CN105675375A - 马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物样品内失活线虫的分离技术领域，公开了一种马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒。该分离液由pH为4.40的盐酸溶液、纤维素酶和果胶酶组成，纤维素酶和果胶酶的浓度分别为0.005和0.001mg/μl。马尾松病死木中失活线虫的分离方法按照以下步骤：将马尾松病死木材料纵切成长0.8～1.0cm，厚0.1～1mm的切片置于离心管；移取2000μl分离液于装有切片的离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，采用50℃和250R振荡6h。本发明的分离技术，扩大了可用于检测线虫的样本来源，提高了分离效率。本发明的分离技术简单高效，可制备成试剂盒进行大规模推广。

Description

马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒

技术领域

本发明属于植物样品内失活线虫的分离技术领域，具体涉及一种马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒。

背景技术

松材线虫病是重要的检疫性病害，截至2012年底，我国先后有17个省(自治区、直辖市)的275个县级行政区发生过松材线虫病，占县级行政区域总数9.6％，给我国森林资源和生态环境造成了巨大破坏(宋玉双，2013)。截至2013年，全国仍有15个省(自治区、直辖市)的179个县(市、区)发生松材线虫病(国家林业局2013年第2号公告)。但是中国幅员辽阔，针叶树占森林面积的42.7％，而松树约占整个针叶林面积的58％，适宜松材线虫病流行的地区较广。根据研究，松材线虫病在平均温度10℃的地区就能发生，我国的海南、广东、广西、福建、台湾、浙江、江西、云南、贵州、四川、湖南、湖北、江苏、安徽、河南、陕西、山东、河北、山西、北京、上海、天津、香港均为松材线虫的适生区，而辽宁、新疆、西藏、甘肃的部分地区也适合松材线虫的发生(何龙喜等，2014)。

关于松木中线虫的分离技术，目前常用的方法有：贝尔曼漏斗法和浅盘法两种技术，具体步骤如下所述：

1.贝尔曼漏斗法：①置备一只直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15cm的乳胶管，置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹(弹簧夹)。②对松木样品细木条(或木片、木屑)进行线虫分离时，用剪刀将其剪碎或用尖头镊子、解剖针将其撕碎，剪取大小合适的2层纱布将碎体包裹后，放入漏斗中，关闭漏斗下端乳胶管上的止水夹。然后从漏斗壁慢慢注入清水，使清水充满漏斗和下面乳胶管，水要漫过纱布包。③在25℃下，浸泡24h后，将培养皿置于乳胶管下，打开止水夹，接取15ml浸泡液，供显微镜检验或计数。

2.浅盘法：①浅盘分离装置由2个口径不同的用不锈钢或铝合金等材料制成的浅盘组成，将其中口径略小、底部为粗网筛的浅盘放在另一个浅盘上面。②将大小合适的2层纱布平铺于筛盘上，松木样品细木条(或木片、木屑)置于筛盘纱布上面，慢慢注入清水，使清水浸泡全部样品。③在25℃下，浸泡24h后，移去筛盘，把大浅盘内的样品浸泡液倒入烧杯。烧杯内浸泡液中的线虫可通过自然沉降或离心方法，移去多余的水分，浓缩至适宜的量，以便显微镜检验或计数。

这两种分离线虫的原理是线虫是喜水动物，遇水便会从植物体游出。线虫个体小，可穿过纱布，同时由于线虫身体比重比水大，所以线虫便会下沉到浸泡样品的液体底部(冯志新，2000)。这也决定了这两种技术只能分离出活动性较强的线虫，无法分离出样本中失活线虫。

线虫的活动度受温度和本身生命力影响。生产上存在大量含有失活线虫的植物样品。比如冬天低温和夏天高温，线虫活动减慢；比如冰冻样本内，线虫已经死亡。如何分离出植物样本内失活线虫，国内未见报道。

鉴于松材线虫病是我国的头号森林病害，防治马尾松松材线虫病的最有效途径是抗病育种，而抗病育种需要检测数量巨大的样本内的松材线虫，因此需要将这些样本冰冻储藏起来，因此必须发明植物样本内失活线虫的分离技术。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种马尾松病死木中失活线虫的分离液。该液体对分离马尾松松木内线虫具有高特异性，可用于分离马尾松病死木中的线虫。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述分离液进行马尾松病死木中失活线虫的分离方法。

本发明的再一目的在于提供上述分离液制备而成的用于分离马尾松病死木中失活线虫的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种马尾松病死木中失活线虫的分离液，该分离液由pH为4.40的盐酸溶液、纤维素酶和果胶酶组成，其中纤维素酶的浓度为0.005mg/μl，果胶酶的浓度为0.001mg/μl。

所述pH为4.40的盐酸溶液是用浓盐酸调节双蒸水的pH至4.40制备而成。

一种利用上述的分离液进行马尾松病死木中失活线虫的分离方法，按照以下操作步骤：

(1)用手术刀片纵切马尾松病死木材料，切成长0.8～1.0cm，厚0.1～1mm的切片，用电子天平称取0.2g材料切片置于10ml离心管，并且置于-20℃的冰箱中保存；

(2)用移液枪取2000μl分离液于装有材料切片的10ml离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，设置振荡器的参数为温度50℃、转速250R，振荡6h后，将材料切片取出，于-20℃冰箱保存。

一种利用上述分离液制备而成的用于分离马尾松病死木中失活线虫的试剂盒，可以使得马尾松病死木中失活线虫的分离更加快速、便利。

本发明人通过分析可以分解木材的液体之后，筛选液体组分，确定使用该分离液各组分的浓度配比和使用该分离液处理木材的时间，然后统计利用该技术分离出的线虫数量。运用本发明筛选的分离液，分离出的线虫形态完整；本发明还提供该分离液各组分的最佳浓度配比，在此浓度下，分离出的线虫数量最多；本发明还提供该分离液最佳处理时段，在此时段内，分离出的线虫数量最多。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明的技术可以分离出马尾松病木中的失活线虫。分离出的线虫完整，可以用于单条计数，可以用于定量松材内的线虫数量比较。

(2)由于松材线虫病的复杂性，如何快速、有效地从病木中分离出线虫，一直是松材线虫病鉴定的难点，本发明提供一种从病木中分离失活线虫技术，扩大了可用于检测线虫的样本来源，提高了分离效率。

(3)用分离液处理松材时，处理时所用液体成分是关键的技术参数，本发明通过筛选，得出盐酸\双蒸水\纤维素酶\果胶酶四种最佳组分组合。

(4)用分离液处理松材时，处理时所用液体浓度是关键的技术参数，本发明通过浓度梯度实验，筛选出了最佳浓度，提高了分离效率；

(5)用分离液处理松材时，分离液体处理时间是关键的技术参数。本发明通过处理时间梯度实验，筛选出了最佳时间，提高了分离效率；

(6)本发明的分离技术可制备相应检测试剂盒，从而使得检测更加简单程序化，成本低、有利于大规模推广。

附图说明

图1是分离液处理马尾松松材后分离出的完整的线虫图。

图2是不同浓度梯度的分离液处理马尾松松材后分离出的线虫数量图。

图3是不同时间梯度的分离液处理后分离出的马尾松松材中的线虫数量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1本发明马尾松病死木中失活线虫的分离液筛选及其分离方法

1.马尾松材料准备

用手术刀片纵切马尾松病死木材料材料，切成长0.8～1.0cm，厚0.1mm-1mm的切片，用电子天平称取0.2g材料切片于10ml离心管，并且置于-20℃的冰箱中保存。

2.配制分离液

(1)pH为4.40的盐酸溶液：用浓盐酸调节双蒸水pH至4.40，得到pH为4.40的盐酸溶液；

(2)分离液：称量纤维素酶、果胶酶于50ml离心管中，用移液枪取pH未4.40的盐酸溶液5000ul于50ml离心管，在漩涡震荡仪上震荡，使其混合均匀。不同浓度的分离液按照此方法现配现用，低浓度的分离溶液通过高浓度混合溶液按倍数稀释；

3.利用上述方法处理马尾松材料

用移液枪取2000ul的分离液于装有材料切片的10ml离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，设置振荡器的参数为50℃、250R，计时11h。取出后，于-20℃冰箱保存。

4.线虫形态观察

用移液枪吸取20ul的反应液于载玻片，在解剖镜下观察线虫形态，每次吸取前都要摇匀管内的溶液，每管作5个重复，作好记录。统计线虫完整率。从图1所示，可以看出分离出的线虫形态完整。

实施例2分离液浓度优化

本实施例按照实施例1所述的方法，对分离马尾松病死木失活线虫时，所需要的分离液各组分的量，进行一个优化。

本实施例是根据实施例1的步骤2，配制浓度[纤维素酶/果胶酶(mg/ul)]分别为0.00、0.005/0.001、0.01/0.002、0.02/0.004、0.04/0.008的5个梯度的分离液各10000ul。再用移液枪取2000ul的分离液于装有材料切片的10ml离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，设置振荡器的参数为50℃、250R，计时6h。取出后，于-20℃冰箱保存。

用移液枪吸取20ul的反应液凹载玻片，在解剖镜下观察、计数线虫，每次吸取前都要摇匀管内的溶液，每管作5个重复，作好记录。取平均值。既为每次处理所分离出的线虫数。

用MicrosoftWord(2013，美国微软)和MicrosoftExcel(2013，美国微软)对数据进行处理，作出分离出的线虫数量随分离液浓度的变化曲线。如图2所示，在含有纤维素酶/果胶酶浓度为0.005/0.001mg/ul时，分离出线虫数量最高为4.6条(1g材料中有2300条)。

实施例3分离液对样品处理时间优化

本实施例按照实施例1所述的方法，具体对分离液对样本处理时间进行优化。

本实施例是根据实施例1的步骤2，配制浓度为0.005/0.001(mg/ul)的纤维素酶/果胶酶分离液70000ul，再取含有1620条/克的冰冻松材材料和对照各7组，设置恒温振荡器的参数为50℃、250R，分别计时4h、6h、8h、10h、11h、12h、14h等7个梯度。实验结果表明在50℃、250R、6h，分理出的线虫数量最多，因此本发明优选6h作为处理时间(如图3所示)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种马尾松病死木中失活线虫的分离液，其特征在于：该分离液由pH为4.40的盐酸溶液、纤维素酶和果胶酶组成，其中纤维素酶的浓度为0.005mg/μl，果胶酶的浓度为0.001mg/μl。

2.根据权利要求1所述的一种马尾松病死木中失活线虫的分离液，其特征在于：所述pH为4.40的盐酸溶液是用浓盐酸调节双蒸水的pH至4.40制备而成。

3.一种利用权利要求1所述的分离液进行马尾松病死木中失活线虫的分离方法，其特征在于按照以下操作步骤：

(1)用手术刀片纵切马尾松病死木材料，切成长0.8～1.0cm，厚0.1～1mm的切片，用电子天平称取0.2g材料切片置于10ml离心管，并且置于-20℃的冰箱中保存；

(2)用移液枪取2000μl分离液于装有材料切片的10ml离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，设置振荡器的参数为温度50℃、转速250R，振荡6h后，将材料切片取出，于-20℃冰箱保存。

4.一种利用权利要求1所述的分离液制备而成的用于分离马尾松病死木中失活线虫的试剂盒。