CN103604917B - 热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法。根据参与燃烧的物质的燃烧状态确定其热裂解温度；挑选几种细胞毒性试验常用阳性物作为热裂解捕集物细胞毒性试验用阳性物的备选物，根据备选物质的沸点、熔点、热稳定性等理化性质决定是否进入后续筛选步骤：未能查询到相关理化性质的物质或沸点低于燃烧温度且在燃烧未分解或少量分解的物质进行热裂解试验，裂解产物富集后至气相色谱-质谱联用仪分离分析，在燃烧温度条件下未分解或小部分分解的物质进行热裂解试验，并将捕集的热裂解产物进行MTT细胞毒性试验，将得到的细胞抑制率≥80%的物质作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物。本发明能有效筛选出热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物。

Description

热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法
技术领域
   本发明涉及一种热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的筛选方法，属生物技术领域。
背景技术
热裂解技术是利用热能将大分子化合物在高温下分解为一些分子量相对较小和分子结构相对简单的化合物的技术，通过采用色谱技术来分析这些小分子化合物的组成和结构，对裂解产物进行定性和定量分析，可以研究裂解产物与原样品的组成、结构和物化性能的关系，以及裂解机理和反应动力学等。卷烟作为一种特殊的消费品，其消费是通过燃烧后产生烟气来实现的，而热裂解技术可以快速升温，且燃烧气体氛围可按需要调整，因此，热解裂技术成为了模拟卷烟燃烧状态的一种有力手段。对于参与燃烧的物质，如卷烟、卷烟纸以及添加剂等，考察其燃烧产物的生物学活性有助于了解该物质的安全性。因此可以采用热裂解技术模拟这些物质在实际使用过程中的燃烧状态，然后通过对热裂解产物的捕集物进行相应的生物学检测，考察其生物活性。
体外细胞毒性实验作为一类重要的体外实验，在新药的研发、开发以及化学物质毒性评价方面均发挥重要的作用。根据染色原理不同，体外细胞毒性实验有多种方法，应用较为广泛的方法有中性红细胞毒性法和噻唑蓝法（MTT）。其中MTT细胞毒性法是被国际医药行业广泛采用的细胞毒性检测方法，具有简便、快捷、灵敏等特点，被广泛应用于评定食品、药品、环境化学物质对细胞的毒性作用[1]，也被用于考察电子烟填充液的细胞毒性[2]，是目前应用较多的毒理学检测细胞毒性的方法。
通常情况下，毒理学检测需采用阳性物以证明试验方法的可行性和试验体系的可靠性，这是毒理学试验的基本原则之一。如：夭建华[3]等人以十二烷基磺酸钠为阳性物对烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价的中性红细胞毒性法进行了研究、文琛[4]等人应用 MTT法测定了孔雀石绿对鲤鱼上皮癌细胞、草鱼肾细胞、斑点叉尾鱼卵巢细胞的急性毒性、王琴美[5]等人以磷酸氯喹作为阳性对照化合物检测了 20个牌号的国产烤烟型卷烟烟气冷凝物( TPM )对中国仓鼠肺上皮细胞( CHL)的细胞毒性、吴友苹[6]等人研究了阳性药物苯酚对体外细胞毒性试验系统的影响。
按照毒理学测试的基本原则，在对参与燃烧的物质的热裂解产物进行体外细胞毒性检测时，需要选用合适的阳性物来全面考证热裂解捕集物细胞毒性试验的科学性及可靠性，而且这种阳性物必须是既能验证热裂解试验过程又能验证裂解产物细胞毒性检测过程的物质。而目前细胞毒性试验常用的阳性物仅能验证细胞毒性试验过程的可行性和科学性，无法验证热裂解试验过程的可行性和科学性。因此，建立一种热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的筛选方法对参与燃烧的物质的体外细胞毒性检测有着重要意义。
本发明的热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法，经文献搜索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供一种热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的筛选方法。
本发明的热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的筛选方法，具体步骤如下：
a. 根据参与燃烧的物质的燃烧状态确定其热裂解温度；
b. 挑选几种细胞毒性试验常用阳性物作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的备选物质，并根据备选物质的沸点、熔点、热稳定性等理化性质决定是否进入后续筛选步骤：沸点高于燃烧温度的物质或在燃烧温度下明显分解的物质不再作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物；未能查询到相关理化性质的物质或沸点低于燃烧温度且在燃烧温度条件下未分解或少量分解的物质进入后续筛选步骤；
c. 将未查询到相关理化性质的物质或沸点低于燃烧温度且在燃烧温度条件下未分解或少量分解的物质在其实际燃烧温度条件下进行热裂解试验，裂解产物富集后升温进样至气相色谱-质谱联用仪分离分析，根据分析结果决定是否进入后续筛选步骤：在燃烧温度条件下完全分解或大部分分解的物质（总离子流图中原化合物的峰面积归一化百分含量＜40%）不再作为热裂解产物捕集物毒理学试验的阳性物；在燃烧温度条件下未分解或小部分分解的物质（总离子流图中原化合物的面积归一化含量≥40%）进入后续的筛选步骤；
d.将在燃烧温度条件下未分解或小部分分解的物质（总离子流图中原化合物的峰面积归一化百分含量≥40%）进行热裂解试验，捕集热裂解产物，并将热裂解产物捕集物进行MTT细胞毒性试验，根据试验结果确定可以作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物使用的物质：MTT细胞毒性试验得到的细胞抑制率≥80%的物质可以作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物使用；MTT细胞毒性试验得到的细胞抑制率＜80%的物质不再作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物使用。
本发明的优点在于：筛选方法简单、实用、可操作性强，能有效筛选出适合用作热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物的物质。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细描述。
主要仪器与试剂：
Agilent 6890A/5975C气相色谱/质谱联用仪（美国安捷仑公司）、CDS5250T热裂解仪（美国CDS公司）、METTLER XP504分析天平（瑞士梅特勒公司）、乙醇（色谱纯，美国DIMA公司）、石英管（美国CDS公司）、石英棉（美国CDS公司）、无水空气、高纯氦气（纯度>99.999%）、毛细管柱：HP-5MS[30 m(长度）×0.25 mm（内径）×0.25 μm(膜厚)] 、高压蒸汽灭菌锅（ALP CL-40M）、二级生物安全柜（HFsafe-1500）、微孔板振荡器、二氧化碳培养箱（Forma公司）、酶标仪（Bio-Rad，Model 680型）
胰蛋白酶（Sigma公司）、磷酸盐缓冲液（pH7.2，1×，Gibco公司）、青霉素-链霉素（Gibco公司）、胎牛血清（Gibco公司）、二甲亚砜（DMSO）（Bimol公司）、DMEM/F12培养液（Hyclone公司）、MTT（Solarbio公司）。
中国仓鼠卵巢细胞系（Chinese hamster ovary cell line, CHO细胞），购自中国科学院昆明动物所细胞库。
实施例：
本实施例以卷烟纸及其添加剂的热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的筛选为例来陈述。
（一）资料查询的结果表明卷烟纸层最高燃烧温度为420 ℃，依据风险估计最大化的原则，在裂解试验方法中将裂解试验最高温度设定为450 ℃。
（二）、通过资料查询，以四种细胞毒性试验常用阳性物（十二烷基磺酸钠、孔雀石绿、磷酸氯喹和苯酚）作为卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的备选物质。查询四种备选物质（十二烷基磺酸钠、孔雀石绿、磷酸氯喹和苯酚）的熔点、沸点、热稳定性等理化性质。
表1、四种备选物质（十二烷基磺酸钠、孔雀石绿、和苯酚）理化性质
化合物名称 熔点（℃） 沸点（℃） 热稳定性
十二烷基磺酸钠 ＞300℃ / /
孔雀石绿 112-114℃ 526.2°C /
磷酸氯喹 200℃ 460.6℃ /
苯酚 40.91℃ 181.84℃ /
注：表中“/”表示未查询到相关资料
由查询到的四种备选物质的理化性质可以看出：孔雀石绿的沸点较高（526.2°C），明显高于卷烟抽吸过程中卷烟纸的最高燃烧温度（420°C），在卷烟抽吸过程中无法进入烟气，不能作为卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物；磷酸氯喹的沸点（460.6℃）略高于420°C，在卷烟抽吸过程中可能不会挥发进入烟气，亦不能作为卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物；未查询到十二烷基磺酸钠的沸点及热稳定性的数据和资料，从查询到的熔点（＞300℃）估计其沸点可能会高于420°C，需通过后续步骤确定其是否适合用作卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物；苯酚的沸点较低（181.84℃），远远低于420°C，在卷烟抽吸过程中可能会挥发进入烟气，由于未查询到热稳定性的相关资料，需通过后续步骤确定其是否适合用作卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物。
（三）、称取苯酚和十二烷基磺酸钠标准样品约1mg于装填好石英棉的石英管中，在另一端填上相同的石英棉，装入CDS5250T热裂解仪进样盘待裂解。热裂解产物峰采用RTE积分方式，峰面积在最大峰（非溶剂峰）峰面积0.1%以上的予以积分，并应用质谱谱库进行检索定性，并计算峰面积归一化百分含量。试验结果表明：十二烷基磺酸钠热裂解试验未检测到十二烷基磺酸钠及其裂解产物，即十二烷基磺酸钠在最高裂解温度（450°C）条件下未挥发也未分解，故不适合用作卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物；苯酚热裂解产物中苯酚的峰面积归一化百分含量为100%，即苯酚在最高裂解温度（450°C）条件下能够完全原形转移至烟气中，但仍需通过后续步骤进一步验证其是否适合用作卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物。
裂解升温条件：初始温度100 ℃，保持5 s，而后以 10 ℃/s 升至450 ℃,并保持30 s；裂解氛围：无水空气，气体流速70mL/min；裂解产物采用CDS5250T自带冷阱捕集：捕集温度：-60℃捕集，捕集完毕后保持1min，升温至280℃（仪器自动设置），保持5min；裂解仪阀箱和传输线温度：280 ℃。
GC/MS分析条件：HP-5MS柱，固定相：5%的联苯与95%的二甲基硅氧烷；规格：[30m(长度）×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）]；载气流量：1 mL/min；分流比：20:1；升温条件：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至240 ℃，再以20 ℃/min升至 280 ℃然后保持5 min；质谱离子源温度：230 ℃，传输线温度：280 ℃，四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟时间为2 min。
（四）、采用手动进样针取浓度为100mg/mL的苯酚标准溶液20uL，直接注射至装填有石英棉的石英管，将石英管装入CDS5250T热裂解仪进行裂解，裂解产物用3mLDMEM/F12捕集，将热裂解产物捕集物进行MTT细胞毒性试验。
1、MTT细胞毒性试验操作步骤
（1）培养及种植受试细胞：
采用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液在二氧化碳培养箱（5%CO2，37℃）中培养中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell line，CHO细胞），使之达到80%左右的汇合率时，用0.25%（v/v）胰蛋白酶溶液消化并制成单细胞悬浮液，细胞浓度为（0.5-1.0）×105个/mL，将单细胞悬浮液种植于96孔细胞培养板内，每孔200μL，其中一列不种植CHO细胞以作为空白对照组，放置于二氧化碳培养箱（5%CO2，37℃）中培养24h。
（2）加入受试物
取出96孔细胞培养板，移除板内的溶液，加入受试物，每组样品进行8孔重复检测：
①    试验组：每孔加入180μL的热裂解产物捕集液和20μL的胎牛血清；
②    细胞对照组：每孔加入180μL的DMEM/F12细胞培养液和20μL的胎牛血清；
③ 空白对照组：空白对照组内没有种植CHO细胞，每孔加入180μL的DMEM/F12细胞培养液和20μL的胎牛血清。
（3）孵育受试物
将加入受试物的96孔细胞培养板放置于二氧化碳培养箱（5%CO2，37℃）中孵育24h。
（4）孵育MTT
取出96孔细胞培养板，加入配制好的5mg/mL MTT溶液，每孔20μL，将96孔细胞培养板放置于二氧化碳培养箱（5%CO2，37℃）中孵育4h。
（5）萃取MTT
取出96孔细胞培养板，移除板内的溶液，加入二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），每孔200μL，将96孔细胞培养板放置于微板振荡器内，振荡10 min。
（6）测定吸光值
取出96孔细胞培养板，用酶标仪检测490nm下每孔的吸光值。
（7）计算细胞抑制率
根据吸光值，按照公式（1）计算细胞抑制率：
细胞抑制率=1-[( ODn – ODo)/( ODc – ODo)]×100%… …………………(1)
式中：
ODn ——试验组OD值的平均值；
ODo ——空白对照组OD值的平均值；
ODc ——细胞对照组OD值的平均值。
2、试验结果
对100mg/mL的苯酚标准溶液进行热裂解，并对热裂解产物捕集物进行了检测，检测数据见表2（重复试验两次）。由表中数据可见：两次苯酚标准溶液热裂解产物捕集物MTT细胞毒性试验的细胞抑制率均大于96%，呈现显著的细胞毒性，故可以作为卷烟纸及其添加剂热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物。
表2、苯酚标准溶液热裂解产物捕集物MTT细胞毒性试验检测数据

Claims (1)

1.一种热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法，其特征在于按以下步骤进行：
a.根据参与燃烧的物质的燃烧状态确定其热裂解温度；
b.挑选几种细胞毒性试验常用阳性物作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验用阳性物的备选物质，并根据备选物质的沸点、熔点、热稳定性理化性质决定是否进入后续筛选步骤：将未能查询到相关理化性质的物质或沸点低于参与燃烧物质的燃烧温度且在燃烧温度条件下未分解或少量分解的物质进入后续筛选步骤；
c.将未查询到相关理化性质的物质或沸点低于参与燃烧物质的燃烧温度且在燃烧温度条件下未分解或少量分解的物质在其热裂解温度条件下进行热裂解试验，裂解产物富集后升温进样至气相色谱-质谱联用仪分离分析，根据分析结果决定是否进入后续筛选步骤：将在燃烧温度条件下未分解或小部分分解的物质，即总离子流图中原化合物的面积归一化含量≥40%，进入后续的筛选步骤；
d.将在燃烧温度条件下未分解或小部分分解的物质，即总离子流图中原化合物的峰面积归一化百分含量≥40%，进行热裂解试验，捕集热裂解产物，并将热裂解产物捕集物进行MTT细胞毒性试验，根据试验结果确定可以作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物使用的物质：MTT细胞毒性试验得到的细胞抑制率≥80%的物质可以作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物使用；MTT细胞毒性试验得到的细胞抑制率＜80%的物质不再作为热裂解产物捕集物细胞毒性试验的阳性物使用。
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