CN101539524B - 食品及环境有机污染物荧光检测卡及检测方法 - Google Patents
食品及环境有机污染物荧光检测卡及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种食品及环境有机污染物荧光检测卡及检测方法，属于有机物检测设备技术领域，其特征是：检测卡均内置2-5个检测槽，每个检测槽内均装有C.T非细胞体系试剂，检测槽底面是透明材料。其方法是：将检测样本加入到检测卡上，通过刺激转化的C.T非细胞体系试剂，产生绿色荧光蛋白，利用光电技术原理，以检测表达的GFP荧光强度，来判断有样本中机物浓度，评价食品及环境污染物的的程度。有益效果是：利用光电技术原理，将荧光检测卡与光电技术检测手段有机结合设计出有机污染物检测仪，以检测表达的GFP荧光强度，具有灵敏、简便、快速、经济的优点，可以定量检测，是目前进行食品及环境中雌激素类物质安全检测与监测的发展趋势。
Description
技术领域
本发明属于有机物检测设备技术领域。
背景技术
目前国内外食品雌激素及多环方烃等有机污染物的检测方法主要为化学和生物两大类：前者多为色谱及质谱法，仪器设备大型昂贵，检测项目单一、通量小，样品前处理比较复杂，而且对于样品中新的未知物查不出来；对于有些醛类化合利用与染料形成有色化合物通过可见光分光光度法检测，灵敏度低，检测项目非常有限。生物学检测方法，如子宫生长实验、肝细胞卵黄蛋白原生成实验、人乳腺癌细胞(MCF-7)增值实验、重组基因酵母实验、酵母双杂交实验等五种主要的环境雌激素生物检测方法，仪器需要酶标仪和动物细胞培养箱，超净台及相关超净工作环境，方法较繁琐、时间长、成本高，检测样品单一。这些方法不适合基层和现场快速检测。
经研究发现睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni，C.T)能够以各种类固醇化合物及多环芳烃化合物(PAHs)作为唯一碳源和能源，比如二恶英、多氯联苯、农用化学药品(DDT)等通过一系列涉及复杂代谢途径的诱导酶作用，最终将这些稳定的化合物降解为H2O和CO2。其C.T细胞中关键酶3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3α-HSD)受食品及环境有机污染物(芳环和甾醇类化合物；简称：有机污染物)诱导而表达，二者成正相关的关系。
发明内容
本发明的目的是：提供一种食品及环境有机污染物荧光检测卡及检测方法，利用C.T非细胞荧光体外诱导表达体系，制备一种有机污染物荧光检测卡，建立一种对有机污染物含量进行测定的检测方法。广泛用于环境、畜禽、饲料、食品等行业领域有机污染物快速监测。
本发明的技术方案是：检测卡均内置2-5个检测槽，每个检测槽内均装有C.T非细胞体系试剂，检测槽底面是透明材料。
将可表达3α-HSD的C.T，通过转基因技术，用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因替换掉C.T中的3α-HSD基因，构建出C.T荧光变异菌株。该变异菌可在有机污染物存在下，高效表达绿色荧光蛋白。通过大量的增菌及破碎菌体，获得菌体内各种细胞器和绿色荧光蛋白报告基因，制成非细胞C.T荧光体外诱导表达体系试剂。
有机污染物荧光检测卡检测方法就是将有机污染物即检测样本加入到检测卡上，与非细胞表达体系试剂37℃温育10分钟，通过刺激转化的C.T非细胞体系试剂，产生绿色荧光蛋白，利用光电技术原理，将荧光检测卡与光电技术检测手段有机结合设计出食品有机污染物检测仪，以检测表达的GFP荧光强度，来判断有样本中机物浓度，评价食品及环境污染物的的程度。
本发明的有益效果是：有机污染物荧光检测卡检测方法就是将有机污染物等(检测样本)加入到检测卡上，与非细胞表达体系试剂37℃温育10分钟，通过刺激转化的C.T非细胞体系试剂，产生绿色荧光蛋白。利用光电技术原理，将荧光检测卡与光电技术检测手段有机结合设计出“便携式快速食品有机污染物检测仪”，以检测表达的GFP荧光强度，来判断样本中有机物浓度，评价食品及环境污染物的的程度。与国内外其他方法相比较，具有灵敏、简便、快速、经济的优点，可以定量检测，是目前进行食品及环境中雌激素类物质安全检测与监测的发展趋势。广泛用于环境、畜禽、饲料、食品等行业领域有机污染物快速监测。
附图说明
图1是本发明荧光检测卡正面立体图；
图2是本发明荧光检测卡后面立体图；
图3是本发明荧光检测卡剖视立体图；
图4是本发明空白荧光检测卡剖视图；
图5是本发明阳性荧光检测卡剖视图；
图6是本发明阴性荧光检测卡剖视图；
图7是本发明失效荧光检测卡剖视图；
图8是本发明使用荧光检测卡的检测仪结构图。
具体实施方式
如图1-3所示，1是检测槽、2是卡的正面、3是荧光检测窗、4是卡的背面、5是侧壁。
如图8所示，21是激发光源、22是柱面镜、23是发射光滤光片、24是聚焦镜组、25是接收光滤光片、26是准直镜组、27是光电接收器、28是数据采集与处理电路、29是控制电路。
实施例1(以有机污染物检测为例)
1.材料与方法
1.1C.T非细胞体系试剂及实验材料的来源
C.T非细胞体系试剂和荧光检测卡均为自制。雌二醇购自Whatman公司。
1.2C.T非细胞体系试剂的制备方法
将可表达3α-HSD的C.T，通过转基因技术，用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因替换掉C.T中的3α-HSD基因，构建出C.T荧光变异菌株。该变异菌可在有机污染物存在下，高效表达绿色荧光蛋白。通过大量的增菌及破碎菌体，获得菌体内各种细胞器和绿色荧光蛋白报告基因，制成非细胞C.T荧光体外诱导表达体系试剂。
1.3.有机污染物荧光检测卡的制备
荧光检测卡为小包装形式。检测卡由塑料铸造而成，体积规格为70×20×6mm；荧光检测卡的正面(图1)上(2)有5个检测槽(1)，卡的背面(图2)上(4)有5个荧光检测窗(3)。检测槽外体积规格为8×8×6mm，5面各减去1mm，槽内体积为6×6×5mm；检测槽由透明有机材料组成正方形凹槽，其结构(图3)依次为检测槽4侧壁(5)和荧光检测窗(3)；其中检测槽4侧壁(5)负责组成荧光体外诱导表达体系试剂反应空间；荧光检测窗(3)负责为检测仪提供检测窗口。
下面以有机污染物检测为例介绍卡的基本原理：
其原理是：睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni，C.T)能够以各种类固醇化合物及多环芳烃化合物(PAHs)作为唯一碳源和能源，比如二恶英、多氯联苯、农用化学药品(DDT)等通过一系列涉及复杂代谢途径的诱导酶作用，最终将这些稳定的化合物降解为H2O和CO2。其C.T细胞中关键酶3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3α-HSD)受食品及环境有机污染物(芳环和甾醇类化合物；简称：有机污染物)诱导而表达，二者成正相关的关系。
将C.T，通过转基因技术，用绿色荧光(GFP)蛋白报告基因替换掉C.T中的3α-HSD基因，构建出C.T荧光变异菌株。该变异菌可在有机污染物存在下，高效表达绿色荧光蛋白。通过大量的增菌及破碎菌体，获得菌体内各种细胞器和绿色荧光蛋白报告基因，制成非细胞C.T荧光体外诱导表达体系试剂。
测定分析时，操作者将标本和标准液分别加到检测卡样品槽中，而后将检测卡插入“便携式快速食品有机污染物检测仪”中，仪器自动提供恒温环境，标本和标准液与检测槽中非细胞表达体系试剂37℃温育10分钟，通过刺激转化的C.T非细胞体系试剂，产生绿色荧光蛋白。当反应完成后，“便携式快速食品有机污染物检测仪”分析检测卡标本和标准液窗荧光变化，进而测定出待测环境有机物的浓度。生成荧光的强弱的关键是构建特异性强、灵敏度高的绿色荧光蛋白报告基因，以及非细胞体系试剂的制备。
空白：检测前在检测卡的检测窗(3)无荧光产生(图4)。
阳性：将标本和标准液分别加到检测卡检测槽中，若被检样品中有机污染物浓度大于检测临界值，有机污染物和标准液在检测槽内(1)与非细胞体系试剂反应，均产生绿色荧光蛋白(GFP)，可定量测定有机污染物浓度，结果为阳性(图5)。
阴性：将标本和标准液分别加到检测卡检测槽中，若被检样品中有机污染物浓度小于检测临界值，有机污染物在检测槽内(1)与非细胞体系试剂反应，不产生绿色荧光蛋白(GFP)，而标准液在检测槽内(1)与非细胞体系试剂反应，产生绿色荧光蛋白(GFP)，不能定量测定有机污染物浓度，为阴性结果(图6)。
无效：将标本和标准液分别加到检测卡检测槽中，若检测卡和仪器出现异常，被检样品中有机污染物和标准液在检测槽内(1)与非细胞体系试剂反应，均不产生绿色荧光蛋白(GFP)或检查不出绿色荧光蛋白，不能定量测定有机污染物浓度，结果为无效(图7)。
2.有机污染物荧光检测卡的应用
测定分析时，操作者将标本和标准液分别加到检测卡检测槽中(1)，而后将检测卡插入便携式快速食品有机污染物检测仪中，仪器自动检测检测槽荧光本底并提供恒温环境，标本和标准液与检测槽中非细胞表达体系试剂37℃温育10分钟，通过刺激转化的C.T非细胞体系试剂，产生绿色荧光蛋白。当反应完成后，便携式快速食品有机污染物检测仪分析检测卡标本和标准液窗荧光变化，进而测定出待测环境有机物的浓度。
检测卡进入检测仪进行检测时，激发光源和数据采集系统与检测窗(3)紧密接触，与几乎没有空间。通过卡的移动，测定检测窗荧光强度。
Claims (2)
1.一种食品及环境有机污染物荧光检测卡，其特征是：检测卡上设置2-5个检测槽，每个检测槽内均装有转化的3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌非细胞体系试剂，检测槽底面是透明材料，将可表达3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌，通过转基因技术，用绿色荧光蛋白报告基因替换掉睾丸酮丛毛单胞菌中的3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶基因，构建出3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌荧光变异菌株，该变异菌可在有机污染物存在下，高效表达绿色荧光蛋白，通过大量的增菌及破碎菌体，获得菌体内各种细胞器和绿色荧光蛋白报告基因，制成转化的3α-羟基类固醇脱氢酶/羰酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌非细胞体系试剂。
2.一种采用食品及环境有机污染物荧光检测卡的检测方法，其方法是：将有机污染物即检测样本加入到检测卡上，与转化的3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌非细胞表达体系试剂37℃温育10分钟，通过刺激转化的3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌非细胞表达体系试剂，产生绿色荧光蛋白，利用光电技术原理，将荧光检测卡与光电技术检测手段有机结合设计出食品有机污染物检测仪，以检测表达的绿色荧光蛋白荧光强度，来判断有样本中有机污染物浓度，评价食品及环境污染物的程度，将可表达3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌，通过转基因技术，用绿色荧光蛋白报告基因替换掉睾丸酮丛毛单胞菌中的3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶基因，构建出3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌荧光变异菌株，该变异菌可在有机污染物存在下，高效表达绿色荧光蛋白，通过大量的增菌及破碎菌体，获得菌体内各种细胞器和绿色荧光蛋白报告基因，制成转化的3α-羟基类固醇脱氢酶/羰酰基还原酶的睾丸酮丛毛单胞菌非细胞体系试剂。
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