CN111826325A - 多壁碳纳米管在根瘤菌菌剂中的应用及其菌剂和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了多壁碳纳米管在根瘤菌菌剂中的应用及其菌剂和制备方法，将多壁碳纳米管应用于根瘤菌菌剂中，可以显著降低菌剂中活菌数的死亡，延长保存时间。同时还提供了根瘤菌菌剂，包括多壁碳纳米管和根瘤菌浓缩培养液，其中，多壁碳纳米管的浓度为0.01～0.2mg/ml，根瘤菌浓缩培养液的浓度为1010cfu/mL。该菌剂通过将多壁碳纳米管添加至根瘤菌浓缩培养液中得到。本发明根瘤菌菌剂保存时间达十二个月时，比常规菌剂中的存活菌数提高了10倍，具有很好的商业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及多壁碳纳米管在根瘤菌菌剂中的应用及其菌剂和制备方法。
背景技术
自1886年首次发现豆科植物根瘤的固氮功能以来，生物固氮逐渐成为生物学和农业科学的重要研究对象，成为植物-微生物互作研究的理想模型。豆科植物与固氮根瘤菌之间的根瘤共生关系是陆地生态系统中氮的重要来源。共生固氮作用是一种经济、生态上重要的生物过程，它使植物能够在缺氮的土壤中生长而不需要施用氮基肥料。根瘤菌剂代表了一种从长远来看旨在提高农业系统生产力的新技术。与近代越来越多地使用肥料相比，根瘤菌剂接种技术是与可持续农业原则相一致的技术。
液体根瘤菌剂的研制相比其它类型的菌剂，生产过程得到了简化，并且在种子和田间应用上更加方便。然而，由于根瘤菌株缺少了优质载体的保护，导致液体根瘤菌剂在储存过程中或接种到种子上的菌株存活率较低。为了提高根瘤菌剂中的菌株存活率，研究者们一直在积极寻找一些高效的保护载体。
多壁碳纳米管具有表面积大、具有小的、中空的和层状的结构特征，且可溶于生物液体，有可能提供保护根瘤菌存活的微环境。
发明内容
针对现有技术根瘤菌菌剂中菌株存活率低的问题，本发明以多壁碳纳米管(MWCNTs)作为保护载体，应用于根瘤菌菌剂中，可以显著降低菌剂中活菌数的死亡，延长保存时间。
本发明的另一目的在于提供一种以多壁碳纳米管为保护载体的根瘤菌菌剂。
本发明的另一目的提供了上述根瘤菌菌剂的制备方法。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了多壁碳纳米管作为微生物菌剂保护载体的应用。
优选的，所述的微生物菌剂为根瘤菌菌剂。更优选的，所述的根瘤菌选自根瘤菌USDA110、根瘤菌NW5-3或根瘤菌HN01。
同理，所述的多壁碳纳米管在制备微生物菌剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
在本发明的另一方面，提供了一种以多壁碳纳米管为保护载体的根瘤菌菌剂，所述的根瘤菌菌剂包括多壁碳纳米管和根瘤菌浓缩培养液，所述的多壁碳纳米管的质量体积分数为0.01～0.2mg/ml，所述的根瘤菌浓缩培养液的浓度为1010cfu/mL。
优选的，所述的多壁碳纳米管的质量体积分数为0.1～0.2mg/ml。
在本发明的另一方面，提供上述以多壁碳纳米管为保护载体的根瘤菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将无菌多壁碳纳米管置于蒸馏水中破碎，灭菌后得到无菌多壁碳纳米管母液；
2)将多壁碳纳米管母液添加至根瘤菌浓缩培养液中即得。
所述的根瘤菌浓缩培养液通过以下制备方法得到：将根瘤菌菌株活化，用豆芽汁(BSE)培养基培养至对数期，取菌液离心PBS洗涤后，将菌液浓缩20倍用生理盐水重悬。
所述的豆芽汁(BSE)培养基为：甘露醇或蔗糖10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2·6H2O/CaCl2·2H2O 0.1g/0.064g，Rh微量元素液4.0mL，豆芽汁1000mL，调节pH 6.8～7.0。其中豆芽汁为：500g豆芽在1500mL水中煮沸后过滤得到1000mL豆芽汁；Rh微量元素液为：Na2MoO4 5g，H3BO3 5g，dH2O至1000mL。
本发明的有益效果为：
采用本发明制作的大豆根瘤菌剂，与对照相比，MWCNTs能够显著降低根瘤菌活菌数的死亡速度。保存时间达十二个月时，根瘤菌剂的活菌数可达109cfu/ml，比常规菌剂中的存活菌数提高了10倍，具有很好的商业应用前景。
附图说明
图1是本发明4℃保藏MWCNTs-USDA110浓缩液体根瘤菌剂保藏效果图；
图2是本发明4℃保藏MWCNTs-NW5-3浓缩液体根瘤菌剂保藏效果图；
图3是本发明4℃保藏MWCNTs-HN01浓缩液体根瘤菌剂保藏效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 MWCNTs-USDA110液体根瘤菌剂
1)MWCNTs-USDA110浓缩液体根瘤菌剂的制备
无菌MWCNTs材料悬液制备：称量MWCNTs倒入锥形瓶中，加蒸馏水，在使用前放入超声波震碎仪中超声30min，高压蒸汽灭菌30min，以得到均匀细小颗粒状的无菌MWCNTs悬液。
根瘤菌液的培养：将USDA110在YMA平板培养基上活化，用装有5mlYMA液体培养基的PA瓶培养至对数期，之后转接至BSE液体培养基中28℃培养至对数期。
其中，YMA培养基为：甘露醇(或蔗糖)10.0g，酵母粉0.4g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2.6H2O/CaCl2.2H2O 0.1g/0.064g，Rh微量元素液4.0mL，dH2O补充至1000mL，调节pH 6.8-7.0。Rh微量元素液为：Na2MoO4 5g，H3BO3 5g，dH2O至1000mL。
BSE培养基为：甘露醇或蔗糖10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2·6H2O/CaCl2·2H2O 0.1g/0.064g，Rh微量元素液4.0mL，豆芽汁1000mL，调节pH6.8～7.0。其中豆芽汁为：500g豆芽在1500mL水中煮沸后过滤得到1000mL豆芽汁。
以上培养基，121℃灭菌30min，固体培养基加1.5％的琼脂。
根瘤菌剂的制备：无菌操作条件下，将培养好的根瘤菌液离心收菌，用无菌PBS洗涤2次，按将菌液浓缩20倍的条件下，加入0.8％的生理盐水重悬菌液。将重悬后的菌液分成4组，分别向其中添加配备好的无菌MWCNTs母液，使菌剂中的多壁碳纳米管终浓度分别为0mg/ml，0.01mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml。
2)保存效果分析
将制作完成的根瘤菌剂分装入无菌PA瓶中，用封口膜密封，保存于4℃冰箱中。
每隔30天每组取一份菌剂，采用YMA平板计数法进行活菌数测定。
表1 4℃保藏MWCNTs-USDA110浓缩液体根瘤菌剂活菌数测定结果
由表1数据和图1可以看出，USDA110菌剂在4℃保存12个月后，对照组中活菌数下降3个数量级，而添加碳纳米材料MWCNTs的菌剂中活菌数数量级保持不变。这表明碳纳米材料MWCNTs在4℃对浓缩型慢生根瘤菌USDA110活菌数起到保护作用，在菌剂保存至一年时，菌剂中的活菌数依然可达到109cfu/ml，比常规菌剂中的存活菌数(108cfu/ml)提高了10倍。保护剂MWCNTs的有效范围为0.01～0.2mg/ml；保护剂MWCNTs浓度为0.1mg/ml时效果最佳。
实施例2 MWCNTs-NW5-3液体根瘤菌剂
MWCNTs-NW5-3浓缩液体根瘤菌菌剂制备中涉及的无菌纳米材料悬液制备、根瘤菌液的培养、根瘤菌剂的制作保藏以及计数等方法与实施例1中的方法一致，此处不再重复描述。
表2 4℃保藏MWCNTs--NW5-3浓缩液体根瘤菌剂活菌数测定结果
由表2和图2可以看出，MWCNTs-NW5-3浓缩液体根瘤菌剂在4℃保存10个月时，对照组中NW5-3活菌数下降6个数量级，而添加0.01、0.1mg/ml浓度的MWCNTs菌剂中，NW5-3活菌数下降4个数量级，MWCNTs浓度为0.2mg/ml时，活菌数下降3个数量级；当菌剂保存7个月时，CK活菌数下降5个数量级，添加0.01、0.1mg/ml浓度的MWCNTs的菌剂中，活菌数下降2个数量级，MWCNTs浓度为0.2mg/ml时，活菌数下降1个数量级，此时活菌数数量级达到109cfu/ml。
以上分析结果可以看出，加入碳纳米材料MWCNTs的菌剂中活菌数下降速度明显低于对照组。因此碳纳米材料MWCNTs在4℃对浓缩型慢生根瘤菌NW5-3活菌数起到保护作用，保护剂MWCNTs的有效范围为0.01～0.2mg/ml；保护剂MWCNTs浓度为0.2mg/ml时效果最佳。保存时间可达7个月，此时菌剂中活菌数可达109cfu/ml，比常规菌剂中的存活菌数(108cfu/ml)提高了10倍。
实施例3 MWCNTs-HN01液体根瘤菌剂
MWCNTs-HN01浓缩液体根瘤菌菌剂制备中涉及到的无菌纳米材料悬液制备、根瘤菌液的培养、根瘤菌剂的制作保藏以及计数等方法与实施例1中的方法一致，此处不再重复描述。
表3 4℃保藏MWCNTs--HN01浓缩液体根瘤菌剂活菌数测定结果
从表3和图3可以看出，当菌剂在4℃保存8个月时，对照组中HN01活菌数下降4个数量级，添加0.01，0.1mg/ml保护剂的菌剂中HN01活菌数下降2个数量级，保护剂浓度为0.2mg/ml的菌剂中，活菌数下降1个数量级，活菌数可达109cfu/ml。
以上分析可以看出，加入碳纳米材料MWCNTs的菌剂中活菌数下降速度低于对照组，因此碳纳米材料MWCNTs在4℃对浓缩型快生根瘤菌HN01活菌数起到保护作用。保护剂MWCNTs的有效范围为0.01～0.2mg/ml；保护剂MWCNTs浓度为0.2mg/ml时效果最佳。保存时间可达8个月，此时菌剂中活菌数可达109cfu/ml，比常规菌剂中的存活菌数(108cfu/ml)提高了10倍。
实施例4大豆根瘤菌菌剂在盆栽大豆上的接种效应
在实验条件下，模拟田间拌种方式接种根瘤菌菌剂。选取大豆品种天隆1号。实验组采用4℃保存7-12个月、本发明制备的大豆根瘤菌菌剂(109cfu/ml)，对照组采用新鲜培养和制备的大豆根瘤菌菌剂(109cfu/ml)。将100ml根瘤菌菌剂和5公斤大豆种子混合拌种，从而粘附在每颗大豆种子表面的活菌数在106cfu/ml。室温晾干后，将拌菌后的大豆种子种植于蛭石盆栽系统，生长30d后测定大豆植物地上部分鲜重、瘤数、瘤重和固氮酶活等指标。
大豆天隆1号接菌30d后检测各项共生固氮指标，结果如下表4。统计分析显示，接种本发明的HN01菌剂(保存8个月)后，与HN01常规菌剂相比，大豆根系上的结瘤数量增加、瘤重增大、根瘤固氮酶活提高、植物地上部分鲜重生物量提高。接种本发明的USDA110菌剂(保存12个月)后，与USDA110常规菌剂相比，根系上的结瘤数量增加、瘤重增大、根瘤固氮酶活提高、植物地上部分鲜重提高。接种本发明的NW5-3菌剂(保存7个月)后，与NW5-3常规菌剂相比，根系上的结瘤数量增加、瘤重增大、根瘤固氮酶活提高、植物地上部分鲜重提高。在以上3组根瘤菌菌剂对比接种实验中，共生固氮的各个指标分析均达到显著性差异。结果表明，接种本发明的大豆根瘤菌菌剂，具有更好的促进大豆结瘤和固氮的接种效应，具有更优的应用潜力。
表4 发明的大豆根瘤菌菌剂在盆栽大豆上的接种效应
实施例5本发明的大豆根瘤菌菌剂在田间试验中的接种效应
尽管通过盆栽实验进行了比较，发现接种本发明的根瘤菌菌剂具有更优的促进大豆共生结瘤固氮的能力，但有必要在实际田间条件下进行应用试验，进一步检测其应用效果。因此，于2017-2019年在佳木斯开展了大豆接种根瘤菌液体菌剂的田间试验示范。采用大豆根瘤菌液体菌剂拌种、配合氮肥使用量减半。菌剂拌种方式、方法、对照设置等与上述盆栽实验中的描述相同，不再赘述。大豆品种采用黑农48和合农76。中期进行田间调查，测定大豆植株长势性状；成熟期收获，测定产量。相关结果见表5和表6。
田间中期调查发现，接种本发明的NW5-3菌剂能够显著促进合农76的根部结瘤数量；在产量方面，接种本发明的NW5-3菌剂能够增产大豆10.8％，而对照菌剂增产6.5％。在另外一组对比试验中，接种本发明的USDA110菌剂促进黑农48的地上长势、地下结瘤数量和重量；测产数据表明，接种本发明的USDA110菌剂于黑农48上增产12.5％，而接种对照菌剂增产7.3％。
总之，田间试验结果也表明，本发明的大豆根瘤菌菌剂接种大豆后的增产效果优于接种对照菌剂。
表5 本发明的根瘤菌剂NW5-3在田间试验中的应用效果(合农76)
注：数据统计为3个小区(每个小区5个重复)的平均值和标准差，显著性分析采用SPSS-ANOVA分析。
*表示p<0.05水平差异显著。
表6 本发明的根瘤菌剂USDA110在田间试验中的应用效果(黑农48)
注：数据统计为3个小区(每个小区5个重复)的平均值和标准差，显著性分析采用SPSS-ANOVA分析。
*表示p<0.05水平差异显著。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.多壁碳纳米管作为微生物菌剂保护载体的应用，其特征在于，所述的微生物菌剂为根瘤菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的根瘤菌选自根瘤菌USDA110、根瘤菌NW5-3或根瘤菌HN01。
3.多壁碳纳米管在制备微生物菌剂中的应用。
4.一种以多壁碳纳米管为保护载体的根瘤菌菌剂，其特征在于，所述的根瘤菌菌剂包括多壁碳纳米管和根瘤菌浓缩培养液，所述的多壁碳纳米管的质量体积分数为0.01～0.2mg/ml，所述的根瘤菌浓缩培养液的浓度为1010cfu/mL。
5.根据权利要求4所述的一种以多壁碳纳米管为保护载体的根瘤菌菌剂，其特征在于，所述的多壁碳纳米管的质量体积分数为0.1～0.2mg/ml。
6.权利要求4所述的根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将无菌多壁碳纳米管置于蒸馏水中破碎，灭菌后得到无菌多壁碳纳米管母液；
2)将多壁碳纳米管母液添加至根瘤菌浓缩培养液中即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的根瘤菌浓缩培养液通过以下制备方法得到：将根瘤菌菌株活化，用BSE培养基培养至对数期，取菌液离心PBS洗涤后，将菌液浓缩20倍用生理盐水重悬。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的BSE培养基为：甘露醇或蔗糖10.0g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2·6H2O/CaCl2·2H2O 0.1g/0.064g，Rh微量元素液4.0mL，豆芽汁1000mL，调节pH 6.8～7.0；其中豆芽汁为：500g豆芽在1500mL水中煮沸后过滤得到1000mL豆芽汁；Rh微量元素液为：Na2MoO45 g，H3BO35 g，dH2O至1000mL。
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