+++とし
て採点した。
抗−T4抗体によるHTLV−■B複製の凪止H901:100 02″ 1.
06 0.4 6迭L23 1:100 α5 0.4 0.!1 10.91
25 1:100 0.5 23 0.8 0.6クロー>160 未希釈 1
4.0729.6 CPE”″に1:100 0.4 2B 5B
25 1:10 0.3 1.8 0.61:100 0.5 1.8 0.5
125 未希釈 0.7 75上 113.81:10 0.3 1.4 0.
3
1:100 0.6 2.4 0.4
帯 未希釈−4X 105cprn/ml軸 逆転写酵素活性x 1(13Cp
m、パックグラウンドの10倍をこえる値を陽性とみなした(アンダーライン)
。
剰蹄細胞変性効果によシ破壊された細胞培養物1、 Asj♂、B0氏民地(1
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Claims (11)
- 1.単球様野生型のサブクローンであることを特徴とする、インピトロで無限増 殖しうる単球様細胞の細胞系統。
- 2.5%を越えるT4含量を有することを特徴とする、請求項1記載の細胞系統 。
- 3.前記野生型がU−937であることを特徴とする、請求項1または2記載の 細胞系統。
- 4.T4含量が50%を越えることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記 載の細胞系統。
- 5.前記細胞系統がウイルス、特にHIVで感染されうることを特徴とする、請 求項1〜4のいずれかに記載の細胞系統。
- 6.前記感染が産生性感染を生ずることを特徴とする、請求項5記載の細胞系統 。
- 7.好ましくは約50%を越える安定したT4含量を有しかつその細胞が産生性 感染を生じ得るものである単球様野生型のサブクローンの細胞をウイルスに感染 させることを特徴とする、ウイルス粒子およびそのフラグメントを産生させるた めに無限増殖しうる細胞系統をインピトロで感染させる方法。
- 8.前記感染されたサブクローンがU−937のサブクローンであることを特徴 とする、請求項7記載の方法。
- 9.HIVが感染に用いられることを特徴とする、請求項7または8のいずれか に記載の方法。
- 10.インピトロで無限増殖できかつウイルス、特にHIVにより感染され得る 細胞系統を生成させるに当たり、野生型の単球細胞系統をそれ自体知られた方法 でクローニングし、つぎに5%好ましくは50%を越えるT4含量を有する増殖 性クローンを選択および回収することを特徴とする方法。
- 11.U−937をクローニングすることを特徴とする、請求項9記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997033977A1 (fr) * | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Shionogi & Co., Ltd. | Clone de cellules t humaines specifique a la polyarthrite rhumatoide |
Families Citing this family (1)
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DK544389A (da) * | 1988-11-02 | 1990-05-03 | Du Pont | Kontinuerlig pattedyrcellelinie med monocyt/makrofag-egenskaber, dens etablering og anvendelse |
Family Cites Families (4)
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1986
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-
1987
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- 1987-12-22 EP EP19880900607 patent/EP0294454A1/en not_active Withdrawn
- 1987-12-22 JP JP88501166A patent/JPH01502637A/ja active Pending
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