PL233267B1 - Sposób detekcji bakterii gruźlicy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób detekcji bakterii gruźlicy z wykorzystaniem metody powierzchniowego rezonansu plazmonowego.

Znane są różne metody detekcji zakażenia gruźlicą. Historycznie najstarszym, ale nadal stosowanym ze względu na dużą dokładność diagnostyczną, jest rozwiązanie polegające na wysianiu wymazu plwociny pacjenta na odpowiednią pożywkę bakteriologiczną, którą następnie umieszcza się w inkubatorze w warunkach umożliwiających wzrost bakterii gruźlicy. Metoda ta jest czasochłonna i wymaga od 2 do 4 tygodni w celu uzyskania rezultatu w postaci widocznych w pożywce rozwijających się kolonii bakterii. Nowszym rozwiązaniem są zautomatyzowane urządzenia do hodowli i wykorzystanie oznaczenia radiologicznego, tzw. test BACTEC, dzięki któremu czas analizy skraca się do od 1 do 3 tygodni [1]. Jest to wynalazek z lat 80. XX wieku, stosowany z pewnymi ulepszeniami do dziś [2] [3].

Innym rodzajem testów diagnostycznych są metody mikroskopowe. W przypadku klasycznej bakterioskopii do próbek śliny dodaje się barwnik Ziehl-Neelsena, po czym obserwuje się je pod mikroskopem. Oznaczenia tego typu wykonuje się szybciej niż w przypadku posiewów - wynik można otrzymać po ok. 24 godzinach [4]. Rozwinięciem tej metody jest mikroskopia fluorescencyjna. Barwniki fluorescencyjne zapewniają większą czułość, umożliwiają także, do pewnego stopnia, zautomatyzowanie procedury diagnostycznej [5] [6] [7]. Wadą metod bakterioskopowych jest generalnie niska czułość. Próbki plwociny badane tego typu metodami muszą zawierać 5 do 10 tys. jednostek tworzących kolonie bakterii gruźlicy w mililitrze próbki (cfu/ml), aby mogły być pozytywnie zdiagnozowane. Skutkuje to niską liczbą prawidłowo pozytywnie zdiagnozowanych pacjentów (około 50-60%, a niekiedy tylko 20-30% [5]).

Rozwój techniki PCR (polymerase chain reaction) umożliwił powstanie szybkich testów diagnostycznych opartych na detekcji specyficznych fragmentów DNA. Metody te można zautomatyzować i są najszybszymi z obecnie stosowanych. Polegają na poddaniu próbki warunkom, w których zachodzi liza komórek bakteryjnych. Następnie przeprowadza się namnażanie specyficznych fragmentów DNA, które poddaje się później identyfikacji. Najbardziej rozpowszechnione obecnie urządzenie Xpert® MTB/RIF firmy Cepheid do automatycznej analizy PCR jest w stanie wykonać analizę próbki w około 90 minut [8] [9].

Kolejną grupą metod detekcji bakterii gruźlicy są testy oparte na reakcji antygen-przeciwciało. Reakcja ta wykorzystuje powinowactwo specyficznych przeciwciał do antygenu, sekwencji DNA lub całego mikroorganizmu konkretnego gatunku lub nawet szczepu bakterii i jest np. stosowana do identyfikacji bakterii hodowanych w testach posiewowych [10]. Wykrywanie antygenów przy użyciu przeciwciał stosuje się w metodzie diagnozowania zakażenia gruźlicą u pacjentów będących nosicielami wirusa HIV [11]. Metody tego typu cechuje duża specyficzność i szybkość wykonania. Metody różnią się między sobą sposobem wywołania wyniku, najczęściej stosuje się przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe skoniugowane z enzymem lub reagentem reakcji enzymatycznej (tzw. test ELISA). Stosując odpowiednią procedurę wynik można odczytać w postaci reakcji barwnej.

Jedną z metod odczytu reakcji antygen-przeciwciało może być zastosowanie techniki powierzchniowego rezonansu plazm onowego (SPR). Jest to technika optyczna, która pozwala na wyznaczenie stężenia biomolekuł w niewielkiej odległości od metalicznej powierzchni poprzez pomiar zmian współczynnika załamania światła. W pomiarach wykorzystuje się płytkę szklaną pokrytą cienką warstwą złota lub srebra (sensor), będącą w kontakcie z roztworem zawierającym cząsteczki ulegające adsorpcji. Spolaryzowane światło laserowe pada na czujnik pod określonym kątem i oddziałuje z chmurami swobodnych elektronów na powierzchni metalu. Nawet ba rdzo niewielkie zmiany na powierzchni metalu, takie jak np. adsorpcja pojedynczych cząsteczek, powodują zmianę warunków rezonansu, co przejawia się przesunięciem kąta odbicia, dla którego rejestrowane jest tłumienie. Ta właściwość sprawia, że technika znajduje zastosowanie w pomiarach oddziaływań na poziomie molekularnym.

Przewagą techniki SPR nad innymi metodami odczytu wyniku jest możliwość bezpośredniej obserwacji oddziaływania poszukiwanego w próbce antygenu z przeciwciałem immobilizowanym na powierzchni czujnika bez konieczności stosowania, jak w przypadku innych metod immunochemicznych, dodatkowych etapów wywoływania odpowiedzi próbki. Pozwala to na znaczne skrócenie czasu analizy, ponieważ teoretycznie jedynym czynnikiem decydującym o czasie detekcji jest czas

PL 233 267 B1 zajścia reakcji antygen-przeciwciało. Technika SPR cechuje się ponadto wysoką czułością, specyficznością i szerokimi możliwościami zastosowania [12]. Podejście polegające na zastosowaniu techniki SPR zostało wykorzystane do wykrywania białka markerowego gruźlicy CFP-10 obecnego w filtratach kultur komórkowych M. tuberculosis, co może mieć zastosowanie w identyfikacji szczepów bakteryjnych w hodowlach. Dodatkowo, dla zwiększenia czułości analizy, detekcja była wzmacniana przez zastosowanie nanocząstek z tlenku niklu połączonych z przeciwciałem anty-CFP-10 [13].

Obecność antygenu CFP-10 była także oznaczana techniką SPR w tkankach pacjentów chorych na gruźlicę. Zgłoszenia patentowe nr CN102914520 i CN102914520 (A) ujawniają metodę identyfikacji zakażenia gruźlicą wykorzystującą detekcję białka CFP-10. W metodzie tej przygotowuje się sensory SPR z naniesionym na powierzchni przeciwciałem anty-CFP-10. Następnie podaje się na nie próbkę osocza krwi pacjenta, w którym może być obecne białko CFP-10 świadczące o zakażeniu bakterią. Należy podkreślić, że w metodzie tej wymagane jest przygotowanie próbki osocza krwi poprzez odwirowanie komórek (krwinek) z krwi pobranej od pacjenta przy użyciu urządzenia mechanicznego (wirówki). Oprócz tego, wykrywanym w metodzie analitem jest białko pochodzące od bakterii, które nie zawsze musi być obecne we krwi zakażonego pacjenta. Skuteczność diagnostyczna metod opartych na detekcji CFP-10 była kwestionowana [14], atesty wykorzystujące detekcję CFP-10 nie są jak dotąd stosowane w praktyce klinicznej.

Praca Ho i współpracowników opisuje zastosowanie techniki SPR w detekcji sekwencji nukleotydowej specyficznej dla bakterii M. tuberculosis. Autorzy pokazują w niej niską granicę detekcji bakteryjnego DNA sięgającą stężenia 115 ng/ml [15]. W metodzie tej wymagane jest uwolnienie materiału genetycznego bakterii z wnętrza komórek. Realizowane to może być przez enzymatyczne trawienie ścian komórkowych, sonikację lub wirowanie próbki zawierającej dane komórki. Próbkę zawierającą uwolnione DNA można następnie podać na sensor, na którym uprzednio zaimmobilizowano komplementarną sekwencję DNA. W przypadku złączenia się nici DNA z próbki z nicią zaimmobilizowaną na powierzchni sensora wygenerowany zostaje sygnał mierzalny metodą SPR.

W pracy Malhotra i współpracowników zademonstrowano jeszcze niższą granicę detekcji DNA M. tuberculosis (1 ng/ml) osiągniętą poprzez odpowiednie zmodyfikowanie odpowiedzialnego za detekcję fragmentu komplementarnej nici DNA [16].

Praca Lin i współpracowników przedstawia wykorzystanie matrycy SPR równocześnie badającej we krwi obecność dziewięciu antygenów, których obecność w osoczu może być skutkiem zakażenia bakterią gruźlicy [17]. W przypadku tej metody również wymagane jest odwirowanie komórek krwi przed wykonaniem badania próbki pobranej od pacjenta.

Opisane powyżej metody diagnostyczne wykorzystujące technikę detekcji opartą na zjawisku powierzchniowego rezonansu plazmonowego cechuje stosowanie aparatury obsługiwanej przez wykwalifikowany personel, w miejscu o odpowiednim zapleczu aparatury pomocniczej, takiej jak wirówki, sonikatory (w laboratoriach diagnostycznych). Aparatura jest skonstruowana w sposób uniemożliwiający jej łatwe przenoszenie, czy stosowanie w warunkach bez dostępu do sieci elektrycznej. Stosowane obecnie, najczulsze i najszybsze, immunochemiczne metody oznaczania obecności bakterii gruźlicy w krwi lub plwocinie pacjenta polegają na wykrywaniu markerowych antygenów bakteryjnych (DNA, białka błonowe, lipidy bakteryjne). Z tego powodu każda metoda tego typu musi obejmować dodatkowy, co najmniej jeden etap przygotowania próbki, mający na celu uwolnienie z wnętrza komórek bakteryjnych ich kwasów nukleinowych, białek błonowych itd. realizowany przy użyciu takich technik jak sonikacja, wirowanie, trawienie enzymatyczne itp.

Pożądana byłaby metoda detekcji oparta na reakcji immunochemicznej, niewymagająca takiego etapu przygotowania próbki. Metoda taka uprościłaby etap przygotowania próbki do analizy i przez to skróciła czas, a także zmniejszyła koszt wykonania całej analizy. Co więcej, uproszczenie wykonania analizy automatycznie umożliwiłoby uproszczenie konstrukcji aparatury, co prowadziłoby do możliwości jej zminiaturyzowania, a także zautomatyzowania całego procesu analizy. Rozwiązałoby to problem konieczności posiadania bogatego zaplecza techniczno-laboratoryjnego wymaganego obecnie do przeprowadzania detekcji bakterii gruźlicy. Ten problem został rozwiązany dzięki metodzie według wynalazku.

Sposób detekcji bakterii gruźlicy u pacjentów z aktywną gruźlicą płuc, metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, w której wykorzystuje się reakcję antygen-przeciwciało, z zastosowaniem co najmniej jednego połączonego z układem kontrolnym sensora z naniesionym na powierzchnię przeciwciałem, według wynalazku charakteryzuje się tym, że w próbce plwociny w buforze uwadniającym, o objętości od 0,5 do 2 ml, oznacza się obecność całych, żywych i aktywnych

PL 233 267 B1 bakterii Mycobacterium tuberculosis metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, w której jako przeciwciało stosuje się anty-MPT64 albo anty-Mycobacterium bovis, przy czym próbka jest podawana do urządzenia metodą przepływową z natężeniem przepływu od 0,2 do 1 ml/min, czas kontaktu próbki z powierzchnią sensora wynosi od 30 s do 10 min, a czas płukania powi erzchni sensora wynosi od 5 min do 30 min.

Korzystnie bufor uwadniający plwocinę zawiera N-acetylo-L-cysteinę i wodorotlenek sodu (bufor NALC-NaOH).

Korzystnie próbkę plwociny podaje się z natężeniem przepływu od 0,25 do 0,5 ml/min, bardziej korzystnie 0,3 ml/min.

Sposób według wynalazku pozwala na oznaczenie obecności całych, żywych i aktywnych bakterii Mycobacterium tuberculosis, z wykorzystaniem zjawiska powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Uzyskano to poprzez dobór odpowiednich przeciwciał odp owiedzialnych za reakcję antygen-przeciwciało (anty-MPT64 i anty-Mycobacterium bovis)). Dzięki zastosowaniu tych rodzajów przeciwciał, reagujących na białko powierzchniowe bakterii M. tuberculosis w jego natywnej formie, możliwe stało się przeprowadzenie r eakcji antygen-przeciwciało z całą bakterią, zamiast, jak do tej pory w innych metodach detekcji gruźlicy SPR, z samymi białkami bądź innymi składnikami wnętrza komórki bakteryjnej. Realizację sposobu umożliwił także dobór parametrów metody analitycznej, takich jak czas płukania powierzchni sensora, czas kontaktu próbki z powierzchnią sensora. Istotne jest także zastosowanie układu przepływowego do transportu uwodnionej plwociny.

Sposób według wynalazku można zrealizować w urządzeniu do powierzchniowego rez onansu plazmonowego, w którym zastosowano układ przepływowy, pompę perystaltyczną i przewody o odpowiednich średnicach, co najmniej 100 gm, korzystnie 200-500 gm. Zazwyczaj w urządzeniach SPR stosowane są węższe przewody, o średnicy mniejszej niż 100 gm, w celu minimalizacji objętości martwej urządzenia, zminimalizowania potrzebnej do oznaczenia objętości próbki, a dzięki temu zwiększenia czułości urządzenia. W takim przypadku, aby uniknąć zapchania się przewodów urządzenia, próbki nie mogą być podawane do urządzenia bez uprzedniego przefiltrowania filtrem o wielkości porów np. 0,4 gm. Taka filtracja pozbawia próbkę wszelkich bakterii, co oczywiście uniemożliwia ich detekcję. Pompa perystaltyczna w konstrukcji urządzenia została zastosowana w celu umożliwienia wykrywania bakterii, gdyż nie powoduje wytwarzania w transportowanym płynie tak dużych naprężeń ścinających jak np. pompy wirowe i nie naraża bakterii na działanie pola elektrycznego, jak w przypadku pomp elektroosmotycznych, które często są stosowane w mikroukładowych systemach pomiarowych. To sprawia, że bakterie znajdujące się w próbce nie zostają zniszczone przez transportującą próbkę pompę.

Sposób według wynalazku pozwala na stosowanie urządzenia prostego w obsłudze, przez co rozumie się możliwość automatycznego przeprowadzenia analizy próbki, a także możliwość łatwego przenoszenia urządzenia oraz możliwość pracy w miejscach pozbawionych zaplecza sanitarnego i aparaturowo technicznego, np. bez dostępu do sieci elektrycznej i wodociągowej. Odróżnia się zatem od innych urządzeń detekcyjnych wykorzystujących technikę SPR, które są projektowane do pracy stacjonarnej w laboratoriach standardowym wyposażeniu pomocniczym. Urządzenia te projektuje się w ten sposób, gdyż zazwyczaj technika SPR służy do uzyskiw ania bardzo niskich granic detekcji analitów (rzędu cząsteczki na miliard i niższych), z tego powodu stosowane muszą być bardzo precyzyjnie działające komponenty urządzenia, a pomiary muszą być wykonywane w środowisku odizolowanym od czynników zewnętrznych, takich jak wahania temperatury, wilgotności, czy drgania aparatury. Sposób według wynalazku wymaga granicy detekcji dla oznaczania bakterii, która jest stosunkowo wysoka (około 1000-10000 jednostek tworzących kolonię/ml próbki), dzięki czemu można zastosować mniejsze, mniej precyzyjne komponenty (pompę, zawór, układ przepływowy) kosztem mniejszej czułości, ale zyskując prostszą konstrukcję i zmniejszone rozmiary całego urządzenia.

Dodatkowo, zastosowana metoda znacznie upraszcza analizę powodując, że jest ona łatwa do zautomatyzowania. Prostota wykonania sprawia, że do obsługi urządzenia nie potrzeba wykwalifikowanego personelu. Umożliwia to także miniaturyzację sprzętu do rozmiarów urządzenia przenośnego. Wszystkie wymienione cechy urządzenia umożliwiają zastosowanie go w środowisku, gdzie diagnostyka gruźlicy nie była do tej pory rutynowo wykonywana, czyli bezpośrednio w terenie, miejscach zgrupowań ludności, czy placówkach ochrony zdrowia bez względu na standardy posiadanej aparatury.

PL 233 267 B1

Sposób według wynalazku bardziej szczegółowo realizuje się tak, że na powierzchni sensora SPR immobilizuje się przeciwciała specyficzne wobec bakterii gruźlicy. Można tu stosować dowolne, znane sensory SPR. Przykładowo, można stosować sensory posiadające dwukanałową powierzchnię czułą pokrytą złotem. Na tej powierzchni immobilizuje się przeciwciała za pomocą metod dobrze znanych w chemii. Na przykład, do powierzchni złota przyłącza się związek pośredniczący zdolny do reakcji z metalicznym złotem, posiadający wolną grupę karboksylową, aminową lub inną, na przykład kwas tioglikolowy, kwas merkaptopropionowy, tiolowany, karboksylowany glikol polietylenowy (HS-PEG-COOH), cystaminę, tiolowany, aminowany glikol polietylenowy (HS-PEG-NH2) itp. Związek ten generalnie musi posiadać grupę tiolową (do połączenia ze złotem) oraz co najmniej jedną dodatkową grupę funkcyjną, zdolną do reakcji z przeciwciałem. Następnie do tak zmodyfikowanej powierzchni przyłącza się specyficzne przeciwciało metodą odpowiednią dla dostępnej reaktywnej grupy funkcyjnej obecnej na powierzchni sensora. Na przykład, wytworzenie wiązań amidowych znaną metodą sprzęgania amin z wykorzystaniem karbodiimidów lub inną. Możliwe jest zastosowanie sensorów SPR wstępnie zmodyfikowanych przez producenta, posiadających powierzchnię pokrytą związkiem bogatym w grupy karboksylowe lub aminowe. W takim wypadku sensor modyfikuje się od razu poprzez przyłączenie przeciwciała.

Istotnym jest przyłączenie przeciwciała do tylko jednego z dwóch kanałów pomiarowych sensora. Można to zrealizować poprzez umieszczenie sensora w dwukanałowym układzie przepływowym, mogącym rozdzielić strumienie cieczy dochodzącej do sensora na poszczególne kanały i podając roztwór przeciwciała tylko na jeden z nich. Opcjonalnie roztwór przeciwciała można precyzyjnie nakropić przy użyciu strzykawki dokładnie na połowę powierzchni czułej sensora.

Procedura modyfikacji zawsze musi być zakończona zablokowaniem nieprzereagowanych grup funkcyjnych np. poprzez zastosowanie roztworu niespecyficznego białka, lub, w odpowiednim przypadku, związku o wysokim powinowactwie do aktywowanych grup karboksylowych np. etanoloaminy.

Przykładowe urządzenie do realizacji sposobu według wynalazku w schemacie ideowym zostało przedstawione na Fig. 1.

Przykładowe urządzenie do realizacji sposobu według wynalazku jest zbudowane z następujących elementów: jednostki sterującej 1, pompy 2, zaworu 3, zbiornika na próbkę 4, zbiornika na bufor płuczący 5, celki przepływowej połączonej z sensorem SPR 6. Pracą urządzenia steruje jednostka sterująca 1, która realizując program pomiaru uruchamia pompę 2, oraz przestawia zawór 3 w taki sposób, aby pompa zaciągała ciecz znajdującą się w zbiorniku na próbkę 4 lub bufor płuczący 5. Pompa kieruje odpowiednią ciecz na celkę pomiarową z sensorem 6, po czym c iecz trafia do wylotu urządzenia 7. Jednostka sterująca oprócz sterowania pracą pompy 2 i zaworu 3 jest odpowiedzialna za kontrolę parametrów pracy sensora oraz odczyt danych zebranych przez sensor i przekazuje te dane do wyjścia urządzenia 8, które może być połączone z zewnętrznym urządzeniem elektronicznym, np. komputerem.

Przykładowym sensorem wykorzystanym w urządzeniu do realizacji wynalazku jest sensor SPR Spreeta 2000. Źródłem światła jest dioda LED wbudowana w sensor, a pomiar jest realizowany poprzez rejestrowanie intensywności światła odbitego przez powierzchnię czułą przy pomocy wbudowanego w sensor liniowego detektora CCD. Wynikiem pojedynczego pomiaru jest w uproszczeniu numer piksela detektora CCD, na który pada światło o najniższej intensywnoś ci. Zmiana tego numeru oznacza przesunięcie kąta światła najsilniej absorbowanego przez powierzchnię, a zatem zmianę właściwości powierzchni czułej sensora, co może oznaczać przyłączenie do jej powierzchni poszukiwanego antygenu. Wynik analizy jest zatem różnicą wyników pomiarów przed i po podaniu na powierzchnię sensora badanej próbki i jest podawany w postaci bezjednostkowej. Dzięki temu, że sensory są dwukanałowe, pojedynczy sensor posiadać może kanał pomiarowy i kanał odniesienia, co oznacza, że pojedynczy sensor wystarczy do przeprowadzenia analizy pod kątem obecności pojedynczego antygenu.

Sensor jest także podłączony do płyty elektronicznej urządzenia, która steruje jego pracą i odczytuje wyniki pomiarów. Układ elektroniczny urządzenia jest poza tym o dpowiedzialny za kontrolę pracy układu przepływowego dostarczającego próbkę i bufor płuczący do powierzchni sensora (steruje pracą pompy i zaworu). Urządzenie może obsługiwać układ przepływowy z podłączonym pojedynczym sensorem lub układy łączące do ośmiu sensorów w sposób szeregowy lub równoległy. Umożliwia to badanie próbek pod kątem na przykład identyfikacji konkretnego szczepu bakterii gruźlicy lub badanie wielu próbek jednocześnie. Układ elektroniczny posiada wbudowane oprogra

PL 233 267 B1 mowanie pozwalające na zaprogramowanie wykonania całkowicie automatycznej procedury analitycznej, może wykonać samodzielnie operacje matematyczne potrzebne do wykonania analizy próbki i podać użytkownikowi gotowy wynik analizy, może też przesłać surowe dane zebrane z sensora(ów) za pośrednictwem wbudowanego interfejsu do zewnętrznego komputera. Urządzenie może być opcjonalnie wyposażone w układ do kontroli temperatury wewnątrz urządzenia. Przykładowym układem jest układ oparty na modułach Peltiera służący do ogrzewania lub chłodzenia wnętrza urządzenia.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładzie.

P r z y k ł a d

Przygotowanie urządzenia do pracy

Przed wykonaniem analizy urządzenie należy zaopatrzyć w bufor płuczący. Umieszcza się go w zbiorniku na bufor 5. Zadaniem buforu jest wstępne zwilżenie powierzchni sensora pozwalające na zmierzenie sygnału bazowego oraz płukanie powierzchni sensora po kontakcie z próbką pozwalające na zmierzenie sygnału od próbki.

Do urządzenia należy podłączyć sensor, np. sensor Spreeta 2000 z zaimmobilizowanym przeciwciałem anty-MPT64 lub anty-Mycobacterium bovis. Sensor należy połączyć z układem elektronicznym oraz z celką przepływową połączoną z układem przepływowym 6. Tak przygotowane urządzenie jest już gotowe do pomiaru próbki.

Procedura pomiarowa.

Próbkę plwociny pacjenta umieszcza się w zbiorniku na próbkę 4. Konstrukcja urządzenia nie musi zawierać oddzielnego zbiornika na próbkę, podanie próbki może zostać zrealizowane przez zanurzenie wężyka doprowadzającego próbkę w dowolnym naczyniu zawierającym próbkę, nastrzyknięcie próbki strzykawką itp. Próbka plwociny jest uprzednio upłynniona przy użyciu protokołu NAlc-NaOH, znanego w praktyce laboratoriów diagnostycznych. Należy upewnić się, że do urządzenia podłączony jest sensor i urządzenie ma dostęp do buforu płuczącego. Sensor w momencie podłączenia powinien być suchy (celka przepływowa nie powinna zawierać płynu), lub istnieje możliwość osuszenia go z wykorzystaniem układu przepływowego poprzez przepuszczenie nad jego powierzchnią suchego powietrza. Ustalić sygnał bazowy każdego kanału pomiarowego czujnika (zarówno zmodyfikowanego przeciwciałami jak i niezmodyfikowanego) ustawiając właściwości prądu czujnika tak, aby mierzone sygnały znajdowały się w zakresie dynamicznym czujnika. Konkretnie, czas trwania impulsu prądowego dostarczanego do diody LED w cyklu pomiarowym powinien wynosić od 50 do 700 ps, korzystnie 400 ps. Wartość parametru określającego natężenie prądu przepływającego przez diodę, określanego w dokumentacji technicznej czujnika Spreeta2000 symbolem DAC powinna wynosić od 550 do 700, korzystnie 640. Domyślnym korzystnym ustawieniem, przy którym czujnik odczytuje pomiary w optimum zakresu dynamicznego jest czas impulsu równy 400 ps i DAC równy 640. Przed rozpoczęciem pomiaru należy jednak sprawdzić, czy przy takich ustawieniach każdy z kanałów czujnika wykazuje odpowiedź w postaci wyraźnego sensogramu o płaskim przebiegu (bez tzw. dipu SPR - obecność dipu oznaczać może niedostateczne osuszenie powierzchni czujnika). I w razie potrzeby dostroić ustawienia prądu podawanego na czujnik w podanych wyżej granicach. Osoba biegła w technice bez problemu rozpozna prawidłowy przebieg krzywej kalibracyjnej sensora. Przy użyciu technik numerycznych można również zaprogramować procedurę automatycznego dostrajania czujnika, np. przyjmując zadaną średnią wartość odpowiedzi SPR do której algorytm będzie miał dostosować parametry prądu dostarczanego do czujnika.

Wykonanie oznaczenia

Na początku należy wykonać przepłukanie powierzchni sensora od 0,5 ml do 10 ml, korzystnie 1 ml roztworu buforowego o pH znajdującym się w zakresie wartości 5,5-8, korzystnie 6-7, na przykład buforem fosforanowym lub buforem HEPES, zawierającym dodatek detergentu o stężeniu od 0,02% do 0,5%, na przykład 0,1% detergentu Tween 20 lub 0,1% dodecylosiarczanu sodu; z natężeniem przepływu od 0,2 do 1 ml/ min, korzystnie od 0,25 do 0,5 ml/ min, bardziej korzystnie 0,45 ml/min.

Następnie wykonuje się pomiar sygnału odniesienia (czyli odpowiedzi obu kanałów sensora na sam bufor).

Kolejny etap to podanie na powierzchnię sensora próbki uwodnionej plwociny o minimalnej objętości od 0,5 do 2 ml, korzystnie minimum 1 ml, z natężeniem przepływu od 0,2 do 1 ml/min, korzystnie od 0,25 do 0,5 ml/min, bardziej korzystnie 0,3 ml/min. W tym etapie zachodzi reakcja antygen-przeciwciało pomiędzy składnikami próbki (bakteriami, jeżeli są obecne), a przeciwciałem zaimmobilizowanym

PL 233 267 B1 na jednym z kanałów sensora. Zachodzi też niespecyficzna adsorpcja składników próbki do obu kanałów - zarówno pomiarowego jak i odniesienia. Dlatego bezpośrednio po tym etapie nie wykonuje się zmierzenia sygnału, a wykonuje się płukanie sensora.

Istotne w procedurze są czasy kontaktu buforu i próbki z powierzchnią sensora - czas kontaktu z próbką wynosi 5 minut, a czas kontaktu z buforem wynosi 10 minut.

W następnym etapie wykonuje się przepłukanie powierzchni sensora od 0,5 ml do 10 ml roztworu buforowego o pH znajdującym się w zakresie wartości 5,5-8, korzystnie 6-7, na przykład bufor fosforanowy lub bufor HEPES, zawierającym dodatek detergentu o stężeniu od 0,02% do 0,5%, na przykład 0,1% detergentu Tween 20 lub 0,1% dodecylosiarczanu sodu; przy przepływie od 0,2 do 1 ml/min; z natężeniem przepływu od 0,2 do 1 ml/min, korzystnie od 0,25 do 0,5 ml/ min, bardziej korzystnie 0,45 ml/min. Etap ten ma na celu wypłukanie niespecyficznie zaabsorbowanych składników próbki z obu kanałów sensora.

Następnie mierzy się sygnał odpowiedzi obu kanałów sensora po przepłukaniu buforem. Wykonanie obliczeń wyniku.

Wyniki wykonanych pomiarów (dane surowe) można wykorzystać do ręcznej analizy próbki, albo zaprogramować w urządzeniu automatyczną procedurę analizy. W skrócie procedura wygląda następująco. Poszczególne serie pomiarów dla obu kanałów uśrednia się, odrzucając wyniki odbiegające od średniej np. o więcej niż trzykrotna wartość odchylenia standardowego. Następnie oblicza się wyniki analizy na przykład w sposób następujący:

W=|(P0b-P1b)|-|(P0p-P1p)|

Gdzie:

W - wynik analizy

P0 - pomiar na kanale odniesienia (bez przeciwciał)

P1 - pomiar na kanale pomiarowym (z przeciwciałem)

Pb - pomiar po podaniu buforu przed podaniem próbki

Pp - pomiar po podaniu próbki i przepłukaniu buforem || - wartość bezwzględna (moduł)

Wynik diagnozy obecności bakterii w próbce ustala się jako pozytywny (+) lub negatywny (-) w następujący sposób:

Jeżeli W > przyjęta wartość progowa, wynik diagnozy = (+)

W innym przypadku wynik diagnozy = (-)

W opisany w przykładzie sposób zbadano pod kątem wykrywania gruźlicy na bakteriach M ycobacterium tuberculosis z hodowli in vitro oraz na próbkach plwociny od pacjentów niezależnie pozytywnie zdiagnozowanych na obecność w ślinie prątków gruźlicy przy użyciu standardowych metod posiewowych. Do badania bakterii z hodowli in vitro zastosowano sensory z przeciwciałami anty-MPT64 oraz anty-M. bovis. Do badania próbek od pacjentów zastosowano sensory z przeciwciałem anty-MPT64. Wyniki od pacjentów zarażonych zestawiono z próbą kontrolną zawierającą sam bufor do uwadniania próbek śliny. Badano próbki o znanych zawartościach bakterii, mieszczących się w przedziale od 1,5 cfu/ml do 1,5x10⁶ cfu/ml (cfu - jednostki tworzące kolonie).

Wyniki przedstawiono w postaci wykresów zależności odpowiedzi urządzenia na stężenie bakterii w podanej próbce.

Na Fig. 2 przedstawiono odpowiedź detektora bakterii gruźlicy na podawane próbki zawierające bakterie M. tuberculosis, o wzrastającym stężeniu. Sensor czuły na antygen Anty-MPT64.

Na Fig. 3 przedstawiono odpowiedź detektora bakterii gruźlicy na podawane próbki zawierające bakterie M. tuberculosis, o wzrastającym stężeniu. Sensor czuły na antygen Anty-M. Bovis.

Na Fig. 4 przedstawiono odpowiedź detektora bakterii gruźlicy na podawane próbki śliny zawierające bakterie M. tuberculosis. Sensor czuły na antygen Anty-MPT6 4.

PL 233 267 Β1

Literatura [1] M. A. Morgan, C. D. Horstmeier, D. R. DeYoung, and G. D. Roberts, “Comparison of a radiometrie method (BACTEC) and conventional culture media for recovery of mycobacteria from smear-negative specimens.,” J. Clin. Microbiol., vol. 18, no. 2, pp. 384-8, Aug. 1983.

[2] G. E. Pfyffer, Η. M. Welscher, P. Kissling, C. Cieślak, M. J. Casal, J. Gutierrez, and S. Rusch-Gerdes, “Comparison ofthe Mycobacteria Growth Indicator Tubę (MGIT) with radiometrie and solid culture for recovery of acid-fast bacilli.J. Clin. Microbiol., vol. 35, no. 2, pp. 364-8, Feb. 1997.

[3] “BD (Becton, Dickinson and Company) - Diagnostic Systems: BD BACTEC™ Instrumented Mycobacterial Growth Systems.” [Online], Available: http://www.bd.com/ds/productCenter/MT-Bactec.asp.

[4] K. Siddigi, M.-L. Lambert, J. Walley, and R. O’Brien, “Clinical diagnosis of smearnegative pulmonary tuberculosis in low-income countries: the current evidence.,” Lancet. Infect. Dis., vol. 3, no. 5, pp. 288-96, May 2003.

[5] L. G. Lehman, A. L. Ngapmen Yamadji, F. Ngo Sack, and C. F. Bilong Bilong, “The CyScope® fluorescence microscope, a reliable tool for tuberculosis diagnosis in resource-limited settings.,” Am. J. Trop. Med. Hyg., vol. 83, no. 4, pp. 906-8, Oct. 2010.

[6] “CellScope - UC Berkeley.” [Online], Available: http://cellscope.berkeley.edu/.

[7] J. Chang, P. Arbelaez, N. Switz, C. Reber, A. Tapley, J. L. Davis, A. Cattamanchi, D. Fletcher, and J. Malik, “Automated tuberculosis diagnosis using fluorescence images from a mobile microscope.,Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv., vol. 15, no. Pt 3, pp. 345-52, 2012.

[8] “Cepheid | Xpert MTB/RIF.” [Online], Available: http://www.cepheid.com/us/cepheidsolutions/clinical-ivd-tests/critical-infectious-diseases/xpert-mtb-rif.

[9] C. C. Boehme, P. Nabeta, D. Hillemann, Μ. P. Nicol, S. Shenai, F. Krapp, J. Allen, R. Tahirli, R. Blakemore, R. Rustomjee, A. Milovic, M. Jones, S. M. O’Brien, D. H. Persing, S. Ruesch-Gerdes, E. Gotuzzo, C. Rodrigues, D. Alland, and M. D. Perkins, “Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance,” N. Engl. J. Med., vol. 363, no. 11, pp. 1005-1015, Sep. 2010.

[10] J. Arora, G. Kumar, A. K. Verma, M. Bhalla, R. Sarin, and V. P. Myneedu, “Utility of MPT64 Antigen Detection for Rapid Confirmation of Mycobacterium tuberculosis Complex.,” J. Glob. Infect. Dis., vol. 7, no. 2, pp. 66-9, 2015.

[11] “Alere Determine TB LAM Ag - Alere.” [Online], Available:

htt p ://www. a le re. co m/e n/h o m e/prod u ct-d eta i Is/d ete rm i n e-t b- la m. htm I.

[12] J. Homola, “Surface plasmon resonance sensors for detection of chemical and biological species.,” Chem. Rev., vol. 108, no. 2, pp. 462-93, Feb. 2008.

[13] H. Chen, F. Liu, K. Koh, J. Lee, Z. Ye, T. Yin, and L. Sun, “Sensitive detection of tuberculosis using nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance,” Microchim. Acta, vol. 180, no. 5-6, pp. 431-436, 2013.

[14] N. C. Gey van Pittius, R. M. Warren, and P. D. van Helden, “ESAT-6 and CFP-10: what isthe diagnosis?,” Infect. Immun., vol. 70, no. 11, p. 6509-10; author reply 6511, Nov. 2002.

[15] S. H. Hsu, Y. Y. Lin, S. H. Lu, F F. Tsai, Y. T. Lu, and Η. T. Ho, “Mycobacterium tuberculosis DNA Detection Using Surface Plasmon Resonance Modulated by Telecommunication Wavelength,” Sensors (Basel), vol. 14, no. 1, pp. 458-467, 2013.

[16] N. Prabhakar, K. Arora, S. K. Arya, P. R. Solanki, M. Iwamoto, H. Singh, and B. D. Malhotra, “Nucleic acid sensor for M. tuberculosis detection based on surface plasmon resonance,” Analyst, vol. 133, no. 11, p. 1587, 2008.

[17] S.-C. Hsieh, C.-C. Chang, C.-C. Lu, C.-F. Wei, C.-S. Lin, H.-C. Lai, and C.-W. Lin, “Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis infection by a new array formatbased surface plasmon resonance method,” Nanoscale Res. Lett., vol. 7, no. 1, p. 180, 2012.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób detekcji bakterii gruźlicy u pacjentów z aktywną gruźlicą płuc, metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, w której wykorzystuje się reakcję antygen-przeciwciało, z zastosowaniem co najmniej jednego połączonego z układem kontrolnym sensora z naniesionym na powierzchnię przeciwciałem, znamienny tym, że w próbce plwociny w buforze uwadniającym, o objętości od 0,5 do 2 ml, oznacza się obecność całych, żywych i aktywnych bakterii Mycobacterium tuberculosis metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, w której jako przeciwciało stosuje się anty-MPT64 albo anty-Mycobacterium bovis, przy czym próbka jest podawana do urządzenia do powierzchniowego rezonansu plazmonowego metodą przepływową z natężeniem przepływu od 0,2 do 1 ml/min, czas kontaktu próbki z powierzchnią sensora wynosi od 30 s do 10 min, a czas płukania powierzchni sensora wynosi od 5 min do 30 min.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bufor uwadniający plwocinę zawiera N-acetylo-L-cysteinę i wodorotlenek sodu (bufor NALC-NaOH).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę plwociny podaje się z natężeniem przepływu od 0,25 do 0,5 ml/ min, bardziej korzystnie 0,3 ml/min.