CN111665209B - 基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，该方法将中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标，通过检测中国鲎血液中铜元素含量并计算出上述其他指标，来监测中国鲎血液的质量，其监测方法包括取得样品、样品处理、检测样品中Cu元素含量、计算结果、等确定中国鲎血液质量健康标准步骤。该方法简便、高效、快捷、省时、省力、省钱，本发明中国鲎血液质量的采血量仅为1‑3ml，一旦在生产上实施，即可减少不当采血对中国鲎健康造成的影响，对中国鲎的利用与保护具有重要意义。

Description

基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法
技术领域
本发明涉及一种甲壳类海洋动物的血液质量监测方法，特别是涉及一种基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，属于海洋药用资源开发与利用领域。
背景技术
世界上现在仅存4种鲎，分别为美洲东海岸的美洲鲎(Limulus polyphemus)、亚洲地区的中国鲎(Tachypleus tridentatus)(也称三棘鲎、中华鲎、东方鲎)、南方鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。在这4种鲎中，只有中国鲎和美洲鲎可以生产鲎试剂，所以按来源鲎试剂可分为两种，一种是中国鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate，缩写为 TAL)，原材料为中国鲎血液; 另一种是美洲鲎试剂( Limulus Amebocyte Lysate，缩写为 LAL)，提取自美洲鲎的血液。中国鲎是世界上体形最大、最适合生产鲎试剂的鲎。因此，中国鲎是我国生产鲎试剂重要的海洋药用生物资源。
北部湾是世界上仅存的拥有中国鲎数量最大的地区，是中国鲎最重要的栖息地，但由于从20世纪80年代开始中国大规模生产鲎试剂，中国鲎的数量便开始急剧下降。生产鲎试剂过程中不科学的采血方式，使中国鲎面临着巨大的威胁，采血不规范、放生保护措施不到位、过度取血，甚至直接把鲎血抽干，这些杀鸡取卵式的采血方法造成很多被采血的中国鲎难逃一死，导致中国鲎的种群数量持续下降。根据广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室的调查，目前，广西北部湾海域成年的中国鲎数量仅为1万对左右，资源几近枯竭。2019年3月，中国鲎在世界自然保护联盟（IUCN）红色名录里的等级从原本的数据缺乏（DD）更新为濒危（EN）。
如果继续按照传统的采血方式生产鲎试剂，势必会造成中国鲎数量持续下降，甚至在短时间内中国鲎将消耗殆尽。如果不继续从野外捕捉中国鲎采血生产鲎试剂，我国的鲎试剂（TAL）产业，将会因为没有原料而无以为继。因此，作为濒危物种，中国鲎的保护必将进入到新的历史阶段。但是，面对巨大的市场需求，如何科学利用中国鲎资源则显得尤为重要。
科学利用中国鲎资源就是要改变传统的中国鲎采血方式，如果我们在人工养殖条件下开展可持续性抽血，即把在自然海域捕获的中国鲎驯养在池塘中，然后定期定量对鲎进行抽血，并确保鲎的成活率，提高鲎的利用率，实现可持续性多次抽血，从而减少中国鲎的捕获量。鲎的寿命通常可以达到60岁，如果实现可持续抽血，估计一只鲎的抽血量至少要达到传统抽血方式的20-30倍。这样，在当前的鲎试剂生产规模下，可以确保中国鲎的种群数量不再减少。
但是，由于中国鲎在养殖与采血过程中会受到气候、水质、摄食等多种因素的影响，血液的再生与恢复并非总是一样的，如果采血以后的中国鲎的血液质量没有得到很好的恢复而继续按照原来的计划定期定量采血，势必直接影响到中国鲎的健康甚至造成其死亡。因此，建立基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，是科学利用中国鲎资源的一项重要的技术。
我们通常选择中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标。但是，由于中国鲎的血细胞具有更容易凝集的特点，在进行中国鲎血细胞计数时要求全程无菌操作，实验条件较为苛刻，稍有不慎就可能影响实验结果。即使严格地执行无菌操作，如果多次采血，中国鲎的血细胞也同样可能出现凝集，影响血细胞计数。而血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量的检测需要购买试剂盒进行生化反应，对实验设备要求较高，同时需要消耗大量的试剂盒等材料，还要付出人力成本和时间成本。因此，在生产鲎试剂过程中监测血液质量需要较高的人力、物力、财力付出，这样企业就没有监测的积极性，不利于中国鲎的保护。
发明内容
为了解决现有技术对实验设备要求较高，同时需要消耗大量的试剂盒等材料，在生产鲎试剂过程中监测血液质量需要较高的人力、物力、财力付出等问题，本发明提供一种在每次采血的过程中取少量中国鲎血液作为样品，通过仅检测中国鲎血液中铜元素含量，并通过铜元素含量计算出血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等生理生化指标，以监测中国鲎血液质量的变化，建立基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法。
解决上述技术问题，采用以下技术方案：
一种基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，该方法将中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标，通过仅检测中国鲎血液中铜元素含量并计算出上述其他指标，来监测中国鲎血液的质量，其监测方法包括下述步骤：
A.取得样品：
每只中国鲎采血1-3ml作为样品，首先在取样管中精确加入抗凝剂0.5-2ml，把1-3ml的中国鲎血移入样品管中，中国鲎血与抗凝剂混合均匀即为样品；
B.样品处理：
采用灰化法或微波消解法将样品加热、冷却、定容处理；
C. 检测样品中Cu元素含量：
使用原子吸收光谱仪对样品中Cu元素含量进行检测，按照原子吸收光谱仪的操作要求配制Cu元素标准溶液，然后用火焰法或石墨炉法测定样品中的Cu元素含量；
D.计算结果：
①中国鲎血液中Cu元素含量的计算：
中国鲎血液中Cu元素含量（mg/l）=样品中Cu元素含量（mg/l）×[样品量（ml）-抗凝剂的量（ml）]÷样品量（ml）；
②中国鲎血细胞数的计算：y=12.28+1.72x
式中：y为中国鲎血细胞数（×103/ml），x为中国鲎血液中铜元素含
量（mg/l）；
③中国鲎血浆蛋白含量的计算：y=2.08+0.78x
式中：y为中国鲎血浆蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜元素含量（mg/l）；
④中国鲎血淋巴蛋白含量的计算：y=1.87+0.62x
式中：y为中国鲎血淋巴蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）；
E.确定中国鲎血液质量健康标准：
根据生产实际,当以下四种情况出现其中一种时即提示中国鲎血液质量下降，应当暂停采血作业：
①中国鲎血液中Cu元素含量低于16mg/l,
②中国鲎血细胞数量低于20×103个/ml,
③中国鲎血浆蛋白含量低于14mg/ml,
④中国鲎血淋巴蛋白含量低于12mg/ml。
作为优选方案：
步骤A选择的中国鲎体长30cm，从北部湾海域捕获后，在海边的水塘中养两周，然后转移至实验室的循环水养殖系统中，养殖用水取自广西三娘湾海域的海水，盐度25‰，养殖温度26-28℃，在实验室静养4周后进行取样。
步骤A取样品时，要准确记录添加抗凝剂的量（ml）和血液样品量（ml）。
步骤A中所述的抗凝剂是用茶碱≥98%和NaCl配制盐度25‰、茶碱浓度0.5mol/L的混合溶液。
步骤B所述的灰化法是：把样品放入坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，500-550℃恒温灰化4-5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容至10ml。
步骤B所述的微波消解法是：把样品放入微波消解罐中,加入2-5mL硝酸,按照微波消解的操作步骤消解试样,即120℃升温5min、恒温5min，160℃升温5min、恒温10min，180℃升温5min、恒温10min，消解结束后冷却取出,在电热板上于120-150℃赶酸至1mL，再次冷却后定容至10ml。
步骤C所述的火焰法是：称取鲎血样品于坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，500℃恒温灰化5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容10ml，用原子吸收分光光度计火焰法测定Cu元素含量。
D、E步骤中所述的血细胞的计数方法是： 将血细胞计数板及相关用品180℃烘干6h，取鲎血样品经抗凝剂稀释后滴入血细胞计数板，在显微镜下计数，重复三次，取平均值得中国鲎血血细胞数量。
D、E步骤中所述的血浆蛋白含量的检测方法是：将多功能酶标仪预热25-35min，调节波长至540nm，蒸馏水调零，取中国鲎血样品放入经灭菌处理的离心管离心，然后用酶标仪测定并计算蛋白含量，取三个重复的平均值，即为血浆蛋白含量。
D、E步骤中所述的血淋巴蛋白含量的检测方法是：取中国鲎血样品不经离心管离心，直接按照双缩脲法蛋白含量检测试剂盒说明书的方法检测，即为血淋巴蛋白含量。
采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明在每次采血的过程中取少量中国鲎血液作为样品，通过检测中国鲎血液的几个重要的生理生化指标，监测中国鲎血液质量的变化，当中国鲎血液质量的指标下降到标准限度，则停止采血让其恢复健康，直至血液质量的指标重新恢复到预定数值，即可再次进行采血作业。该方法具有简便、高效、快捷、省时、省力、省钱的特点。与现有技术相比，现有技术生产鲎试剂过程中每只中国鲎采血量为100-200ml，本发明中国鲎血液质量的采血量仅为1-3ml，一旦在生产上实施，即可减少不当采血对中国鲎健康造成的影响，对中国鲎的利用与保护具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，应该指出，本发明的保护范围并不局限与此。
本发明公开的是一种基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，该方法选择中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标。通过检测鲎血液中的铜元素含量，计算血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指标，监控血液质量，事实上就是通过铜元素含量监测血液质量，其质量监测方法按照下述步骤进行监测。
1. 选择的中国鲎
本发明选择的中国鲎体长30cm左右（含剑尾），从北部湾海域捕获后，暂养在海边的水塘中2周，然后随机捕捞9只分3组每组3只转移至实验室的循环水养殖系统中，分别标记为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9。养殖用水取自广西三娘湾海域的海水，盐度25‰，养殖温度26-28℃，每周投喂鱼肉2次，在实验室静养4周后进行取样。
2.取得样品：
把中国鲎放入经紫外线灭菌的超净台内，用碘伏消毒液对其背侧胸腹连接处的心门位置消毒处理，然后用75%的酒精擦去碘伏。取20ml的无菌注射器先吸入10ml的抗凝剂，该抗凝剂是用茶碱≥98%和NaCl配制盐度25‰、茶碱浓度0.5mol/L的溶液混合制得，用注射针头从中国鲎胸腹关节处刺入心门，抽取血液1-3ml，在采血过程中把鲎血精确移入样品管中至1-5ml，混匀即为样品备用，准确记录添加抗凝剂的量（ml）和血液样品量（ml）。
3.样品处理：采用灰化法或微波消解法
①灰化法：把样品放入坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，500-550℃恒温灰化4-5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容至10ml。
②微波消解法：把样品放入微波消解罐中,加入2-5mL硝酸,按照微波消解的操作步骤消解试样,即120℃升温5min、恒温5min，160℃升温5min、恒温10min，180℃升温5min、恒温10min，消解结束后冷却取出,在电热板上于120-150℃赶酸至1mL左右。再次冷却后定容至10ml。
3. 检测样品
（1）检测样品中Cu元素含量：
用原子吸收光谱仪检测样品中Cu元素含量（ml）。按照原子吸收光谱仪的操作要求配制Cu元素标准溶液，然后用火焰法或石墨炉法测定样品中的Cu元素含量（ml）。
火焰法测定铜元素含量：精确称取鲎血样品10ml于坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，500℃恒温灰化5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容10ml，用AA-7000系列原子吸收分光光度计火焰法测定Cu元素含量。
石墨炉法测定：石墨炉法是原子吸收光谱仪的另一种常规分析方法。
(2)血细胞计数：
血细胞计数板及相关用品180℃烘干6h，取鲎血样品经抗凝剂稀释后滴入血细胞计数板，在显微镜下计数，重复三次，取平均值得中国鲎血血细胞数量。
(3)血浆蛋白与血淋巴蛋白含量的检测：
采用多功能酶标仪，将多功能酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。取中国鲎血样品1ml放入经灭菌处理的离心管10000rpm离心10min，按照双缩脲法蛋白含量检测试剂盒说明书的要求，制备空白管、标准管，用鲎血和血浆分别制备测定管，每个样品制备三个测定管，然后用酶标仪测定并计算蛋白含量，取三个重复的平均值，即为血浆蛋白含量。
取中国鲎血样品不经离心直接按照双缩脲法蛋白含量检测试剂盒说明书的方法检测，即为血淋巴蛋白含量。
本实施例所述的原子吸收光谱仪、多功能酶标仪、双缩脲法蛋白含量检测试剂盒均为市售产品。
4.计算检测结果：
①中国鲎血液中Cu元素含量的计算：
中国鲎血液中Cu含量（mg/l）=样品中Cu元素含量（ml）×样品量（ml）-抗凝剂的量（ml））÷样品量（ml）
②中国鲎血细胞数的计算：y=6.14+0.86x
式中：y为中国鲎血细胞数（×103/ml），x为中国鲎血液
中铜元素含量（mg/l）。
③中国鲎血浆蛋白含量的计算：y=2.08+0.78x
式中：y为中国鲎血浆蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）。
④中国鲎血淋巴蛋白含量的计算：y=1.87+0.62x
式中：y为中国鲎血淋巴蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）。
5.根据生产实际确定中国鲎血液质量健康标准：
例如，当以下四种情况出现其中一种时即提示中国鲎血液质量下降，应当暂停采血作业：
①中国鲎血液中Cu含量低于16mg/l；
②中国鲎血细胞数量低于20×103个/ml；
③中国鲎血浆蛋白含量低于14mg/ml；
④中国鲎血淋巴蛋白含量低于12mg/ml。
本发明的检测原理：
中国鲎的血液通常称为血淋巴，血淋巴由血细胞和血浆组成。血细胞包括两种，即占比达99%的血细胞和少量的血蓝细胞，血细胞也称颗粒细胞，成年鲎只含有血细胞。鲎的血细胞中含有能与内毒素起凝集作用的酶系统，可以用于生产鲎试剂，因此，鲎血中的血细胞数量不但反映了鲎的血液恢复状态，也决定了鲎试剂生产的效率。血浆是血细胞的载体，对内环境的稳态起着决定性作用。血浆蛋白包括血蓝蛋白、α2-巨球蛋白、C-反应蛋白，其中血蓝蛋白是一种可溶性的呼吸蛋白，占血浆蛋白的90-95%。铜元素是血蓝蛋白的重要组成成分，血蓝蛋白的每个氧结合位点有2个铜离子，血液中铜的含量能够准确反映血蓝蛋白的含量。因此，我们选择中国鲎血液中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指标。
统计分析：采用WPS2019表格对实验数据进行整理、统计，采用SPSS22进行相关性与显著性分析。
结果：中国鲎血液质量指标检测结果见表1。
表1 中国鲎血液质量指标检测结果（n=9）
Figure 668046DEST_PATH_IMAGE001
中国鲎血液质量指标相关性与显著性见表2。
表2 中国鲎血液质量指标相关性与显著性（n=9）
Figure 191431DEST_PATH_IMAGE002
注：**表示相关性在0.01层上显著
参见表1-2
由表1、2可知，中国鲎血液中铜含量与血细胞数呈极显著相关，其换算关系为：
y=6.14+0.86x
式中：y为中国鲎血细胞数（×103/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）。
由表1、2可知，中国鲎血液中铜含量与血浆蛋白含量呈极显著相关，其换算关系为：
y=2.08+0.78x
式中：y为中国鲎血浆蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）。
由表1、2可知，中国鲎血液中铜含量与血淋巴蛋白含量呈极显著相关，其换算关系为：
y=1.87+0.62x
式中：y为中国鲎血淋巴蛋白含量（mg/ml），x为中国鲎血液中铜含量（mg/l）。
由于中国鲎血液中铜元素含量与血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量均呈极显著相关，检测血液中铜含量不但代表了中国鲎血液中血蓝蛋白含量，而且还可以换算成血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量，因此，中国鲎血液中铜含量作为检测血液质量的指标，具有较高的科学性和可行性，可以减少检测所需的时间，节约检测成本，节省人力成本，提高检测效率，减少中国鲎血液的消耗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了较详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，该方法将中国鲎血液
中铜元素含量、血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量作为监测中国鲎的血液质量指
标，通过检测中国鲎血液中铜元素含量并计算出上述血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量，来监测中国鲎血液的质量，
其监测方法包括下述步骤：
A.取得样品：
每只中国鲎采血1-3ml作为样品，首先在取样管中精确加入抗凝剂0.5-2ml，把1-3ml的
中国鲎血移入样品管中，中国鲎血与抗凝剂混合均匀即为样品；
B.样品处理：
采用灰化法或微波消解法将样品加热、冷却、定容处理；
C. 检测样品中Cu元素含量：
使用原子吸收光谱仪对样品中Cu元素含量进行检测，按照原子吸收光谱仪的操作要求
配制Cu元素标准溶液，然后用火焰法或石墨炉法测定样品中的Cu元素含量；
D.计算结果：
①中国鲎血液中Cu元素含量的计算：
中国鲎血液中Cu元素含量mg/l=样品中Cu元素含量mg/l×[样品量ml-抗凝剂的
量ml]÷样品量ml；
②中国鲎血细胞数的计算：y1=12.28+1.72x
式中：y1为中国鲎血细胞数单位为103个/ ml，x为中国鲎血液中铜元素含
量mg/l；
③中国鲎血浆蛋白含量的计算：y2=2.08+0.78x
式中：y2为中国鲎血浆蛋白含量mg/ml，x为中国鲎血液中铜元素含量mg/l；
④中国鲎血淋巴蛋白含量的计算：y3=1.87+0.62x
式中：y3为中国鲎血淋巴蛋白含量mg/ml，x为中国鲎血液中铜含量mg/l；
E.确定中国鲎血液质量健康标准：
当以下四种情况出现其中一种时即提示中国鲎血液质量下降，应当暂
停采血作业：
①中国鲎血液中Cu元素含量低于16mg/l,
②中国鲎血细胞数量低于20×10 3 个/ml,
③中国鲎血浆蛋白含量低于14mg/ml,
④中国鲎血淋巴蛋白含量低于12mg/ml。
2.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，步骤
A选择的中国鲎体长30cm，从北部湾海域捕获后，在海边的水塘中养2周，然后转移至实验室
的循环水养殖系统中，养殖用水取自广西三娘湾海域的海水，盐度25‰，养殖温度26-28℃，
在实验室静养4周后进行取样。
3.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，步骤
A取样品时，要准确记录添加抗凝剂的量ml和血液样品量ml。
4.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，步骤
A中所述的抗凝剂是用茶碱≥98%和NaCl配制盐度25‰、茶碱浓度0.5mol/L的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，步骤
B所述的灰化法是：把样品放入坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，
500-550℃恒温灰化4-5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容至10ml。
6.根据权利要求1或5所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，
步骤B所述的微波消解法是：把样品放入微波消解罐中,加入2-5mL硝酸,按照微波消解的操
作步骤消解试样,即120℃升温5min、恒温5min，160℃升温5min、恒温10min，180℃升温
5min、恒温10min，消解结束后冷却取出,在电热板上于120-150℃赶酸至1mL，再次冷却后定
容至10ml。
7.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，步骤
C所述的火焰法是：称取鲎血样品于坩埚中，在电炉上小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉
中，500℃恒温灰化5小时，然后加入适量1：1的盐酸溶解后定容10ml，用原子吸收分光光度
计火焰法测定Cu元素含量。
8.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，D、E
步骤中所述的血细胞的计数方法是： 将血细胞计数板及相关用品180℃烘干6h，取鲎血样
品经抗凝剂稀释后滴入血细胞计数板，在显微镜下计数，重复三次，取平均值得中国鲎血血
细胞数量。
9.根据权利要求1所述的基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法，其特征在于，D、E
步骤中所述的血浆蛋白含量的检测方法是：将多功能酶标仪预热25-35min，调节波长至
540nm，蒸馏水调零，取中国鲎血样品放入经灭菌处理的离心管离心，然后用酶标仪测定并
计算蛋白含量，取三个重复的平均值，即为血浆蛋白含量。
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