JPH04179480A - ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、プローブ用ＤＮＡ断片及びそれらを用いるボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はボルデテラ・ブロンキセプチカの１６３リボゾ
ームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）遺伝子、プローブ用ＤＮＡ断
片及びそれらを用いるボルデテラ・ブロンキセプチカの
検出法に関する。

（従来の技術） ボルデテラ・ブロンキセプチカは豚、犬、ウサギ、モル
モット、ラット及び七面鳥等の多種の動物に感染し、保
菌されている。また、ヒトからの分離例も報告されてい
る。ボルデテラ・ブロンキセプチカはこれらの動物に呼
吸器病を引き起こす重要な病原菌である。

豚においては、その養豚規模が拡大するにつれ各種の慢
性呼吸器疾患の発生が増加しており、とりわけ萎縮性鼻
炎（Ａｔｒｏｐｈｉｃ　ｒｈｉｎｉｔｉｓ；以下ＡＲと
略す）は、我が国のみならず世界の豚群で広く発生して
いる。重病は、鼻甲介骨の萎縮・欠損及び顔面の変形の
みならず、二次的に他の呼吸器感染症の誘発、発胃の遅
延などにより、経済的損失を招いている。

ＡＲの原因に関して、歴史的には遺伝病や栄養障害説も
報告されていたが、１９６０年代以後にボルデテラ・ブ
ロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅｐｔｉｃａ）　　Ｉ相菌を単独で子豚の鼻腔内に接
種することにより、ＡＲ病変が形成されることが明らか
にされた。

マウス、モルモット及びラット等の実験動物では、ボル
デテラ・ブロンキセプチカに感染すると気管支肺炎とな
る。このため重囲に感染している動物を試験に用いるこ
とは好ましくなく、重囲に感染していない動物群の作成
とその維持に努力が払われている。

ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染の有無を診断する方
法としては、動物の鼻腔・上部気管粘液等から原因菌で
あるボルデテラ・ブロンキセプチカを分離・同定する方
法、あるいは対象動物の血清から凝集抗体を検出する血
清学的診断方法が行われている。しかし、血清学的診断
方法は、ワクチンを接種した対象動物では用いることが
できず、診断的意義は小さい。確実な診断を行うために
；ま原因菌であるボルデテラ・ブロンキセプナカを分離
・同定し、感染の有無を確認する必要がある。

重囲は、ダラム陰性の小桿菌で、主な生化学的性状とし
てはブドウ糖分解能陰性、尿素分解能陽性、クエン酸塩
利用能陽性等が挙げろれる。

重囲の分離・同定方法は、綿棒等により採取した検査材
料を５０〜１００μｇ／−のフラジリドンを加えたマツ
コンキー寒天培地等に接種し、３７℃で２〜４日間培養
する。８現した淡紫色半透明のコロニーを純培養し、形
態学的及び各種生化学試験、さらにボルデテラ・ブロン
キセプチカ■相菌免疫ウサギ血清を使用してスライド凝
集反応を行い菌を同定する。しかし、検査材料中には、
多種類の菌が存在していることが多く、その中からボル
デテラ・ブロンキセプチカのみを分離するには熟練と経
験を要し、その手法は煩雑であり最終的に同定するまで
に約−週間を必要とする。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６
５　ｒＲＮＡ遺伝子、プローブ用ＤＮＡ断片及びそれら
を用いてボルデテラ・ブロンキセプチカを短期間で簡便
に検出する方法を提供することである。

（課題を解決するた約の手段） 本発明は、下記の塩基配列で表されるボルデテラ・ブロ
ンキセプチカの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を提供するもの
である。

［ｉ１’Ａ［ｉＵｉ’Ｌｉ１ｉＴ’ｌ”　「ＧＡ（ｉＡ
ＧＧＡ匹　Ａ［Ｉ：Ａ肛ＣＡじＡ　　ＣＴＧＧＧＡ［Ｔ
ＧＡ［：ＡＵＧ［：［：［：ＴＡＡ　　ＡじＧＡＴＧＴ
じＡＡ　　Ｕ’ｌ’Ａ［ｉＬ：’ｌ’［１ｌＴ１．ｉ　
　［１６６Ｌビｉ’　ｉ’　［［ｉ　Ｇ本発明はまた、
上記遺伝子に含まれるＤＮＡ塩基配列又はその逆相補鎖
塩基配列を有するＤＮＡ断片であって、下記の群から選
択されたＤ　Ｎ　Ａ断片の少なくとも一部を含むＤＮＡ
断片を提供するものである。

６８〜７７番目、 ２１４〜２２１番目、 ４２９〜４３５番目、 ４６７〜４７１番目、 ６３２〜６４３番目、 ６５４〜６６５番目、 １００２〜１０１２番目、 １０２１〜１０２２番目、 １２７６〜１２８０番目、 １４４９〜１４５２番目、及び １４６２〜１４６４番目 上記Ｄ　Ｎ　Ａ断片のうち特に好ましし）ものは、下記
の群から選択されたＤＮＡ断片の少なくとも一部を含む
ＤＮＡ断片である。

７５〜７７番目、 ４３１番目、 ４６７〜４７１番目、 ６４０〜６４３番目、 ６６４〜６６５番目、 １４４９〜１４５２番目、及び １４６２〜１４６４番目 本発明はさらに上記ＤＮＡ断片をプローブとして用いて
、ハイブリダイゼーション法、好ましくはｒＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーション法を行いボルデテラ・ブロ
ンキセプチカを検出することを特徴とするボルデテラ・
ブロンキセプチカの検出法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

リボゾームＲＮ　Ａ　（ｒ　Ｒ？Ｎ’Ａ　）は生物が生
存する上で必須の細胞構成成分であり、その構造は生物
の進化の過程において比較的よく保存されている。たと
えば大腸菌と枯草菌のｒＲＮＡを比較した場合７０〜８
０％の相同性がある。

ｒＲＮＡの中でも１６５　ｒＲＮＡにライては、比較的
よく研究がなされており多くの生物種においてその塩基
配列が同定されでいる。１６３　ｒＲＮ　Ａには種々の
生物で共通に保存されている領域以外に生物種によって
構造が異なる可変領域の存在が知られており、この領域
に対応するＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーシ
ョン法により細菌の検圧・同定を行う方法が近年開発さ
れてきた。

ｒＲＮＡは細胞光たり１０４個以上存在しハイブリダイ
ゼーション法のターゲットとしては感度の面からも有効
である。しかしながら、この方法を利用するためには目
的とする細菌の１６５　ｒＲＮＡ、あるいはその遺伝子
の塩基配列が同定されていなければならない。

ボルテ°テラ・フ゛ロンキセプチカにおいても、１６Ｓ
　ｒＲＮＡの塩基配列は知られていない。そこで、ボル
デテラ・ブロンキセプチカより１６５　　ｒＲＮ　Ａ遺
伝子を単離、全塩基配列を決定し、これを既知の細菌１
６５　ｒＲＮＡの塩基配列と比較し型閉特異領域を同定
した。さらに、この特異領域に相補するＤＮＡプローブ
を合成し、これを使用したボルデテラ・ブロンキセプチ
カの検出法を開発した。

以下、その概要を説明する。

＾）ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６５　　ｒＲＮ
Ａ遺伝子のクローニングと全塩基配列の決定１）　Ｐ　
ＣＲ法による１６５　ｒＲＮＡ遺伝子断片のクローニン
グ 既知の種々の細菌のｒＲＮＡ塩基配列を比較検討し共通
配列構造の領域を推定する。次いで、この領域に対応す
る配列に）Ｉｉｎｄｌｆｆ　！Ｊンカーを導入したプラ
イマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法でボルデテラ・ブロン
キセプチカＤＮＡ中の１６５　ｒＲＮＡ遺伝子領域内の
約８００塩基の断片を増幅、プラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１１
８ＨｉｎｄＩ［［切断部位にクローニングする。得られ
た遺伝子を塩基配列分析し、既知の１６５ｒＲＮ　Ａ塩
基配列との比較により、１６５ｒＲＮＡ遺伝子の一部で
あることを確認する。

２）完全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のクローニングＰＣＲ
法でクローニングした遺伝子断片を用いて、完全長の１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子を分離する。

ボルデテラ・ブロンキセプチカＤＮＡを３ａｍＨ１で切
断、λファージ・ベクターＥ！、＋ＢＬ４に挿入しＤＮ
Ａライブラリーを作製する。これを、ＰＣＲ法でクロー
ニングした　１６５ｒＲＮＡ遺伝子断片をプローブとす
るプラーク・ハイブリダイモーション法でスクリーニン
グし、完全長１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を含むクローンを
選択する。得られたクローンをさらに詳細に分析し、最
終的に１６５　ｒＲＮ　、Ａ、完全長遺伝子を含む約１
．７ｋｂのＢａｍ）ＩＩ−３ａｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を
得る。

３）ボルデテラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列分析 塩基配列の決定はキロシーフェンス法により行う。プラ
スミドｐＵ　Ｃ１１９ＢａｍＨＩ−３ａｌｌ切断部位に
挿入した遺伝子をエキソヌクレアーゼ■及びＭｕｎｇ　
ｂｅａｎヌクレアーゼにより処理し段階欠失変異株を分
離、これを用いてジデオキシ法により塩基配列を分析す
る。決定した塩基配列をパーソナル・コンピューターを
用いて既知の他種細菌１６Ｓ　ｒＲＮＡの配列と比較し
遺伝子領域を特定する。

Ｂ）ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６５　　ｒＲＮ
Ａ遺伝子の特異領域の決定 決定したボルデテラ・ブロンキセプチカ１６３ｒＲＮＡ
遺伝子塩基配列と既知の他種細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
塩基配列との比較によりボルデテラ・ブロンキセブチ力
に特異的な領域を決定する。

解析はパーソナルコンピューター及び遺伝子解析ソフト
ウェア（ＧＥＮＩＡＳ　：三井情報開発）を用いＨａｒ
ｒ　ｐｌｏｔ法等の方法により行う。

Ｃ）プローブＤＮＡの合成 り）で決定したボルデテラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ　
ｒＲＮ　Ａ遺伝子の特異配列領域より１５〜５０塩基程
度のヌクレオチド配列を選択しその逆相補鎖をプローブ
ＤＮＡとしてＤＮＡ合成機で合成する。

例えば、好ましい配列としては、 Ｂｂｌ　　ＡＧＧＣＣＧＡＡＧ［：　　［：ＣＧＴＧＣ
ＴＧＣＣＧ（６８〜８８番目の逆相補鎖） Ｂｂ２ＡｒＡＴｃＧＧｃｃＧｃＴｃｃＡＡＴＡ６丁ＧＣ
ＧＡＧＧ［：ＣＣＧ　　ＡＡ （２０３〜２３４番目の逆相補鎖） Ｂｂ３　　ＣＴＣＣＣＴＣＴＧＡ　　ＣＡＣＡＣＴ［：
ＴＡＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＴ　　ＡＡＡＡ （６３２〜６６５番目の逆相補順） Ｂｂ４　　ＧＣＡＣＴＣＣ［：ＡＡ　　ＡＴＣＴＣＴＴ
ＣＧＧ　　ＧＡＴＴ（９９８〜１０２１番目の逆相補釦
） Ｂｂ５　　ＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧ　　ＴＧＣＴＴＴＡＣ
ＡＡ（４２１〜４４０番目の逆相補鎖） Ｂｂ６　　　［：ＧＴＣＡＧＴＴＧ［：　　ＡＣＡＧＧ
（４６５〜４７９番目の逆相補鎖） などが挙げられる。

Ｄ）ｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法による
ボルデテラ・ブロンキセプチカの検出Ｃ）で合成したプ
ローブを用いてハイブリダイゼーションによるボルデテ
ラ・ブロンキセプチカの検出を行う。

検体をドツトプロット作製装置に供しナイロン膜上に固
定し、これを用いてハイブリダイゼーションを行うこと
により、ボルデテラ・ブロンキセプチカの検出が可能で
ある。また、ボルデテラ・ブロンキセプチカと生化学的
性状が非常によく似ている豚鼻腔内存在菌アルカリゲネ
ス・フェカリスはこれらのプローブを用いたハイブリダ
イゼーション法によりまったく検出されない。

ｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションでは、ＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリダイゼーションの場合のように検体の
前処理（アルカリ処理等）は必要としない。またｒＲＮ
Ａはコピー数が多いため、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイ
ゼーションの場合には通常１０時間以上要するハイブリ
ダイゼーション時間が、ｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイ
ゼーションでは１〜２時間時間下よい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１　ボルデテラ・ブロンキセプチカの１６５ｒＲ
ＮＡ遺伝子の単離とＤＮＡ塩基配 列の決定 １）ボルデテラ・ブロンキセプチカＤ　Ｎ　Ａの精製ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカＳ１株をヒツジ血液加ポル
デジヤング寒天培地にて培養後、菌体を白金耳にてかき
とり、りん酸生理食塩水に懸濁した。菌体を遠心分離に
より回収した後、０．１％リゾチームを含む１０　ｍ？
Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ
８，０）中で０℃、３０分間インキュベートし、プロテ
ナーセＫを０．１　ｍｇ／−になるように加え、次いで
ＳＤＳを終濃度１％加え４５℃、３０分間インキュベー
トした。さらに、等容の水飽和フェノールを加え、遠心
分離により水層を回収、これにクロロホルムを加え遠心
分離で水層を回収した。２．５容の冷エタノールを加え
ガラス棒で生じた沈澱を巻きとり、風乾後、１０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−）１［：Ｉ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ
８，０）に溶解し、ＤＮＡ標品とした。

２）　Ｐ　ＣＲ法による１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子断片の
増幅と単離 細菌１６５　ｒＲＮＡ共通配列に対応する合成りＮＡブ
ライマーを用い、Ｐ　ＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈ
ａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりボルデテラ・ブロ
ンキセプチカＤＮＡ中の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子断片を
増幅した。ＰＣＲ反応はパーキンエルマー・シータス社
のサーマルサイクラ−及びＧｅｎｅＡｍｐキットを用い
説明書記載の方法にしたがって実施した。プライマーは
ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ社モデル
３９１ＥＰ）を用いて合成した。プライマーの配列には
、クローニングが容易に行えるように、５゛末端Ｈｉｎ
ｄ■リンカ−を導入した。プライマーの配列は次の通り
。

ＡＴＧ［：Ａ　ＡＧＣＴＴ　Ｇ［：ＣＡＧ　ＣＡＧＣＣ
ＧＣＧＧＴ　ＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡ　ＡＧＣＴＴ　ＴＧ
ＡＣＧ　ＧＧＣＧＧ　ＴＧＴＧＴ　ＡＣＡＡＧボルデテ
ラ・ブロンキセプチカＤＮＡより上記のプライマーを用
いＰＣＲ反応を行い、反応生成物をアガロース電気泳動
法により分離精製した。得られた約８００塩基のＤＮＡ
断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これをプラスミド・ベ
クターｐＵｃ１１９の）ＩｉｎｄＩＩＩ切断部位にクロ
ーニングした。

３）ボルデテラ・ブロンキセブチカ１６Ｓ　ｒＲＮＡ完
全長遺伝子のクローニング ２）で得られたＤＮＡ断片は完全長のボルデテラ・ブロ
ンキセプチカ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子ではない。そこで
、これをプローブとしてλファージ・ベクターを用いて
作製したボルデテラ・ブロンキセプチカＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングし、完全長の１６Ｓ　ｒＲＮ　Ａ
遺伝子を含むクローンを単離した。

ボルテ°テラ・ブロンキセプチ力Ｄ　Ｎ　ＡをＢａｍＨ
Ｉで消化し、λファージ・ベクターＥＭＢＬ　４のＢａ
ｍＨ１切断部位に連結、パッケージング・キット（ＧＩ
ＧＡＰＡＣＫ　ＧＯＬＤ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
でパッケージングしボルデテラ・ブロンキセプチカＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

次いで、２）で得られたＤＮＡ断片をプローブとして、
ＤＮＡラベリング・デテクションキット（非放射性、ベ
ーリンガー社）を用いてプラーク・ハイブリダイゼーシ
ョン法により、スクリーニングを行った。方法はキット
のプロトコールに従った。得られた陽性クローンよりＤ
ＮＡを単離解析したところ、完全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝
子を含む１ＯｋｂのＢａｍＨＩ断片を有していた。

さらに詳細に検討したところ、このＤＮＡ断片を５ａｌ
ｌで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡ断片上に完
全長１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子が含まれていることが明ら
かとなり、これをプラスミド・ベクターｐＵｃ１１９の
ＢａｍＨＩ−８ａｌＩ切断部位にクローニングしプラス
ミドｐＢＳ　１を得た。

４）　ホル７’　テラ・ブロンキセプチカ１６５　　ｒ
ＲＮＡ遺伝子塩基配列の決定 プラスミドｐＢｓ　１を用いて、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカ１６ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した
。

ｐＢｓ　１をＢａｍＨＩ及び５ａｃＩで完全消化した後
にエキソヌクレアーゼＩＩＩにて限定消化した。

これをＭｕｎｇ　ｂｅａｎヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理、ＤＮＡリガーセで
連結し、大腸菌ＭＶ１１８４に形質転換した。得られた
コロニーより、プラスミドを調製し、適当なサイズの段
階欠失変異株を選択した。こうして作製した段階変異株
を用い、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ２、　Ｏ
Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｕ　Ｓ　
Ｂ社）で塩基配列分析を行った。方法はキット説明書に
従った。

実施例２　　ｒＲＮＡ−ＤＮＡプローブ法によるボルデ
テラ・ブロンキセプチカの検出 １）プローブの合成 ＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣ［１，Ｇ　（
Ｂｂｌ：　６８〜８８番目の逆相補鎖）の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドＤ　’Ｎ　Ａを合成した。合成
はＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ社モデ
ル３９−Ｉ　ＥＰ）によった。精製はＯＰＣカートリッ
ジ（アプライド・バイオシステムズ社）で行った。

２）プローブの標識 合成したプローブの５”末端をＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（Ｄ
ＮＡ　５“末端標識キット、宝酒造社）を用いて３２ｐ
で標識した。

３）ハイブリダイゼーション 被検液に終濃度１０％のＮ−アセチル−Ｌ−システィン
を加え３７℃、３０分間処理した。

この処理により、ｒＲＮＡを安定化させることができる
ほか、豚の重粘液等の粘度の高い試料を低粘度化できる
。この試料１００μｌを、ドツトプロット作製装置（ア
トパンチツク東洋社、ＤＰ４８等）に供し、ナイロン膜
（ナイトラン１３ＮＳＳ＆Ｓ社）上にスポットした。８
０℃で２時間乾燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーシ
ョン溶液（５ＸＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ溶液
、０．２％、ＳＤＳ、１００％ｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ）
に１時間浸漬した。続いて６０℃のノ１イブリダイゼー
ション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に２　ｘ
　１０６ｃ、　ｐ、ｍ、、／　１０−のＰ　３ｉＢｊ識
プローブを加えたもの）に２時間浸漬した。

６０℃の５ｘＳＳＣ−０，２％　ＳＤＳ溶液で２分間ず
つ３回洗浄し、風乾後、Ｘ線フィルム及び増感スクリー
ンを用いて、−７０℃で１６時間オートラジオグラフィ
ーを行った。

さらに、ナイロン膜上のスポットを切りとり、液体シン
チレーション・カウンターを用いて、放射能カウントを
測定し、結果の数値化を行った。

ボルデテラ・ブロンキセプチカ各種菌株（野外分離株を
含む）、大腸菌、枯草菌、緑膿菌、アルカリゲネス・フ
ェカリスの培養液を用いて上記方法に従って、検出を行
った。結果を第１図及び第１表に示す。ボルデテラ・ブ
ロンキセプチカについては、すべての菌株と強くハイブ
リダイズしているが、類縁菌のアルカリゲネス・フェカ
リス及びその他の菌株とはまったく反応しなかった。

また、ボルデテラ・ブロンキセプチカ培養液を段階希釈
したもので本方法の感度を測定した。

これより、約１０３個の菌数で十分検出できることがわ
かる。

第　　１　　表 実施例３　他のプローブを用いた例 ＣＴＣＣ［：ＴＣＴＧＡ　ＣＡＣＡＣＴＣＴＡＧ　ＣＣ
ＣＧＧＴＡＴＴ　ＡＡＡＡ　（Ｂｂ３）（６３２〜６６
５番目の逆相補鎖） ＧＣＡ［：ＴＣＣＣＡＡ　ＡＴＣＴＣＴＴ［：ＧＧ　Ｇ
ＡＴＴ　　　　　　（Ｂｂ４）（９９８〜１０２１番目
の逆相補鎖） の２種類の合成りＮＡプローブを用いてボルデテラ・ブ
ロンキセプチカの検出を行った。

プレハイブリダイゼーション溶液を５ｘＳＳＣ。

５ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’　ｓ溶液、０．２％ＳＤＳ、３
０％ホルムアミド、１００μｇ／ｒｎｌ酵母ｔＲＮＡの
組成に変更した以外は、実施例２と同様の方法によった
。

結果を第２図及び第３図にそれぞれ示す。８ｂ３及びＢ
ｂ４いずれを用いた場合でも、実施例２と同様ボルデテ
ラ・ブロンキセプチカのみが検出された。

実施例４　豚鼻粘液からのボルデテラ・ブロンキセプチ
カの検出 豚２頭の両鼻腔内にボルデテラ・ブロンキセプチカＳＩ
株Ｉ相菌を１０”個ずつ接種した。１週間後、常法の培
養による細菌検査でボルデテラ・ブロンキセブチ力の感
染が確認された２頭の豚の鼻粘液を綿棒で採取し、これ
を１ｒｎｌのリン酸生理食塩水に懸濁した。次いで、こ
の０，５−に２０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンを等
容加えたものを試料として実施例２と同様の方法でボル
デテラ・ブロンキセプチカの検出を行った。また、対照
としては、ボルデテラ・ブロンキセプチカを接種してい
ないプライマＩＪ　−Ｓ　Ｐ　Ｆ豚から採取した鼻粘液
を用いた。結果を第２表及び第４図に示す。

本発明方法を用いることによりボルデテラ・ブロンキセ
プチカを感染豚鼻粘液から直接に検出することが可能で
あることがわかる。

（発明の効果） 本発明のＤＮＡをプローブとして用いるボルデテラ・ブ
ロンキセプチカの検出法は、通常の分離・同定による検
出法と比較して短時間で且つ多数の検体を検査すること
ができる。ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染豚の鼻粘
液には約１０６個／−以上のボルデテラ・ブロンキセプ
チカが存在すると考えられているので、本方法を用いて
鼻粘液からボルデテラ・ブロンキセプチカ感染豚の直接
診断も可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は、本発明のＤＮＡプローブ
Ｂｂｌ　、Ｂｂ３及びＢｂ４をそれぞれ用いてボルデテ
ラ・ブロンキセプチカを検出した結果を示す図面である
。 第４図は、ボルデテラ・ブロンキセプチカを感染豚鼻粘
液から検出した結果を示す図面である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列で表されるボルデテラ・ブロンキ
   セプチカの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項（１）記載の遺伝子に含まれるＤＮＡ塩基
   配列又はその逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片であ
   って、下記の群から選択されたＤＮＡ断片の少なくとも
   一部を含むＤＮＡ断片。 ６８〜７７番目、 ２１４〜２２１番目、 ４２９〜４３５番目、 ４６７〜４７１番目、 ６３２〜６４３番目、 ６５４〜６６５番目、 １００２〜１０１２番目、 １０２１〜１０２２番目、 １２７６〜１２８０番目、 １４４９〜１４５２番目及び １４６２〜１４６４番目
3. （３）請求項（１）記載の遺伝子に含まれるＤＮＡ塩基
   配列又はその逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片であ
   って、下記の群から選択されたＤＮＡ断片の少なくとも
   一部を含むＤＮＡ断片。 ７５〜７７番目、 ４３１番目、 ４６７〜４７１番目、 ６４０〜６４３番目、 ６６４〜６６５番目、 １４４９〜１４５２番目及び １４６２〜１４６４番目
4. （４）請求項（２）又は（３）記載のＤＮＡ断片をプロ
   ーブとして用いてハイブリダイゼーション法を行いボル
   デテラ・ブロンキセプチカを検出することを特徴とする
   ボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法。