CN110221041B - 利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，包括以下步骤：S1：筛选发光蚯蚓并在净化培养基中进行净化1天；S2：将净化后的发光蚯蚓平均分为三组，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；S3：在污染土壤区域取样，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入一组发光蚯蚓，培育3‑4天；S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；S5：计算每组平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级。本发明具有检测方便，准确率高等优点。

Description

利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法
技术领域
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法。
背景技术
随着人类科学的发展进步，大量的重金属污染物通过各种途径进入到土壤环境中，导致土壤的重金属污染问题越来越严重。蚯蚓毒性试验是诊断和鉴别土壤污染生态效应的常用方法。蚯蚓是完全的土壤环节动物，通过土壤中食物链而富集重金属，蚯蚓体内重金属含量随着重金属污染的程度加深而增加，是监测土壤重金属污染、评价土壤质量最常用的指示物。而在蚯蚓中有一类能够发光的蚯蚓较为特殊，全世界已经报道的发光蚯蚓有17属近40种，分别属于以下3科，即正蚓科、巨蚓科、线蚓科。对于发光物质的来源问题，经过学者大量的观察和实验，证实蚯蚓的发光物质是来自体腔液，该体腔液中含有能够被激发的发光蛋白，并且该蛋白的活性受到重金属污染物的影响。
目前国内外有关蚯蚓生态毒性试验的研究很多，但是大部分都集中在农药或者重金属污染对蚯蚓的死亡率的影响上，或者蚯蚓的逃避率上。例如中国发明专利CN201610970436.2公开了一种用于评价液体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法及装置，以及CN201320721635.1公开的一种诊断污染土壤生态毒性的蚯蚓逃避实验装置。上述两种方法在诊断土壤污染中确实有一定程度的效果，但是判断较为模糊，不能够精确的对土壤的污染等级进行初步划分。
现有技术中也有利用发光细菌对重金属污染土壤进行定量检测分析，例如发明专利号为CN107238599A公开了一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，通过甲醇/乙二醇浸提农田土壤样品中的毒性物质，用毒性检测仪直接检测样品浸提液的综合毒性。但是该方法中需要用到含有发光细菌的冻干粉通常价格也并不廉价，造成成本偏高，并且整体操作所用到的试剂和仪器等也较为繁琐。
发明内容
针对以上存在的技术问题，本发明提供一种用时短，测量方便，准确度高的重金属污染土壤生态毒性检测的方法。
本发明的技术方案为：一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，包括以下步骤：
S1：筛选发光蚯蚓并在净化培养基中进行净化1天；
S2：将净化后的发光蚯蚓利用纯水进行清洗，平均分为三组，每组8-10条，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；
S3：在污染土壤区域取样，初步筛分后，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入一组发光蚯蚓，调节环境参数，培育3-4天；
S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，清洗干净后，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；
S5：计算对应的实验组的初始荧光值和最终荧光值的差值，利用差值除以初始荧光值得到每组的抑光率再求平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级。
进一步地，S1中所述发光蚯蚓为陆正蚓、安德爱盛蚓或腹枝蚓中的一种或任意几种。
进一步地，S1中所述发光蚯蚓的筛选标准为：选择来自同一生长环境，无伤残，个体均匀，蚯龄小于或等于4周的蚯蚓进行实验。
进一步地，S1中所述净化培养基按照质量百分比计包括：1-3％小分子肽、3-6％亚油酸、5-7％葡萄糖、0.7-0.9％NaCl、0.5-1.5％复合维生素粉，余量为无菌纸浆。小分子肽能够激发发光蚯蚓体内荧光蛋白的活性，强化其功能。亚油酸、葡萄糖、NaCl和复合维生素粉为其提供生命要素，其中复合维生素粉是由维生素A、维生素B、维生素C按照质量比为1:1:1组成的。无菌纸浆则采用经过高温灭菌的无漂白原木纸浆。
进一步地，S1和S4中所述发光检测体系包括：2-5mg碳酸钙、2-4mg七水硫酸镁、2-6ml双氧水、50-60ml甲醇、300-500ml磷酸缓冲液。
更进一步地，利用所述发光检测体系检测发光蚯蚓荧光值的方法包括以下步骤：
1)以每组发光分蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入2-5mg碳酸钙、2-4mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，避免浸泡，每隔30s通入0.5-2mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；用于刺激发光蚯蚓分泌能发光的粘液；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，将其表面的残余液体均匀涂抹在载玻片上；
3)在每片含有残余液体的载玻片表面上滴加2-3ml的甲醇，并涂抹均匀，固定停留10-20min，利用剩余的磷酸冲液冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
4)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入2-6ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
进一步地，S3中所述环境参数为：温度为20-25℃，湿度为60-80％，pH为6.8-7.3，含氧量为8-10％，避光。
进一步地，S3中每个实验组中污染土壤样本中发光蚯蚓的密度为2条/dm3。密度过低都会影响实验参数的准确性，过低则会造成检测的繁琐。
进一步地，S5中所述生态毒性等级的划分标准为：当平均抑光率<45％，毒性为低毒，等级为三级；当所述45≦平均抑光率≦80％，毒性为中毒，等级为二级；当平均抑光率>80％，毒性为高毒，等级为一级。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用重金属对发光蚯蚓体内发光蛋白抑制的原理，对其前后的产生的粘液的荧光值进行检测，并计算平均抑光率，更具平均抑光率的参数划分土壤污染的生态毒性等级。相较于利用蚯蚓死活判断土壤生态毒性的方法，用时更短且精准度更高。而相对于利用发光细菌进行重金属污染土壤检测的方法，本发明利用发光蚯蚓则对较大的样本量中的重金属成分进行富集，检测的稳定性好、准确率高且成本低。
具体实施方式
实施例1
一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，包括以下步骤：
S1：筛选来自同一生长环境，无伤残，个体均匀，蚯龄等于4周的发光蚯蚓(陆正蚓)进行实验，将陆正蚓在净化培养基中进行净化1天；其中，净化培养基按照质量百分比计包括：1％小分子肽、3％亚油酸、5％葡萄糖、0.7％NaCl、0.5％复合维生素粉，余量为无菌纸浆。小分子肽能够激发发光蚯蚓体内荧光蛋白的活性，强化其功能。亚油酸、葡萄糖、NaCl和复合维生素粉为其提供生命要素，其中复合维生素粉是由维生素A、维生素B、维生素C按照质量比为1:1:1组成的。无菌纸浆则采用经过高温灭菌的无漂白原木纸浆。
S2：将净化后的发光蚯蚓(陆正蚓)利用纯水进行清洗，平均分为三组，每组8条，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；
S3：在污染土壤区域取样，初步筛分后，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入8条发光蚯蚓，密度为2条/dm3。密度过低都会影响实验参数的准确性，过低则会造成检测的繁琐。并且调节环境参数为：温度为20℃，湿度为60％，pH为6.8，含氧量为8％，避光培育3天；
S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，清洗干净后，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；
其中，S1和S4中初始荧光值和最终荧光值的测量方法相同，均包括以下步骤：
1)以每组发光分蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入2mg碳酸钙、2mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，避免浸泡，每隔30s通入2mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；用于刺激发光蚯蚓分泌能发光的粘液；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，将其表面的残余液体均匀涂抹在载玻片上；
3)在每片含有残余液体的载玻片表面上滴加2ml的甲醇，并涂抹均匀，固定停留10min，利用剩余的磷酸冲液冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
4)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入2ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
S5：计算对应的实验组的初始荧光值和最终荧光值的差值，利用差值除以初始荧光值得到每组的抑光率再求平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级。
所述生态毒性等级的划分标准为：当平均抑光率<45％，毒性为低毒，等级为三级；当所述45≦平均抑光率≦80％，毒性为中毒，等级为二级；当平均抑光率>80％，毒性为高毒，等级为一级。
实施例2
一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，包括以下步骤：
S1：筛选来自同一生长环境，无伤残，个体均匀，蚯龄等于4周的发光蚯蚓(腹枝蚓)进行实验，将陆正蚓在净化培养基中进行净化1天；其中，净化培养基按照质量百分比计包括：2％小分子肽、4.5％亚油酸、6％葡萄糖、0.8％NaCl、1.0％复合维生素粉，余量为无菌纸浆。小分子肽能够激发发光蚯蚓体内荧光蛋白的活性，强化其功能。亚油酸、葡萄糖、NaCl和复合维生素粉为其提供生命要素，其中复合维生素粉是由维生素A、维生素B、维生素C按照质量比为1:1:1组成的。无菌纸浆则采用经过高温灭菌的无漂白原木纸浆。
S2：将净化后的发光蚯蚓(腹枝蚓)利用纯水进行清洗，平均分为三组，每组9条，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；
S3：在污染土壤区域取样，初步筛分后，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入9条发光蚯蚓，密度为2条/dm3。密度过低都会影响实验参数的准确性，过低则会造成检测的繁琐。并且调节环境参数为：温度为20-25℃，湿度为72％，pH为7.1，含氧量为9％，避光培育3天；
S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，清洗干净后，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；
其中，S1和S4中初始荧光值和最终荧光值的测量方法相同，均包括以下步骤：
1)以每组发光分蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入3.5mg碳酸钙、3mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，避免浸泡，每隔30s通入1.2mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；用于刺激发光蚯蚓分泌能发光的粘液；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，将其表面的残余液体均匀涂抹在载玻片上；
3)在每片含有残余液体的载玻片表面上滴加2.5ml的甲醇，并涂抹均匀，固定停留15min，利用剩余的磷酸冲液冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
4)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入4ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
S5：计算对应的实验组的初始荧光值和最终荧光值的差值，利用差值除以初始荧光值得到每组的抑光率再求平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级。
所述生态毒性等级的划分标准为：当平均抑光率<45％，毒性为低毒，等级为三级；当所述45≦平均抑光率≦80％，毒性为中毒，等级为二级；当平均抑光率>80％，毒性为高毒，等级为一级。
实施例3
一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，包括以下步骤：
S1：筛选来自同一生长环境，无伤残，个体均匀，蚯龄等于4周的发光蚯蚓(安德爱盛蚓)进行实验，将陆正蚓在净化培养基中进行净化1天；其中，净化培养基按照质量百分比计包括：3％小分子肽、6％亚油酸、7％葡萄糖、0.9％NaCl、1.5％复合维生素粉，余量为无菌纸浆。小分子肽能够激发发光蚯蚓体内荧光蛋白的活性，强化其功能。亚油酸、葡萄糖、NaCl和复合维生素粉为其提供生命要素，其中复合维生素粉是由维生素A、维生素B、维生素C按照质量比为1:1:1组成的。无菌纸浆则采用经过高温灭菌的无漂白原木纸浆。
S2：将净化后的发光蚯蚓(安德爱盛蚓)利用纯水进行清洗，平均分为三组，每组10条，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；
S3：在污染土壤区域取样，初步筛分后，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入10条发光蚯蚓，密度为2条/dm3。密度过低都会影响实验参数的准确性，过低则会造成检测的繁琐。并且调节环境参数为：温度为25℃，湿度为80％，pH为7.3，含氧量为10％，避光培育4天；
S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，清洗干净后，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；
其中，S1和S4中初始荧光值和最终荧光值的测量方法相同，均包括以下步骤：
1)以每组发光分蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入5mg碳酸钙、2-4mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，避免浸泡，每隔30s通入0.5mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；用于刺激发光蚯蚓分泌能发光的粘液；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，将其表面的残余液体均匀涂抹在载玻片上；
3)在每片含有残余液体的载玻片表面上滴加3ml的甲醇，并涂抹均匀，固定停留20min，利用剩余的磷酸冲液冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
4)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入6ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
S5：计算对应的实验组的初始荧光值和最终荧光值的差值，利用差值除以初始荧光值得到每组的抑光率再求平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级。
所述生态毒性等级的划分标准为：当平均抑光率<45％，毒性为低毒，等级为三级；当所述45≦平均抑光率≦80％，毒性为中毒，等级为二级；当平均抑光率>80％，毒性为高毒，等级为一级。
对比例1
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于：净化培养基只含有无菌纸浆。
对比例2
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于：
S1和S4中初始荧光值和最终荧光值的测量方法为：
1)以每组发光分蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入3.5mg碳酸钙、3mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，避免浸泡，每隔30s通入1.2mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；用于刺激发光蚯蚓分泌能发光的粘液；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，并利用剩余的磷酸冲液对每条发光蚯蚓冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
3)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入4ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
对比例3
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于：在S3中每个实验组的污然土壤的发光蚯蚓密度为1条/dm3。
对比例4
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于：在S3中每个实验组的污然土壤的发光蚯蚓密度为3条/dm3。
以国家环保局《环境监测分析方法》以及《土壤元素的近代分析方法》中记录的国家标准的土壤监测方法设置标准对照组，根据《土壤环境质量标准》(GB15618－1995)可以划分污染程度等级。其中标准对照组中含有重金属污染等级为一级、二级、三级共计90个样本，每个等级30个样本。分别采用实施例1-3，以及对比例1-4对每个等级的样本进行盲测，最终检测结果的准确率如表1所示：
表1：实施例1-3以及对比例1-4组检测结果的准确率
Figure BDA0002086416800000091
结论：由表1可知，实施例1-3的准确率几乎差不多，均在95％上，最高可达96.3％。而对比例1则明显与实施例2相比，准确率下降了10.7％，是由于发光蚯蚓在进行净化培养的1天中没有得到充分的营养，也没有激活发光蚯蚓体内的发光蛋白，因此造成数据的准确率下降；对比例2与实施例2相比，准确率下降了12.9％，这是因为没有对发光蚯蚓表面的粘液进行收集，导致待测样本数量不稳定，因此造成了准确率的下降；对比例2和实施例2相比，准确率下降了15.4％，这是由于发光蚯蚓与待测土壤密度较低，使其检测的样本数据偏小，因此造成准确率的下降；对比例4和实施例2的准确率基本差不多，但是多增加蚯蚓的数量不仅会导致实验操作的繁琐，还会增大实验误差。由此可知，实施例2的技术方案为最优方案。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：筛选发光蚯蚓并在净化培养基中进行净化1天；
S2：将净化后的发光蚯蚓利用纯水进行清洗，平均分为三组，每组8-10条，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录初始荧光值；
S3：在污染土壤区域取样，初步筛分后，分为三个实验组，每个实验组的污然土壤内放入一组发光蚯蚓，调节环境参数，培育3-4天；
S4：取出各个实验组中的发光蚯蚓，清洗干净后，利用发光检测体系提取每组发光蚯蚓分泌的粘液，利用荧光分光光度计检测并记录最终荧光值；
S5：计算对应的实验组的初始荧光值和最终荧光值的差值，利用差值除以初始荧光值得到每组的抑光率再求平均抑光率，根据平均抑光率划分污染土壤样本的生态毒性等级；
其中，步骤S1和S4中所述发光检测体系包括：2-5mg碳酸钙、2-4mg七水硫酸镁、2-6ml双氧水、50-60ml甲醇、300-500ml磷酸缓冲液；
利用所述发光检测体系检测发光蚯蚓荧光值的方法包括以下步骤：
1)以每组发光蚯蚓为单元分别放入培养皿中，加入2-5mg碳酸钙、2-4mg七水硫酸镁以及100ml磷酸缓冲液作为溶液A，使发光蚯蚓浸润在溶液A中，每隔30s通入0.5-2mA电流5s，10min后取出发光蚯蚓；
2)利用镊子逐条夹取步骤1)处理后的发光蚯蚓，将其表面的残余液体均匀涂抹在载玻片上；
3)在每片含有残余液体的载玻片表面上滴加2-3ml的甲醇，并涂抹均匀，固定停留10-20min，利用剩余的磷酸冲液冲洗干净，收集冲液记为溶液B；
4)将每组的溶液A和溶液B进行混合，加入2-6ml双氧水，促进发光显色，最红利用荧光分光光度计检测初始荧光值或最终荧光值。
2.如权利要求1所述的一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，S1中所述发光蚯蚓为陆正蚓、安德爱盛蚓或腹枝蚓中的一种或任意几种。
3.如权利要求1所述的一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，S1中所述发光蚯蚓的筛选标准为：选择来自同一生长环境，无伤残，个体均匀，蚯龄小于或等于4周的蚯蚓进行实验。
4.如权利要求1所述的一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，S1中所述净化培养基按照质量百分比计包括：1-3％小分子肽、3-6％亚油酸、5-7％葡萄糖、0.7-0.9％NaCl、0.5-1.5％复合维生素粉，余量为无菌纸浆。
5.如权利要求1所述的一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，S3中所述环境参数为：温度为20-25℃，湿度为60-80％，pH为6.8-7.3，含氧量为8-10％，避光。
6.如权利要求1所述的一种利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法，其特征在于，S5中所述生态毒性等级的划分标准为：当平均抑光率<45％，毒性为低毒，等级为三级；当45≦平均抑光率≦80％，毒性为中毒，等级为二级；当平均抑光率>80％，毒性为高毒，等级为一级。
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