CN117264934A - 一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法，涉及植物寄生线虫分离获取领域。所述酶解液包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶R‑10、离析酶R‑10和果胶酶。将具有根结症状的植物根系与酶解液混合后振荡，得到振荡物；将所述步骤1)得到的振荡物先后过60目、100目和400目网筛，得到筛上物；将得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。利用本发明提供的方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括RNA提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。
Description
技术领域
本发明涉及幼虫分离获取领域，特别是涉及一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法。
背景技术
根结线虫是一种世界范围内广泛分布的重要植物病原线虫，可寄生危害多种粮食和园艺作物，造成重大经济损失。根结线虫属于专性固着性植物内寄生线虫，大部分生活史在寄主根系内完成。根结线虫侵染性幼虫进入根系后，会建立一个固定的取食位点，成为体型膨大不具备移动能力的寄生期幼虫(后期二龄幼虫、三龄幼虫和四龄幼虫)，并最终发育成为雌成虫。
研究表明，寄生期幼虫是取食、致病和抵抗防御反应的关键阶段。因此，获得大量完整的寄生期幼虫是开展根结线虫分子寄生致病机理研究的基本材料需求。由于寄生期幼虫呈固着态存活于根系内，需要对根系进行破碎才能将幼虫分离出来。
目前，获取寄生期幼虫的方法主要有人工解剖法和搅拌破碎法。人工解剖法即利用挑针和手术刀对根系进行人工解剖，并且在显微镜下观察单一逐个挑取膨大的幼虫。该方法劳动量耗费大，难度高，速度慢，且很难一次获得足够的虫量。搅拌破碎法是利用厨房搅拌器对根系进行快速破碎，从而将幼虫释放出来。然而该方法很容易造成虫体破碎失活，且通常虫体表面粘附带有根碎片残渣，同样难以获得大量高质量的虫体。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法，利用本发明提供的酶解液和方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括RNA提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液，包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶R-10、离析酶R-10和果胶酶，所述柠檬酸缓冲液与纤维素酶R-10、离析酶R-10、果胶酶的体积比为200:1:1:4。
优选的，所述纤维素酶R-10的酶活性>10,000U/g；
所述离析酶R-10的酶活性>3,000U/g；
所述果胶酶的酶活性≥3,800U/ml；
所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.1M，pH值为5.0。
本发明还提供了一种根结线虫寄生期幼虫的分离方法，包括以下步骤：
1)将受根结线虫感染具有根结症状的植物根系与上述技术方案所述的酶解液混合后振荡，得到振荡物；
2)将所述步骤1)得到的振荡物依次过60目、100目、400目网筛，得到筛上物；
3)将所述步骤2)得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。
优选的，所述步骤1)植物根系的长度为1cm；
所述植物根系清洗消毒后再与酶解液混合；
所述消毒的条件包括：将所述植物根系经质量百分含量为0.1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水清洗10min。
优选的，所述步骤1)酶解液完全覆盖植物根系。
优选的，所述步骤1)振荡的条件包括：转速为180rpm，时间为6h，温度为30℃。
优选的，所述步骤3)蔗糖溶液的质量百分含量为60％。
优选的，所述步骤3)筛上物离心后再经蔗糖溶液悬浮；
所述离心的条件包括：转速为2000rpm，时间为2min，温度为25℃。
优选的，所述步骤3)离心的条件包括：转速为1000rpm，时间为5min，温度为25℃。
优选的，所述步骤3)水包括无菌水。
本发明分离根结线虫寄生期幼虫的机理为：根结线虫侵染进入植物根系后，在细胞与细胞间隙中生存发育。通过加入可以降解植物细胞壁的酶解液(纤维素酶R-10水解植物细胞壁主要成分纤维素；离析酶R-10半纤维素；果胶酶水解果胶成分)，虫体周围的植物细胞壁组织被酶解呈松弛状态，从而释放出虫体。
本发明的有益效果为：
利用本发明提供的酶解液和方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括RNA提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。
附图说明
图1为酶解法从番茄根系中分离获得体型发育膨大的寄生期幼虫虫体；
图2为根结线虫侵染后形成具有明显根结症状的番茄根系；
图3为酶解法分离获得的根结线虫寄生期幼虫，虫量多，虫体干净完整；
图4为机械破碎法分离获得的根结线虫寄生期幼虫，虫量少，杂质多。
具体实施方式
本发明提供了一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液，包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶R-10、离析酶R-10和果胶酶，所述柠檬酸缓冲液与纤维素酶R-10、离析酶R-10、果胶酶的体积比为200:1:1:4。在本发明中，所述纤维素酶R-10的酶活性优选>10,000U/g；所述离析酶R-10的酶活性优选>3,000U/g；所述果胶酶的酶活性优选≥3,800U/ml；所述柠檬酸缓冲液的浓度优选为0.1M，pH值为5.0。
本发明提供了还一种根结线虫寄生期幼虫的分离方法，包括以下步骤：
1)将受根结线虫感染具有根结症状的植物根系与上述技术方案所述的酶解液混合后振荡，得到振荡物；
2)将所述步骤1)得到的振荡物依次过60目、100目、400目网筛，得到筛上物；
3)将所述步骤2)得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。
本发明将具有根结症状的植物根系与上述技术方案所述的酶解液混合后振荡，得到振荡物。在本发明中，所述植物根系的长度优选为1cm。在本发明中，所述植物根系优选消毒后再与酶解液混合。在本发明中，所述纤维素酶、离析酶和果胶酶的作用是水植物细胞壁主要成分纤维素、半纤维素和果胶等。在本发明中，所述消毒的条件优选包括：将所述植物根系经质量百分含量为0.1％次氯酸钠溶液消毒5min，水清洗10min。在本发明中，所述缓冲液优选完全覆盖植物根系。在本发明中，所述振荡的条件优选包括：转速为180rpm，时间为6h，温度为30℃。
本发明将得到的振荡物依次过60目、100目、400目网筛，得到筛上物。本发明优选按从上到下的顺序组合放置60目、100目和400目的分离网筛。
本发明将得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。在本发明中，所述蔗糖溶液的质量百分含量为60％，所述蔗糖的作用是悬浮线虫。在本发明中，所述筛上物优选离心后再经蔗糖溶液悬浮；所述离心的条件优选包括：转速为2000rpm，时间为2min，温度为25℃。在本发明中，所述步骤3)离心的条件优选包括：转速为1000rpm，时间为5min，温度为25℃。在本发明中，所述水优选包括无菌水，本发明优选将无菌水轻轻滴加到悬浮物上，所述水与蔗糖溶液的体积比为1:10。本发明优选使用水平离心机进行离心。在本发明中，所述根结线虫寄生期幼虫被分离到无菌水中。
本发明实施例使用到的材料和试剂如下：
主要实验材料与试剂：次氯酸钠溶液、固体纤维素酶、固体离析酶、液体果胶酶、柠檬酸、蔗糖、控温摇床、水平离心机、分离网筛(60目、100目、400目)、玻璃离心管(15ml)。
柠檬酸缓冲液(pH 5.0)：0.1M柠檬酸溶液(C4H2O7·H2O)。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从番茄根系中分离获取南方根结线虫(Meloidogyne incognita)寄生期幼虫的方法，步骤为：
(1)收集具有明显根结症状的番茄根系，用清水彻底清洗表面土壤及残渣后，剪成长度约为1厘米左右的片段。
(2)将根片段用质量百分含量为0.1％次氯酸钠溶液消毒处理5分钟，随后用清水彻底冲洗10分钟，去除残留次氯酸钠溶液。
(3)将番茄根片段放入500毫升规格的容量瓶中，并加入200毫升0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.0)，使溶液能完全覆盖住根系。
(4)加入1克纤维素酶R-10、1克离析酶R-10和4毫升果胶酶，轻微振荡混匀。
(5)将含番茄根系片段混合液的容量瓶放入控温摇床，180rpm，30℃振荡6小时，得到振荡物。
(6)机械破碎法，将步骤3收集的根片段放入厨房用搅拌器中，加入灭菌水，使水完全覆盖根系。
(7)在搅拌器中，点动破碎30秒，得到根碎片。
(8)按从上到下的顺序组合放置60目、100目和400目的分离网筛。
(9)分别将步骤6和步骤9得到的振荡物从上到下分离过筛，收集400目分离筛上的残渣。
(10)将残渣转入玻璃离心管，在水平离心机上2000rpm，离心2分钟。
(11)弃上清，加入10毫升质量百分含量为60％蔗糖溶液，悬浮离心管底层的残渣。
(12)静置2分钟后，在蔗糖溶液界面轻轻滴加1毫升灭菌水，保持蔗糖-水呈分层状态。
(13)水平离心机上1000rpm，离心5分钟。
(14)用滴管吸取位于灭菌水层的寄生期幼虫，显微镜下观察。
(15)镜检结果显示，灭菌水层中含有多头体型膨大呈腊肠形和肾形状线虫，此为典型的根结线虫寄生期幼虫的形态特征(图2)。并且所获虫体干净，体形完整，保持有完好的活性。上述试验结果表明，采用酶解法具有良好的根结线虫寄生期幼虫分离效率，且获得的虫体干净，活性好，能够满足RNA提取、原位杂交等试验对虫体的质量要求。
实施例2
酶解法和机械破碎法分离寄生期幼虫效率比较。
(1)收集受根结线虫侵染30天的番茄根系(图1)。
(2)按照实施例1中的所述步骤1和3，收集根结碎片，并进行消毒处理。
(3)将根片段混匀平均分成两份，每份取5克根片段，分别以酶解法和机械破碎法分离寄生期幼虫。
(4)酶解法，按照实施例1所述步骤进行。
(5)机械破碎法，将步骤3收集的根片段放入厨房用搅拌器中，加入200毫升灭菌水，使水完全覆盖根系。
(6)在搅拌器中，点动破碎30秒，得到根碎片。
(7)按从上到下的顺序组合放置60目、100目和400目的分离网筛。
(8)收集400目分离筛上的残渣。
(9)线虫的离心悬浮步骤均按照实施例1所述方法进行。
(10)镜检统计结果显示，酶解法获取的寄生期幼虫数量多，平均达到31头/克根，且虫体干净完整，保持有完整的活性(图3)。机械破碎法获取的寄生期幼虫数量少，平均仅为9头/克根，部分虫体断裂失活，且分离溶液中根系碎片残渣多，上面粘附有较多的卵粒无法清除(图4)。上述试验结果表明，采用酶解法具有更高的根结线虫寄生期幼虫分离效率，且获得的虫体干净，活性好，能够满足RNA提取、原位杂交等试验对虫体的质量要求。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液，其特征在于，包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶R-10、离析酶R-10和果胶酶，所述柠檬酸缓冲液与纤维素酶R-10、离析酶R-10、果胶酶的体积比为200:1:1:4。
2.根据权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述纤维素酶R-10的酶活性>10,000U/g；
所述离析酶R-10的酶活性>3,000U/g；
所述果胶酶的酶活性≥3,800U/ml；
所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.1M，pH值为5.0。
3.一种根结线虫寄生期幼虫的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将受根结线虫感染具有根结症状的植物根系与权利要求1所述的酶解液混合后振荡，得到振荡物；
2)将所述步骤1)得到的振荡物依次过60目、100目、400目网筛，得到筛上物；
3)将所述步骤2)得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)植物根系的长度为1cm；
所述植物根系清洗消毒后再与酶解液混合；
所述消毒的条件包括：将所述植物根系经质量百分含量为0.1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水清洗10min。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)酶解液完全覆盖植物根系。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)振荡的条件包括：转速为180rpm，时间为6h，温度为30℃。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)蔗糖溶液的质量百分含量为60％。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)筛上物离心后再经蔗糖溶液悬浮；
所述离心的条件包括：转速为2000rpm，时间为2min，温度为25℃。
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)离心的条件包括：转速为1000rpm，时间为5min，温度为25℃。
10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)水包括无菌水。
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