CN102520154A - 一种检测环境中二恶英类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测环境中二恶英类物质的方法，采用大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞作为检测手段，贴壁培养24h后，加入环境样品的有机溶剂提取液或用有机溶剂溶解的化学品，继续培养72h后，通过测定EROD酶活性，以2,3,7,8-TCDD为标准化合物，绘制2,3,7,8-TCDD对H4ⅡE细胞的EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线，进而评价样品中二恶英类化合物的毒性效应。本发明的操作简便，造价低廉，检测时间短，高通量，能够作为环境样品和可疑类二恶英化合物的快速筛查手段。

Description

一种检测环境中二恶英类物质的方法

技术领域

本发明涉及环境监测技术领域，具体涉及一种检测环境中二恶英类物质的方法。

背景技术

二恶英类(Dioxins，DXNs)污染物是一类具有相似化学结构、理化性质和生物效应的氯代芳香化合物，包括多氯代二苯并对二恶英(PolychlorinatedDibenzo-p-Dioxins，PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(PolychlorinatedDibenzofurans，PCDFs)和类二恶英多氯联苯(dioxin like PolychlorinatedBiphenyls，dl-PCBs)。二恶英类化学物质的毒性作用主要是通过与机体细胞内芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor，AhR)相结合(poland et al.，1982)，形成的复合物转移入细胞核与芳香烃受体核转位子蛋白(AhR nucleartranslocator，Arnt蛋白)结合，形成的DXNs-AhR-Arnt复合物能与二恶英应答元件(Dioxin Response Elements，DRE)结合，诱导特异基因表达(主要是CYP1A1)，导致毒性作用。由于二恶英与芳香烃受体接触的量与其诱导基因表达的能力在一定范围内成正比，因此可通过检测特异基因的表达产物来反映样品中二恶英的毒性当量(Toxic Equivalence，TEQ)。

环境DXNs分析属于超痕量、多组分分析，基质效应复杂，定性定量检测复杂，是现代分析的难点，目前发展起来的检测技术主要包括：色谱法分析测试技术、生物法快速分析测试技术和其他测试技术(Reiner，et al.2006)。检测二恶英类化合物的生物检测法，主要有活体检测法(in vivo)、体外受体结合实验(Receptor binding assay in vitro)和基于离体细胞培养检测法(bioassay in vitro)。其中活体检测法是利用动物活体暴露于待测物质，通过检测体内指标性酶活来进行检测，但该法检测时间较长，造价较为昂贵；受体结合实验是基于二恶英-Ah受体结合并激活其结合DNA的特性，同构检测二恶英-Ah受体复合物或与DNA结合的复合物的量来指针样品的二恶英效应强度，但抗体较难获得；因此，以上两种方法均不适于作为二恶英类污染物的快速筛查技术。而现用的离体生物测试方法测得的结果也不能真实地反映污染物的生物毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测环境中二恶英类物质的方法，该方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，能够反映环境样品的类二恶英效应，并且通过标准曲线计算得到样品中二恶英类污染物的毒性当量值。

本发明的技术方案是：

环境二恶英类物质能诱导大鼠肝癌细胞株H4IIE产生EROD酶，7-乙氧基-异吩恶唑酮和NADPH在氧气和EROD酶生成7-羟基-异吩恶唑酮(RF)，RF为荧光物质，以大鼠肝癌细胞株H4IIE中EROD酶为生物标记，用2，3，7，8-TCDD诱导的酶活作出剂量-效应关系标准曲线，根据此标准曲线得出待测样品的二恶英当量(TEQ量)。

本发明检测环境中二恶英类物质的方法包括以下步骤：

1)大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞的培养

(a)冻存：在DMEM培养基中加入20％血清和10％DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞混匀液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；

(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于37℃水浴，手动慢摇恒温2min，复苏后离心、吸去上清液，加入10mL含15％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂的恒温箱37℃条件下培养；

(c)传代培养：取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3遍，加入消化液37℃条件下消化3min，加入含12％胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新鲜培养基充分，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养；

2)环境中二恶英类物质的检测

(a)接种：取步骤1)得到的生长良好的H4IIE细胞，弃去培养液，加入DMEM胰酶消化，倒置显微镜观察消化情况，消化完全后加入2mL新鲜配制的含胎牛血清和双抗的培养液终止消化，滴管轻轻将细胞吹打脱壁，吸至无菌洁净锥形瓶中添加培养基进行细胞浓度调节，混匀后取5μL用血小球计数板计数；按每孔2×10⁵个细胞接种到96孔板，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养24h；

(b)上样：取出上述步骤(a)得到的96孔板，弃去培养液。取无菌洁净EP管，每个EP管中先加995μL添加胎牛血清与双抗的DMEM培养液，再加5μL溶于DMSO的待测样品，另取作为溶剂对照的EP管中添加5μL DMSO，涡旋混匀，按照每孔100μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露72h；

(c)反应：取出上述步骤(b)得到的96孔板，弃去溶液，加入100μL新鲜配制的含1μL 1mM的ERF和0.1μL 10mM的双香豆素的DMEM培养液，置于CO₂培养箱中反应60min，60min后加入130μL甲醇终止反应，室温下于96孔板摇床混匀，得到反应液；

(d)用酶标仪测反应溶液的荧光强度：移液器吸取100μL反应液于酶标板中，激发波长535nm，吸收波长590nm，测荧光强度；

(e)用酶标仪测反应液的蛋白吸光值：将上述步骤(d)的96孔板中剩余的反应液吸出，加入120μL 0.3M的NaOH破碎细胞10min，细胞破碎后吸出100μL，加入G250染液200μL反应10min，于酶标仪上595nm测蛋白吸光值；

(f)用酶标仪检测步骤(c)的反应液荧光强度和蛋白蛋吸光值，计算出样品的EROD酶的活性，用5μL溶于DMSO的不同浓度的2，3，7，8-TCDD诱导的EROD酶活作出剂量-效应关系标准曲线，将样品的EROD酶活值与标准曲线对比得到样品的2，3，7，8-TCDD毒性当量。

酶活关系曲线由以下Logistic方程用最小二乘法进行拟合：

$Y=\frac{A-D}{1+{(X/c)}^B}+D$

式中，

Y：EROD酶活性；

X：2，3，7，8-TCDD浓度，即诱导剂量；

A：最大EROD酶活值；

B：回归曲线中线性区段的斜率；

C：导致半数最大EROD酶活性时的2，3，7，8-TCDD标准液浓度，即EC50值；

D：最小EROD酶活值

方程中的四个参数A、B、C、D通过求解获得。得到的2，3，7，8-TCDD诱导的EROD酶活剂量-效应关系标准曲线如图2。

待测样品EROD酶活力用样品中RF的值除以蛋白含量和反应时间表示(pmol/min/mg protein)。将样品的酶活值与剂量-效应关系标准曲线对比计算得到样品的2，3，7，8-TCDD毒性当量值。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

利用大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞作为检测手段，建立一种经济高效的评价环境样品二恶英类污染效应的生物测试方法，该检测方法快速简便、成本低廉、省时省力、应用广泛，所需样品量少，能够反映环境样品的类二恶英效应，并且通过标准曲线计算得到样品中二恶英类污染物的毒性当量值。

附图说明

图1为2，3，7，8-TCDD诱导的EROD酶活性剂量-效应关系标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例子对本发明作进一步详细的介绍以便清楚理解本发明所保护的技术方案。

实施例1

利用大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞EROD酶活性诱导方法测定2，3，7，8-TCDD的效应来绘制标准曲线，方法如下：

1.冻存：在DMEM培养基中加入20％血清和10％DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4IIE田胞混匀液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存。

2.复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，将冻存小管快速放于37℃水浴慢摇至其溶解。溶解后马上转入37℃水浴箱，手动慢摇恒温2min。复苏后以800r pm的速度离心5min，吸去上清液，加入10mL含15％胎牛血清的DMEM培养基，5％CO₂温箱37℃条件下培养。复苏细胞培养10h后，在倒置相差显微镜下观察复苏后细胞存活的情况，按照已经贴壁细胞为存活细胞、未贴壁细胞为死亡细胞的原则，检查细胞株复苏的效果。(在倒置显微镜下观察复苏后细胞存活情况，按已贴壁细胞即为存活细胞，未贴壁细胞为死亡细胞观察细胞复苏率)。

3.传代培养：取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS(Ph7.4)缓冲液清洗3遍。加入消化液37℃条件下消化约3min，倒置显微镜观察细胞消化情况。(翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时吸去消化液；如消化程度不够可延长消化时间，如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能倾倒消化液)。加入12％胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层(着重边角等细胞密集部位)，至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新鲜培养基至5mL左右，于5％CO₂箱中，37℃条件下培养。

4.接种：取生长良好的H4IIE细胞，弃去培养液，加1～2mL DMEM胰酶消化，倒置显微镜观察消化情况，消化完全(细胞变圆，不紧贴壁)加入2mL新鲜配制的含胎牛血清和双抗的培养液终止消化，滴管轻轻将细胞吹打脱壁，吸至无菌洁净锥形瓶中添加培养基进行细胞浓度调节，混匀后取5μL用血小球计数板计数；按每孔2×10⁵个细胞接种到96孔板，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

5.上样：24h后取出96孔板，显微镜下观察细胞生长情况(铺满底部70％即可)，弃去培养液。取无菌洁净EP(Eppendorf)管，每个EP管中先加995μL的DMEM(添加胎牛血清与双抗)培养液，再加5μL溶于DMSO的2，3，7，8-TCDD，另取作为溶剂对照的EP管中添加5μL DMSO，涡旋混匀，按照每孔100μL添加于96孔板中。在CO₂培养箱中暴露72h。

6.反应：72h后取出96孔板，弃去溶液，加入100μL新鲜配制的含1μL 1mM的ERF和0.1μL 10mM的双香豆素的DMEM培养液，置于CO₂培养箱中反应60min。60min后加入130μL甲醇终止反应，室温下于96孔板摇床混匀，移液器吸取100μL混合液于酶标板中，激发波长535nm，吸收波长590nm，上酶标仪测RF的荧光强度，将96孔板中剩余的反应液吸出，加入120μL 0.3M的NaOH破碎细胞10min，于显微镜下观察细胞破碎情况；细胞破碎后吸出100μL，加入G250染液200μL反应10min，于酶标仪上测595nm波长下蛋白质。

7.数据处理

酶活关系曲线由以下Logistic方程用最小二乘法进行拟合：

$Y=\frac{A-D}{1+{(X/c)}^B}+D$

式中，

Y：EROD酶活性；

X：2，3，7，8-TCDD浓度，即诱导剂量；

A：最大EROD酶活值；

B：回归曲线中线性区段的斜率；

C：导致半数最大EROD酶活性时的2，3，7，8-TCDD标准液浓度，即EC50值；

D：最小EROD酶活值。

方程中的四个参数A、B、C、D通过求解获得。

2，3，7，8-TCDD的最低效应值出现在0.05ug/L，最高效应值出现在10ug/L，EC50值为0.49ug/L，检测区间为0.05ug/L-10ug/L。若换算成培养基中浓度则EC50是0.8fmol/well，与其他诸多研究结果一致，离体大白鼠肝癌细胞能适应各个实验室条件，对类二恶英物质有着较一致的灵敏反应。

实施例2

样品为2010年9月采集于南方某特区的土壤样品。

样品采集和保存方式分别参照HT/T166-2004和GB17378.3的要求进行。用干净的不锈钢采土器从南方某水库采集表层土壤样品1kg左右，用锡箔纸包好放入密封袋内，低温环境送回实验室，用冷冻干燥机在-70℃以下干燥并研磨。称取已过200目筛的土壤样品80g用传统索式抽提法，用甲苯溶剂抽提48h，所得抽提液用旋转蒸发仪旋蒸至1～2ml，加100ml正己烷转溶后继续旋蒸至1～2ml。将样品用正己烷定溶至20ml，取其中5ml(即含20g土壤样品)溶液，将5ml样品经多段硅胶柱净化，收集洗脱溶液旋蒸至1～2ml，再将样品经氧化铝/弗洛里硅土复合柱进行净化分离，收集含PCDD/Fs组分的溶液旋蒸至1～2ml，溶液转移到窄口玻璃瓶用高纯氮气进一步浓缩，至溶液体积将近100μL时加入300μL异丙醇∶二甲基亚砜(DMSO)(V∶V＝2∶1)的混合溶剂混溶，继续氮吹至溶液体积不再变化即只剩100ul DMSO，最后样品含量为20g/100μL，制备好的试验溶液作下一步生物试验用。

将H4IIE细胞按2×10⁵个/孔接种于96孔平底培养板中，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，培养基为含10％小牛血清和双抗的DMEM。24h后当细胞达到70％融合时吸出培养基，将溶于DMSO的有机污染物进行染毒，染毒物以1/2稀释率配成6个浓度梯度，即稀释倍数为1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，其中的DMSO体积占终体积的0.5％，每个浓度每个时相点设4个平行孔，以DMSO为阴性对照，2，3，7，8-TCDD为阳性对照。暴露72h后.去除原培养基，加入100μL新鲜配制含1mM的ERF(sigma)和10mM的双香豆素(sigma)的培养基，继续培养60min。将每孔中的培养基移入一新的96孔板的对应孔中，并加入130μL乙醇终止反应。于荧光酶标仪上535nm激发波长590nm吸收波长条件下测反应终产物RF的荧光强度。将96孔板中剩余的反应液吸出，每孔加入120μL0.3M的NaOH破碎细胞10min，于显微镜下观察细胞破碎情况，细胞破碎后吸出100μL，加入G250染液200μL反应10min后于酶标仪595nm测蛋白质吸光值。根据样品酶活诱导强度，从标准曲线中求得每个样品相对于2，3，7，8-TCDD标准样品的毒性当量。(toxic equivalency，TEQ)值。EROD实验方法测定结果如表1。

表1土壤样品检测结果单位：pg/g

在进行样品测量中，所有样品的浓度均应符合标准曲线的线性范围。其总提取物中能够检测到较强的Ah受体效应，毒性当量TEQ为16pg/g，土壤样品中分离出的PCDD/Fs组分的bio-TEQ和WHO-TEQ的拟合度达到95％以上，说明离体细胞(H4IIE)的方法得到的结果与化学分析方法具有良好的对比性，能作为一种有效的检测手段。

Claims (2)

1.一种检测环境中二恶英类物质的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞的培养

（a）冻存：在DMEM培养基中加入20%血清和10%DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞混匀液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存;

（b）复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于37℃水浴融化，离心、吸去上清液，加入10mL含15%胎牛血清的DMEM培养基吹散均匀，置于5％CO₂的恒温箱37℃条件下培养；

（c）传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3遍，加入0.05%DMEM胰蛋白酶37℃条件下消化3min，加入含12% 胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的12% 胎牛血清的DMEM培养基，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养；

2）环境中二恶英类物质的检测

（a）接种：取步骤1）得到的生长良好的H4IIE细胞，弃去培养液，加入 DMEM 胰酶消化，倒置显微镜观察消化情况，消化完全后加入新鲜配制的含胎牛血清和双抗的培养液终止消化，滴管轻轻将细胞吹打脱壁，吸至无菌洁净锥形瓶中添加培养基进行细胞浓度调节，混匀后取5μL用血小球计数板计数；按每孔2×10⁵个细胞接种到96孔板，于含5％CO₂的培养箱中37°C条件下培养24h；

（b）上样：取出上述步骤（a）得到的96孔板，弃去培养液。

2.取无菌洁净EP管，每个EP管中先加995μL添加胎牛血清与双抗的DMEM培养液，再加5μL溶于DMSO的待测样品，另取作为溶剂对照的EP管中添加5μL DMSO，涡旋混匀，按照每孔100μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露72h；

（c）反应：取出上述步骤（b）得到的96孔板，弃去溶液，加入100μL 新鲜配制的含1μL 1mM的ERF和0.1μL 10mM 的双香豆素的DMEM培养液，置于CO₂培养箱中反应60min，60min后加入130μL甲醇终止反应，室温下于96孔板摇床混匀；

（d）用酶标仪测反应液的荧光强度:移液器吸取100μLRF溶液于酶标板中，激发波长535nm，吸收波长590nm，测荧光强度；

(e) 用酶标仪测蛋白吸光值:将上述步骤（d）的96孔板中剩余反应液吸出，加入120μL 0.3M的NaOH破碎细胞10min，细胞破碎后吸出100μL，加入G250染液200μL反应10min，于酶标仪上595nm测蛋白吸光值；

（f）用酶标仪检测步骤（c）的反应液的荧光强度和蛋白蛋吸光值，用5μL 溶于DMSO的不同浓度的2,3,7,8-TCDD 诱导的EROD酶活作出剂量－效应关系标准曲线，将样品的EROD酶活值与上述剂量-效应关系标准曲线对比得到样品的2,3,7,8-TCDD毒性当量。