CN104480219A - 一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量pcr方法的引物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物,所述的引物包括上、下游引物,具体如下:上游引物:5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示;下游引物:5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。本发明利用荧光定量PCR方法替代普通PCR的方法筛选试猪,利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测,使试猪筛选更准确。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物。
背景技术
常规测定试猪中支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)抗原的方法是将从试猪身上采集的鼻拭子进行培养,再利用培养基分离鉴定,或者通过普通的PCR方法进行检测。其中,培养基分离鉴定法在实际操作中非常繁复,且易受杂菌干扰影响;而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法,虽然较为灵敏快捷,但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格,且有可能出现假阴性与假阳性等结果,使筛选出的萎缩性鼻炎阴性猪或者感染猪出现偏差;同时,这种方法耗时费力。
本发明的目的在于:通过设计高特异性引物,采用实时荧光定量PCR方法,测定试猪鼻拭子中的支气管败血性波氏杆菌抗原含量,从而替代普通PCR的方法筛选试猪;并利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测,使试猪筛选更准确和高效。
发明内容
本发明的目的在于:设计一对高特异性荧光定量PCR检测引物,便于优化支气管败血波氏杆菌抗原检测,简化待测样本制备工作,从而提高抗原检测效率。
本发明的目的是这样实现的:一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物,所述的引物包括上、下游引物,具体如下:上游引物:5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示;下游引物:5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
有益效果:本发明采用的高特异引物,使用荧光定量PCR法,在细菌含量在10时即可准确的检测出来,且不受杂菌干扰影响;采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌抗原,具有方便、准确、高灵敏度的特点。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为 普通PCR对Bb抗原检测图;附图1说明:如图1所示:1:108 CFU Bb菌体;2:107 CFU Bb菌体;3:106 CFU Bb菌体;4:105 CFU Bb菌体;5:104 CFU Bb菌体;6:103 CFU Bb菌体;7:102 CFU Bb菌体;8:10 CFU Bb菌体;9:1 CFU Bb菌体;10:Maker2000;11:阳性对照。
具体实施方式
实施例1、一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物,所述的引物包括上、下游引物,具体如下:上游引物:5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示;下游引物:5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
具体实践验证:荧光定量PCR检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原(支气管败血波氏杆菌)的方法步骤:
1抗原检测
1.1制作鼻拭子 将竹签一头缠绕脱脂棉,制作鼻拭子,不同日龄的试猪使用相应长度的棉签,制作好的鼻拭子高压灭菌。
1.2采样 保定试猪,将制作好的鼻拭子轻轻旋转插入试猪鼻孔,避免误伤试猪,取出鼻拭子放入事先分装的BHI培养基中;
1.3菌液制备 将接入鼻拭子的BHI培养基放入37℃摇床,在200rpm条件下,过夜培养16h;另取保存菌种Bb,经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。
1.4荧光定量PCR 将培养好的菌液作为模板,使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)配制PCR体系,并使用荧光定量PCR仪(BioRad公司)进行反应。
1.5 观察荧光定量PCR结果,将待测样本与阴阳性对照的出峰时间与峰值大小进行对比,记录结果。
其中,为便于使用荧光定量PCR方法鉴定支气管败血波氏杆菌抗原,包括待测抗原样本制备与检测引物特异性;其中1、待测样本制备:使用鼻拭子采集试猪鼻腔内菌体,BHI液体培养;2、在波氏杆菌基因组高度保守区域内设计高特异性引物如下:
Bb上游引物:5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’;Bb下游引物:5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’;
(1)RT-PCR反应体系
SYBR Premix 12.5ul
Primer F 1ul;
Primer R 1ul
模板 2ul
Water 8ul
总体积 25ul
(2)RT-PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps:1 (95℃ 30秒)
Stage 2: PCR反应
Raps:40 (95℃ 5秒) (56/59℃ 30秒)
Stage 3: Melt Curve
(3)普通PCR反应体系
Taqmix 12.5ul
Primer F 0.5ul
Primer R 0.5ul
模板 2ul
Water 9.5ul
总体积 25ul
(4)普通PCR反应程序
Stage 1: 预变性
Raps:1 (95℃ 5min)
Stage 2: PCR反应
Raps:30 (95℃ 30秒) (56/59℃ 45秒)(72℃30秒)
Stage 3: 4℃
实时荧光定量PCR所用的试剂盒为TAKARA公司生产。
2 传统方法对比验证
2.1 分离鉴定 取步骤1.3制备的菌液,接入不同的分离培养基分离鉴定。
2.2 普通PCR鉴定 使用与步骤1.4同样的模板,用普通PCR进行对比验证,普通PCR结果见附图1。
验证结果显示:普通分离鉴定培养法中杂菌大量生长,遮盖了生长速度较慢的产毒型巴氏杆菌,无法分离;普通PCR法鉴定灵敏度较低,在细菌含量大于104CFU时才能检测到;采用的荧光定量PCR法,在细菌含量在10时即可准确的检测出来,且不受杂菌干扰影响;采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原,具有方便,准确,高灵敏度的特点。
Claims (1)
1.一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物,其特征在于,所述的引物包括上、下游引物,具体如下:上游引物:5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示;下游引物:5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2015
- 2015-01-22 CN CN201510033460.9A patent/CN104480219A/zh active Pending
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袁翠霞等: "猪支气管败血波氏杆菌FlaA基因克隆与序列分析", 《山地农业生物学报》 * |
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