CN1548945A - 用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用原代培养技术获得的草鱼肝细胞来监测环境样品中存在的二噁英类污染物的方法。该方法将草鱼进行尾静脉去血后，采用原代细胞培养其肝细胞；将此草鱼肝细胞与2，3，7，8－四氯代二苯并二噁英一起培养；然后加入含有过量7－乙氧基－异酚噁唑酮的反应液；用荧光光度计测定终产物7－羟基－异酚噁唑酮的荧光强度，并以此作为表示EROD酶活性的参数，绘制2，3，7，8－四氯代二苯并二噁英对草鱼的原代肝细胞的EROD酶活力诱导的剂量－效应关系标准曲线；用同样的方法来检测环境样品，与标准曲线比较，可计算出环境样品中二噁英类污染物的含量。本发明采用中国的代表性草鱼，材料易得，操作简便，所需样品量少，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物测试方法，具体地说是涉及一种利用原代培养技术获得的草鱼肝细胞来监测环境样品中存在的二噁英类污染物的方法。
技术背景
二噁英类化合物包括二噁英，呋喃，多氯联苯，以及其他共平面卤代芳烃，其特征是具有芳烃受体效应。此类化合物具有强烈的致癌、致畸、致突变，干扰神经/内分泌系统效应，并在环境中持久存在，已成为环境领域里全球关注的重点污染物。对环境样品中二噁英类污染物进行监测，通常采用化学分析和生物测试技术。化学分析法需要使用高分辨色谱/高分辨质谱，或色谱/同位素稀释质谱，因此分析费用较高，对仪器设备条件和人员素质也有相当严格的要求。通常采用的生物方法是利用离体培养的鼠肝癌细胞株(Rat hepatic carcinoma cell-line，为方便起见，以下简称H4IIE)对二噁英类污染物进行测试，此法需要长期培养细胞，而且纯的H4IIE细胞不能如实反映二噁英类污染物毒性，应用范围窄；而采用商品化试剂盒，费用高昂，且在中国市场上没有销售。
一般说来，进入生物机体的有毒有机污染物质，一般在细胞或体液内进行酶促转化生成代谢物，其主要的转化部位是肝脏。很多有机毒物是肝细胞中一组专一性较低的酶的底物，如大量存在于肝细胞内质网膜中的混合功能氧化酶(又称单加氧酶)，而其中起关键作用的是细胞色素P4501A1酶，这种酶的诱导是通过诱导物结合到肝细胞的芳烃受体上来启动的，许多细胞色素P4501A1的底物可以激活此通道。细胞色素P4501A1酶活的诱导可以通过EROD测试来进行分析，具体来说就是，细胞色素P4501A1酶(即EROD酶，即7-乙氧基-3-异吩噁唑酮-脱乙基酶)可以作用于一种底物7-乙氧基-3-异吩噁唑酮，将其中的α-C-H氧化为α-C-OH，生成荧光物质7-羟基-异酚噁唑酮，然后通过测定该物质的荧光强度，即可推知EROD酶的催化活性。
Pesonen等人的研究表明，虹鳟鱼的原代培养的肝细胞含有可以被二噁英类污染物之一——TCDD(2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英)专一性诱导的EROD酶，可以通过测定酶活性来判定环境样品中的TCDD的含量，如文献1：Pesonen，M.，Goksoyr，A.，Andersson，T.，1992，Arch.Biochem.Biophys.292：228-233中所述。Smeets等人的研究也表明，可以通过测定鲤鱼原代培养的肝细胞中被TCDD专一性诱导的EROD酶活性来判定环境样品中的TCDD的含量，如文献2：Smeets，J.M.W.，Rankouhi，T.R.，Nichols，K.M.，Komen，H.，Kaminski，N.E.，Giesy，J.P.，Berg，M.，1999，Toxicol.Appl.Pharmacol.157，68-76中所述。上述方法使用的原代培养细胞，是从活体生物体内取目的组织并获得肝细胞后，在体外进行原代培养，原代培养的细胞在短期内基本保留了活体动物的代谢特征。但是通常在进行原代培养时采用的对活体生物去血的方法是用含有有助于组织软化的酶的缓冲液进行心脏灌输的传统方法。当以个体小的生物鱼为材料时，心脏灌输方式操作困难，费时费力，容易造成目的组织污染；而且在使用鱼的原代培养的肝细胞检测TCDD时，不同鱼种，甚至不同地域的同一鱼种会有不同的效果。例如，对于我国生长的鲤鱼，其肝细胞对于TCDD的检测效果就不理想。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术使用原代培养的肝细胞技术对二噁英类污染物进行测试时使用的心脏灌输方式操作困难，费时费力，容易造成目的组织污染，且所使用的鱼种不适用于我国的鱼种，从而提供一种经济高效的二噁英类化合物的生物监测方法，使用在我国最为常见的鱼种——草鱼，利用其原代培养的肝细胞检测环境样品中二噁英类污染物，且通过标准曲线可计算出环境样品中二噁英类污染物的含量。
本发明的目的是由如下技术方案实现的：
本发明提供一种用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，包括如下步骤：
1)原代细胞培养：将供试草鱼消毒，进行尾静脉去血，解剖鱼体取小块肝组织，用平衡缓冲液清洗至白色后，将肝组织切成0.1～2mm3，用10～30倍肝重体积的0.25v％胰酶消化液消化1～5分钟，待肝组织的细胞分散成小细胞团时即停止消化；过60～100目筛，将滤液转入离心管，离心，倾除上清液，用DMEM/F12培养基清洗沉淀物以除去消化液，最后用同样的培养基重新悬浮细胞，打散均匀并计数，于室温下培养；对细胞的活性用常规的台盼蓝排除法评价，选取活细胞数达到细胞总数的90％以上的草鱼肝细胞备用；
2)绘制标准曲线：将步骤1)得到的草鱼肝细胞按(1～5)×105个/毫升接种至96孔板中，培养1天后，移去90v％的培养基，加入等体积的2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英，继续培养2～5日；然后用pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗培养板中的细胞，再将含有过量7-乙氧基-异酚噁唑酮和香豆素的三羟甲基氨基甲烷反应液加入到微孔板中；室温下充分反应后，在激发波长535nm和发射波长590nm处用荧光光度计测定终产物7-羟基-异酚噁唑酮的荧光强度，并以此作为表示EROD酶活性的参数，绘制2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英对草鱼的原代肝细胞的EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线；
3)检测环境样品：将步骤1)得到的草鱼肝细胞按(1～5)×105个/毫升的密度直接接种至96孔板中，培养1天后，移去90v％的培养基，加入待测环境样品的有机溶剂提取液，继续培养2～5日；然后用pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗培养板中的细胞，再将含有过量7-乙氧基-异酚噁唑酮和香豆素的三羟甲基氨基甲烷反应液加入到微孔板中；室温下充分反应后，在激发波长535nm和发射波长590nm处用荧光光度计测定终产物7-羟基-异酚噁唑酮的荧光强度，来检测环境样品中是否含有二噁英类污染物；
4)将步骤3)测得的结果与步骤2)绘制的标准曲线比较，进而可计算出环境样品中二噁英类污染物的含量，从而评价环境中二噁英类化合物的毒性效应。
所述步骤1)中的平衡缓冲液包括0.145mol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，12mmol/LNaHCO3，5mmol/L Na2EDTA(乙二氨四乙酸二钠)，3mmol/L NaH2PO4，1.1mmol/LKH2PO4和100mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸。
所述步骤1)中的DMEM/F12培养基包括2wt％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素和100μg/mL链霉素。
所述步骤3)中的待测环境样品的有机溶剂提取液的浓度为4～35pg/mL。
所述二噁英类化合物包括二噁英，呋喃，多氯联苯。
本发明提供的二噁英类化合物的生物监测方法的优益之处在于：1)原代细胞刚刚离体，具有二倍体的遗传性，生物性状至少在1周内尚未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性，且大多数细胞表现出原有组织的特性，很适合作为毒物测试、细胞分化及病理学方面的试验研究；2)原代细胞试验介于活体试验和离体试验之间，使活体试验条件归一简单化而不失其真实性，使离体试验更接近实际而使试验结果可以直接外推到活体生物；3)鱼肝细胞原代培养技术为建立介于水体内源代谢和外源代谢之间的生态毒理分析模型提供了可能性，弥补了活体试验和离体试验的不足；4)对生物鱼直接进行尾静脉抽血，将肝组织直接用0.25％胰酶消化成单个细胞后接种至96孔板中，大大缩短了操作时间，相当程度上减轻了污染的可能性，所需细胞量小且一次性处理样品个数多；5)利用鱼肝细胞原代培养技术进行二噁英类污染物的筛选和毒性毒理研究时，材料易得，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉；6)本发明采用了草鱼，是中国的代表性鱼种。
附图说明
图1为2，3，7，8-TCDD对草鱼的原代肝细胞的EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线；其中■表示TCDD诱导的EROD酶活性；▲表示受试细胞的LDH(％)(即乳酸脱氢酶百分比)；
图2为利用化学分析、鼠肝癌细胞株培养方法和草鱼原代细胞培养方法三种方法测试环境样品的结果；其中横坐标是化学分析结果，纵坐标是鼠肝癌细胞株培养方法和草鱼原代细胞培养方法的测试结果；其中◆表示鼠肝癌细胞株；▲表示草鱼原代细胞。
具体实施方式
实施例1：利用草鱼肝细胞的原代培养方法测定TCDD的毒性效应来绘制标准曲线
原代细胞培养：将1.0Kg的供试草鱼消毒，进行尾静脉去血，解剖鱼体取小块肝组织，用0.145mol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，12mmol/L NaHCO3，5mmol/L Na2EDTA，3mmol/L NaH2PO4，1.1mmol/L KH2PO4，100mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(以下简称HEPES)组成的缓冲液(pH7.5)洗至白色。将肝组织切成1mm3大小后，用30倍肝重体积的0.25v％胰酶消化液消化2～3min，待肝组织的细胞分散成小细胞团时即停止消化；过100目筛，将滤液转入离心管中，在1000r/min下离心2min，倒出上清液，用DMEM/F12培养基(内含2％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素和100μg/mL链霉素)清洗沉淀以除去消化液；最后用同种培养基重悬细胞，然后将细胞移入培养瓶，打散均匀并计数，于室温下培养；对细胞的活性用台盼蓝排除法评价，选取活细胞数达到细胞总数的90％以上的草鱼肝细胞备用。
绘制标准曲线：将上述草鱼肝细胞以1×105个/mL及每孔200μL的密度直接接种至96孔板中，1天后，移出90％的培养基/孔，将含有二噁英类污染物中毒性最强的2，3，7，8-TCDD的培养基180μL加入到该微孔板的每一孔中，培养基中的DMSO的浓度应少于0.5％；细胞继续于室温下培养，暴露4天后，除去培养基并用100μL/孔冰冻的Tris(50mmol/L，pH7.4)缓冲液清洗培养板中的细胞，再将100μL/孔含2μM 7-乙氧基-异酚噁唑酮和20μM香豆素的Tris(50mmol/L，pH7.8)反应液加入到微孔板中；室温下反应30min后，在激发波长535nm和发射波长590nm处用TECAN A5082型多功能荧光光度计测定终产物7-羟基-异酚噁唑酮的荧光强度，并以此绘制标准曲线(图1)。
由图1可知，2，3，7，8-TCDD对草鱼原代肝细胞EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线的EC50值为9.7pg/mL，在4～35pg/mL范围内存在线性关系，可以作为环境中二噁英类化合物的毒性效应的定量分析标准。
同时用LDH％(即乳酸脱氢酶百分比)表示细胞的活性，所测LDH(％)＜10％，没有明显剂量效应关系，表明受试细胞在整个实验过程中都是有效的。
实施例2：利用草鱼肝细胞的原代培养方法评价环境样品的二噁英类污染物毒性
分别采集河流沉积物，电解废渣、漂尘、底泥标样、标准土壤和化工产品作为样品。采用索氏提取的方法，加入甲苯提取样品中的二噁英类污染物，将提取得到的有机溶剂加载到硅胶/活化硅胶柱上纯化样品，然后再用正己烷淋洗出浓缩后的组分，在高纯氮气中吹干，加入DMSO溶解并制备成在标准曲线线性范围内任一浓度的测试用的样品溶液。
利用实施例1中所述的草鱼肝细胞原代培养方法评价环境样品中二噁英类污染物的毒性，测定结果与H4IIE细胞培养方法、高分辨质谱分析方法的测定结果进行了比较，绘于图2。
从图2可以看出，无论是鼠肝癌细胞株和草鱼原代培养细胞测试，所得到的结果与高分辨质谱分析二噁英/呋喃类污染物的毒性当量数之间均有很好的相关关系。草鱼原代培养细胞测试结果更接近化学分析(即高分辨色谱/质谱分析)，而且和国际上目前通常采用的鼠肝癌细胞测试方法有很好的可比性。图2的结果表示可以用本发明提出的方法，判断环境样品中二噁英/呋喃类污染物的毒性定量或其潜在生态毒性的大小。
综上所述，与前人评价二噁英毒性效应的方法相比，本发明主要有以下优点：材料易得，操作简洁，成本低廉，省时省力，可以广泛应用于环境样品中二噁英类污染物的毒性评价和快速筛选，所需样品量少，基本反映了环境样品中二噁英类污染物的含量和毒性。
Claims (5)
1.一种用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，包括如下步骤：
1)原代细胞培养：将供试草鱼消毒，进行尾静脉去血，解剖鱼体取小块肝组织，用平衡缓冲液清洗至白色后，将肝组织切成0.1～2mm3，用10～30倍肝重体积的0.25v％胰酶消化液消化1～5分钟，待肝组织的细胞分散成小细胞团时即停止消化；过60～100目筛，将滤液转入离心管，离心，倾除上清液，用DMEM/F12培养基清洗沉淀物以除去消化液，最后用同样的培养基重新悬浮细胞，打散均匀并计数，于室温下培养；对细胞的活性用常规的台盼蓝排除法评价，选取活细胞数达到细胞总数的90％以上的草鱼肝细胞备用；
2)绘制标准曲线：将步骤1)得到的草鱼肝细胞按(1～5)×105个/毫升接种至96孔板中，培养1天后，移去90v％的培养基，加入等体积的2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英，继续培养2～5日；然后用pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗培养板中的细胞，再将含有过量7-乙氧基-异酚噁唑酮和香豆素的三羟甲基氨基甲烷反应液加入到微孔板中；室温下充分反应后，在激发波长535nm和发射波长590nm处用荧光光度计测定终产物7-羟基-异酚噁唑酮的荧光强度，并以此作为表示EROD酶活性的参数，绘制2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英对草鱼的原代肝细胞的EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线；
3)检测环境样品：将步骤1)得到的草鱼肝细胞按(1～5)×105个/毫升的密度直接接种至96孔板中，培养1天后，移去90v％的培养基，加入待测环境样品的有机溶剂提取液，继续培养2～5日；然后用pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗培养板中的细胞，再将含有过量7-乙氧基-异酚噁唑酮和香豆素的三羟甲基氨基甲烷反应液加入到微孔板中；室温下充分反应后，在激发波长535nm和发射波长590nm处用荧光光度计测定终产物7-羟基-异酚噁唑酮的荧光强度，来检测环境样品中是否含有二噁英类污染物；
4)将步骤3)测得的结果与步骤2)绘制的标准曲线比较，进而可计算出环境样品中二噁英类污染物的含量，从而评价环境中二噁英类化合物的毒性效应。
2.按权利要求1所述的用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，其特征在于，所述步骤1)中的平衡缓冲液包括0.145mol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，12mmol/LNaHCO3，5mmol/L Na2EDTA，3mmol/L NaH2PO4，1.1mmol/L KH2PO4和100mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸。
3.按权利要求1所述的用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，其特征在于，所述步骤1)中的DMEM/F12培养基包括2wt％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素和100μg/mL链霉素。
4.按权利要求1所述的用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，其特征在于，所述步骤3)中的待测环境样品的有机溶剂提取液的浓度为4～35pg/mL。
5.按权利要求1所述的用于监测环境样品中二噁英类化合物的生物测试方法，其特征在于，所述二噁英类化合物包括二噁英，呋喃，多氯联苯。
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