CN104774967A - 一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量pcr方法的引物及检测方法 - Google Patents

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何海
韩端
贺笋
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何玉仙
张淑琴
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’如SEQ ID NO.2所示。用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将如权利要求1所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。本方法具有方便、准确、高灵敏度的特点。

Description

一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法。
背景技术
常规测定试猪中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)抗原的方法是将从试猪身上采集的鼻拭子进行培养，再利用培养基分离鉴定，或者通过普通的PCR方法进行检测。其中，培养基分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响；而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果，使筛选出的萎缩性鼻炎阴性猪或者感染猪出现偏差；同时，这种方法耗时费力。
本发明的目的在于：通过设计高特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法，测定试猪鼻拭子中的多杀性巴氏杆菌抗原含量，从而替代普通PCR的方法筛选试猪；并利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确和高效。
发明内容
本发明的目的在于：设计一对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于优化多杀性巴氏杆菌抗原检测，简化待测样本制备工作，从而提高抗原检测效率。
本发明的目的是这样实现的：一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：
上游引物：5’‐ TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’‐ GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’ 如SEQ  ID  NO.2所示。
一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将上述所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。
有益效果：本发明采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在10CFU时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎多杀性巴氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。
附图说明   
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为 普通PCR对Pm抗原检测图；
附图1说明：如图1所示：1:108 CFU Pm菌体；2:107 CFU Pm菌体；3:106 CFU Pm菌体；4:105 CFU Pm菌体；5:104 CFU Pm菌体；6:103 CFU Pm菌体；7:102 CFU Pm菌体；8:10 CFU Pm菌体；9:1 CFU Pm菌体；10：Maker2000；11：阳性对照。
 具体实施方式
实施例1、一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：
上游引物：5’‐ TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’‐ GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’ 如SEQ  ID  NO.2所示。
一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将上述所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。
具体实践验证：荧光定量PCR检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原（多杀性巴氏杆菌）的方法步骤：
1抗原检测
1.1制作鼻拭子 将竹签一头缠绕脱脂棉，制作鼻拭子，不同日龄的试猪使用相应长度的棉签，制作好的鼻拭子高压灭菌。
1.2采样 保定试猪，将制作好的鼻拭子轻轻旋转插入试猪鼻孔，避免误伤试猪，取出鼻拭子放入事先分装的BHI培养基中；
1.3菌液制备 将接入鼻拭子的BHI培养基放入37℃摇床，在200rpm条件下，过夜培养16h；另取保存菌种Pm，经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。
1.4荧光定量PCR 将培养好的菌液作为模板，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司）配制PCR体系，并使用荧光定量PCR仪（BioRad公司）进行反应。
1.5 观察荧光定量PCR结果，将待测样本与阴阳性对照的出峰时间与峰值大小进行对比，记录结果。
其中，为便于使用荧光定量PCR方法鉴定多杀性巴氏杆菌抗原，包括待测抗原样本制备与检测引物特异性；其中1、待测样本制备：使用鼻拭子采集试猪鼻腔内菌体，BHI液体培养；2、在多杀性巴氏杆菌基因组高度保守区域内设计高特异性引物如下：
上游引物：5’‐ TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’‐ GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’ 如SEQ  ID  NO.2所示。
（1）RT-PCR反应体系
SYBR Premix  12.5ul
Primer F      1ul;
Primer R      1ul
模板          2ul
Water         8ul
总体积        25ul
（2）RT-PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps：1    (95℃ 30秒)
Stage 2: PCR反应
Raps：40   (95℃ 5秒) (59℃ 30秒)
Stage 3: Melt Curve
（3）普通PCR反应体系
Taqmix        12.5ul
Primer F      0.5ul
Primer R      0.5ul
模板          2ul
Water         9.5ul
总体积        25ul
（4）普通PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps：1    (95℃ 5min)
Stage 2: PCR反应
Raps：30   (95℃ 30秒) (59℃ 45秒)(72℃30秒)
Stage 3: 4℃
实时荧光定量PCR所用的试剂盒为TAKARA公司生产。
2 传统方法对比验证
2.1 分离鉴定 取步骤1.3制备的菌液，接入不同的分离培养基分离鉴定。
2.2 普通PCR鉴定 使用与步骤1.4同样的模板，用普通PCR进行对比验证，普通PCR结果见附图1。
验证结果显示：普通分离鉴定培养法中杂菌大量生长，遮盖了生长速度较慢的产毒型多杀性巴氏杆菌，无法分离；普通PCR法鉴定灵敏度较低，在细菌含量大于103CFU时才能检测到；采用的荧光定量PCR法，在细菌含量在10CFU时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原，具有方便，准确，高灵敏度的特点。
序  列  表
 
<110> 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司
 
<120> 一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法
 
<160> 2   
 
<170> PatentIn version 3.5
 
<210> 1
<211>22
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 1
 TGCTCTATCCGCTATTTACCCA 
 
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 2
 GCTCAACACACCAAACTCCG
 

Claims (2)

1.一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：
上游引物：5’‐TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’‐GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’ 如SEQ  ID  NO.2所示。
2.一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将如权利要求1所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。
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