CN104246505A - 结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

由于用于检测结核菌群的常规方法需要时间长且还需要大量劳力和费用，因此，还不能进行结核病的确定诊断和早期治疗开始。已存在对快速检测方法的需求。即使对于从生物样品直接检测，如果生物样品中不存在MPT64或仅存在非常少量的MPT64，也不能进行检测。结果，已产生结核菌群感染被忽略的风险，并且更可靠的检测方法十分必要。提供一种方法和试剂盒，其中加热处理施加至含有结核菌群的生物样品，从而使结核菌群特异的分泌蛋白质，特别是MPB64，分泌到细菌细胞外，并将得到的处理样品进行免疫学测定，从而在不培养生物样品的情况下以更迅速且简便的方式检测结核菌群。

Description

结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及高度安全的结核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex)的免疫学检测方法和试剂盒，其通过在预定的温度下加热处理生物样品并免疫学检测由此被细胞外分泌(extracellularly secreted)的结核菌群特异的分泌蛋白质，可在不进行培养操作的情况下由含有结核菌群的生物样品直接简便且迅速地进行。
背景技术
结核(Tuberculosis)为目前高度重要的传染病，据称每年日本国内有数千人、世界各地有数百万人死于该疾病，根据传染病法(Infectious Disease Law)疑似结核感染的患者必须入院。当诊断患者患有结核时医师必须立即报告给当局，因而需要及时的响应。
属于结核菌群的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)、牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis，牛型结核菌)、鼠结核分枝杆菌(Mycobacterium microti，鼠型结核菌)和非洲结核分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum，非洲型结核菌)已知为对人类致病的抗酸菌(acid-fast bacteria)。鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、堪萨斯结核分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)和海鱼结核分枝杆菌(Mycobacterium marinum)等已知为非结核性分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria)。
感染有结核菌群的人类主要由结核分枝杆菌引起，在某些罕见病例中，由牛结核分枝杆菌引起。近年来，非结核性分枝杆菌种中，感染有鸟结核分枝杆菌的病例增加。由于这两类感染存在类似的临床症状，病因细菌的鉴定对于确定治疗方针也是重要的。
因此，结核感染或非结核性分枝杆菌感染的区别检测对于减轻患者负担和适当地进行早期治疗同样是重要的。在另一方面，从公共卫生的角度，区别检测对于防止第三人继发感染的目的也是重要的。
迄今为止，作为检测结核菌群的方法，已实施了基于培养的检测方法。此类培养方法通过将待试验的生物样品接种至液体培养基或固体培养基并检测生长的细菌细胞来进行。尽管使用液体培养基的方法可缩短待试验的生物样品的培养期，但该方法在操作期间具有继发感染的高风险，因而需要高度安全的设备和装置。使用固体培养基的方法需要长达大约2个月的时间才能获得检测结果。结核菌群必须使用高度安全的装置在高度安全的环境中特别小心地培养以防止继发感染。
作为用于从上述培养的生物样品的培养基中鉴定结核菌群的方法，已知涉及免疫学测定分泌至培养基中的结核菌群特异的蛋白质的简便检测方法。
日本专利特开平11-108931号公报公开了用于检测结核菌群存在的方法，该方法包括：将从结核病患者收集的生物样品接种至固体培养基或液体培养基，培养结核菌群数日至数周；然后免疫学检测分泌至培养基中的结核菌群特异的分泌蛋白质MPB64。根据该文献，该方法与常规方法相比允许在培养后立即鉴定和检测结核菌群并减少操作期间继发感染的风险。
然而，该方法涉及培养包含在生物样品中的结核菌群，并使用得到的培养物作为样品。因此，该方法需要与直至结核菌群被检测和鉴定的培养期几乎相同的时间，因而需要大量劳力和费用。
如日本专利特开平11-108931号公报所述，MPB64为牛结核分枝杆菌BCG(M.bovis BCG)产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPT64为结核分枝杆菌产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPB64和MPT64已知为相同的物质。
日本专利特开2002-62299号公报指出，结核菌群特异的分泌蛋白质MPT64可在不培养包含在生物样品中的结核菌群的情况下通过免疫学测定来检测。该方法涉及处理生物样品如痰并检测包含在生物样品中的MPT64，从而检测结核菌群的存在。
然而，即使结核菌群存在于生物样品中，除非MPB64由结核菌群被细胞外分泌并包含在生物样品中，否则该方法也不能检测出结核菌群。另外，丰度小的MPT64，即使分泌也需要大量的生物样品并使操作复杂化。该操作增加了试验对象和负责试验人员的负担。同时，可能会忽略结核菌群的感染，导致公共卫生问题。
国际公开WO2009/084481号公开了一种更快速、更安全且比以往更精确地诊断结核菌感染的方法，该方法包括使用抗MPB64中特定表位的抗体特异地检测生物样品中的MPB64。根据该方法，可应用的样品可为通过使用少量液体培养基仅在结核菌群的细菌细胞实质上开始生长之前的一段时间内培养生物样品获得的培养物。
然而，该方法仍需要促进MPB64从生长前的细菌细胞分泌以使大量MPB64在培养基中累积的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利申请特开平11-108931号公报
专利文献2：日本专利申请特开2002-62299号公报
专利文献3：国际公开WO2009/084481号
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，常规方法需要长时间检测结核菌群还需要大量劳力和费用。出于这些原因，结核的确定诊断和早期治疗开始不能进行。因此，已存在对快速检测方法的需求。另外，如果生物样品不含有MPT64或含非常少量的MPT64，也不能进行生物样品的直接检测。结果，结核菌群感染可能被忽略。因此，需要更可靠的检测方法。本发明的目的为通过提供简便、快速且更可靠的结核菌群检测方法来解决这些问题。
用于解决问题的方案
本发明人已进行了孜孜不倦的研究来解决上述问题，因此发现该问题可通过加热处理含有结核菌群的生物样品以便细胞外分泌结核菌群特异的分泌蛋白质如MPB64并检测由此分泌的蛋白质来解决，结果，已完成了本发明。
根据一个方面，本发明提供一种结核菌群的检测方法，其包括使结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有结核菌群的生物样品进行加热处理而被细胞外分泌。根据另一方面，本发明还提供一种结核菌群检测用试剂盒，作为出于进行上述方法的目的的结核菌群检测用试剂盒，其至少包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理的处理容器，和用于检测通过加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免疫学测定装置。该试剂盒可进一步包括样品处理剂和/或溶剂。本发明的检测方法和试剂盒能够快速且简便地检测结核菌群。根据另外的方面，本发明还提供用于细胞外分泌结核菌群特异的蛋白质的方法，其包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理。
附图说明
图1为示出当使用M.bovis BCG东京菌株的细菌细胞时加热处理温度与促进细胞外MPB64分泌的效果之间关系的图。
图2为示出当使用M.bovis BCG东京菌株的细菌细胞时加热处理时间与促进细胞外MPB64分泌的效果之间关系的图。
具体实施方式
用于本发明的生物样品不特别限定，只要生物样品可含有结核菌群即可。生物样品的实例包括痰、胸膜积液、支气管分泌物、胃液、血液、脊髓液、尿液和排泄物。优选地，使用痰是因为其细菌浓度高。可选地，呼吸检查期间收集的支气管灌洗液或收集自支气管或肺的组织等可用作生物样品。这些生物样品可各自单独使用或可作为其两种以上的混合物而使用。
生物样品的加热处理优选通过将生物样品置于气闭密封的容器中，然后将该容器作为整体进行加热处理来进行，这是因为待处理的生物样品含有高感染性结核菌群。从确保操作者安全的观点，加热处理操作优选在安全橱内进行。加热处理中使用的容器不特别限定，只要该容器可保持其气闭密封的状态并可抵抗预定的加热温度即可。容器可根据待试验的生物样品适当地选择。容器可在其开口部安装有带滤器的滴嘴(dropper nozzle)以便促进由此处理的生物样品从容器排出，以用于免疫学测定。优选使用带滤器的滴嘴，是因为带滤器的滴嘴可除去包含在处理的生物样品中的固体物质如变性组分，并进一步可简便地将得到的生物样品置于免疫学测定装置。
生物样品可根据其加热处理前的性质利用样品处理剂进行处理如溶解。例如，当痰用作样品时，可用减少痰的粘度的碱性物质、还原物质、蛋白酶、糖、表面活性剂或蛋白质变性剂等溶解，从而改进加热处理的效力。特别地，使用氢氧化钠作为碱性物质和N-乙酰基-L-半胱氨酸作为还原物质的组合处理是简便的且优选使用。
根据另一实施方案，生物样品可分散或溶于溶剂，接着进行加热处理。溶剂可为，例如可保持包含在生物样品中的结核菌群活着的任何溶剂。可使用缓冲液如磷酸盐缓冲盐水或在抗酸菌分离培养中使用的液体培养基如Middlebrook7H9。特别地，优选使用液体培养基，因为需要通过加热处理来细胞外分泌蛋白质而不影响结核菌群的活性，还因为由此处理的样品可直接进行免疫学测定。可选地，用样品处理剂溶解的生物样品可再分散于溶剂中。
生物样品的处理温度可为蛋白质可被结核菌群细胞外分泌至生物样品或溶剂中的任何温度，并优选在40℃至60℃的范围内，更优选在40℃至55℃的范围内。特别地，有效促进分泌的温度在45℃至50℃的范围内。
生物样品的处理时间可为当处理温度保持在上述范围内时，足以细胞外分泌可检测量的结核菌群特异的分泌蛋白质的时间。处理时间优选15分钟以上，更优选15分钟以上且2.5小时以下，进一步优选15分钟以上且1.5小时以下，最优选30分钟以上且1小时以下。
由此加热处理的样品可仅通过升高加热温度进行结核菌群失活处理。结核菌群的失活处理温度不特别限定但优选100℃。包含在样品中的结核菌群的失活使免疫学测定安全进行而无继发感染的风险。
加热处理用加热设备不特别限定，只要该设备能够保持温度恒定即可。可使用恒温器浴、加热器块(heater block)或培养器等。特别优选小型加热设备，因为所有检测结核菌群的步骤可在安全橱中完成。
根据本发明，结核菌群特异的蛋白质可通过加热处理生物样品来细胞外分泌。因此使用由此处理的生物样品通过免疫学测定等可容易地检测结核菌群的存在。
本发明中，被细胞外分泌的结核菌群特异的蛋白质不特别限定，只要蛋白质被细胞外分泌即可。
由结核菌群细胞外分泌的蛋白质的实例包括许多蛋白质如MPT64、MPB64、MPB70、ESAT-6和CFP-10。这些蛋白质中，在短时间内被大量细胞外分泌的蛋白质优选作为用作本发明中使用的指示免疫学测定中结核菌群存在的指标的蛋白质。例如，MPB64，即MPT64，通过根据本发明的加热处理生物样品，在无培养的情况下，即在细菌细胞开始增殖之前，被大量细胞外分泌或释放。由此观点，MPB64，即MPT64优选用作检测结核菌群存在的靶标。被细胞外分泌的MPB64，即MPT64可被免疫学测定，从而确定结核菌群存在与否。
在本发明的检测方法中，免疫学测定不特别限定，且优选使用抗结核菌群特异的分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定(sandwichimmunoassay)，特别是酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫层析测定。第一抗体和第二抗体可相同或可彼此互不相同，只要它们允许结核菌群特异的分泌蛋白质检测即可。
该免疫学测定可为能够免疫检测通过生物样品的加热处理而被细胞外分泌的MPB64的任何方法，且优选免疫层析测定，特别优选使用抗-MPB64单克隆抗体的免疫层析测定。MPB64检测用免疫层析测定可根据日本专利特开平11-108 931号公报记载的方法容易地进行。另外，可使用商购可得的MPB64，即MPT64检测用免疫层析测定装置TB(由TAUNSLaboratories,Inc.制造)。
实施例
本发明将借助下述实施例进一步详细描述。然而，本发明不意欲受这些实施例的限制。
参考例1(供试菌液的制备)
将4.7g Middlebrook7H9肉汤培养基(broth base)(由Difco Laboratories Inc.制造)溶于900ml含0.5g吐温80的蒸馏水中。将溶液在高压釜中121℃高压灭菌10分钟。冷却后，100ml的ADC增菌液(ADC Enrichment)(白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(albumin-dextrose-catalase))在无菌下加入其中，从而制备Middlebrook7H9液体培养基。
M.bovis BCG东京菌株(下文中称作，BCG菌株)接种至上述制备的液体培养基，并根据标准方法培养。继续培养直至获得对应于马克法兰氏标准1的浊度。离心所得细菌溶液以回收细菌细胞。回收的细菌细胞通过加入上述Middlebrook7H9液体培养基而重悬，接着进一步离心以回收细菌细胞。该操作重复三次。洗涤细菌细胞以除去附着至细菌细胞的结核菌群分泌蛋白质。洗涤操作之后将100μL悬浮液应用于MPB64检测的免疫层析测定装置TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)。结果，该产物显示阴性，证实分泌的MPB64不存在悬浮液中。
实施例1(加热处理温度的最佳条件的研究)
将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在530nm的吸光度下为O.D.为0.1，从而制备试验用菌液(细菌计数：相当于107CPU)。试验用菌液进一步用液体培养基稀释，从而制备10倍稀释菌液(细菌计数：相当于106CFU)和100倍稀释菌液(细菌计数：相当于105CFU)。200μl各制备的菌液分散于各塑料管中(核酸扩增用管)并使用核酸扩增设备用温度可控加热器块加热处理。加热温度设为从35℃至75℃以5℃间隔的温度。加热处理进行30分钟。在35℃的普通培养温度下加热处理的样品用作对照。从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与参考例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)，从而检测MPB64的存在。使用Immno Chromato-Reader(由Otsuka Electronics Co.,Ltd.制造)测量读取部(reading area)的吸光度。
结果示于图1。图1中，纵坐标表示TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)中显色强度(color intensity)(吸光度)的测量值，横坐标表示加热温度。吸光度与处理温度之间的关系由实线、虚线和长虚线表示，其中实线为关于试验用菌液(细菌计数：相当于107CPU)的结果，虚线为关于10倍稀释菌液(细菌计数：相当于106CPU)的结果，长虚线为关于100倍稀释菌液(细菌计数：相当于105CPU)的结果。
从结果来看，所有试验样品显示在40℃至60℃下吸光度升高，特别是在45℃至50℃下显著升高。这表示细菌细胞的热处理促进其细胞外MPB64分泌。在35℃的普通培养条件下处理的对照不显示吸光度的升高，表明仅在室温下或在与其相当的条件下保持样品不使MPB64被细胞外分泌。另一方面，在比证实了MPB64分泌的40℃至60℃温度范围高的温度范围内证实吸光度不升高。这表明，MPB64在等于或高于60℃的温度范围内不分泌。
因此，从这些结果证实细菌样品在40℃至60℃下、特别是在45℃至50℃下的加热处理显著促进细胞外MPB64分泌并显著增加免疫学测定的检出率。
实施例2(加热处理温度的最佳条件的研究)
将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在530nm的吸光度下为O.D.为0.1，从而制备试验用菌液(细菌计数：相当于107CPU)。200μl各制备的菌液分散于各塑料管中(核酸扩增用管)并使用核酸扩增设备用温度可控加热器块加热处理。加热温度设为35℃、从40℃至64℃以2℃间隔的13个温度和作为高温范围的70℃和80℃的2个温度。加热处理进行60分钟。将在35℃的普通培养温度下加热处理的样品用作对照。从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与参考例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)，从而检测MPB64的存在。通过目视观察标记物质在读取部累积的显色强度进行评价。显色强度目视评价为品红色的程度，分为5级：-(不着色)，±(微弱着色)，+(明显着色)，++(较明显着色)，和+++(显著着色)。评价结果示于表1。
表1
处理温度 评价
35℃(对照) -
40℃ ±
42℃ +
44℃ +
46℃ ++
48℃ +++
50℃ +++
52℃ ++
54℃ +
56℃ +
58℃ +
60℃ ±
62℃ -
64℃ -
70℃ -
80℃ -
从表1的结果来看，40℃至60℃下显示显色强度的升高，特别是在44℃至52℃下证实显著升高。这表明如实施例1中所述，细菌细胞的加热处理促进它们的细胞外MPB64分泌。在35℃的普通培养条件下处理的对照不显示吸光度的升高，表明仅在室温下或在与其相当的条件下保持样品不使MPB64被细胞外分泌。另一方面，在等于或高于62℃的温度下或者在70℃和80℃的高温范围内证实吸光度不升高。这显示，MPB64在等于或高于60℃的温度范围内不分泌。
因此，由这些结果证实细菌样品在40℃至60℃下、特别是在45℃至50℃下的加热处理显著促进细胞外MPB64分泌并显著增加免疫学测定的检出率。
实施例3(加热处理时间的最佳条件的研究)
将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在530nm的吸光度下为O.D.为0.1，从而制备试验用菌液(细菌计数：相当于107CPU)。将200μl各制备的菌液分散于各塑料管中(核酸扩增用管)并使用核酸扩增设备用温度可控加热器块加热处理。在设为从35℃至75℃以5℃间隔的温度的加热温度进行加热操作。处理时间设为0分钟、15分钟、30分钟和60分钟。从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与实施例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)。使用ImmnoChromato-Reader(由Otsuka Electronics Co.,Ltd.制造)测量读取部的吸光度。
结果示于图2中。在图2中，纵坐标表示TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)中显色强度(吸光度)的测量值，横坐标表示加热温度。吸光度和加热温度之间的关系由虚线、实线和长虚线表示，其中虚线为关于处理时间为15分钟的处理样品的结果，实线为处理时间为30分钟的处理样品的结果，和长虚线为处理时间为60分钟的处理样品的结果。
从结果来看，处理时间为15分钟、30分钟和60分钟的所有处理样品在45℃至50℃的温度下吸光度显著升高。在处理时间之间没有看出差异。甚至加热时间为60分钟的处理样品也没有证实与其它样品存在大的区别。因此，至少15分钟的加热处理时间证实具有促进细胞外MPB64分泌的效果。
实施例4(加热处理时间的最佳条件的研究)
将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在530nm的吸光度下为O.D.为0.01，从而制备试验用菌液(细菌计数：相当于106CPU)。将200μl各制备的菌液分散于各塑料管中(核酸扩增用管)并在50℃下使用核酸扩增设备用温度可控加热器块加热处理。在设为0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、120分钟和150分钟的处理温度下进行加热处理。作为对照，将与上述相同的待试验菌液置于室温下而不进行加热处理。从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与实施例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)。目视观察累积的标记物质的显色强度。显色强度目视评价为品红色的程度，分为5级：-(不着色)，±(微弱着色)，+(明显着色)，++(较明显着色)，和+++(显著着色)。评价结果示于表2。
表2
从表2的结果来看，非加热处理的对照样品和处理时间为0分钟的处理样品证实读取部不显示颜色。15分钟的加热处理证实产生源自细胞外MPB64分泌的颜色。加热处理60分钟的样品证实显著地显示颜色。加热处理长达150分钟的样品不进一步显示显色强度的升高并证实显著显色水平与加热处理60分钟的样品的显著显色水平相同。从这些结果证实加热处理至少15分钟具有促进细胞外MPB64分泌的效果，其在60分钟达到峰值。
实施例5(溶剂的研究)
使用含吐温80的磷酸盐缓冲溶液或Middlebrook7H9液体培养基作为生物样品处理用溶剂，将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液制成具有相当于107CFU、106CFU或105CFU的细菌计数的菌液，从而制备试验样品。将200μl各试样分散于各塑料管中。然后将样品在加热器块中在50℃下加热30分钟。接着，从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与实施例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)，接着评价。通过目视观察读取部中累积的标记物质的显色强度进行评价。显色强度目视评价为品红色的程度，分为5级：-(不着色)，±(微弱着色)，+(明显着色)，++(较明显着色)，和+++(显著着色)。评价结果示于表3。
表3
从表3的结果显而易见的是，在含吐温80的磷酸盐缓冲溶液用作溶剂和Middlebrook7H9液体培养基用作溶剂的两种情况中可检出被细胞外分泌的MPB64。因此，证实免疫学测定在溶剂组成的变化上没有差异。
实施例6(痰样品的检测)
将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液加入已证实结核感染阴性的痰中，从而制备具有相当于107CFU的细菌计数的假阳性痰样品。该样品分散于塑料管中。向这些痰样品的每一个等量添加N-乙酰基-L-半胱氨酸和氢氧化钠水溶液，并将混合物静置于室温15分钟以溶解样品。接着，将样品使用加热器块在50℃下加热处理30分钟。然后，从由此处理的各试样收集100μl等份，并以与实施例1相同的方式应用于TB(由TAUNS Laboratories,Inc.制造)，接着评价。对照痰样品除了静置于室温下30分钟而不加热处理以外，以与上述相同的方式处理，接着评价。目视观察读取部中累积的标记物质的显色强度来进行评价。显色强度目视评价为品红色的程度，分为5级：-(不着色)，±(微弱着色)，+(明显着色)，++(较明显着色)，和+++(显著着色)。评价结果示于表4。
表4
无加热处理 50℃加热处理
样品<1> - +
样品<2> - +
样品<3> -至± ++
样品<4> - +
结果，加热处理的样品证实在读取部明显地显示颜色，表明在样品中存在MPB64。相比之下，对照样品明显不同于加热处理样品，尽管某些样品在读取部显示微弱的颜色。因此，证实即使在痰样品中加热处理也促进MPB64分泌，表明结核菌群可迅速且简便地从生物样品中检出。
产业上的可利用性
本发明提供一种结核菌群的检测方法，其能够直接由含有结核菌群的生物样品在无培养操作下通过在预定温度下加热处理生物样品并免疫学测定由此被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质来快速简便地进行，还提供一种直接针对其的试剂盒。本发明不仅对于结核菌群的检测有用，而且还对结核的适当诊断和处理有用。

Claims (20)

1.一种结核菌群的检测方法，其包括使结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有所述结核菌群的生物样品进行加热处理而被细胞外分泌。
2.根据权利要求1所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理在40℃至60℃下进行。
3.根据权利要求2所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理在40℃至55℃下进行。
4.根据权利要求1至3任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理进行至少15分钟。
5.根据权利要求4所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理进行15分钟以上且2.5小时以下。
6.根据权利要求1至5任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品为选自由痰、支气管分泌物、胸膜积液、胃液、血液、脊髓液、尿液、排泄物、支气管灌洗液和收集自支气管或肺的组织组成的组的至少一种样品。
7.根据权利要求6所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品为痰。
8.根据权利要求1至7任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品在进行所述加热处理之前用样品处理剂溶解。
9.根据权利要求8所述的结核菌群的检测方法，其中用样品处理剂溶解的所述生物样品在进行所述加热处理之前分散或溶于溶剂中。
10.根据权利要求1至9任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为使用抗所述结核菌群特异的分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定。
11.根据权利要求10所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为免疫层析测定。
12.根据权利要求10所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为ELISA。
13.根据权利要求10至12任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述结核菌群特异的分泌蛋白质为MPB64或MPT64。
14.一种结核菌群检测用试剂盒，其至少包括使含有所述结核菌群的生物样品进行加热处理的处理容器，和用于检测通过所述加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免疫学测定装置。
15.根据权利要求14所述的结核菌群检测用试剂盒，其进一步包括样品处理剂和/或溶剂。
16.根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定为使用抗所述结核菌群特异的分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定。
17.根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定装置为免疫层析测定装置。
18.根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定装置为ELISA测定装置。
19.根据权利要求14至18任一项所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述结核菌群特异的分泌蛋白质为MPB64或MPT64。
20.一种用于细胞外分泌结核菌群特异的蛋白质的方法，其包括使含有所述结核菌群的生物样品进行加热处理。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108473931A (zh) * 2015-11-02 2018-08-31 拜奥法尔诊断有限责任公司 困难样品类型的样品制备
US10823730B2 (en) 2012-04-05 2020-11-03 Tauns Co., Ltd. Method and kit for immunological detection of Mycobacterium tuberculosis

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015164617A1 (en) * 2014-04-24 2015-10-29 Somalogic, Inc. Tuberculosis biomarkers in urine and uses thereof
RU2594063C1 (ru) * 2015-04-27 2016-08-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза" Способ диагностики микобактерий туберкулёза
PL233267B1 (pl) * 2017-10-16 2019-09-30 Politechnika Warszawska Sposób detekcji bakterii gruźlicy
JP6989428B2 (ja) * 2018-03-23 2022-01-05 アークレイ株式会社 前処理剤、前処理キット、抗原検査キット及び抗原検査方法
JP7352490B2 (ja) 2020-02-27 2023-09-28 京セラ株式会社 配線基板

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07110332A (ja) * 1993-10-12 1995-04-25 Tetsuo Tomiyama 結核菌の検査試薬及び検出方法
JP2002062299A (ja) * 2000-08-24 2002-02-28 Kyowa Medex Co Ltd 結核菌の検出方法及び試薬
JP2004166564A (ja) * 2002-11-19 2004-06-17 Bl:Kk モノクローナル抗体および結核症診断法
JP2006184295A (ja) * 2006-03-31 2006-07-13 Towns:Kk 結核菌検出用キット
JP2006234627A (ja) * 2005-02-25 2006-09-07 Chang Gung Univ 体液中の結核菌抗原を検出する方法
WO2009084481A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Bl Co., Ltd. 結核菌群の免疫検出法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3700049A1 (de) * 1987-01-02 1988-07-14 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zum immunologischen nachweis von mykobakterien im sputum sowie monoklonale antikoerper zur durchfuehrung des verfahrens
SE9600949D0 (sv) * 1996-03-12 1996-03-12 Stefan Svenson Method of diagnosing a mycobacterial disease and immunoassay kit
JP4269006B2 (ja) 1997-09-30 2009-05-27 株式会社ビーエル 結核菌検出法
CA2634968A1 (en) * 2005-12-26 2007-07-05 Bl Co., Ltd. Method for detection of virulent strain of influenza type-a virus
ES2887019T3 (es) 2012-04-05 2021-12-21 Tauns Co Ltd Procedimiento para secretar extracelularmente una proteína específica del complejo de mycobacterium tuberculosis

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07110332A (ja) * 1993-10-12 1995-04-25 Tetsuo Tomiyama 結核菌の検査試薬及び検出方法
JP2002062299A (ja) * 2000-08-24 2002-02-28 Kyowa Medex Co Ltd 結核菌の検出方法及び試薬
JP2004166564A (ja) * 2002-11-19 2004-06-17 Bl:Kk モノクローナル抗体および結核症診断法
JP2006234627A (ja) * 2005-02-25 2006-09-07 Chang Gung Univ 体液中の結核菌抗原を検出する方法
JP2006184295A (ja) * 2006-03-31 2006-07-13 Towns:Kk 結核菌検出用キット
WO2009084481A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Bl Co., Ltd. 結核菌群の免疫検出法
CN101925819A (zh) * 2007-12-28 2010-12-22 株式会社比尔生命 结核分歧杆菌复合群的免疫检出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNELIES VERBON: "Antigens in culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis: epitopes defined by monoclonal and human antibodies", 《JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY》 *
P ANDERSEN: "host response and antigens involved in protective immunity to mycobacterium tuberculosis", 《SCAND J.IMMUNOL.》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10823730B2 (en) 2012-04-05 2020-11-03 Tauns Co., Ltd. Method and kit for immunological detection of Mycobacterium tuberculosis
US10830769B2 (en) 2012-04-05 2020-11-10 Tauns Co., Ltd Method and kit for immunological detection of Mycobacterium tuberculosis
US10883988B2 (en) 2012-04-05 2021-01-05 Tauns Co., Ltd. Method and kit for immunological detection of Mycobacterium tuberculosis complex
CN108473931A (zh) * 2015-11-02 2018-08-31 拜奥法尔诊断有限责任公司 困难样品类型的样品制备
US11175205B2 (en) 2015-11-02 2021-11-16 Biofire Diagnostics, Llc Sample preparation for difficult sample types
CN108473931B (zh) * 2015-11-02 2022-07-19 拜奥法尔诊断有限责任公司 困难样品类型的样品制备

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