CN104480219A - 一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量pcr方法的引物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。本发明利用荧光定量PCR方法替代普通PCR的方法筛选试猪，利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物。
背景技术
常规测定试猪中支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)抗原的方法是将从试猪身上采集的鼻拭子进行培养，再利用培养基分离鉴定，或者通过普通的PCR方法进行检测。其中，培养基分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响；而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果，使筛选出的萎缩性鼻炎阴性猪或者感染猪出现偏差；同时，这种方法耗时费力。
本发明的目的在于：通过设计高特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法，测定试猪鼻拭子中的支气管败血性波氏杆菌抗原含量，从而替代普通PCR的方法筛选试猪；并利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确和高效。
发明内容
本发明的目的在于：设计一对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于优化支气管败血波氏杆菌抗原检测，简化待测样本制备工作，从而提高抗原检测效率。
本发明的目的是这样实现的：一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
有益效果：本发明采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在10时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为 普通PCR对Bb抗原检测图；附图1说明：如图1所示：1:108 CFU Bb菌体；2:107 CFU Bb菌体；3:106 CFU Bb菌体；4:105 CFU Bb菌体；5:104 CFU Bb菌体；6:103 CFU Bb菌体；7:102 CFU Bb菌体；8:10 CFU Bb菌体；9:1 CFU Bb菌体；10：Maker2000；11：阳性对照。
具体实施方式
实施例1、一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
具体实践验证：荧光定量PCR检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原（支气管败血波氏杆菌）的方法步骤：
1抗原检测
1.1制作鼻拭子 将竹签一头缠绕脱脂棉，制作鼻拭子，不同日龄的试猪使用相应长度的棉签，制作好的鼻拭子高压灭菌。
1.2采样 保定试猪，将制作好的鼻拭子轻轻旋转插入试猪鼻孔，避免误伤试猪，取出鼻拭子放入事先分装的BHI培养基中；
1.3菌液制备 将接入鼻拭子的BHI培养基放入37℃摇床，在200rpm条件下，过夜培养16h；另取保存菌种Bb，经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。
1.4荧光定量PCR 将培养好的菌液作为模板，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司）配制PCR体系，并使用荧光定量PCR仪（BioRad公司）进行反应。
1.5 观察荧光定量PCR结果，将待测样本与阴阳性对照的出峰时间与峰值大小进行对比，记录结果。
其中，为便于使用荧光定量PCR方法鉴定支气管败血波氏杆菌抗原，包括待测抗原样本制备与检测引物特异性；其中1、待测样本制备：使用鼻拭子采集试猪鼻腔内菌体，BHI液体培养；2、在波氏杆菌基因组高度保守区域内设计高特异性引物如下：
Bb上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’；Bb下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’；
（1）RT-PCR反应体系
SYBR Premix 12.5ul
Primer F 1ul;
Primer R 1ul
模板 2ul
Water 8ul
总体积 25ul
（2）RT-PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps：1 (95℃ 30秒)
Stage 2: PCR反应
Raps：40 (95℃ 5秒) (56/59℃ 30秒)
Stage 3: Melt Curve
（3）普通PCR反应体系
Taqmix 12.5ul
Primer F 0.5ul
Primer R 0.5ul
模板 2ul
Water 9.5ul
总体积 25ul
（4）普通PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps：1 (95℃ 5min)
Stage 2: PCR反应
Raps：30 (95℃ 30秒) (56/59℃ 45秒)(72℃30秒)
Stage 3: 4℃
实时荧光定量PCR所用的试剂盒为TAKARA公司生产。
2 传统方法对比验证
2.1 分离鉴定 取步骤1.3制备的菌液，接入不同的分离培养基分离鉴定。
2.2 普通PCR鉴定 使用与步骤1.4同样的模板，用普通PCR进行对比验证，普通PCR结果见附图1。
验证结果显示：普通分离鉴定培养法中杂菌大量生长，遮盖了生长速度较慢的产毒型巴氏杆菌，无法分离；普通PCR法鉴定灵敏度较低，在细菌含量大于104CFU时才能检测到；采用的荧光定量PCR法，在细菌含量在10时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原，具有方便，准确，高灵敏度的特点。
Claims (1)
1.一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
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| CN201510033460.9A CN104480219A (zh) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | 一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量pcr方法的引物 |
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| JPH04179480A (ja) * | 1990-11-09 | 1992-06-26 | Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai | ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、プローブ用ＤＮＡ断片及びそれらを用いるボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法 |
| CN102925547A (zh) * | 2012-08-02 | 2013-02-13 | 四川农业大学 | 用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法 |
-
2015
- 2015-01-22 CN CN201510033460.9A patent/CN104480219A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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