CN103399159A

CN103399159A - 一种卷烟烟气致细胞dna损伤的定量评价方法

Info

Publication number: CN103399159A
Application number: CN2013103406826A
Authority: CN
Inventors: 陈欢; 付立伟; 田永峰; 韩书磊; 刘彤; 侯宏卫; 邢军; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-06
Also published as: CN103399159B

Abstract

一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，属于卷烟烟气基因毒性的毒理学评价技术领域，其特征在于：是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（γH2AX）的定量测定方法；具体步骤包括：（1）细胞培养，（2）卷烟烟气染毒，（3）基于量子点标记荧光免疫法对细胞中γH2AX定量测定，（4）数据处理。本发明的优点在于：通过细胞固定和通透实现细胞样本的直接、高通量检测，省去了蛋白质提取步骤，提高检测速度；可实现96个样品的同时测定，具有高通量的优势。通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，提高方法重现性。

Description

一种卷烟烟气致细胞 DNA 损伤的定量评价方法

技术领域

本发明涉及卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价技术，具体说是涉及一种基于量子点标记荧光免疫法对卷烟烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（ɣH2AX）的定量测定方法。

背景技术

大量证据表明，卷烟烟气会引起细胞DNA损伤，如碱基的氧化损伤、DNA加合物和DNA双键断裂等。其中DNA双链断裂被认为是DNA最严重的损伤，ɣH2AX作为DNA双链断裂的特异性标志物，被广泛用于细胞DNA损伤的评价。近年来，有大量文献开展了卷烟烟气导致DNA双链断裂的研究。Albino等使用ɣH2AX来评价卷烟烟气对人类A549肺癌细胞和正常的人支气管上皮细胞基因毒性，发现呈剂量效应关系，进一步研究表明ɣH2AX与焦油含量正相关，而与卷烟类型和吸烟行为无关。Toyooka等研究证实卷烟主流和侧流烟气暴露于人类A549肺癌细胞，ɣH2AX呈剂量效应关系且与时间正相关。目前ɣH2AX的检测方法主要有免疫荧光法、流式细胞技术和高内涵细胞成像技术。这些技术都是利用ɣH2AX的特异性抗体和荧光分子标记的二抗实现对目标物定量测定的，所用的荧光分子均为传统有机染料。量子点是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机染料相比，量子点具有激发谱宽，发射谱窄，较高的荧光稳定性和较长的衰减寿命等优势。且量子点标记免疫荧光法与普通免疫荧光法相比，荧光信号可显著增强。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而开发的一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，即采用量子点标记荧光免疫法对卷烟烟气诱导的细胞中ɣH2AX进行定量测定，该方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（ɣH2AX）的定量测定方法；具体步骤如下：

1．细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于以1640培养基为溶剂的细胞培养基中，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种；96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

2．细胞染毒：使用细胞培养基将烟气总粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每列6 孔为一组，分别设置7个不同浓度的烟气染毒组和空白对照组处理，烟气染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 稀释培养液作为空白对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

3．基于量子点标记荧光免疫法对细胞中ɣH2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用Tris缓冲液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定细胞；(2)固定好的A549细胞用Tris缓冲液洗涤2次，加入通透液室温孵育20 min；(3) Tris缓冲液洗涤3次，滴加2% BSA封闭液，在37℃湿盒中孵育30min；(4) 加入100 μl含有兔抗人H2AX抗体和小鼠抗人ɣH2AX抗体组成的一抗混合液，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)Tris缓冲液洗涤3次，加入量子点标记混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育2小时；(6) 向微孔板中加入100 μL的Tris缓冲液，经荧光酶标仪（405nm处激发，在525nm和605nm处检测）测定荧光强度值；

4．数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后，根据目标物ɣH2AX与总H2AX含量的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。

在本发明中，各种实验试剂的配制方式如下：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

（2）1%中性甲醛溶液：通过4mL的 40%甲醛和96mL的Tris缓冲液配置。

（3）Tris缓冲液：1.21g三羟基氨基甲烷和7.6g氯化钠加入到900mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值至7.4，定容止1000mL。

（4）细胞膜通透液：0.3% Triton X-100的配制：取0.3 ml Triton X-100，加入至100 ml的 Tris缓冲液中，充分混匀后使用。

（5）2%牛血清白蛋白（BSA）封闭液：取2g的BSA用Tris缓冲液充分溶解，定容至100mL。

（6）混合一抗溶液：使用前取适量兔抗H2AX抗体和小鼠抗ɣH2AX抗体混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。

（7）量子点标记混合二抗溶液：使用前取适量QD 605 nm-羊抗鼠IgG和QD 525 nm-羊抗兔IgG混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。

本发明中，卷烟烟气染毒样本的制备：卷烟样品于温度（22±1）℃和相对湿度60%±3%条件下平衡48h。然后使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据TPM质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10mg TPM/mL的烟气粒相物标准储备液。使用前在－70℃以下储存。在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有细胞培养基的吸收瓶中，粒相物收集完毕后，将气相物吸收液定容至与粒相物储备液中DMSO体积相同，通过0.2μm的滤膜除菌后，得到最终浓度与10 mg TPM/mL相当的烟气气相物标准储备液，且必须在制备后半小时内使用。

本发明中，对特异性抗体使用浓度进行了优化：量子点标记荧光免疫法对细胞中γH2AX测定的灵敏度取决于特异性识别的一抗与目标物分子的结合量，其间接影响量子点标记的二抗分子对目标分子的特异性识别。为提高检测灵敏度，分别对实验中小鼠抗ɣH2AX抗体和兔抗总H2AX抗体进行了优化。图2A所示为使用不同浓度的小鼠抗ɣH2AX抗体和相同浓度的QD605-羊抗小鼠IgG抗体对相同目标物分析时，在荧光酶标仪上测定的荧光强度值。由图2A可知，当小鼠抗ɣH2AX抗体稀释比为1:200时，发射波长605nm处测定的荧光强度最大。因此本实验中选择小鼠抗ɣH2AX抗体的最佳稀释比为1:200。图2B所示为使用不同浓度的兔抗总H2AX抗体和相同浓度的QD525-羊抗兔IgG抗体对相同目标物分析时，在荧光酶标仪上测定的荧光强度值。由图2B可知，当兔抗总ɣH2AX抗体稀释比为1:150时，发射波长525nm处测定的荧光强度最大。因此本发明中选择兔抗总H2AX抗体抗体的最佳稀释比为1:150。

本发明中，为了消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，使用了ɣH2AX特异性抗体和能识别总H2AX蛋白的抗体作为识别一抗，然后采用不同激发波长量子点标记的特异性二抗对一抗识别，根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和烟气染毒浓度绘制效应——剂量曲线，从而实现目标物ɣH2AX的准确定量。图3A为对卷烟样品3R4F烟气冷凝物对细胞染毒12小时后检测细胞中ɣH2AX得到的荧光信号。由图3A可知，烟气冷凝物染毒后细胞中ɣH2AX对应的荧光检测信号随着烟气冷凝物染毒浓度的增加而逐渐增大，呈明显的剂量效应关系。图3B为根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和烟气染毒浓度绘制的效应——剂量曲线。由图3B可知，通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，从而实现目标物ɣH2AX的准确定量。

本发明的方法克服了现有ɣH2AX免疫测定方法的不足，利用量子点标记抗体代替传统有机染料标记抗体，提高了检测灵敏度。细胞接种在96孔板中，烟气染毒后通过细胞固定和通透可实现细胞样本的直接、高通量检测，省去了蛋白质提取步骤。通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，从而实现目标物ɣH2AX的准确定量。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

（1）利用量子点标记抗体代替传统有机染料标记抗体，提高了检测灵敏度。

（2）通过细胞固定和通透实现细胞样本的直接、高通量检测，省去了蛋白质提取步骤，提高检测速度。

（3）可实现96个样品的同时测定，具有高通量的优势。

（4）通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，提高方法重现性。

附图说明

图1. 本发明分析方法流程图；

图2. 特异性识别一抗的浓度优化：（A）使用不同稀释比的小鼠抗ɣH2AX抗体所得到的荧光强度，（B）使用不同稀释比的兔抗总H2AX抗体所得到的荧光强度；

图3. （A）烟气染毒浓度和目标物ɣH2AX荧光检测信号绘制的剂量效应曲线；（B）烟气染毒浓度和目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值绘制的剂量效应曲线；

图4. 烟气冷凝物染毒浓度与细胞中ɣH2AX测定的相对荧光强度的剂量效应曲线；

图5. 烟气气相物染毒浓度与细胞中ɣH2AX测定的相对荧光强度的剂量效应曲线。

具体实施方式

本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

为考察卷烟样品A的烟气冷凝物染毒对细胞的DNA损伤，采用转盘式20H型吸烟机（德国，Borgwaldt公司）对卷烟样品A进行抽吸，抽吸模式参照ISO的要求，通过对20支卷烟的抽吸，剑桥滤片共捕集到烟气粒相物208mg。加入20.8mL的DMSO溶液，置于振荡器上萃取30分钟。将萃取液通过0.22μm的滤膜除菌后得到10mg/mL的TPM储备液。用细胞培养液稀释TPM储备液，配制一系列不同浓度的烟气冷凝物染毒溶液对A549细胞进行染毒，染毒浓度分别为10、25、50、75、100、125、150μg/mL。然后用基于量子点标记荧光免疫法对烟气冷凝物暴露下的ɣH2AX和总H2AX进行测定。试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号。所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号。最后，根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线，结果如图4所示。由图4可知，细胞中ɣH2AX的含量随着烟气冷凝物萃取液浓度的升高而增大，呈明显的剂量效应关系，烟气冷凝物暴露会引起细胞DNA的双链断裂。

实例2：

为考察卷烟样品B的烟气气相成分染毒对细胞的DNA损伤，采用转盘式20H型吸烟机（德国，Borgwaldt公司）对卷烟样品B进行抽吸，抽吸模式参照ISO的要求，用剑桥滤片捕集卷烟的粒相物成分，烟气通过剑桥滤片后的气相物成分用装有适量细胞培养液的吸收瓶收集，通过20支卷烟的抽吸共捕集到烟气粒相物182mg。将吸收瓶中的细胞培养液补足至18.2mL。将气相物吸收液通过0.22μm的滤膜除菌后得到浓度与10 mg TPM/mL相当的烟气气相物标准储备液，且必须在制备后半小时内使用。用细胞培养液稀释气相物吸收液，配制一系列不同浓度的烟气气相物染毒溶液对A549细胞进行染毒，染毒浓度分别为10、25、50、75、100、125、150μg/mL。然后用基于量子点标记荧光免疫法对烟气冷凝物暴露下的ɣH2AX和总H2AX进行测定。试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号。所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号。最后，根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线，结果如图4所示。由图4可知，细胞中ɣH2AX的含量随着烟气气相物吸收液浓度的升高而增大，呈明显的剂量效应关系，烟气气相物暴露会引起细胞DNA的双链断裂。

Claims

1.一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，其特征在于：是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（ɣH2AX）的定量测定方法；具体步骤如下：

1) 、细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于以1640培养基为溶剂的细胞培养基中，然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种；96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

2)、细胞染毒：使用细胞培养基将烟气总粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每列6 孔为一组，分别设置7 个不同浓度的烟气染毒组和空白对照组处理，烟气染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 稀释培养液作为空白对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

3)、基于量子点标记荧光免疫法对细胞中ɣH2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用Tris缓冲液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定细胞；(2)固定好的A549细胞用Tris缓冲液洗涤2次，加入通透液室温孵育20 min；(3) Tris缓冲液洗涤3次，滴加2% BSA封闭液，在37℃湿盒中孵育30min；(4) 加入100 μl含有兔抗人H2AX抗体和小鼠抗人ɣH2AX抗体组成的一抗混合液，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)Tris缓冲液洗涤3次，加入量子点标记混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育2小时；(6) 向微孔板中加入100 μL的Tris缓冲液，经荧光酶标仪（405nm处激发，在525nm和605nm处检测）测定荧光强度值；

4)、数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后，根据目标物ɣH2AX与总H2AX含量的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。

2.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述细胞培养基的配制方法为：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

3.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述1%中性甲醛溶液的配制方法为：通过4mL的 40%甲醛和96mL的Tris缓冲液配制。

4.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述Tris缓冲液的配制方法为：1.21g三羟基氨基甲烷和7.6g氯化钠加入到900mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值至7.4，定容止1000mL。

5.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述细胞膜通透液为浓度0.3% Triton X-100液，配制方法：取0.3 ml Triton X-100，加入至100 ml的 Tris缓冲液中，充分混匀后使用。

6.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述封闭液为浓度2%牛血清白蛋白（BSA），配制方法：取2g的BSA用Tris缓冲液充分溶解，定容至100mL。

7.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述混合一抗溶液的配制方法为：使用前取适量兔抗H2AX抗体和小鼠抗ɣH2AX抗体混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。

8.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述量子点标记混合二抗溶液配制方法为：使用前取适量QD 605 nm-羊抗鼠IgG和QD 525 nm-羊抗兔IgG混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。