CN107151665A - 固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，包括以下步骤：将固定化内生菌生物吸附剂加入含铅废水中，恒温振荡下进行吸附，以去除废水中的铅；其中固定化内生菌生物吸附剂的制备包括(1)制备改性碳纳米管；(2)将聚乙烯醇、海藻酸钠和改性碳纳米管加水混合均匀，制备固定化基质；(3)将内生菌悬液与固定化基质搅拌均匀后，挤压到氯化钙溶液中进行交联反应。本发明的方法对废水中的Pb2+具有强去除能力，吸附容量大，吸附效率好，稳定性好，且重复利用率高。

Description

固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法
技术领域
本发明属于重金属污染废水生物修复领域，具体涉及一种固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法。
背景技术
随着经济的快速发展，人类在城市化建设、工农业生产等过程中向环境中排放了大量的重金属。重金属污染物释放进入环境介质后，不易分解，同时通过生物累积作用，参与食物链循环并在生物体内积累与放大，因而具有明显的生物毒性，对生态系统和公众健康产生了巨大威胁。近年来，在众多的污染物治理中，重金属污染治理受到了越来越多的关注。近几十年来，利用物理、化学方法治理铅污染废水的方法取得了很大发展并被成功地应用，主要有淋洗法、化学沉淀法、电化学法、氧化还原法、离子交换法、膜技术法、反向渗透法、蒸发治理等方法。但这些方法存在治理费用高、效率低下、需要大量劳动力、处理过程缺乏选择性及容易带来二次污染等缺点。因而努力寻求新的方法来治理铅污染变得很迫切。作为环境友好型技术的生物修复技术在治理铅污染中具有重要的意义，研究发现：在重金属污染地区生存的微生物能够进化出一系列的生存手段来应对重金属的环境压力。重金属的生物修复法的关键就是利用这些微生物进化出来对抗重金属污染的生存机制来处理环境中特别是水体环境中的重金属污染。因此，如何筛选驯化出重金属耐性强的微生物并开发出能有效处理重金属污染废水的生物吸附材料和生物修复技术成为当务之急。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种吸附容量高、吸附效率好、稳定性好、对废水中的重金属铅有强去除能力且重复利用率高的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，包括以下步骤：将固定化内生菌生物吸附剂加入含铅废水中，恒温振荡下进行吸附，以去除废水中的铅；在恒温振荡前调节所述含铅废水的pH值至2～5，所述吸附的时间为0.25h～24h，所述吸附的温度为20℃～35℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.15g/50mL含铅废水～0.85g/50mL含铅废水，所述含铅废水中铅离子的初始浓度为10mg/L～500mg/L；
所述固定化内生菌生物吸附剂由以下方法制备得到：
(1)改性碳纳米管的制备：将多壁碳纳米管与混酸进行混合，所述混酸由浓硫酸和浓硝酸组成，混合后在110℃～130℃温度和10r/min～30r/min搅拌的条件下，冷却回流1h～3h，然后在室温下放置24h～72h，再进行离心分离，将所得沉淀物洗涤至中性，经真空抽滤和真空干燥后，得到改性碳纳米管；
(2)固定化基质的制备：将聚乙烯醇、海藻酸钠和步骤(1)得到的改性碳纳米管加入水中混合，搅拌均匀后，静置冷却并灭菌，得到固定化基质；其中，聚乙烯醇、海藻酸钠、改性碳纳米管与固定化基质的比例为2g～8g∶1g～6g∶0.2g～0.5g∶100mL；
(3)生物吸附剂的制备：将内生菌悬液加入到步骤(2)所得固定化基质中，内生菌悬液与固定化基质的体积比为5～20∶100，搅拌均匀后，经注射装置挤压到氯化钙溶液中进行交联反应，交联反应时间为10h～48h，得到固定化内生菌生物吸附剂，本步骤的操作均在室温无菌环境下进行。
上述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法中，优选的，所述含铅废水的pH值为3～5，所述吸附的时间为10h～24h，所述吸附的温度为25℃～35℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.25g/50mL含铅废水～0.65g/50mL含铅废水，所述含铅废水中铅离子的初始浓度为10mg/L～200mg/L。
上述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法中，优选的，所述含铅废水的pH值为5，所述吸附的时间为12h，所述吸附的温度为30℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.25g/50mL含铅废水，所述铅离子在废水中的初始浓度为100mg/L。
上述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法中，优选的，所述固定化内生菌生物吸附剂对含铅废水的吸附-解吸循环使用次数≤20次。
上述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法中，优选的，所述固定化内生菌生物吸附剂制备过程中：步骤(2)中，聚乙烯醇、海藻酸钠、改性碳纳米管与固定化基质的比例为6g∶2g∶0.5g∶100mL；步骤(3)中，内生菌悬液与固定化基质的体积比为15∶100，交联反应时间为10h。
上述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法中，优选的，所述固定化内生菌生物吸附剂制备的步骤(3)中，所述内生菌悬液由以下方法制备得到：
(a)植物样品预处理：将新鲜植物样品东南景天洗净并将其根茎叶分别切成2cm～3cm的小段；
(b)植物样品表面的消毒：将预处理后的植物样品的根茎叶在乙醇溶液中浸泡2min～5min后转移到次氯酸钠溶液中继续浸泡0.5min～2min，将浸泡后的植物根茎叶样品用无菌水多次冲洗以去除表面的消毒液，并取最后一次洗涤液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无菌落则证明表面消毒充分，后续步骤所分离获得的均为植物内生菌；
(c)内生菌的分离和浸出：将经过表面消毒后的植物根茎叶样品置于含纤维素酶和十二烷基硫酸钠的灭菌PBS溶液中研磨，将研磨液转入容器中搅拌，将植物组织的内生菌充分浸出，得到内生菌浸出液和植物残渣；
(d)内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀释，分别取原液和不同稀释倍数的稀释液涂布于TSB琼脂平板，另将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所有平板恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中真菌至察氏培养基中，细菌至TSB固体培养基中，划线培养至纯后，得到内生菌，具体为内生地衣芽孢杆菌；
(e)内生菌悬液的制备：将内生菌接种培养为种子液，种子液再接种至发酵培养基中培养，得到内生菌悬液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明采用了一种新型的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水，吸附容量高，吸附效率好，吸附剂在废水中的稳定性好，对废水中的重金属铅有强去除能力，并且吸附-解吸过程的重复利用率高，多次重复后吸附效率仍然能保护较高水平，能够广泛用于处理水体环境中的重金属污染。
2、本发明处理含铅废水采用的生物吸附剂是首次以重金属重污染区域的植物东南景天体内提取的内生地衣芽孢杆菌作为固定化用的微生物、并首次将碳纳米管进行改性后结合聚乙烯醇、海藻酸钠固定化内生地衣芽孢杆菌制得，该生物吸附剂的吸附性能好，重复利用率高，可有效解决现有生物吸附剂所存在的缺陷，并且制备过程简单易行，易于控制，生产周期短，成本低廉，技术通用性好。
附图说明
图1为本发明实施例1中提取得到的BRE07号微生物的照片。
图2为本发明实施例1中提取的BRE07号耐铅微生物在革兰氏染色前的显微照片。
图3为本发明实施例1中提取的BRE07号耐铅微生物在革兰氏染色后的显微照片。
图4为本发明实施例1中提取的BRE07号耐铅微生物的电泳图(图a)与现有NCBI数据库中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的电泳对比图(图b)，其中，图a为实施例1的BRE07的16SrDNA图，图b为标准条带图。
图5为本发明实施例1中不同pH值下固定化微生物小球和未添加微生物小球对含铅废水吸附效果的影响曲线。
图6为本发明实施例1中不同吸附时间下固定化微生物小球对含铅废水(浓度为50、100mg/L)吸附效果的影响曲线。
图7为本发明实施例1中不同吸附温度下固定化微生物小球对含铅废水吸附效果的影响曲线。
图8为本发明实施例1中不同吸附剂用量下固定化微生物小球和未添加微生物小球对含铅废水吸附效果的影响曲线。
图9为本发明实施例1中不同铅离子初始浓度下固定化微生物小球对含铅废水吸附效果的影响曲线。
图10为本发明实施例1中固定化内生菌生物吸附剂的吸附-解吸效率图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
以下各实施例和对比例中，采用的实验设备、药剂和测定方法等如下：
1、实验设备及仪器
本发明将从超累积植物体内提取的内生菌进行了固定化制得一种新型的生物吸附剂，通过处理实验室模拟重金属铅废水，探讨了本发明的生物吸附剂的最佳制备条件、最佳吸附条件、最优吸附量。
实验中需要使用的实验设备有超净工作台、生化培养箱、高压灭菌锅、恒温震荡摇床等。实验中需要使用的实验仪器有：pH计、原子吸收分光光度计、电子分析天平等。
2、实验材料与药剂
本实验中需要测定的项目主要是重金属铅离子的浓度，根据标准的测定方法，研究中需要使用到的药剂均为分析纯试剂。
3、分析项目及方法
重金属铅离子的测定：原子吸收分光光度法。
相应的分析步骤均按国家标准分析方法执行。
本发明创新性地将从重金属超累积植物中筛选出铅抗性强的微生物，采用聚乙烯醇、海藻酸钠和改性后的碳纳米管来固定微生物，通过考察制备吸附剂的最佳操作条件及吸附铅的最佳吸附条件，系统地研究改性碳纳米管固定化微生物处理含铅废水的技术方案，以便实现对废水中铅的良好处理效果。
实施例1：
一种本发明的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，研究过程和方案如下：
将固定化内生菌生物吸附剂加入含铅废水中，在恒温振荡下进行吸附，以去除废水中的铅。其中，固定化内生菌生物吸附剂的制备过程以及生物吸附剂去除含铅废水中铅离子的工艺过程具体如下。
S1、制备固定化内生菌生物吸附剂，用于作为处理含铅废水的吸附剂。
1、超累积植物体内内生菌的筛选驯化
1.1土壤中重金属含量的测定
(1)准确称取0.5g过100目孔径筛的土壤样品，置于聚四氟乙烯坩埚中，用水润湿后，加入盐酸10mL，彻底冷却。
(2)将步骤(1)所得装有土壤样品的坩埚置于通风橱内的电热板上，120℃加热，分解样品。若反应还产生棕黄色烟，说明有机质还多，要反复补加5mL硝酸，至不产生棕黄色烟，剩余约3～4mL，取下，待其冷却。
(3)加入HF酸5mL，设置180℃加热煮沸10min，取下，冷却。
(4)加入高氯酸5mL，以220℃的温度蒸发至剩余2mL左右，然后加入高氯酸2mL，再次蒸发至近干，冷却。
(5)加入质量分数为1％的硝酸25mL，煮沸溶解残渣。
(6)将消解好的溶液移至50mL容量瓶中，定容至标线，备测。
以下表1是采集植物区的土壤重金属含量情况，采自衡阳市水口山尾矿库附近。
表1土壤中重金属含量
金属元素 铅Pb 镉Cd 备注
含量(mg/kg) 1482.23 197.17
土壤背景值(mg/kg) 25 0.5
超标倍数 59.29 394.34 重金属污染超标严重
由表1我们可看出，实验采集的土壤中重金属含量超标相当严重，土壤中铅污染超标59.29倍，镉污染超标394.34倍。
1.2内生菌的提取
(a)植物样品预处理
小心将采集好的新鲜植物东南景天根部泥土去除，用清水洗净并将其根茎叶分别切成2cm左右的小段。
(b)植物样品表面的消毒
根据植物表皮厚薄分别将预处理后的植物样品的根茎叶在体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡2～5min后立即转移到氯元素质量分数为2％的次氯酸钠溶液中继续浸泡0.5～2min，用无菌水将浸泡后的植物样品冲洗5次以去除参于表面的消毒液，并取100μL最后一次洗涤液涂布平板于30℃下恒温培养3天作为表面消毒的对照，若对照平板无菌落则证明表面消毒充分，后续步骤所分离获得的均为植物内生菌。表面消毒液(乙醇溶液和次氯酸钠溶液)的浸泡时间为获得充分表面消毒效果的最短时间。一般说来，植物的根茎表面消毒时间要长于叶部。
(c)内生菌的分离和浸出方法
将经过表面消毒后的植物根茎叶样品于10mL含重量体积分数为1％纤维素酶和0.25％SDS(十二烷基硫酸钠)的灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥形瓶中150rpm搅拌，30℃条件下保持1h。在利用机械剪切力使植物内生菌释放出来的同时再利用表面活性剂和纤维素酶能分解植物的纤维素和细胞壁的特点，将植物组织的内生菌充分浸出。
(d)内生菌的分离纯化
在无菌条件下一方面将经内生菌分离和浸出液作梯度稀释，分别取原液、10倍、100倍稀释液100μL涂布于TSB琼脂平板；另一方面，将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所有平板均于30℃恒温培养箱2～14天后挑取不同形态的菌落。真菌至察氏培养基，细菌至TSB固体培养基中，划线培养至纯后，经筛选得到重金属铅抗性强的内生菌，于-80℃保存。
本步骤是超累积植物体内内生抗性菌株的提取，超累积植物体内含有的微生物种类繁多，本实施例从采自衡阳市水口山尾矿库附近采集的超累积植物东南景天体内提取了耐铅性微生物，编号为07，命名为BRE07，如图1所示。
将此种微生物转接种至含Pb2+牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，形成的菌落大，与在不含Pb2+牛肉膏蛋白胨培养基中形成的菌落大小相差不多，最高耐受浓度为600mg/L。
对微生物进行革兰氏染色，在显微摄像系统下观察到，对比未染色的微生物，BRE07号微生物经革兰氏染色后呈红色，表明其为革兰氏阴性菌，染色前后对比分别如图2和图3所示。
将提取得到的抗性较强的微生物进行琼脂凝胶电泳后，具体为1％琼脂糖电泳，150V、100mA、20min的电泳观察，得到如图4所示的结果，a为本实施例的16SrDNA图，b为标准条带图，可看到图片对应的光带很明显，将其进行处理后进行后续的研究。
在耐Pb2+微生物BRE07的16S rDNA进行PCR扩增后，得到了长度为1449bp的该菌的16S rDNA，将测得的序列与现有NCBI数据库中的菌种序列进行比对发现07属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，并且与数据库地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)具有100％的相似性，GenBank数据库中序列登录号为GU967445。由此可知，本实施例中提取的微生物为内生地衣芽孢杆菌。
1.3内生菌悬液的制备
调节种子液培养基pH为7.0，于0.1MPa灭菌30min。在新鲜的斜面上挑取少许菌落，接种至装有20ml种子液培养基的50ml锥形瓶内，于30℃、150r/min的摇床速度下培养24h，将此培养液作为菌种接种时的种子液。发酵液培养基于自然pH下，在0.1MPa灭菌30min，在无菌条件下以体积分数为4％的接种量接种种子液于含100ml发酵液培养基的250ml的锥形瓶中，温度30℃、摇床速度120r/min下培养48h，得到的即为后续所需内生菌悬液。内生菌悬液中内生菌的体积分数为2％～6％均可。
2、固定化内生菌生物吸附剂的制备及制备条件最优化
2.1改性碳纳米管的制备
(1)多壁碳纳米管的来源：购买所得，量为20g。
(2)制作改性碳纳米管
将5g多壁碳纳米管(MWCNTs)放入三口圆底烧瓶中，在烧瓶里加入100mL混酸(体积比为3∶1的浓硫酸和浓硝酸)，在110～130℃温度下、以较小的速度10r/min搅拌，冷却回流1h，并且室温下放置24h，离心分离(10000r/min)，将氧化后的MWCNTs用超纯水洗涤至中性，真空抽滤，过滤后置于真空干燥箱里于60℃下干燥12h，得到改性多壁碳纳米管，研磨后储于干燥箱备用。
经测试，改性后的碳纳米管顶端的五边形结构产生开口，管壁的七边形结构破裂，氧化形成COOH键(可由傅里叶红外光谱仪得到该结果)
2.2固定化内生菌生物吸附剂的制备
(1)固定化基质的制备：首先将聚乙烯醇、海藻酸钠、上述制得的改性碳纳米管按表3中的比例用水混合，加热并连续搅拌直至该混合液变得均匀。然后将混合液在室温下放置24h，以便冷却和消除溶解过程中生成的气泡。将上述混合液进行分装、灭菌、冷却后，得到固定化基质。
(2)生物吸附剂的制备：将表3中相应体积的内生菌悬液(由菌液量算得)加入到100mL固定化基质中，反复搅拌均匀后，用对应规格的注射器将其挤压到氯化钙溶液(CaCl2溶液，50mL，0.2M)中，室温下交联反应10h，形成直径约为3-5mm的小球，即为固定化内生菌生物吸附剂。将所得固定化内生菌生物吸附剂用无菌水清洗后，在4℃下放置10h～72h，再投入到相应废液中进行吸附效果测定。
在上述制备固定化内生菌生物吸附剂的过程中，包括聚乙烯醇在固定化基质中的浓度A、海藻酸钠在固定化基质中的浓度B、改性碳纳米管在固定化基质中的浓度C、菌液量D(即内生菌悬液与固定化基质的体积比)、交联时间E对吸附剂的吸附效果进行影响因素水平正交实验，正交表选择L16(45)，16表示行数及所需实验组数，5表示因子，4表示水平，以确定最优操作条件。单因素值及正交实验设计组数如表2及表3所示：
表2单因素值
表3正交实验设计组数
在上述制备固定化内生菌生物吸附剂的过程中，聚乙烯醇浓度、海藻酸钠浓度、改性碳纳米管浓度、菌液量、交联时间会影响吸附剂的吸附效果，因此进行了影响因素水平正交实验，正交表选择L16(45)，16表示行数及所需实验组数，5表示因子，4表示水平，以确定最优操作条件。
根据上述设计的正交试验做出16组小球并将小球投入200mg/L的Pb2+废液中于30℃、150rpm转速下吸附12h，检测吸附后废液中Pb2+浓度，第十组即A3B2C4D3E1成球状态理想且吸附率高，因此本发明制备生物吸附剂的最佳条件为每100mL固定化基质含聚乙烯醇6g，海藻酸钠2g，改性碳纳米管0.5g，菌悬液15mL，交联时间为10h。
S2：将上述制备的固定化内生菌生物吸附剂(优选采用第十组A3B2C4D3E1条件下制备的固定化内生菌生物吸附剂)用于处理含铅废水，并研究处理过程的最佳条件
1、吸附方法
固定化内生菌生物吸附剂制备完成后，无菌超纯水清洗3-5次，用于转移至含铅模拟废水中进行吸附。用1mol/L HNO3溶液调节含铅模拟废水的pH。称取一定量的固定化内生菌生物吸附剂加入到已调pH含50mL含铅废水的150mL锥形瓶中，恒温振荡(转速150r/min)进行吸附，吸附完成后取液体的样，5000r/min离心5min，取上清液，0.45μm滤膜过滤，用原子吸收分光光度计测定溶液中剩余Pb2+浓度，计算离子的吸附量、吸附率。实验设三个平行样，测量的数据平均值用于结果分析。
2、吸附条件对固定化内生菌生物吸附剂的影响实验
(1)pH值(添加未固定微生物作为对照)
取适量含Pb(II)溶液，使Pb(II)浓度为100mg/L，用HNO3溶液调节其pH值分别为2、3、4、5，分装到2×4×3个250mL锥形瓶里(每个pH值装6个瓶，3瓶为固定化微生物小球，3瓶为未固定化微生物小球)，每瓶含溶液50mL。以未固定微生物为对照样，每个pH梯度下设3个平行样。取0.25g吸附剂，分别投加于盛有铅离子的锥形瓶中，30℃，150rpm条件下在摇床中进行恒温振荡吸附，吸附12h后取样，5000r/min离心5min，取上清液，经0.45μm滤膜抽滤，取滤液10mL，测定剩余铅离子浓度，计算吸附效率。
吸附率计算公式：
式中：c0——废液初始铅离子浓度
c——吸附后剩余铅离子浓度
如图5所示，微生物进行固定化后制得的小球比未固定微生物制得的小球对重金属Pb2+有更高的吸附率，图5中分别是固定化微生物小球(即本发明的固定化内生菌生物吸附剂，下同)以及未固定微生物的小球随pH变化趋势图。固定化微生物小球的表面电荷和电离度极容易受溶液pH影响，影响其化学特性和表面特征。当pH过低时，水合氢离子(H3O+)会占据附着在小球表面及孔隙中微生物细胞壁的链接基团，产生斥力作用阻碍Pb2+对细胞的靠近，溶液pH值越低水合氢离子(H3O+)越多阻力越大。但随着pH值升高并超过Pb2+产生微沉淀的上限时，溶液中的大量Pb2+会以不溶解氧化物、氢氧化物微粒的形式，使吸附无法进行。本实验用于吸附的固定化微生物小球是以海藻酸钠、改性多壁碳纳米管包埋植物内生菌BRE07制得，对比未固定内生菌BRE07的小球而言，其吸附Pb2+时受溶液pH值影响小，也有着相对高的吸附率。固定化微生物小球表面、孔隙均可供内生菌BRE07附着，而改性碳纳米管及海藻酸钠对pH值的耐受能力相对强，同时改性碳纳米管、BRE07对Pb2+有着一定的吸附、转化作用，从超累积植物东南景天体内获得的微生物BRE07的细胞表面含有羧基和羟基，能螯合转化吸附Pb2+。废液pH值对制备得到的固定化微生物小球吸附Pb2+的影响较强，从图5可看出，此种生物吸附剂对Pb2+的吸附率随着废液pH值的增加而增加，当pH达到5时，吸附率几乎达到100％，pH＝5是吸附的最佳pH。
(2)吸附时间
取适量含Pb(II)溶液，调节其pH值为5，使Pb(II)浓度分别为50、100mg/L，各分装到13×3个250mL锥形瓶里，每瓶含溶液50mL。取0.25g对应制得的吸附剂，分别投加于盛有铅离子的锥形瓶中，30℃，150rpm条件下在摇床中进行恒温振荡吸附，分别在0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12h、14h、16h、24h取样，5000r/min离心5min，取上清液，经0.45μm滤膜抽滤，取滤液10mL，测定剩余铅离子浓度，计算吸附效率。
如图6所示，吸附时间对固定化微生物小球处理含铅废水有着相对大的影响。图6是在不同重金属Pb2+浓度的溶液中吸附时间对固定化微生物小球吸附过程影响所呈现出来的趋势，在前面12h内属于快速吸附，其速率相对大，在12h后吸附速率减小，在12-24h间，溶液中Pb2+离子浓度的变化相对快速吸附期小，说明固定化微生物小球表面及孔隙的吸附点被充分占据。固定化微生物小球表面孔隙、附着内生菌衣鞘、细胞壁对Pb2+的吸附起很大作用，有一部分Pb2+也可通过微生物离子转移系统进入内生菌内部转化成其他无毒化合物。
由图6可以看出，吸附率先随着时间不断增长，在12h达到最大吸附率，12h后吸附率开始下降或是仅有小幅增长，因此将12h定为最佳吸附时间。
(3)吸附温度
取适量含Pb(II)溶液，调节其pH值为5，使Pb(II)浓度为100mg/L，分装到4×3个250mL锥形瓶里，每瓶含溶液50mL，控制温度在20℃、25℃、30℃、35℃范围内，每个梯度下设3个平行样。取0.25g吸附剂，分别投加于盛有铅离子的锥形瓶中，150rpm条件下在摇床中进行恒温振荡吸附，吸附12h后取样，5000r/min离心5min，取上清液，经0.45μm滤膜抽滤，取滤液10mL，测定剩余铅离子浓度，计算吸附效率。
如图7所示，温度对固定化微生物小球中的微生物体内的酶活性影响较大，对发生在小球内部表面的相应的化学反应也会产生影响。微生物体内的酶催化反应与微生物对重金属Pb2+的吸附、螯合等有着密切关系，而温度通过影响酶活性来影响微生物对重金属Pb2+的处理能力。同时在不同温度下，小球表面的其他化学反应也会有着不同速率。因此适宜的温度对固定化生物吸附剂处理Pb2+有着较重要的影响。由图7可知，当温度从20℃上升到30℃时，吸附率随温度增加而增大，当温度超过30℃，吸附率随温度增大而减小，因此30℃为最佳吸附温度。
(4)吸附剂用量(添加未固定微生物作为对照组)
取适量含Pb(II)溶液，调节其pH值为5，使Pb(II)浓度为100mg/L，分装到4×3个250mL锥形瓶里，每瓶含溶液50mL，取0.15、0.25、0.65、0.85g吸附剂，即吸附剂用量为3g/L含铅溶液、5g/L含铅溶液、13g/L含铅溶液、17g/L含铅溶液，分别投加于盛有铅离子的锥形瓶中，每个梯度下设3个平行样。30℃，150rpm条件下在摇床中进行恒温振荡吸附，吸附12h后取样，5000r/min离心5min，取上清液，经0.45μm滤膜抽滤，取滤液10mL，测定剩余铅离子浓度，计算吸附效率。
如图8所示，固定化小球表面吸附位点会随着吸附剂用量的增大而增加。同时吸附效率增加也与吸附位点和Pb2+之间的浓度梯度差有关，浓度差使得固定化微生物小球对Pb2 +吸附动力增加。但吸附剂用量增加到一定程度后，吸附率开始减小，首先吸附剂用量增加会使得固定化微生物小球产生团聚，吸附剂的有效表面积增加有限，从而导致吸附容量的下降，使得部分固定化微生物小球达不到饱和吸附状态。由图8可以看出，当吸附剂用量由3g/L增加到5g/L时，吸附率随着吸附剂用量增加而增大，但是当吸附剂用量从5g/L增加到17g/L时，吸附率逐渐下降，因此5g/L(0.25g/50mL)是最佳吸附剂用量。
(5)铅离子初始浓度
取适量含Pb(II)溶液，调节其pH值为5，分装到6×3个250mL锥形瓶里，每瓶含溶液50mL，控制Pb(II)浓度为10、50、100、200、300、500mg/L，每个梯度下设3个平行样。取0.25g对应制得的吸附剂，分别投加于盛有铅离子的锥形瓶中，30℃，150rpm条件下在摇床中进行恒温振荡吸附，吸附12h后取样，5000r/min离心5min，取上清液，经0.45μm滤膜抽滤，取滤液10mL，测定剩余铅离子浓度，计算吸附效率。
如图9所示，一般而言，重金属离子的吸附过程与重金属离子浓度/生物量之比有关，增大重金属离子的初始浓度可以使得吸附剂的吸附量增加。在低浓度重金属离子存在的条件下，金属离子的浓度越高，则吸附剂表面吸附位点更容易被占满，吸附剂的利用率较高，吸附剂的吸附率逐渐增加，单位数量的吸附剂所吸附的金属的量也比较大。但是当重金属离子浓度超过一定浓度时，吸附位点饱和度也会增加，空的结合点逐渐减少，吸附量会因为吸附剂表面吸附位点的饱和而不再继续增加，反而会降低重金属离子的吸附率。而且，在活体细胞吸附重金属的过程中，增加金属离子的浓度会增大对生物的毒性，会影响甚至抑制生物体的生长及代谢活动，从而抑制吸附过程的进行。从图9可看出，从10mg/L升至100mg/L时，该吸附剂对Pb2+离子去除率逐渐增加并达到最高，去除率接近100％，有着很好的去除效果，当浓度大于100mg/L时，吸附率随浓度增大而减小，因此100mg/L是最佳铅离子浓度。
3、吸附剂可重复利用性
收集吸附试验中吸附了铅离子的菌体，加入到盛有50mL 0.5M HCl的锥形瓶中，30℃下振荡解析30min。用0.45μm滤膜过滤，测定滤液中被解吸下来铅离子含量，从而确定解吸率。滤出解吸后的固定化微生物小球后，再次转移至铅溶液中，重复吸附试验，循环吸附解吸过程5次，检验吸附剂的重复使用率和稳定性。
如图10所示，经5次循环使用后，吸附剂对铅离子的去除效率仅仅降低了3.29％，吸附效率仍保持90％以上，解吸率均在45％以上，说明本发明制备出的固定化内生菌生物吸附剂具有很好的重复利用性能，稳定性好，可重复利用率高。
由上述实施例的内容可得到如下结论：
本发明固定化内生菌生物吸附剂制备的最佳操作条件为：每100mL固定化基质含聚乙烯醇6g，海藻酸钠2g，改性碳纳米管0.5g，菌悬液15mL，交联时间为10h。
在处理含铅废水时，本发明的固定化内生菌生物吸附剂可实现非常好的吸附效果。特别地，当吸附条件为：pH值5.0，温度30℃，吸附时间12h，吸附剂用量0.25g/50mL含铅溶液，初始Pb2+浓度为100mg/L时，本发明的生物吸附剂对重金属Pb2+的去除率可高达99.8％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (6)

1.一种固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，包括以下步骤：将固定化内生菌生物吸附剂加入含铅废水中，恒温振荡下进行吸附，以去除废水中的铅；在恒温振荡前调节所述含铅废水的pH值至2～5，所述吸附的时间为0.25h～24h，所述吸附的温度为20℃～35℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.15g/50mL含铅废水～0.85g/50mL含铅废水，所述含铅废水中铅离子的初始浓度为10mg/L～500mg/L；
所述固定化内生菌生物吸附剂由以下方法制备得到：
(1)改性碳纳米管的制备：将多壁碳纳米管与混酸进行混合，所述混酸由浓硫酸和浓硝酸组成，混合后在110℃～130℃温度和10r/min～30r/min搅拌的条件下，冷却回流1h～3h，然后在室温下放置24h～72h，再进行离心分离，将所得沉淀物洗涤至中性，经真空抽滤和真空干燥后，得到改性碳纳米管；
(2)固定化基质的制备：将聚乙烯醇、海藻酸钠和步骤(1)得到的改性碳纳米管加入水中混合，搅拌均匀后，静置冷却并灭菌，得到固定化基质；其中，聚乙烯醇、海藻酸钠、改性碳纳米管与固定化基质的比例为2g～8g∶1g～6g∶0.2g～0.5g∶100mL；
(3)生物吸附剂的制备：将内生菌悬液加入到步骤(2)所得固定化基质中，内生菌悬液与固定化基质的体积比为5～20∶100，搅拌均匀后，经注射装置挤压到氯化钙溶液中进行交联反应，交联反应时间为10h～48h，得到固定化内生菌生物吸附剂，本步骤的操作均在室温无菌环境下进行。
2.根据权利要求1所述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，其特征在于，所述含铅废水的pH值为3～5，所述吸附的时间为10h～24h，所述吸附的温度为25℃～35℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.25g/50mL含铅废水～0.65g/50mL含铅废水，所述含铅废水中铅离子的初始浓度为10mg/L～200mg/L。
3.根据权利要求2所述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，其特征在于，所述含铅废水的pH值为5，所述吸附的时间为12h，所述吸附的温度为30℃，所述固定化内生菌生物吸附剂的用量为0.25g/50mL含铅废水，所述铅离子在废水中的初始浓度为100mg/L。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，其特征在于，所述固定化内生菌生物吸附剂对含铅废水的吸附-解吸循环使用次数≤20次。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，其特征在于，所述固定化内生菌生物吸附剂制备过程中：步骤(2)中，聚乙烯醇、海藻酸钠、改性碳纳米管与固定化基质的比例为6g∶2g∶0.5g∶100mL；步骤(3)中，内生菌悬液与固定化基质的体积比为15∶100，交联反应时间为10h。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的固定化内生菌生物吸附剂处理含铅废水的方法，其特征在于，所述固定化内生菌生物吸附剂制备的步骤(3)中，所述内生菌悬液由以下方法制备得到：
(a)植物样品预处理：将新鲜植物样品东南景天洗净并将其根茎叶分别切成2cm～3cm的小段；
(b)植物样品表面的消毒：将预处理后的植物样品的根茎叶在乙醇溶液中浸泡2min～5min后转移到次氯酸钠溶液中继续浸泡0.5min～2min，将浸泡后的植物根茎叶样品用无菌水多次冲洗以去除表面的消毒液，并取最后一次洗涤液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无菌落则证明表面消毒充分，后续步骤所分离获得的均为植物内生菌；
(c)内生菌的分离和浸出：将经过表面消毒后的植物根茎叶样品置于含纤维素酶和十二烷基硫酸钠的灭菌PBS溶液中研磨，将研磨液转入容器中搅拌，将植物组织的内生菌充分浸出，得到内生菌浸出液和植物残渣；
(d)内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀释，分别取原液和不同稀释倍数的稀释液涂布于TSB琼脂平板，另将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所有平板恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中真菌至察氏培养基中，细菌至TSB固体培养基中，划线培养至纯后，得到内生菌，具体为内生地衣芽孢杆菌；
(e)内生菌悬液的制备：将内生菌接种培养为种子液，种子液再接种至发酵培养基中培养，得到内生菌悬液。
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