CN103834716B - 一种电子烟烟液体外细胞毒性wst-1测试方法 - Google Patents

Abstract

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞培养，3）细胞接种，4）电子烟烟液染毒，5）WST-1染色，6）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法；通过细胞接种密度的优化步骤，通过WST-1染液反应时间的优化提高检测灵敏度；通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线；WST-1染色减少了多次洗涤细胞的试验步骤，本测定方法还具有操作更快速简便、灵敏性更高、结果更稳定的优点。

Description

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法

技术领域

本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于WST-1（一种水溶性四唑盐）染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。

背景技术

随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价。但由于MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生产的蓝紫色结晶物需加入二甲亚砜溶解后方能比色检测，操作步骤繁琐，易对实验结果造成影响。而WST-1（一种水溶性四唑盐）染料是一种广泛应用于细胞增殖和细胞存活率的快速高灵敏度检测试剂，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。WST-1产生的甲臜是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤，同时WST-1染料稳定性强，其颜色反应时线性范围宽，灵敏度高，且对细胞无明显毒性。

电子烟烟液是由烟碱、保润剂、香料等多种物质组成的复杂体系，且毒性较低，在进行电子烟烟液的细胞毒性评价时，需要灵敏度高、快速、简便的试验方法。

目前，使用WST-1法评价电子烟烟液的细胞毒性还未见文献报道，亟需建立基于WST-1染料的电子烟烟液细胞毒性评价方法，考察市售电子烟产品的细胞毒性。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，并基于WST-1染料颜色反应的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点，建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法。具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）溶液的制备：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2mM，青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

（2）电子烟烟液染毒溶液：

由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到。

（3）WST-1染液：-20℃保存，临用前37℃温育融化，避免发生沉淀。

（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），使用去离子水配制1mg/ml储备液，使用时使用细胞培养基，稀释至最终染毒浓度200μg/ml。

2）细胞样本的处理：

（1）细胞培养：本方法适用于贴壁细胞，包括人肺癌细胞A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞。由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化。通过观察细胞生长状态筛选适用的细胞培养基。通过大量实验，最终筛选出对两种细胞株均适用的细胞培养基：以1640培养基为溶剂，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2mM，青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用胰蛋白酶消化法进行细胞接种；

（2）细胞接种：向96孔板中（除最外周36个孔）分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。

（3）电子烟烟液染毒：细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、电子烟烟液染毒组和阳性对照组处理。空白对照组每孔加入100μl细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，电子烟烟液最佳染毒浓度为10mg/ml~100mg/ml，应设置不少于7个非零染毒浓度。96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔加入细胞培养基作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37℃、5%CO₂条件下培养24h。

（4）WST-1染色：电子烟烟液染毒24h后，每孔加入10μl经温育的WST-1染液，置于37℃、5%CO₂条件下孵育2h。孵育完成后室温下快速振荡1min，使用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值A₄₅₀。

（5）结果与分析：

吸光值A：A=A_450nm

A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值

A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值

A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值

A(阳性对照)=6个平行孔的吸光度平均值

细胞存活率（%）=（A_染毒组-A_{染毒溶液背景}）/（A_{空白对照组}-A_{培养基背景}）

注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_阳性对照应小于等于0.3。

电子烟抽吸时，烟气与肺部细胞直接接触，因此本发明中选择A549细胞和BEAS-2B细胞进行细胞毒性评价。在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，向96孔板中分别接种含有不同细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。然后每孔加入10μl经温育的WST-1染液，至于37℃、5%CO₂条件下孵育。孵育完成后室温下快速振荡1min，使用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值A450。选择细胞处于指数增长期的细胞个数作为最佳接种密度。图1所示为A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞的接种密度优化曲线，由图1可知，当A549细胞的接种密度等于或大于20000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为10000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，适合染毒。因此，A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔。对于BEAS-2B细胞，接种密度等于或大于40000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为20000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，适合染毒。因此，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。

本发明中对WST-1染液的孵育时间进行了优化，图2所示为A549细胞用不同浓度电子烟烟液样品A染毒24h后，每孔加入10μl经温育的WST-1染液，置于37℃、5%CO2条件下分别孵育0.5h，1h，2h，4h后，使用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值A₄₅₀所检测到的吸光度。如图2可知，当WST-1染液染毒时间为0.5h和1h时，检测的吸光度值低且无剂量效应关系，当WST-1染液孵育时间为2h时，染毒浓度与检测信号有较好的剂量效应关系。而当孵育时间为4h时，虽然检测吸光度值增加，但剂量效应关系变差，因此选择WST-1染液的孵育时间为2h。

为准确评价电子烟烟液的细胞毒性，本发明中对电子烟烟液的染毒浓度进行了优化，图3所示为A549细胞分别用5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，80mg/ml，100mg/ml的电子烟样品1烟液染毒所得到的剂量效应曲线，如图3可知，当染毒浓度为10mg/ml-100mg/ml时，可得到很好的剂量效应曲线，因此考察电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含10mg/ml-100mg/ml范围。

本发明根据电子烟烟液的特性，建立了一种基于WST-1染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法，本发明具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过细胞接种密度的优化步骤，本发明可适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察电子烟烟液对肺部不同细胞系的细胞毒性。（3）通过WST-1染液反应时间的优化提高检测灵敏度。（4）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

附图说明

图1.细胞接种密度优化。

图2.WST-1不同孵育时间下电子烟烟液细胞毒性的剂量-效应关系曲线。

图3.电子烟品牌1烟液的细胞毒性的剂量-效应关系曲线。

图4.电子烟样品2烟液的细胞毒性的剂量-效应关系曲线。

具体实施方式

本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。

为考察电子烟样品2烟液染毒对A549细胞的细胞毒性。将A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37℃，5％C02培养箱中培养,当细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种，制备细胞悬液（1×10⁵个/ml）。96孔板的每孔（除最外周36个孔）加入100μl细胞悬液，接种密度为10000个/孔，于37℃、5%CO₂条件下培养24h。最外周36个孔中，选择6孔加入100μl细胞培养基作为培养基对照，6孔加入100μl最高染毒溶液作为染毒背景对照。细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、8个不同剂量（5，10，20，30，40，50，60，80，100mg/ml）的电子烟烟液染毒组和阳性对照处理组。每组分别加入100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒溶液或阳性对照，于37℃、5%CO₂条件下培养24h。然后每孔加入10μl经温育的WST-1染液，细胞于37℃、5%CO₂条件下孵育2h。孵育完成后室温下快速振荡1min，使用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值。所得结果如图4所示，电子烟烟液染毒浓度与WST-1检测吸光度值有很好的剂量效应关系，可通过公式计算IC50值。

Claims (1)

1.一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）溶液的制备：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2mM，青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；

（2）电子烟烟液染毒溶液：

用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；

（3）WST-1染液：-20℃保存，临用前37℃温育融化，避免发生沉淀；

（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），使用去离子水配制1mg/ml储备液，使用时使用细胞培养基，稀释至最终染毒浓度200μg/ml；

2）细胞样本的处理：

（1）细胞培养：本方法适用于贴壁细胞，包括人肺癌细胞A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞，由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化，然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用胰蛋白酶消化法进行细胞接种；

（2）细胞接种：通过对细胞接种密度进行优化后，向96孔板中除最外周36个孔外分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时,A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔；

（4）电子烟烟液染毒：细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板除最外周36孔外每列6孔为一组分别设置为空白对照组、电子烟烟液染毒组和阳性对照组处理，空白对照组每孔加入100μl细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，电子烟烟液应设置不少于7个非零染毒浓度，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔加入细胞培养基作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37℃、5%CO₂条件下培养24h；电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含10mg/ml-100mg/ml范围；

（5）WST-1染色：电子烟烟液染毒24h后，每孔加入10μl经温育的WST-1染液，置于37℃、5%CO₂条件下孵育2h，孵育完成后室温下快速振荡1min，使用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值A₄₅₀；

（6）结果与分析：

吸光值A：A=A450nm

A_{空白对照组}=6个平行孔的吸光度平均值

A_{培养基背景}=6个平行孔的吸光度平均值

A_{染毒溶液背景}=6个平行孔的吸光度平均值

A_阳性对照=6个平行孔的吸光度平均值

细胞存活率（%）=（A_染毒组-A_{染毒溶液背景}）/（A_{空白对照组}-A_{培养基背景}）

注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_阳性对照应小于等于0.3。