CN108570450A - 一种细胞模型及其构建和筛选五羟色胺受体靶点活性物质之应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达5‑HT1B(五羟色胺)基因的细胞模型及其构建的方法，以及其在筛选以5‑HT1BR(五羟色胺受体)为靶点的活性物质中的应用，如筛选抗抑郁和偏头痛疾病药物。本发明细胞模型是携带并能稳定表达5‑HT1B基因的哺乳动物细胞，其构建方法是将5‑HT1B基因与表达载体连接构建成重组质粒后导入哺乳动物细胞，经过筛选培养获得能稳定表达5‑HT1B基因的细胞株，可用于筛选以5‑HT1BR为靶点的活性物质，通过将待筛选物质加入到细胞模型培养基中，测定应答元件的产量或被激活程度来判断该物质是否被筛出，能够高通量、低成本、准确地筛选以5‑HT1BR为靶点的活性物质，具有很好的稳定性和可靠性。

Description

一种细胞模型及其构建和筛选五羟色胺受体靶点活性物质之 应用
技术领域
本发明属于基因工程及分子药理学技术领域，涉及一种基因表达细胞模型及其构建方法和应用，具体涉及一种稳定表达5-HT1B(五羟色胺)基因的细胞模型及其构建的方法，以及该细胞模型在筛选以5-HT1BR(五羟色胺受体)为靶点的活性物质中的应用。
背景技术
随着社会进步，环境污染和生活压力的日益加重，神经性疾病越来越多地困扰着人类，针对神经性疾病的新药创制已经被列入国家重点发展战略，也成为全球各大药物研发公司关注的焦点。多数人类五羟色胺受体在中枢神经系统中较为丰富,参与多种精神活动的调节,与精神疾病的关系较为密切，因为其独特的生理功能成为精神类疾病药物研发的焦点。
五羟色胺受体是中枢神经系统中的一个重要受体，属于A族GPCR，是以五羟色胺为配体的受体。5-HT1BR与很多精神疾病的发生密切相关，如抑郁症、精神分裂症、焦虑症、强迫症、惊恐障碍等。一些药物可以通过调节5-HT系统的神经传递治疗多种精神障碍。5-HT1受体是5-HT受体中最大的一组受体亚型，可分为5-HT1AR、5-HT1BR、5-HT1CR、5-HT1DR、5-HT1ER和5-HT1FR等6种亚型。这些受体都属于G蛋白偶联受体，有7个α螺旋形成的跨膜结构域，受体被激活并与Gi/o相耦联，被激活后会抑制腺苷酸环化酶进而抑制cAMP产生，进而影响其下游各种生理功能。功能上的重要性使得该家族成员成为重要的药物作用靶点，也成为各大药物公司研发的重点，有着潜在的极高的科研和市场价值。
5-HT1BR是5-HT1受体中的一个重要亚型。5-HT1BR含有390个氨基酸,分子量为43500,由1170个碱基对组成其基因编码。广泛分布于中枢神经系统、前脑皮层、基底节、纹状体和海马区，受体的功能根据其定位的不同而不同。在前脑皮层，可以抑制多巴胺的释放，在基底节和纹状体，5HT1BR作为自身受体，抑制五羟色胺的释放，通过降低微兴奋性突触后电位的频率降低谷氨酸的传送，在抑郁，焦虑，偏头痛等疾病中起重要作用。
通常情况下，5-HT1BR主要定位在突触前膜，为自身受体，抑制5-HT的释放，影响神经元的兴奋性和突触的传递，是治疗神经系统紊乱药物的理想靶标。目前这方面的研究尚处于起步阶段，以5-HT1BR为特异性靶点的药物激动剂Sumtriptan(舒马曲坦)已被用于临床治疗偏头痛。大量的动物实验及临床前研究表明5-HT1BR在抑郁，焦虑，偏头痛等生理及病理过程中发挥重要作用。所以建立这样一种药物筛选模型，不仅为5-HT1BR的基础研究提供一种更为便捷的途径，更为重要的是提供了一种更为高效、便捷的药物筛选方式，丰富抗抑郁和偏头痛药物市场，为人们提供更多选择。
基于细胞信号通路的高通量药物筛选(high throughput screening,HTS)是以细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(FONNUMF.A rapid radio chemical method for the determination of cholineacetyltransferase[J].J Neurochem,1975,24(2):407-409.)。将药物靶点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。
目前，基于GPCR下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选以5-HT1BR为靶点活性物质的细胞模型。
发明内容
本发明的任务是提供一种细胞模型，使其具有筛选五羟色胺受体靶点活性物质之应用。
本发明的另一个任务是提供这种细胞模型的构建方法。
本发明的又一个任务是提供本发明细胞模型之应用。
本发明提供的细胞模型是携带并能表达核苷酸序列如序列表之序列1所示的5-HT1B基因的哺乳动物细胞，所述的哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞，通过表达载体pcDNA5/FRT携带并表达5-HT1B基因。本发明提供的细胞模型名称为中国仓鼠卵巢细胞CHO-5-HT1B，于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016175。
本发明提供的细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将5-HT1B基因与表达载体连接，构建含有5-HT1B基因的重组质粒；
(2)将步骤(1)构建的重组质粒转染哺乳动物细胞，经过药物筛选，培养成能稳定表达5-HT1B基因的细胞株，该细胞株即为所构建的细胞模型。
上述方法还包括对细胞株进行综合评估的步骤(3)：在步骤(2)所得细胞株中加入5-HT1B特异性激动剂或抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。所述测定下游信号应答反应包括检测5-HT1BR与其配体结合程度、5-HT1BR下游G蛋白与[35S]GTPγS结合程度、环腺苷酸积累量、三磷酸肌醇积累量和细胞内钙离子流变化量中的一种或几种。其中检测5-HT1BR与其配体结合程度以及G蛋白与[35S]GTPγS结合程度可以采用放射性结合实验。优选地，本发明对细胞株进行综合评估的检测方法为检测细胞内钙离子流变化量。
上述方法之步骤(1)中所述的表达载体为pcDNA5/FRT。所用质粒pcDNA5/FRT的特征为含有FRT位点(重组酶识别位点)，能与pOG44载体共转染，可以利用重组酶进行定向重组，筛选标记为Hygromycinp(潮霉素)。
上述方法之步骤(2)中所述的哺乳动物细胞可以是CHO细胞或HEK293细胞，其它哺乳动物细胞也能够实现本发明，而以CHO细胞或HEK293细胞构建效果最佳。本发明实施例中使用的是Invitrogen商品化细胞系Flp-in-CHO细胞，Flp-InTM细胞系经设计可快速构建稳定表达细胞系，以能够采用Flp-InTM表达载体表达目的蛋白。这些细胞在转录活跃区上含有一个稳定整合的重组酶识别序列(FRT)位点。Flp-InTM表达载体的定点整合可确保高表达量。用Flp-InTM表达载体和Flp重组酶载体pOG44共转染Flp-InTM细胞系，使得表达载体被定点整合在每个细胞的相同染色体位点上。
上述细胞模型的构建方法，更优选地：步骤(1)还包括对构建的重组质粒进行测序鉴定；步骤(2)所述的重组质粒转染哺乳动物细胞是将重组质粒与表达重组酶的质粒pOG44共导入哺乳动物细胞中，再利用潮霉素(Hygromycin B)进行筛选，获得带有潮霉素抗性的单克隆细胞，继续培养后利用Western blot、测细胞中的cAMP或Ca2+流等方法检测能够表达5-HT1BR的阳性克隆，培养成能稳定表达5-HT1B基因的细胞株。
本发明提供的细胞模型是携带并能表达5-HT1B基因的哺乳动物细胞，即该细胞模型是克隆了表达编码人源5-HT1B基因序列的体外培养的哺乳动物细胞。本发明提供的细胞模型可用于筛选以五羟色胺受体为靶点的活性物质或筛选以五羟色胺受体为靶点的药物，所述的以五羟色胺受体为靶点的药物可以是抗神经性疾病的药物。本发明建立了一种以5-HT1BR为靶点活性物质的筛选模型，它是一种能够稳定表达与神经系统疾病相关的GPCR-5-HT1BR，能够灵敏、特效地筛选以5-HT1BR为靶点的活性物质，包括5-HT1BR相关的激动剂、抑制剂，可为5-HT1BR激动剂serotonin(五羟色胺，5-HT)，5-HT1BR特异性激动剂Sumtriptan(舒马曲坦)、5-HT1BR抑制剂LY393558。本发明提供的这种细胞模型可用于筛选以5-HT1BR(五羟色胺受体)为靶点的活性物质，如抗抑郁和偏头痛疾病药物，通过将待筛选物质加入到细胞模型培养基中，通过检测细胞信号分子所产生的应答信号直接监测5-HT1BR的活性，测定应答元件的产量或被激活程度来判断该物质是否被筛出，本发明细胞模型能够高通量、低成本且准确地筛选以5-HT1BR为靶点的活性物质。本发明细胞模型的构建方法简单可控，成本低廉。本发明以5-HT1BR为靶点的活性物质的筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性，为5-HT1BR靶点活性物质的筛选，如抗抑郁和偏头痛药物的筛选提供了新的方法和手段。
附图说明
图1为本发明细胞模型的工作原理图。
图2为对阳性克隆的Western blot鉴定结果图，其中，CHO表示CHO空细胞，CHO-5-HT1BR-C3、C43、C63分别表示不同编号的CHO-5-HT1BR细胞克隆。5-HT1BR基因构建在载体pCDNA5/FRT上，并携带有HA标签，所以检测时用HA-HRP抗体作为一抗孵育，用相对应的发光底物进行显影。
图3为Sumatriptan对CHO-5-HT1BR细胞内钙流及对细胞活力的影响实验结果。A为不同浓度Sumatriptan对细胞内钙流的影响，纵坐标为细胞内钙释放量；B为不同浓度Sumatriptan对细胞活力的影响，纵坐标为光度吸收值(在波长为560nm处的吸光值)，横坐标为Sumatriptan的浓度。
图4为LY393558对Sumatriptan诱导的CHO-5-HT1BR细胞内钙流及对细胞活力的影响结果。A为不同浓度LY393558对Sumatriptan诱导的细胞内钙流的影响，纵坐标为细胞内钙释放量。B为不同浓度LY393558对细胞活力的影响，纵坐标为光度吸收值(在波长为560nm处的吸光值)，横坐标为Sumatriptan的浓度。
图5为不同浓度5-HT对CHO空细胞(CHO Mock)和CHO-5HT1BR细胞系(CHO-5-HT1BR-Clone43)胞内钙流的影响。
图6为不同细胞接种数目对应答元件检测的影响，纵坐标为CHO-5-HT1BR细胞内钙释放量，横坐标为每孔细胞数。
图7为细胞不同传代数对应答元件检测的影响，A为第7代，B为第23代，纵坐标为CHO-5-HT1BR细胞内钙释放量，横坐标为5-HT和Sumatriptan浓度。
图8为基于该细胞模型的药物筛选方法的评估结果，纵坐标为细胞内钙释放量，横坐标为样品数。Sumatriptan+表示加入Sumatriptan药物处理的实验组，Sumatriptan-表示未加药物处理的对照组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中用到的材料和试剂如下：
Flp-in-CHO细胞(一种中国仓鼠卵巢细胞，以下实施例中简称CHO细胞)、表达载体pcDNA5/FRT和转染试剂Lipofectin2000为Invitrogen公司的商业化产品；F12培养基和胎牛血清购自Gibco公司；其它试剂均为进口和国产分析纯试剂；Sumatriptan、LY393558购自Tocris、5-HT(五羟色胺)购自Sigma公司。
实施例1细胞模型的构建
以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为受体细胞，进行细胞模型的建立。将CHO细胞培养在含10％胎牛血清的F12培养基培养，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(1)重组质粒构建
使用人源5-HT1BR cDNA序列进行扩增，得到目的基因5-HT1BR，将扩增的5-HT1B基因和pcDNA5/FRT表达载体由连接酶催化连接，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒DNA，抽提测序以鉴定阳性克隆，鉴定正确的阳性克隆即为重组质粒，命名为pcDNA5/FRT-5-HT1BR。
(2)重组质粒转染CHO细胞
DNA和脂质体(Lipofectin2000)混合物的配制(60mM培养皿)
A溶液：
重组质粒pcDNA5/FRT-5-HT1BR 0.8μg
表达重组酶(flp)的质粒pOG44 7.2μg
培养基Opti MEM 500μL
A溶液混合，室温放置5min；
B溶液：
脂质体Lipofectamine2000 20μL
培养基Opti MEM 500μL
B溶液混合，室温放置5min；
将A液与B液混合，室温放置20min，然后将混合液加入到CHO细胞中。在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱内培养6h后，换为含血清含抗生素培养基。
(3)阳性克隆筛选
转染24h后的CHO细胞按1：10的密度传代再培养24h，以含500μg/mL Hygromycin B(潮霉素)的F12选择性培养基进行选择性筛选培养，每3天用选择性培养基换液一次，持续2周可见阳性克隆出现。采用极端稀释法将阳性克隆挑出，接种至96孔板再用含250μg/mLHygromycin B的F12选择培养液扩增传代，得到稳定转染的阳性克隆细胞模型。
(4)阳性克隆鉴定
步骤(3)获得的细胞模型用western blot进行鉴定，以获得克隆中5-HT1B的表达情况，CHO空细胞作为对照。利用HA抗体，我们发现挑选的3、43、63号克隆都有较高的HA表达(CHO-5-HT1BR细胞系的C3，C43，C63)，而空细胞中HA却没有表达(图2)。因此我们选择43克隆做后续实验，即以下实施例2和实施例3的实验。43号克隆命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO-5-HT1B，于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016175，保藏地址：武汉大学。
实施例2本发明细胞模型用于药物筛选的特异性
5-HT1BR为Gi/o偶联的G蛋白偶联受体，其激活后通过抑制腺苷酸环化酶(AC)进而抑制cAMP产生，因而可以通过检测cAMP的产生来检测5-HT1BR激活情况；另外可以在该细胞系中转染Gqi9嵌合型G蛋白，可以将5-HT1BR激活的信号偶联到PLC信号通路来，继而促进胞内钙离子释放，因而可以通过检测Ca2+释放确定5-HT1BR激活情况，本实施例中为了鉴定细胞系可以稳定表达功能性的5-HT1BR，均采用第二种方法，即检测Ca2+的释放。
为检测该细胞模型用于药物筛选的特异性，确保应答元件的响应是由5-HT1BR的活性变化所调控。选用5-HT1BR的特异性激动剂Sumatriptan，5-HT1BR的特异性抑制剂LY393558，分别以不同的浓度处理细胞模型并通过检测应答分子的响应确定其诱导激活率，通过MTT法确定细胞的活力。
(1)Sumatriptan对细胞内Ca2+释放及细胞活力的量效关系
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM(钙荧光探针)和0.02％pluronic acid孵育1h。然后分别加入10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4M的Sumatriptan进行刺激，每组设3个重复。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。
试验结果参见图3A，Sumatriptan作为5-HT1BR特异性激动剂，对5-HT1BR的激活效果明显。在本实验中，Sumatriptan对细胞内Ca2+的诱导释放率与Sumatriptan浓度呈剂量依赖关系。
②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液培养24h，分别加入浓度为10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4M的Sumatriptan进行刺激，每组设3个重复。处理24h后用MTT(比色法)检测细胞活力。
试验结果参见图3B，通过MTT检测可知，细胞活力随Sumatriptan浓度增加无显著增加(图3)。这说明Sumatriptan对细胞内Ca2+释放的促进与细胞增殖的活力无关。
(2)LY393558对Sumatriptan诱导内钙释放的影响
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM和0.02％pluronic acid孵育1h。使用10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4M LY393558预孵育30min，加入10-4M的Sumatriptan混合液进行刺激，每组设3个重复。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。
实验结果见图4A，LY393558作为5-HT1BR特异性抑制剂，能够有效抑制Sumatriptan对5-HT1BR的激活。在本实验中，10-4M LY393558对浓度为10-4M的Sumatriptan诱导的细胞系内钙释放均能抑制，使内钙释放程度接近于本底。
②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液培养24h，分别加入浓度为10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4M的LY393558进行处理，每组设3个重复。处理24h用MTT检测细胞活力。
试验结果参见图4B，由试验结果可见：当LY393558浓度在10-11至10-4M上时，细胞活力随LY393558浓度增加无显著降低。这说明LY393558对Sumatriptan诱导的内Ca2+释放的抑制与细胞增殖的活力无关。
(3)5-HT对细胞内Ca2+释放及细胞活力的量效关系
将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM(钙荧光探针)和0.02％pluronic acid孵育1h。然后分别加入10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4，10-3M的5-HT混合液进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。
试验结果参见图5，由试验结果可见：5-HT受体特异性激动剂5-HT能够显著激活胞内Ca2+释放而对CHO空细胞没有激活作用，这说明5-HT对细胞内Ca2+的诱导释放率与5-HT浓度呈剂量依赖关系。
(4)96孔板不同细胞接种数目对细胞内Ca2+释放的影响
无论是自动还是人工接种细胞于96孔板，每孔中的细胞数目都不会完全相同。为了检验不同细胞数目对筛选结果的影响，寻求一个最适的细胞接种密度。分别接种数目为5,000、10,000、20,000、25,000、50,000、100,000/孔的细胞于96孔板，每组设3个重复。待细胞完全贴壁后，分别加入100μM的Sumatriptan刺激，以不含Sumatriptan的缓冲液作为空白对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。
在本实例中发现(结果见图6)，细胞密度为5,000、10,000、20,000、25,000、50,000个/孔时，在这个范围内，荧光钙流的信号随着细胞数目的增加而增加。综合考虑各因素，在试验中均采用50,000/孔的细胞密度。
(5)细胞稳定性检测
随着细胞传代次数的增加，外源目的基因的表达可能丢失，因此，目的基因是否能在宿主细胞中稳定表达，即传代稳定性是检测细胞系优劣的重要指标。为此我们在CHO-5-HT1BR细胞传到第8代和第24代时进行检测。将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液继续培养24h，分别加入不同浓度的Sumatriptan以及5-HT进行刺激，每组设3个重复。用FlexStation3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。
实验结果参见图7，由实验结果可见：Sumatriptan和5-HT可以明显激活5-HT1BR诱导的Ca2+释放。说明该细胞模型具有良好的传代稳定性。
实施例3基于本发明细胞模型的药物筛选方法的评估
建立筛选模型的目的是筛选活性物质，反映该物质所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确地反映受试物的生物活性，必须进行客观地评价。评价一个筛选模型的优劣有很多指标，如模型的稳定性、灵敏性、特异性等。除此之外，为了使模型能够达到筛选的要求，还需要对筛选模型进行定量评价，主要分析该模型能否有效地反映样品的活性。评价药物筛选模型的常用的定量技术参数，主要如下：
(1)信号本底比(signal to background,S/B)
信号本底比反映的是药物筛选模型获得的数据(MSignal)与本底数据(MBackground)之间的距离。一般来讲，这种比值越大，信号与本底的距离越大，在反映样品作用方面有越大的范围，易于反映样品作用。
一般情况下，信号本底比的数值应大于3，当值小于3时，就不能有效地反映样品的生物活性。
信号本底比的计算公式：S/B＝MSignal/MBackground
(2)信噪比(siganl to noise,S/N)
信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪音通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。通常情况下，信噪比要大于10才能认为是可以应用的方法。信噪比的计算公式：S/N＝(MSignal-MBackground)/SDBackground
其中SDBackground表示本底数据标准差。
(3)Z‵因子
Z‵因子综合考虑了信号的变化和波动范围，它只与实验的重现性与可靠性有关而与实验的内容无关，因而在评价高通量药物筛选模型的稳定性和可靠性中得到广泛的应用，Z‵因子是没有单位的统计学参数，其值在0～1之间，Z‵因子<0.5表示稳定性差，实验的可靠性低，这样的模型不能用于药物筛选，Z‵因子在0.5～1时，模型稳定性高，可以充分确保建立的模型用于药物的筛选。Z‵因子的计算公式如下：
MSignal表示筛选模型获得的数据、MBackground表示本底数据、SDBackground表示本底数据标准差、SDSignal筛选模型获得的数据标准差。
为了评估本筛选方法是否稳定地适用于高通量筛选，在经优化所得到的筛选条件下随机选取96孔板中的60个孔，30个孔为一组，以浓度为10-7M的Sumatriptan为阳性对照，不加Sumatriptan的作为阴性对照，根据公式分别计算S/B，S/N和Z‵因子，以对方法进行定量评估。
采用的三个评价指标计算结果是S/B＝7.2，S/N＝15，Z‵＝0.605，说明本方法具有很好的稳定性和可靠性(图8)。本发明的高效表达细胞模型可同时稳定表达5-HT1BR受体，以便于检测5-HT1BR在受到正向刺激引起的信号分子应答反应。
由上实例可见：本发明细胞模型能够高通量地准确筛选以5-HT1B为靶点的活性物质，其制备方法简单科控，成本低廉：本发明药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，具有很好的稳定性和可靠性，可实现高通量的筛选，为抗神经性疾病药物的筛选提供了新的选择。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中科技大学鄂州工业技术研究院
<120> 一种细胞模型及其构建和筛选五羟色胺受体靶点活性物质之应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人类
<400> 1
atggaggaac cgggtgctca gtgcgctcca ccgccgcccg cgggctccga gacctgggtt 60
cctcaagcca acttatcctc tgctccctcc caaaactgca gcgccaagga ctacatttac 120
caggactcca tctccctacc ctggaaagta ctgctggtta tgctattggc gctcatcacc 180
ttggccacca cgctctccaa tgcctttgtg attgccacag tgtaccggac ccggaaactg 240
cacaccccgg ctaactacct gatcgcctct ctggcggtca ccgacctgct tgtgtccatc 300
ctggtgatgc ccatcagcac catgtacact gtcaccggcc gctggacact gggccaggtg 360
gtctgtgact tctggctgtc gtcggacatc acttgttgca ctgcctccat cctgcacctc 420
tgtgtcatcg ccctggaccg ctactgggcc atcacggacg ccgtggagta ctcagctaaa 480
aggactccca agagggcggc ggtcatgatc gcgctggtgt gggtcttctc catctctatc 540
tcgctgccgc ccttcttctg gcgtcaggct aaggccgaag aggaggtgtc ggaatgcgtg 600
gtgaacaccg accacatcct ctacacggtc tactccacgg tgggtgcttt ctacttcccc 660
accctgctcc tcatcgccct ctatggccgc atctacgtag aagcccgctc ccggattttg 720
aaacagacgc ccaacaggac cggcaagcgc ttgacccgag cccagctgat aaccgactcc 780
cccgggtcca cgtcctcggt cacctctatt aactcgcggg ttcccgacgt gcccagcgaa 840
tccggatctc ctgtgtatgt gaaccaagtc aaagtgcgag tctccgacgc cctgctggaa 900
aagaagaaac tcatggccgc tagggagcgc aaagccacca agaccctagg gatcattttg 960
ggagccttta ttgtgtgttg gctacccttc ttcatcatct ccctagtgat gcctatctgc 1020
aaagatgcct gctggttcca cctagccatc tttgacttct tcacatggct gggctatctc 1080
aactccctca tcaaccccat aatctatacc atgtccaatg aggactttaa acaagcattc 1140
cataaactga tacgttttaa gtgcacaagt tga 1173

Claims (10)

1.一种细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带并能表达核苷酸序列如序列表之序列1所示的5-HT1B基因的哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，所述的哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，通过表达载体pcDNA5/FRT携带并表达5-HT1B基因。
4.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，该细胞模型为于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为中国仓鼠卵巢细胞CHO-5-HT1B，保藏编号为CCTCC NO:C2016175的细胞模型。
5.权利要求1或2所述细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将5-HT1B基因与表达载体连接，构建含有5-HT1B基因的重组质粒；
(2)将步骤(1)构建的重组质粒转染哺乳动物细胞，经过药物筛选，培养成能稳定表达5-HT1B基因的细胞株，该细胞株即为所构建的细胞模型。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括对细胞株进行综合评估的步骤(3)：在步骤(2)所得细胞株中加入5-HT1B特异性激动剂或抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。
7.根据权利要求3所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的表达载体为pcDNA5/FRT。
8.根据权利要求3所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
9.权利要求1至4中任一项所述的细胞模型在筛选以五羟色胺受体为靶点的活性物质或在筛选以五羟色胺受体为靶点的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的以五羟色胺受体为靶点的药物是抗神经性疾病的药物。
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