CN106754582A - 恶臭假单胞菌rxx‑01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用 - Google Patents

恶臭假单胞菌rxx‑01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株恶臭假单胞菌RXX‑01，分类名为Pseudomonas putida，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224。本发明提供的恶臭假单胞菌RXX‑01对土壤DBP和DEHP复合污染具有高效的降解效果，在邻苯二甲酸酯污染土壤修复领域具有广泛的应用前景。

Description

恶臭假单胞菌RXX-01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用
技术领域
本发明属于微生物修复污染土壤的技术领域，特别涉及一株恶臭假单胞菌RXX-01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯(phthalates，PAEs)是人工合成的一种难降解、有毒有害的有机化合物，微溶于水，可溶于有机溶剂。最常见的邻苯二甲酸酯有邻苯二甲酸二甲酯(DimethylPhthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl Phthalate，DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate，DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(Di-(2-ethylhexyl Phthalate，DEHP)等。作为一种生产量高、应用面广的化合物，邻苯二甲酸酯被广泛用于工业生产，诸如塑料制品、玩具、农药、化妆品等产品中均含有邻苯二甲酸酯。因此，邻苯二甲酸酯已经成为一种全球性的环境有机污染物，在土壤、水体、大气、生物甚至人体中都已发现邻苯二甲酸酯的分布，尤其在农田土壤中邻苯二甲酸酯的含量甚至已经达到几十mg·kg-1。其中，DBP和DEHP是土壤中检出率最高且含量较高的两种邻苯二甲酸酯类化合物。大量研究表明，土壤邻苯二甲酸酯污染不仅会影响农作物的生长发育和产量品质，而且会造成农产品中邻苯二甲酸酯的累积从而通过食物链对人体健康造成潜在的危害，因此，修复农田土壤邻苯二甲酸酯污染对保护我国农田土壤质量，保障农产品安全、生态安全和人体健康具有十分重要的现实意义。
邻苯二甲酸酯类化合物的降解主要有两种途径：生物降解和非生物降解。非生物降解主要包括水解、光解等途径；生物降解主要利用可降解邻苯二甲酸酯的微生物作用进行。由于生物降解所需费用低而且对环境不会造成二次污染，是解决有机物污染的一种理想的方法。然而，目前仍缺少对DBP和DEHP都能实现高效降解的降解菌。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一株对邻苯二甲酸酯(特别是DBP和DEHP)具有高效降解能力的菌株，解决农田土壤邻苯二甲酸酯污染的问题。
本发明中所涉及的邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)，为两者的复合污染。
本发明经过一系列筛选得到一株恶臭假单胞菌RXX-01，分类名为Pseudomonasputida，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224。
进一步地，所述恶臭假单胞菌RXX-01的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组份为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL。
进一步地，所述恶臭假单胞菌RXX-01的培养条件为：25-30℃、pH6.5-7.5、150-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选28℃、pH7.0、170r/min恒温震荡培养24h。
上述恶臭假单胞菌RXX-01在降解水中邻苯二甲酸酯中的应用。
进一步地，所述恶臭假单胞菌RXX-01降解水中邻苯二甲酸酯的最佳条件为：pH为9，菌悬液接种量为体积比1.5％，温度为35℃，转速为175r/min，所述菌悬液浓度为OD600＝0.8-1.2。
上述恶臭假单胞菌RXX-01在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用。
进一步地，所述恶臭假单胞菌RXX-01应用的形式为菌悬液，用量为0.5-10ml/10g干土，所述菌悬液浓度为OD600＝0.8-1.2，降解过程中保持土壤含水量为田间最大持水量的55-65％。
本发明提供的恶臭假单胞菌RXX-01对土壤DBP和DEHP复合污染具有高效的降解效果，在水溶液中培养3天的降解率分别能达到99％以上和97％以上，在土壤中培养14天的降解率分别能达到99％以上及69％，在邻苯二甲酸酯污染土壤修复领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1恶臭假单胞菌RXX-01的划线培养结果；
图2 pH值对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响；
图3接种量对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响；
图4温度对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响；
图5转速对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响；
图6恶臭假单胞菌RXX-01对DBP和DEHP复合污染土壤的修复效果。
生物材料样品保藏信息：
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)RXX-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中所用到的培养基如下：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL，121℃下灭菌30min。
无机盐培养基：K2HPO4·3H2O：1g，NaCl：1g，NH4NO3：0.5g，MgSO4·7H2O：0.4g，CaCl2：0.1g，FeCl3·6H2O：0.01g，加水定容至1000mL，121℃下灭菌30min。
DBP/DEHP无机盐培养基：各移取1ml浓度为5g/L的DBP和DEHP丙酮溶液于完成灭菌的100ml无机盐培养基中，置于通风橱内。丙酮完全挥发后，即可得到浓度为100mg/L的DBP/DEHP无机盐培养基(DBP、DEHP均为50mg/L)。
实施例1邻苯二甲酸酯降解菌的筛选与鉴定
(1)邻苯二甲酸酯降解菌的筛选
在青岛市郊区的蔬菜大棚中采集一定量的土样，准确秤取10g新鲜土样，加入盛有90mL蒸馏水和10mL玻璃珠的三角瓶中，置于摇床中30℃、175rpm振荡混匀，静置待用。
按1％的接种量从以上混合液中取1mL，加入到100mL初始浓度为100mg/L邻苯二甲酸酯(DBP、DEHP均为50mg/L)的无机盐培养液中，置于摇床中30℃、175rpm避光条件下进行振荡培养7d。每次转接逐渐增加邻苯二甲酸酯浓度(包括200mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L)，每七天作为一个驯化周期转接一次，共经过6个驯化周期持续进行培养。
取100μL终期驯化液，涂布于2000mg/L邻苯二甲酸酯(DBP和DEHP均为1000mg/L)的无机盐固体平板上，然后置于30℃生化培养箱中静置培养。待长出肉眼可见菌落后，观察其生长特征，筛选出长势最好的菌株，挑取单菌落将其反复划线接种于新的无机盐固体培养基上，直至镜检纯化为止。
(2)邻苯二甲酸酯降解菌的鉴定
①对筛选到的单菌落RXX-01进行形态观察，其培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、隆起形状、透明度、颜色、迁移性、质地、形态、边缘特征及光泽度等。菌株RXX-01在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养数天后，菌落呈圆形，橘红色，黏质不透明，边缘整齐，表面隆起，湿润光滑，直径一般在0.5～1.0mm(见图1)。
②将菌株RXX-01送往上海生工生物股份有限公司进行分子生物学鉴定，其16SrDNA序列如序列表中SEQ ID No.1所示，经序列比对，其与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(GenBank登录号AY647158)的同源性达到100％。综合菌株的形态特征及16SrDNA序列分析结果，初步鉴定菌株RXX-01为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
实施例2恶臭假单胞菌RXX-01对邻苯二甲酸酯降解能力检测
菌悬液的制备：挑取光滑完整的恶臭假单胞菌RXX-01菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在摇床中28℃、170r/min恒温震荡培养24h。取出牛肉膏蛋白胨液体培养基后，将培养液装于已灭菌的离心管中，在室温条件下，于4000r/min离心分离10min，收集湿菌体。然后用灭菌的生理盐水(0.9％的NaCl溶液)洗涤三次。最后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使其在波长λ＝600nm条件下的吸光度值OD＝1。
DBP/DEHP无机盐培养基中DBP/DEHP残留量的测定：向100ml的DBP/DEHP无机盐培养基中加入乙酸乙酯30ml，振荡30min，然后转移至分液漏斗振荡5min后分液，再用10ml的乙酸乙酯冲洗三次，将乙酸乙酯溶液全部转移到平底烧瓶中。用玻璃层析柱(1.2cm×30cm)依次加入4g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和4g无水硫酸钠，先用10ml的乙酸乙酯预洗柱子，弃去该淋洗液，将平底烧瓶中的乙酸乙酯萃取液分3次转移到层析柱中，再用50ml的乙酸乙酯进行洗脱。收集全部洗脱液于鸡心瓶中，35℃低压旋转蒸发浓缩至干后用色谱级甲醇定容至1.5mL进行测定分析。
采用高效液相色谱法对DBP和DEHP进行测定。色谱条件为：色谱柱：inertsil ODS-SP(250mm×4.6mm i.d.，5.0μm)；流动相A：甲醇，流动相B：水。采用梯度洗脱，具体条件设定如下：设定B起始为30％，在20min内匀速下降到至5％，而后瞬间降至0％并保持5min，再回到30％平衡10min等待下一次进样；总流速：0.8mL/min；柱温箱温度：32℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器；检测波长：228nm。
(1)pH值对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响
DBP/DEHP初始浓度均为50mg/L的DBP/DEHP无机盐培养基，用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH调节培养基的pH值分别为pH＝5.0、pH＝6.0、pH＝7.0、pH＝8.0、pH＝9.0，灭菌。在菌悬液接种量1％(体积比)、温度25℃、转速150r/min的条件下振荡培养3天，测定DBP/DEHP残留量并计算降解率。
降解率计算公式：降解率(％)＝((邻苯二甲酸酯初始浓度—邻苯二甲酸酯残留浓度)/邻苯二甲酸酯初始浓度)×100％。
图2的结果表明：菌株RXX-01对邻苯二甲酸酯的降解能力随着pH值的升高而升高。当pH＝9时，菌株RXX-01对DBP和DEHP的降解率最高，分别为98.9％和97.8％。因此，菌株RXX-01降解DBP和DEHP的最佳pH条件为9。
(2)接种量对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响
DBP/DEHP初始浓度均为50mg/L的DBP/DEHP无机盐培养基灭菌后分别加入0、0.5％、1％、1.5％、2％(体积比)的菌悬液，在pH＝9、温度25℃、转速150r/min的条件下振荡培养3天，测定DBP/DEHP残留量并计算降解率。
图3的结果表明：在菌悬液接种量为1.5％的条件下，菌株RXX-01对DBP和DEHP的降解率最高，分别达到99.8％和93.6％。因此，菌株降解DBP和DEHP的最佳菌悬液接种量为1.5％。
(3)温度对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响
DBP/DEHP初始浓度均为50mg/L的DBP/DEHP无机盐培养基灭菌后，在菌悬液接种量为1.5％(体积比)、pH＝9、转速150r/min条件下，分别在温度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃条件下振荡培养3天，测定DBP/DEHP残留量并计算降解率。
图4的结果表明：在温度为35℃的条件下，菌株RXX-01对DBP和DEHP的降解率最高，分别达到98.4％和97.5％。因此，菌株降解DBP和DEHP的最佳温度为35℃。
(4)转速对恶臭假单胞菌RXX-01降解DBP和DEHP的影响
DBP/DEHP初始浓度均为50mg/L的DBP/DEHP无机盐培养基灭菌后，在菌悬液接种量为1.5％(体积比)、pH＝9、温度35℃条件下，分别在0、100r/min、150r/min、175r/min、200r/min的转速条件下振荡培养3天，测定DBP/DEHP残留量并计算降解率。
图5的结果表明：在转速为175r/min的条件下，菌株RXX-01对DBP和DEHP的降解率最高，分别达到99.3％和97.3％。因此，菌株降解DBP和DEHP的最佳转速为175r/min。
实施例3恶臭假单胞菌RXX-01对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果
将一定量的DBP、DEHP溶于丙酮溶剂中，配成丙酮溶液。将上述丙酮溶液添加到过筛风干土样中，搅拌混匀，放入通风橱中抽去丙酮，即制备出邻苯二甲酸酯污染土壤原样，使DBP、DEHP的初始浓度均达到60mg/kg。每份称取50g污染土壤样品于150ml灭菌棕色样品瓶中，加入菌悬液5ml(接种量为10％)，再加入去离子水，使土壤含水量达到田间最大持水量的60％。用封口膜封严后放入生化培养箱中25℃避光培养，每隔1～2天调节土壤含水量，使土壤含水量在整个培养过程中保持恒定。培养第0、3、7、14天时分别取样进行分析。
准确称取自然风干后的土壤样品5.00g于250mL锥形瓶中，加入提取液丙酮:石油醚(V/V＝1/3)90mL，超声处理30min，砂芯漏斗抽滤，用90mL提取液充分洗涤锥形瓶及砂芯漏斗内壁，滤液和洗涤液合并收于圆底烧瓶中，35℃低压旋转蒸发浓缩至3～5mL；用玻璃层析柱(1.2cm×30cm)依次加入4g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和4g无水硫酸钠，先用淋洗液石油醚:乙醚(V/V＝10/0.4)10mL预洗柱子，弃去淋洗液，再用石油醚:乙醚(V/V＝10/3)90mL洗涤圆底烧瓶，收集全部洗脱液于鸡心瓶中，35℃低压旋转蒸发浓缩至干后用色谱级甲醇定容至1.5mL进行液相色谱分析。
图6的结果表明：在第3天时，土壤中的DBP和DEHP降解率分别达到77％和11％。在第14天时，DBP和DEHP的降解率分别达到99％和69％。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 恶臭假单胞菌RXX-01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 1
ggcctacaca tgcaagtcga gcggatgacg ggagcttgct ccttgattca gcggcggacg 60
ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggaca acgtttcgaa aggaacgcta 120
ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga 180
gcctaggtcg gattagctag ttggtggggt aatggctcac caaggcgacg atccgtaact 240
ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300
cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga 360
agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa gctaatacct 420
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gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag 1080
cacgttatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca 1200
gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tctcacaaaa ccgatcgtag tccggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca gaatgtcgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcacc 1380
agaagtagct agtctaacct tcgggaggac ggttaccacg gtgtgattca tgactggggt 1440
gaagtcg 1447

Claims (8)

1.一株恶臭假单胞菌RXX-01，分类名为Pseudomonas putida，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224。
2.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌RXX-01，其特征在于，其培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组份为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL。
3.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌RXX-01，其特征在于，所述恶臭假单胞菌RXX-01的培养条件为：25-30℃、pH6.5-7.5、150-200r/min恒温震荡培养24-72h。
4.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌RXX-01，其特征在于，所述恶臭假单胞菌RXX-01的培养条件为：28℃、pH7.0、170r/min恒温震荡培养24h。
5.权利要求1-4任一所述恶臭假单胞菌RXX-01在降解水中邻苯二甲酸酯中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌RXX-01降解水中邻苯二甲酸酯的最佳条件为：pH为9，菌悬液接种量为体积比1.5％，温度为35℃，转速为175r/min，所述菌悬液浓度为OD600＝0.8-1.2。
7.权利要求1-4任一所述恶臭假单胞菌RXX-01在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌RXX-01应用的形式为菌悬液，用量为0.5-10ml/10g干土，所述菌悬液浓度为OD600＝0.8-1.2，降解过程中保持土壤含水量为田间最大持水量的55-65％。
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