CN106085897A

CN106085897A - 一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌

Info

Publication number: CN106085897A
Application number: CN201610379246.3A
Authority: CN
Inventors: 吕辉雄; 周耀红; 黄雪晶; 陈少华; 杨启平; 邵力恒; 刘志健
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-06-01
Also published as: CN106085897B

Abstract

本发明公开了一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚高效降解菌。所述方法是以从石化厂、蚊香厂、农田地等地方采集的含有八氯二丙醚的污泥或土壤为样本，通过微生物菌种的培养、分离、纯化、驯化、筛选，选择出八氯二丙醚降解菌。本发明首次从土壤和污泥中提取出对八氯二丙醚具有高降解性的产气肠杆菌菌株M2016517，于2016年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60041。该菌株对八氯二丙醚的降解率高达95%。而且本发明的筛选方法可同时达到对菌种筛选和驯化的目的，明显缩短驯化周期；而且简单、方便、高效，筛选得到的降解菌对八氯二丙醚具有很高的降解率。

Description

一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌。

背景技术

八氯二丙醚（简称S421），分子式C₆H₆Cl₈O。八氯二丙醚是一种农药增效剂，对多种拟除虫菊酯类农药有活化增效作用；其为淡黄色液体。有香味，大量用于农药喷雾剂、蚊香等。

但是，八氯二丙醚是一种环境行为与滴滴涕类似的有机氯化合物，其性能稳定，在环境中滞留时间长，属于类持久性有机污染物。而且，八氯二丙醚在生物链中会发生生物富集作用，导致在人体和其他生物体中残留，属于持久性污染物。因八氯二丙醚具有潜在的三致（致畸、致癌、致突变）效应，我国于2008年1月1日起已全面禁止销售含八氯二丙醚的农药。有研究表明，八氯二丙醚吸入染毒可引起小鼠外周血细胞及肝、脾、肺细胞DNA细胞的损伤，提示肺细胞可能是其主要靶细胞；程百里等曾报道，无锡市某厂采用一步法直接合成八氯二丙醚，生产工人肺癌发生率及死亡率都较高。Miyazaki等在对日本妇女的乳汁中的有机氯农药残留监测中，在1.5%OV_17+1.95%QF_1色谱柱上紧随着β-六六六出峰后有一个不明色谱峰出现，其相对保留时间为0.85（以狄氏剂的保留时间为1.00）。而且，ECO检测器对这种化合物更加灵敏。Miyazaki研究报道了人乳中八氯二丙醚的残留量。2001年欧盟对中国出口茶叶的安全卫士检测项目中就添加了八氯二丙醚残留量的检测，其最大允许残留量（MRL）为0.01mg/kg。

尽管八氯二丙醚已被禁用，但是因其在我国使用时间长，且性质稳定，不易被分解，在环境中能长期存在，并通过生物富集作用危害人类健康，因此，探索环保、简洁、有效的降解八氯二丙醚的方法，具有很重要的必要性和现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种从土壤或污泥中分离、筛选、驯化能够降解八氯二丙醚的微生物，以及利用所得该微生物降解八氯二丙醚的方法。

本发明的目的是提供一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法。

本发明另一目的是提供一株能够降解八氯二丙醚的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517。

本发明的再一目的是提供一种利用所述产气肠杆菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法，是以含有八氯二丙醚的污泥或土壤为样本，通过微生物菌种的培养、分离、纯化、驯化、筛选，选择出对八氯二丙醚具有良好降解性的降解菌。

优选地，所述含有八氯二丙醚的污泥或土壤为从长期使用农药的农田地、石化厂、蚊香生产厂等地采集的土样或污泥。

进一步地，利用得到的降解菌进行八氯二丙醚降解实验：配制40～60ppm八氯二丙醚降解液，接入权利要求1得到的降解菌，在20～32℃、125～175r/min条件下好氧培养5～8天；然后通过正己烷反复萃取，接着旋蒸干，最后定容成空白理论浓度为5ppm的上机液，进行气相色谱定量检测，找出降解率高的菌种，即得到能够高效降解八氯二丙醚的微生物。

其中，优选地，所述八氯二丙醚降解液的浓度为40ppm。

优选地，所述好氧培养是在30℃、175r/min条件下好氧培养7天。

更优选地，是进一步利用得到的降解菌进行八氯二丙醚降解实验：配制50ppm八氯二丙醚降解液，接入上述方法筛选得到的降解菌，在30℃、175r/min条件下好氧培养7天；然后通过正己烷反复萃取，接着旋蒸干，用10毫升容量瓶定容成空白理论浓度为5ppm的上机液，于Agilent6890气相色谱仪上机定量检测，找出降解率高的菌种。

另外，具体优选地，上述从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括如下步骤：

S1.采样：从长期使用农药的田地、石化厂或蚊香生产厂采集土样或污泥；

S2.细菌的培养：用灭菌水溶解土样或污泥，震荡培养后，静置，取上层清液，并分别稀释为不同浓度梯度的菌液，再经过涂布平板培养、划线分离培养；

S3.降解菌的初步分离：将步骤S2划线分离的菌种接种至一系列八氯二丙醚浓度梯度的选择培养基上进行培养，挑选出可耐八氯二丙醚的菌种；

S4.降解菌分离：将步骤S3得到的菌种划平板培养，选择降解效果较好的单菌落进行LB液体培养基培养，收集菌体制成菌悬液，然后取菌悬液加入含有八氯二丙醚的降解液中进行培养，分离出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。

更具体地，作为一种优选的可实施方案，上述从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括如下步骤：

S1.采样：从长期使用农药的田地、石化厂或蚊香生产厂等地采集土样或污泥，并编号；

S2.细菌的培养：

S21.取土样或污泥于灭菌的容器（如三角瓶）中，加入灭菌水，锡纸封口，于摇床28～30℃，120～150rpm培养20～24h（优选为30℃，120～150rpm培养24h）后，静置，取上层清液；所述底泥：灭菌水=0.5～1.5g：8～10mL（优选为所述底泥：灭菌水=1g：9mL）；

S22.稀释浓度：在无菌操作条件下，吸取上层清液置于无菌水中，分别稀释为不同浓度梯度的菌液；

S23.涂布：将不同浓度梯度的菌液分别涂布于LB平板上，30℃恒温倒置培养24h～36h；观察不同稀释浓度的平板的生长情况，选择生长状况较好的进行接种；

S24.划线接种分离：将烧过的接种环冷却后伸入培养皿中，挑取平板上长出的各种单菌落，分别转移至新的平板上进行平板划线，封口，28～30℃恒温倒置培养20～24h（优选为30℃恒温倒置培养24h）；（注意：培养皿壁需在火焰上微烧一周，且划线时不能划破培养基）；

S3.降解菌的初步分离：将步骤S2中划线分离的菌种接种至一系列八氯二丙醚浓度梯度的选择培养基上，培养3～5天，挑选出可耐高浓度八氯二丙醚的菌种，进行编号，冷冻保存；

S4.降解菌分离：

S41.将步骤S3得到的菌种划LB平板，培养20～24h（优选为培养24h），再用灭菌的接种环挑取分离降解效果较好的单菌落至LB液体培养基中，采用好氧振荡培养法进行培养，即用无菌透气封口膜封口后在30℃、150r/min的摇床中培养24h，得到富集液；

S42.富集液4000r/min离心10min，倾去上清液，加入磷酸盐缓冲液，继续离心，依次重复离心3次，最后加入磷酸盐缓冲液，制成菌悬液，然后取菌悬液于含有八氯二丙醚的降解液中，置于摇床30℃、150r/min培养6～7天；

S43. 降解菌分离：将步骤S42培养到时间的降解残液进行预处理，通过萃取、旋蒸、稀释，最后用正己烷制成上机样品，进行气相色谱定量检测，分离出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。

另外，其中，优选地，所述灭菌水的制备方法：蒸馏水装入容器中，锡纸封口湿热灭菌，于121℃ 0.15MPa湿热高压灭菌20min。

优选地，所述LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂18g、1L H₂O，pH7.2～7.4；配好后倒入三角瓶，拿锡纸封口后，同无菌水放入高压灭菌锅灭菌（湿热灭菌）。

优选地，步骤S23所述涂布的方式为吸取100～200μl上层清液于平板上，用三角刮刀在平板上以“J”字形旋转涂布均匀。

优选地，步骤S3所述选择培养基为无机盐固体选择培养基，其配方为：Na₂HPO_4·12H₂O 7g、KH₂PO₄ 2g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、ZnSO₄·7H₂O 0.005g，NaMoO₄·2H₂O 0.0025g、Ca(H₂PO₄)₂ 0.014g、FeSO₄·7H₂O 0.00013g、蒸馏水 1000ml，琼脂18g，pH7.00。

在上述方法中，在筛选降解菌时，用一系列的无机盐固体选择培养基，可同时达到驯化作用，周期短。

优选地，步骤S42所述降解液为八氯二丙醚浓度为40ppm的无机盐液体无菌降解液，需经过高压灭菌。

因此，通过上述方法筛选获得的八氯二丙醚高降解菌也在本发明的保护范围之内。

一株能够降解八氯二丙醚的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517，该菌株于2016年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：60041，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠产气杆菌属（Enterobacter），是一种革兰氏阴性菌；产气肠杆菌菌株M2016517的16S rDNA序列SEQ ID NO.1所示。

该菌株M2016517对八氯二丙醚具有良好的降解效果，其降解率高达95%。

因此，产气肠杆菌菌株M2016517在降解八氯二丙醚方面的应用，以及在制备八氯二丙醚降解制剂方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。

一种利用产气肠杆菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法，是按照1～8%的接种量，将产气肠杆菌菌株M2016517接种于含有八氯二丙醚的待降解样品，在转速为125～175/min、pH为5～9、温度为20～30℃条件下进行降解。

优选地。当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为八氯二丙醚降解液（液体）时，所述接种量为2%。

优选地，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为八氯二丙醚降解液（液体）时，是在转速为170～175r/min、pH为7、温度为28～30℃条件下进行降解。

最优选地，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为八氯二丙醚降解液（液体）时，是在转速为175r/min、pH为7、温度为30℃条件下进行降解。

即当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为八氯二丙醚降解液（液体）时，最佳的八氯二丙醚降解条件为：底物浓度为30ppm，接种量为2%，在转速为175r/min、pH为7、温度为30℃条件下进行降解。最佳降解率可达95%。

另外，优选地，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为含有八氯二丙醚的土壤时，土壤需要先经过灭菌，然后加入无菌水制成待降解污染土壤。

进一步优选地，所述待降解污染土壤的含水率为50～65%。

更优选地，所述待降解污染土壤的含水率为60%。

优选的，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为含有八氯二丙醚的土壤时，所述接种量为5%。

优选的，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为含有八氯二丙醚的土壤时，是在150r/min、30℃条件下富集培养24h。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次从土壤和污泥中提取出对八氯二丙醚具有高降解性的微生物，产气肠杆菌菌株M2016517，在转速为175r/min、pH为7、温度为30℃，接种量为2% 时具有良好的降解效果，其降解率高达95%。

本发明筛选八氯二丙醚高效降解菌时，利用固体选择培养基，可同时达到对菌种筛选和驯化的目的，明显缩短驯化周期。

其次，本发明在做降解性试验筛选过程中，用无菌透气封口膜代替纱布，在保证微生物生命活动需要的氧气外，还可以很好的防止灰尘杂质等进去培养瓶中。

另外，在上机前预处理时，改进传统的有机物提取方法，省去过柱步骤，通过三次萃取后直接旋蒸，然后定容稀释，也可以避免因步骤繁琐而损失提取物，加标回收率达84%，空白降解率为3.5%。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 八氯二丙醚降解菌的提取

1、一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括以下步骤：

S1.从长期使用农药的田地和蚊香生产厂采集土样或污泥，并编号。

S2.制备稀释水：取一个250mL的锥形瓶装90mL蒸馏水，锡纸封口湿热灭菌；另取10支18mm×180mm的试管分别装9mL蒸馏水，塞上胶塞，锡纸包住并用橡皮筋扎好后于121℃0.15MPa湿热高压灭菌20min。灭菌后置于无菌操作台上，打开操作台紫外灯，冷却至室温备用。

S3.LB固体培养基配制：

配方：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂18g、1L H₂O，pH7.2～7.4。

配好后倒入三角瓶，拿锡纸封口后，同无菌水放入高压灭菌锅灭菌。

S4.细菌的培养：

S41.取10g底泥于灭菌的三角瓶中，加入90mL灭菌水（浓度为10^-1），锡纸封口，于摇床（30℃，120～150rpm）培养24h后，静置，取上层清液。

S42.稀释浓度：将装有底泥和90mL灭菌水的三角瓶和5管9mL的无菌水排列好，按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5及10^-6依次编号贴好标签。在无菌操作条件下，吸取三角瓶中的1mL上层清液置于9mL无菌水中，得到10^-2浓度的混合液。取1mL 10^-2浓度的菌液于无菌水中，摇匀，得到10^-3浓度的菌液。同法依次稀释到10^-6。

S43.倒平板：待经湿热灭菌的培养基冷却至50℃左右后倒入无菌培养皿中冷凝形成平板。

S4.涂布：从10^-1开始吸取适量（100～200μl）菌液于平板上，用三角刮刀在平板上以“J”字形旋转涂布均匀。在恒温培养箱（30℃）中倒置培养24h～36h。观察不同稀释浓度的培养基生长情况，选择生长状况较好的进行接种。

S45.划线接种分离：点燃酒精灯，接种环沾取酒精后在火焰上进行灼烧灭菌，放在试管架上待其冷却（最好备有3个）。将烧过的接种环冷却后伸入培养皿中，挑取平板上长出的各种单菌落，分别转移至平板上进行平板划线。（培养皿壁需在火焰上微烧一周，且划线时不能划破培养基），划线完毕盖好皿盖，用封口膜封口，培养皿倒置于30℃恒温培养箱内培养24h。

S5.降解菌的初步筛选：

S51.无机盐固体选择培养基的配方为：Na₂HPO_4·12H₂O 7g、KH₂PO₄ 2g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、ZnSO₄·7H₂O 0.005g，NaMoO₄·2H₂O 0.0025g、Ca(H₂PO₄)₂ 0.014g、FeSO₄·7H₂O 0.00013g、蒸馏水 1000ml，琼脂18g，pH7.00。

S52.配制一系列八氯二丙醚浓度梯度的无机盐固体选择培养基，将步骤S4中划线分离的菌种接种至选择培养基上根据情况培养3～5天，最后挑选出可耐200ppm选择培养基的菌种进行编号，冷冻保存。

在筛选降解菌时用一系列的无机盐固体选择培养基，可同时达到驯化作用，周期短。

步骤S5的具体方法为：

（1）找一干净（酸洗过）的10ml容量瓶于分析天平上，去皮，然后用取样针吸取0.101010gS421标样（纯度为0.996）于容量瓶，然后用丙酮定容至10ml，摇匀，即可得10000ppm八氯二丙醚母液，再根据需要稀释。

配置八氯二丙醚浓度为Xppm的培养基：C₂ × V₃ = X × V₄

C₂：配置好的S421浓度（ppm）；

V₃ 往培养基中加入的C₂浓度的S421的体积（ml）；

X ：培养基中S421浓度（ppm）；

V₄：培养基体积（ml）。

例如：10000ppm ×V₃=100ppm×100ml

即：使100ml培养基中八氯二丙醚浓度为100ppm ，需加入浓度为10000ppm的八氯二丙醚溶液1ml。

（2）从不含八氯二丙醚的培养基中观察挑选出生长状况良好的菌种进行划线接种，对不同类型的菌种进行标记，如A、B、C······以此类推；

从30ppm浓度开始选择培养，直至200ppm甚至更高浓度（菌种几乎长不出来或生长时间过长为止），然后做富集培养24h，保存菌种。

S6.降解性检验：

S61.取步骤S5保存的菌种进行解冻活化，每种划2个平板（LB基础培养基），在平板上培养24h，用灭菌的接种环挑取分离效果较好的单菌落到50ml液体的LB液体培养基中培养（用肉眼看得到接种环上有菌，放到液体中多搅拌几次，确保看得到菌种落入了液体中），每种做1个，采用好氧振荡培养法进行培养，即用无菌透气封口膜封口后在30℃、150r/min的摇床中培养24h，得到富集液。

S62.取5ml步骤S61得到的富集液，于4000r/min的离心机中离心10min，然后倾去上清液，加入5ml磷酸盐缓冲液，继续离心，依次离心3次，最后加入5ml磷酸盐缓冲液，制成菌悬液。配制50ml八氯二丙醚浓度为40ppm的无机盐液体无菌降解液，高压灭菌。然后取1ml菌悬液于50ml降解液中，置于摇床30℃150r/min培养6～7天。

S63.预处理：将步骤S62培养到时间的降解残液进行预处理，通过萃取、旋蒸、稀释，最后用正己烷制成空白理论浓度为5ppm的上机样品，同时配制浓度为4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0.25ppm、0.125ppm、0.625ppm的标准液，同样品一起上机，用外标法制备标准曲线。

步骤S63的具体方法为：

①按照样品数量搭配分液漏斗（最好多出来一两个，以作备用），确保不漏液；

②将降解液倒入分液漏斗，用50ml正己烷分3次（20+15+15ml）萃取降解液，萃取在250ml分液漏斗中进行。每次萃取前，先加正己烷于装了降解液的三角瓶中，轻轻震荡清洗后倒入分液漏斗内，来回颠倒振荡数次（小心震荡，有时候分液漏斗上口瓶塞不完全密封，颠倒时会有液体洒出），静置10min；

③收集下层水相溶液于原三角瓶中，上层有机相溶液从上口倒入鸡型瓶内，鸡型瓶用锡纸包口。然后再将三角瓶中的下层溶液又加入漏斗中，如此萃取三次，合并萃取液；

④38℃挥发旋蒸正己烷至干后加入20ml正己烷溶解,再超声清洗（需手拿鸡型瓶倾斜慢慢旋转，然后拿滴管吸取瓶底溶液，沿瓶内壁吹洗）3-5min，倒入25ml容量瓶用正己烷定容；

⑤从25ml中准确吸取1ml于10ml容量瓶用正己烷定容10ml，然后取1ml于进样瓶，封口放冰箱待上机。

如上，上机前预处理时通过正己烷萃取、旋蒸、超声清洗等步骤，可显著提高加标回收率。

S64.取步骤S63得到的处理样品1μl于Agilent6890气相色谱仪上机定量检测，找出对八氯二丙醚降解率高的菌株。

2、经过上述方法，筛选得到对八氯二丙醚具有优良降解特性的微生物菌株。

3、对筛选得到的菌株进行鉴定

（1）提取菌株的基因组DNA作为模板，采用16S rDNA通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCA）/1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）进行扩增。PCR反应体系(50μL)：菌液2μl，引物各（10 μmol·L^－1）2μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP（2.5 mmol·L^－1）4μl，rTaqDNA聚合酶(5U·μL^－1)1μl。PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30s，72℃ 2min，循环35次，72℃ 10min。

（2）反应完成后，取出Eppendorf管，从中吸取5μl反应产物，加入1μl上样缓冲液，点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中，120V，电泳24min，结束后在紫外凝胶成像仪下检测扩增结果。

（3）同时，扩增产物纯化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将公司测序送回的序列在NCBI网站中中利用BLAST 进行自动比对分析，选择相似性最高的结果。

最终确定所筛选得到的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。经过鉴定，该菌株属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠产气杆菌属（Enterobacter），是一种革兰氏阴性菌。因此，命名为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517，并于2016年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60041，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2 八氯二丙醚降解液降解条件优化

1、利用利用产气肠杆菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法是：

含有八氯二丙醚的土壤先经过灭菌，配置浓度为40ppm的八氯二丙醚降解液，再按照1～8%的接种量，将产气肠杆菌菌株M2016517接种于含有八氯二丙醚的降解液中，在转速为125～175r/min、pH为5～9、温度为20～30℃条件下进行降解。

2、接种量的优化

以不同梯度为1%、2%、4%、6%、8%的接种量为变量，筛选最佳的接种量。

结果显示，接种量为1%时的降解率为20.7%，接种量为2%时降解率最高，为56.5%，接种量为4%时降解率20.6%，接种量为6%时降解率为44.1%，接种量为8%时降解率为33.6%。

3、转速的优化

以不同梯度为125、150、175r/min的转速为变量，筛选最佳的转速。

结果显示，转速为125r/min下时降解率为0.6%，转速为150r/min时降解率为14.8%，转速为175r/min时降解率最高，为25.6%。

4、温度的优化

以不同梯度为20、25、30℃的温度为变量，筛选最佳的温度。

结果显示，20℃时降解率为2.5%，25℃时降解率为16.5%，30℃时降解率最高，为53%。

5、pH的优化

以不同梯度为5，6，7，8，9的pH为变量，筛选最佳的pH。

结果显示，pH为5时降解率为39.5%，pH为6时降解率为77.4%，pH为7时降解率最高，为83.4%，pH为8时降解率为40.5%，pH为9时降解率为21.8%。

6、底物浓度的优化

以不同梯度为30、50、100、200ppm的底物浓度为变量，筛选最佳降解底物浓度。

结果显示，底物浓度为30ppm时降解率最高，为95%，底物浓度为50ppm时降解率为42.2%，底物浓度为100ppm时降解率为32.5%，底物浓度为200ppm时降解率为6.1%。

综上所述，综合研究筛选后显示，针对降解八氯二丙醚降解液的最佳降解条件为：底物浓度为30ppm，接种量为2%，在转速为175r/min、pH为7、温度为30℃条件下进行降解。最佳降解率可达95%。

实施例3 八氯二丙醚加标回收提取

1、根据实施例2中的八氯二丙醚降解液的配制方法，配制出2份八氯二丙醚浓度为40ppm的降解液样品，并向其中一份加入定量的八氯二丙醚标准物，然后通过萃取、旋蒸、稀释等预处理过程，取1ml样品于进样瓶，封口放冰箱待上机。

2、结果显示，加标回收率达84%。

实施例4 八氯二丙醚加标污染土壤的降解修复

1、降解菌：产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517。

2、样品制备

（1）从农场中取无八氯二丙醚污染的土壤，风干后过0.8mm筛后备用。

（2）于干净玻璃培养皿中秤取50g土壤，于24h内121℃高压灭菌20min两次。

（3）灭菌后的土壤置于无菌操作台冷却后，加入八氯二丙醚配制成50mg/kg的污染土，将用LB液体培养基在150r/min、30℃下富集培养24h的降解菌以5%接种量接入培养皿，加入适量无菌水，使水分保持在60%。

上述为实验组：即土壤灭菌处理，接菌。

另外，同时设置3个对照组，分别为：

对照组1：土壤灭菌处理，不接菌；

对照组2：自然土壤未灭菌处理，接菌；

对照组3：自然土壤未灭菌，不接菌。

共4组，每组3个平行。

3、实验方法

将培养皿放入恒温培养箱避光培养7d后取样测定八氯二丙醚的含量。

土壤中八氯二丙醚的分析检测：

（1）低温（40℃）烘干污染土，过0.3mm筛；取2g于10ml离心管中，加入10ml乙酸乙酯，于温水浴（不高于40℃）超声提取10min，然后4000r/min离心10min，将上层液移至鸡心瓶中，重复提取2次，合并上层液，旋蒸至近干。

（2）然后加20ml正己烷超声洗涤，取400μl于10ml容量瓶定容得理论空白浓度为0.2ppm的提取液，取1μl于Agilent6890气相色谱仪上机定量检测。

降解率=100%（对照样品残留量－处理样品残留量）/ 对照样品残留量。

4、结果

经检测，实验组的降解率为59.5%，对照组1的降解率为3.7%，对照组2的降解率为43.8%，对照组3的降解率为5%。

实施例5 实际污染土壤的降解修复

1、土壤

红壤污染土：采自华南农业大学树木园。

水稻污染土：采自华南农业大学农场。

2、同上，利用本发明的产气肠杆菌菌株M2016517进行降解实验。

实验结果显示，降解1天后，产气肠杆菌菌株M2016517对红壤污染土的降解率7.2%，而对水稻污染土降解3.2%。

第4天后，该菌株对红壤污染土降解率为32.8%，而对水稻污染土降解了18.5%。

第7天后，红壤污染土最终降解率高达65.6%，而水稻污染土降解率为54%。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚

降解菌

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 产气肠杆菌菌株M2016517的16S rDNA序列

<400> 1

cgcaggggcg cagcctacac atgcaagtcg agcggtaaca cagagagctt gctctcgggt 60

gacgagcggc ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc tgatggaggg ggataactac 120

tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa agtgggggac cttcgggcct 180

catgccatca gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt ggggtaatgg ctcacctagg 240

cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca 300

gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc 360

atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcgag gaggaaggcg 420

ttaaggttaa taaccttggc gattgacgtt actcgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt 480

gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540

gcacgcaggc ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat 600

tcgaaactgg caggctagag tcttgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa 660

tgcgtagaga tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc 720

tcaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780

cgatgtcgac ttggaggttg tgcccttgag gcgtggcttc cggagctaac gcgttaagtc 840

gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca 960

tccagagaac ttagcagaga tgctttggtg ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat 1020

ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

atcctttgtt gccagcggtc cggtcgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta 1200

caatggcata tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc 1260

gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag 1320

atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380

gagtgggttg caaaagaagt aggtagctta accttcggga gggcgctacc acttgttacg 1440

Claims

1.一种从土壤或污泥中获取能够降解八氯二丙醚的微生物的方法，其特征在于，以含有八氯二丙醚的污泥或土壤为样本，通过微生物菌种的培养、分离、纯化、驯化，选择出对八氯二丙醚具有降解性的降解菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有八氯二丙醚的污泥或土壤为从长期使用农药的农田地、石化厂或蚊香生产厂采集的土样或污泥。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S4.降解菌分离：将步骤S3得到的菌种划平板培养，选择降解效果较好的单菌落进行液体培养基培养，收集菌体制成菌悬液，然后取菌悬液加入含有八氯二丙醚的降解液中进行培养，分离出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2.细菌的培养：

S21.取土样或污泥于灭菌的容器中，加入灭菌水，封口，于28～30℃，120～150rpm培养20～24h后，静置，取上层清液；

S23.涂布：将不同浓度梯度的菌液分别涂布于LB平板，30℃恒温倒置培养24h～36h；

S24.划线接种分离：将平板上的各种单菌落分别挑至新的平板上进行平板划线，封口，28～30℃恒温倒置培养20～24h；

S3.降解菌的初步分离：将步骤S24划线分离的菌种接种至一系列八氯二丙醚浓度梯度的选择培养基上，培养3～5天，挑选出可耐八氯二丙醚的菌种；

S4.降解菌分离：

S41.将步骤S3得到的菌种划LB平板，培养20～24h，再挑取分离降解效果较好的单菌落至液体LB液体培养基中，封口后在30℃、150r/min的摇床中培养24h，得到富集液；

S42.富集液离心去上清液，用磷酸盐缓冲液离心清洗数次，最后加入磷酸盐缓冲液制成菌悬液，然后取菌悬液于含有八氯二丙醚的降解液中，置于摇床30℃、150r/min培养6～7天；

S43.降解菌分离：将步骤S42培养到时间的降解残液进行预处理，通过萃取、旋蒸、稀释，最后用正己烷制成上机样品，进行气相色谱定量检测，分离出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。

5. 一株能够降解八氯二丙醚的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517，其特征在于，该菌株于2016年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60041，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

6. 根据权利要求5所述的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）菌株M2016517，其特征在于，该菌株属于肠杆菌科、肠产气杆菌属，是一种革兰氏阴性菌，其16S rDNA序列如SEQID NO.1所示。

7.产气肠杆菌菌株M2016517在降解八氯二丙醚方面的应用。

8.产气肠杆菌菌株M2016517在制备八氯二丙醚降解制剂方面的应用。

9.一种利用产气肠杆菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法，其特征在于，是按照1～8%的接种量，将产气肠杆菌菌株M2016517接种于含有八氯二丙醚的待降解样品，在转速为125～175r/min、pH为5～9、温度为20～30℃条件下进行降解。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当所述含有八氯二丙醚的待降解样品为含有八氯二丙醚的土壤时，土壤需要先经过灭菌，然后加入无菌水制成待降解污染土壤。