CN105920773B - 一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂。所述菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇交联产物为载体，包埋白色杆菌（Leucobacter sp.）JW‑1制成；菌剂中白色杆菌属JW‑1菌的湿菌体含量为30 g/L、聚乙烯醇含量为120 g/L、海藻酸钠的含量为20 g/L；菌剂为圆形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能好。白色杆菌属JW‑1菌对多种三嗪类除草剂有很好的降解效果，能快速的降解含甲硫基（‑SCH3）和氯基（‑Cl）的三嗪类除草剂。游离的白色杆菌在环境中易流失、环境适应能力差，因此将该菌包埋固定制成菌剂实际应用到三嗪类除草剂的生物修复技术领域，具有较大的生物修复意义和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物修复有机污染技术领域，涉及一种三嗪类除草剂降解菌菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
三嗪类除草剂是目前世界上使用最广泛的一类除草剂之一，2007年全球三嗪类除草剂销量占除草剂市场5.3％。目前上市的品种有11个，如莠去津、西玛津、特丁津、扑灭津、扑草净、西草净、莠灭净、嗪草酮等。三嗪类除草剂被广泛用于大豆、玉米、高粱等作物田，防除禾本科与阔叶杂草。三嗪类除草剂因其化学性质稳定，在土壤中有较强的吸附性，所以在环境中的半衰期可达几个月甚至一年以上，三嗪类除草剂易污土壤、地表水和地下水。一些研究表明三嗪类除草剂能影响哺乳类和两栖类动物的内分泌系统，中枢神经系统和免疫系统的发育。目前三嗪类除草剂已经被欧盟禁用，但它仍然在中国美国、澳大利亚和非洲被广泛应用。面对环境污染的加剧，修复污染变得越来越重要。
三嗪类除草剂的污染修复主要有物理修复、化学修复和生物修复。物理修复和化学修复因其修复不彻底、易造成二次污染、修复成本高等缺点，实际应用并不多。生物修复技术因其成本低、修复彻底、无二次污染等优点，已逐渐成为一种主流的修复环境污染的技术手段。
发明内容
为解决三嗪类除草剂残留污染等问题，本发明目的在于提供一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂及制备方法。
本发明所述用于降解三嗪类除草剂的菌为白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1，NCBI中Genbank登录号为KT439069，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No：11754，保藏日期：2015年11月27日。
一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇交联产物为载体，包埋白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1制成；
所述菌剂中白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体含量为30g/L、聚乙烯醇含量为120g/L、海藻酸钠的含量为20g/L；
菌剂为圆形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能好。
制备用于降解三嗪类除草剂的菌剂的操作步骤如下：
(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠依次加入水中，搅拌混匀，在压力101KPa、温度121℃条件下灭菌20min，室温冷却，得到混合液；所述混合液中聚乙烯醇的含量为120g/L，海藻酸钠为20g/L；
(2)在混合液中加入白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体，搅拌混匀，得到菌体包埋液；所述包埋液中白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体的含量为30g/L；
(3)将包埋液滴加到交联液中，4℃静置24h，洗涤、收集得到的固体颗粒即为用于降解三嗪类除草剂的菌剂，所述菌剂中白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体含量为30g/L、聚乙烯醇含量为120g/L、海藻酸钠的含量为20g/L。
进一步限定的技术方案如下：
步骤(2)中所述的白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体具体制备操作如下：在无菌条件下，将白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养4天，培养温度30℃±1℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种于100mL富集培养液中，30℃±1℃，150r/min恒温摇床内培养40h，得到菌悬液；将菌悬液于6000r/min离心10min，弃去上清液，保留沉淀物；用0.9％的氯化钠溶液洗涤沉淀3次，得到白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体。
所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH调为7.5，101KPa、121℃灭菌20min。
所述富集培养液为牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、蒸馏水1L，pH调为7.5，101KPa、121℃灭菌20min。
步骤(3)中所述的交联液由硼酸和氯化钙加入水中混合均匀，在压力101KPa、温度121℃条件下灭菌20min，室温冷却配制成的溶液，硼酸的含量为50g/L，氯化钙的含量为20g/L。
白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1对多种三嗪类除草剂有很好的降解效果，能快速的降解含甲硫基(-SCH3)和氯基(-Cl)的三嗪类除草剂。游离的白色杆菌在环境中易流失、环境适应能力差，因此将该菌包埋固定制成菌剂实际应用到三嗪类除草剂的生物修复技术领域，具有较大的生物修复意义和经济效益。
本发明的有益技术效果具体体现在以下方面：
(1)本发明的菌剂，因其使用的材料(聚乙烯醇、海藻酸钠等)对微生物无害，可以较好的保留白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的降解活性。白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的菌体 被包埋于菌剂中，可以避免水体的流动而造成菌体的流失，减少了机械摩擦对菌体造成的伤害。生产成本低，直接投入水体或土壤中即可使用，具有广阔的应用前景。
(2)本发明的菌剂可以快速的降解水体残留的扑草净，100mg/L扑草净的降解半衰期仅为1.1h；在土壤中100mg/L扑草净60天内降解率超过60％。
(3)本发明的菌剂可以反复使用四次，对扑草净(100mg/L)的降解率仍然保持在40％以上。
(4)本发明的菌剂可以降解多种三嗪类除草剂，如：扑草净、西草净、莠灭净、莠去津、西玛津、扑灭津和特丁津，可以广泛的用于修复三嗪类除草剂的残留污染。
附图说明
图1为本发明菌剂的物理形状图；
图2为本发明菌剂对扑草净降解效果图；
图3为本发明菌剂对扑草净降解的循环利用次数与降解效果图；
图4为本发明菌剂对土壤中扑草净的降解效果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明；但本发明的实施方式并不限于此。以下实施例所用白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No：11754，保藏日期：2015年11月27日。
实施例1
制备用于降解三嗪类除草剂的菌剂的操作步骤如下：
(1)制备白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1湿菌体
在无菌条件下，用接菌环蘸取少量白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养4天，培养温度30℃±1℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种两环于装有100mL液体富集培养基的250mL三角瓶中，30℃±1℃，150r/min恒温摇床内培养40h，得到菌悬液；将菌悬液于6000r/min离心10min，弃去上清液，保留沉淀；用0.9％的氯化钠溶液洗涤沉淀3次，得到白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体。
其中固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，配方是：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH调为7.5，101KPa、121℃灭菌20min；液体富集培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方是：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、蒸馏 水1L，pH调为7.5，101KPa、121℃灭菌20min。
(2)制备菌体包埋液
将12g聚乙烯醇和2g海藻酸钠依次加入100mL水中，搅拌混匀，于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min，室温冷却，得到混合液；
在100mL混合液中加入3g白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体，搅拌混匀，得到包埋液。
(3)交联液的配制
将5g硼酸和与2g氯化钙加入100mL水中溶解，于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min，室温冷却得到交联液。
(4)交联制备三嗪类除草剂降解菌菌剂
将装有100mL交联液的250mL三角瓶置于磁力搅拌器上，将100mL包埋液用注射器缓缓滴入交联液中，4℃条件下固定24h，收集菌剂，用无菌的0.9％氯化钠溶液洗涤3次，即得到降解三嗪类除草剂的菌剂；菌剂中白色杆菌(Leucobacter sp.)JW-1的湿菌体的含量为30g/L、聚乙烯醇的含量为120g/L、海藻酸钠的含量为20g/L。
由图1可见，菌剂为圆形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能好。
实施例2
降解三嗪类除草剂的菌剂对扑草净的降解实验
1水体中降解三嗪类除草剂的菌剂对扑草净的降解实验
(1)无机盐培养基(Mineral Salt Medium，以下简称MSM)制备：
MgSO4·7H2O，0.4克；FeSO4·7H2O，0.002克；K2HPO4，0.2克；(NH4)2SO4，0.2克；CaSO4，0.08克；蒸馏水1L；pH调至7.5，配制好的MSM经121℃高压灭菌20min备用。
(2)向含有100.0mg/L扑草净的20mL的MSM中，加入制备好的三嗪类除草剂降解菌菌剂0.3g，在37℃、150r/min摇床上培养0、1、2、3、4、6、8、10、12h后，提取检测扑草净残存浓度。同时设置不加湿菌体的本发明菌剂作为空白对照，对照与处理均设3个重复。
实验结果如图2可见，本发明菌剂对扑草净的降解半衰期为1.1h，6h后的降解率达到96.72％以上，基本降解完全。
(3)降解三嗪类除草剂的菌剂的循环利用实验：向含有100.0mg/L扑草净的20mL的MSM中，加入制备好的降解三嗪类除草剂的菌剂0.3g，在37℃、150r/min摇床上培养 12h后，将使用过的菌剂滤出，以MSM洗涤3次，再次使用，检测其降解效果，操作步骤同上。
实验结果如图3可见，本发明菌剂在循环使用2次，对扑草净的降解率仍能保持90.0％以上；菌剂在循环使用3次，对扑草净的降解率仍能保持60.0％以上。
实际应用中将本发明菌剂直接加入污水中即可，每1L污水加入15g菌剂。本发明菌剂可以循环使用3次，仍能达到60.0％以上的降解效果。
2土壤中降解三嗪类除草剂的菌剂对扑草净的降解实验
向250mL的三角瓶中加入含有100.0mg/L扑草净的100g(干重)的土壤，并同时加入降解三嗪类除草剂的菌剂10g，混匀后，于37℃恒温培养箱中培养，每个3天向土壤中加水使其含水率保持在25％-30％之间并摇匀瓶中的土壤，于0、6、12、18、24、30、45、60d后，取土样检测土壤中扑草净残存浓度。同时设置不加湿菌体的本发明菌剂作为空白对照，对照与处理均设3个重复。
实验结果如图4可见，12d本发明菌剂对土壤中扑草净的降解率达到44.4％，60d的降解率为63.1％。
实施例3
降解三嗪类除草剂的菌剂对其他三嗪类除草剂的降解实验
分别向含有50.0mg/L莠灭净、西草净、莠去津、扑灭津、西玛津的20mL的MSM中，加入降解三嗪类除草剂的菌剂0.5g，在37℃、150r/min摇床上分别培养2、4d后，提取检测三嗪类除草剂残存浓度。同时设置不加湿菌体的本发明菌剂作为空白对照，对照与处理均设3个重复。
表1
结果见表1，降解三嗪类除草剂的菌剂对莠去津、扑灭津、特丁津、西玛津、莠灭净和西草净均有良好的降解效果，2d后，莠去津、扑灭津、特丁津、莠灭净和西草净几乎全部降解完全，西玛津的降解率接近80％；4d后，西玛津的降解率达到90％。因此本发明菌剂对污染环境中的莠去津、扑灭津、特丁津、西玛津、莠灭净和西草净等六种三嗪类除草剂残留的降解具有重要的修复意义。
Claims (6)
1.一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂，其特征在于：所述菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇交联产物为载体，包埋白色杆菌JW-1制成；
所述菌剂中白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体含量为30 g/L、聚乙烯醇含量为120 g/L、海藻酸钠的含量为20 g/L；
菌剂为圆形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能好；
所述白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1菌保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：11754，保藏日期：2015年11月27日。
2.制备权利要求1所述用于降解三嗪类除草剂的菌剂的方法，其特征在于：操作步骤如下：
（1）将聚乙烯醇和海藻酸钠依次加入水中，搅拌混匀，在压力101 KPa、温度121 ℃条件下灭菌20 min，室温冷却，得到混合液；所述混合液中聚乙烯醇的含量为120 g/L，海藻酸钠为20 g/L；
（2）在混合液中加入白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体，搅拌混匀，得到菌体包埋液；所述包埋液中白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体的含量为30 g/L；
（3）将包埋液滴加到交联液中，4 ℃静置24 h，洗涤、收集得到的固体颗粒即为用于降解三嗪类除草剂的菌剂，所述菌剂中白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体含量为30g/L、聚乙烯醇含量为120 g/L、海藻酸钠的含量为20 g/L；所述交联液由5 g硼酸和与2 g氯化钙加入100 mL水中溶解制得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体具体制备操作如下：
在无菌条件下，将白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养4天，培养温度30 ℃±1 ℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种于100 mL富集培养液中，30 ℃±1 ℃，150 r/min 恒温摇床内培养40 h，得到菌悬液；将菌悬液于6000 r/min离心10 min，弃去上清液，保留沉淀物；用0.9 %的氯化钠溶液洗涤沉淀3次，得到白色杆菌（Leucobacter sp.）JW-1的湿菌体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述富集培养液为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的交联液由硼酸和氯化钙加入水中混合均匀，在压力101 KPa、温度121 ℃条件下灭菌20 min，室温冷却配制成的溶液，硼酸的含量为50 g/L，氯化钙的含量为20 g/L。
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