CN101691598B

CN101691598B - 卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法

Info

Publication number: CN101691598B
Application number: CN2009100661677A
Authority: CN
Inventors: 李翔; 尚平平; 聂聪; 彭斌; 赵乐; 刘惠民; 谢剑平
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2009-09-17
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2029-09-17
Also published as: CN101691598A

Abstract

一种卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1)配置实验试剂，2)烟气冷凝物的制备，3)细胞接种培养，4)烟气冷凝物染毒，5)中性红染色，6)结果与分析。本发明的内容是基于中性红细胞毒性试验的原理，根据卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性特点，对试验程序进行了改进，而建立的低危害卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法。本发明减少了甲醛固定液的固定步骤，使得试验过程更加简便；同时根据卷烟主流烟气冷凝物是一种复杂的混合物体系，且毒性较低等毒性特点，对样品稀释培养液进行了改进，即将胎牛血清的浓度由10％调整到5％。从而使试验结果更加准确可靠。本发明具有操作更简便、灵敏性更高、结果更可靠的优点。

Description

卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法

技术领域

本发明涉及卷烟主流烟气体外毒理学评价研究领域，具体说是一种卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法。

背景技术

卷烟烟气的体外毒理学研究已经成为评价吸烟对健康危害的重要手段之一，目前，有关卷烟烟气的体外毒理学研究大多集中于烟气冷凝物的细胞毒性和基因毒性方面。如何科学准确地评价低危害卷烟产品以及烟草添加剂的危害性，目前国际上还没有统一的方法和程序。中性红试验是广泛接受的用来评价药物、化妆品、工业化工原料及环境污染物对不同细胞的毒性的体外细胞毒性测试方法。在众多细胞毒性测试方法中，中性红试验也被应用于评价卷烟烟气冷凝物的细胞毒性。Putnam等采用八种体外细胞毒性分析方法对1R4F参比卷烟的烟气冷凝物的细胞毒性进行了分析，并对八种毒性评价方法进行了比较，结果表明中性红试验是最为灵敏的评价方法(Putnam KP，Bombick DW，Doolittle DJ.Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity ofcigarette smoke condensate.Toxicol In Vitro，2002；16(5)：599-607.)。国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)于2002年成立了烟草烟气体外毒性测试工作组，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，确定主要的方法。卷烟主流烟气冷凝物是一种复杂的混合物体系，且毒性较低，在进行中性红细胞毒性试验时，样品稀释培养液中的血清含量将影响试验的结果。其原理是血清可以与化合物结合从而降低或掩盖化合物的毒性，因此高浓度的血清含量将导致烟气冷凝物的毒性效应被低估，使得试验结果不准确；同时，完全血清剥夺会影响细胞的正常生长。

发明内容

本发明的目的正是针对上述存在的问题，并基于中性红细胞毒性试验的原理，根据卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性特点，对中性红细胞毒性试验的操作程序进行改进，而建立的一种卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定方法。

本发明的方法按以下步骤实现：

1)配制实验试剂，

2)烟气冷凝物的制备，

3)细胞接种培养，

4)烟气冷凝物染毒，

5)中性红染色，

6)结果与分析。

本发明所要配制的实验试剂有以下：

(1)生长培养液：RPMI-1640+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100IU青霉素+100μg/ml链霉素。

(2)0.01M磷酸缓冲盐溶液(PBS)：0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，8g NaCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，加双蒸水至1L，pH 7.2～7.4，高压灭菌。

(3)样品稀释培养液：RPMI-1640+5％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100IU青霉素+100μg/ml链霉素。

(4)中性红储存液：0.2g中性红，加双蒸水至100ml，过滤除菌。

(5)中性红工作液：用RPMI-1640稀释至50μg/ml。

(6)中性红提取液：50％乙醇，1％冰醋酸，49％双蒸水，现用现配。

(7)阳性对照：十二烷基硫酸钠(SDS)(110μg/ml，50％细胞致死率浓度；200μg/ml，100％细胞致死率浓度)。

(8)阴性对照：2％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)。

烟气冷凝物(Cigarette Smoke Condensate，CSC)的制备：

使用DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的烟气粒相组分，制备烟气总粒相物浓度为10mg/ml的烟气冷凝物样品储存液，可于-80℃保存。

细胞接种培养：

经扩增培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞进行消化以后，制备细胞悬液(1×10⁵个/ml)。96孔板的第一列8个孔中每孔加入100μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100μl细胞悬液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

烟气冷凝物染毒：

使用样品稀释培养液将烟气冷凝物样品储存液调整到不同浓度，卷烟CSC的终浓度设置至少包括5个非零浓度。

细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板每列8孔为一组分别设置为空白对照、阴性对照、不同剂量的CSC染毒和阳性对照处理。每孔加入100μl的含有或不含有阴性对照、卷烟CSC和阳性对照的稀释培养液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

中性红染色：

细胞培养24h后，吸去培养液，每孔加入150μl预热的PBS洗一次，加入100μl中性红染液，于37℃、5％CO₂条件下培养3h，吸去中性红染液，每孔加入150μl PBS洗一次，加入150μl中性红提取液，室温下快速振荡10～15min，使用酶标仪检测每孔中性红提取液在540nm波长处的吸光值。

结果与分析：

原始吸光值A_(raw)：直接测得的在540nm波长处的吸光值。

经过校正的吸光值A_{(blank-corrected)}：A_{(blank-corrected)}＝A_(raw)-A_Blank(raw)

相对吸光值C：

C = \frac{A_{(blank - corrected)}}{{\overset{&OverBar;}{A}}_{Negative (blank - corrected)}} \times 100 %

(A：吸光值的平均值)

每个96孔板的阴性对照的原始吸光值的平均值大于0.3，样品的吸光值结果有效。相对吸光值代表细胞存活率。

本发明的内容是建立低危害卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法。本发明减少了甲醛固定液的固定步骤，使得实验过程更加简便；同时，根据卷烟主流烟气冷凝物是一种复杂的混合物体系，且毒性较低等毒性特点，对样品稀释培养液进行了改进，即将胎牛血清的浓度由10％调整到5％，从而可以降低由于血清含量所导致的烟气冷凝物的毒性效应被低估的可能性，同时又保证了细胞的正常生长，使得试验结果更加准确可靠。本发明具有操作更简便、灵敏性更高、结果更可靠的优点。

附图说明

附图为本发明的工艺步骤图。

具体实施方式

实例一对某一国产卷烟进行评价

经扩增培养的A549细胞进行消化以后，制备细胞悬液(1×10⁵个/ml)。96孔板的第一列8个孔中每孔加入100μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100μl细胞悬液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h。使用样品稀释培养液将烟气冷凝物样品储存液调整到不同浓度，卷烟CSC的终浓度设置为10、50、75、100、120、140、160、200μg/ml八个不同的浓度。细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板每列8孔为一组分别设置为空白对照、阴性对照、八个浓度的CSC染毒和阳性对照处理。每孔加入100μl的含有或不含有阴性对照、卷烟CSC和阳性对照的稀释培养液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h。吸去培养液，每孔加入150μl预热的PBS洗一次，加入100μl中性红染液，于37℃、5％CO₂条件下培养3h，吸去中性红染液，每孔加入150μl PBS洗一次，加入150μl中性红提取液，室温下快速振荡10～15min，使用酶标仪检测每孔中性红提取液在540nm波长处的吸光值。

中性红细胞毒性结果

(原始吸光值)

中性红细胞毒性结果

(经校正的吸光值)

中性红细胞毒性结果

(相对吸光值)

实例二对某一国产卷烟进行评价

中性红细胞毒性结果

(原始吸光值)

中性红细胞毒性结果

(经校正的吸光值)

中性红细胞毒性结果

(相对吸光值)

实例三对某一国产卷烟进行评价

中性红细胞毒性结果

(原始吸光值)

中性红细胞毒性结果

(经校正的吸光值)

中性红细胞毒性结果

(相对吸光值)

Claims

1.一种卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)配制实验试剂，包括以下种类：

a、生长培养液：RPMI-1640+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100IU青霉素+100μg/ml链霉素；

b、0.01M磷酸缓冲盐溶液(PBS)：0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，8g NaCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，加双蒸水至1L，pH 7.2～7.4，高压灭菌；

c、样品稀释培养液：RPMI-1640+5％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100IU青霉素+100μg/ml链霉素；

d、中性红储存液：0.2g中性红，加双蒸水至100ml，过滤除菌；

e、中性红工作液：用RPMI-1640稀释至50μg/ml；

f、中性红提取液：50％乙醇，1％冰醋酸，49％双蒸水，现用现配；

g、阳性对照：十二烷基硫酸钠(SDS)，110μg/ml为50％细胞致死率浓度；200μg/ml为100％细胞致死率浓度；

h、阴性对照：2％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；

2)烟气冷凝物的制备通过以下方式：使用DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的烟气粒相组分，制备烟气总粒相物浓度为10mg/ml的烟气冷凝物样品储存液，于-80℃保存；

3)细胞接种培养，步骤为：经扩增培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞进行消化以后，制备细胞悬液1×10⁵个/ml，96孔板的第一列8个孔中每孔加入100μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100μl细胞悬液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h；

4)烟气冷凝物染毒，过程如下：使用样品稀释培养液将烟气冷凝物样品储存液调整到不同浓度，卷烟CSC的终浓度设置包括8个非零浓度，分别为：10、50、75、100、120、140、160、200μg/ml；细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板每列8孔为一组分别设置为空白对照、阴性对照、不同剂量的CSC染毒和阳性对照处理，每孔加入100μl的含有或不含有阴性对照、卷烟CSC和阳性对照的稀释培养液，于37℃、5％CO₂条件下培养24h；

5)中性红染色，过程如下：细胞培养24h后，吸去培养液，每孔加入150μl预热的PBS洗一次，加入100μl中性红染液，于37℃、5％CO₂条件下培养3h，吸去中性红染液，每孔加入150μl PBS洗一次，加入150μl中性红提取液，室温下快速振荡10-15min，使用酶标仪检测每孔中性红提取液在540nm波长处的吸光值；

6)结果与分析通过以下公式进行：

原始吸光值A_(raw)：直接测得的在540nm波长处的吸光值，

经过校正的吸光值A_{(blank-corrected)}：

A_{(blank - corrected)} = A_{(raw)} - {\overset{&OverBar;}{A}}_{Blank (raw)}

相对吸光值C：

C = \frac{A_{(blank - corrected)}}{{\overset{&OverBar;}{A}}_{Negative (blank - corrected)}} \times 100 %

吸光值的平均值

每个96孔板的阴性对照的原始吸光值的平均值大于0.3，样品的吸光值结果有效，相对吸光值代表细胞存活率。