CN104045382A - 一种固氮根瘤菌剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种固氮根瘤菌剂的生产方法，主要包括以下步骤：在好氧发酵器中布置软性纤维；釆用含有低分子有机碳源的培养基，促进根瘤菌的附着生长；定期补充低分子有机碳源和氮源，定期洗脱软性纤维上的根瘤菌；用低溶氧、低pH值、密封条件保存收集液；检测后装入包装容皿。本发明活菌生长旺盛、连续收集量大，保存条件简单，保存时间长，可以实现根瘤细菌（液体）的产品化、商业化。实际使用该产品时，只需将根瘤菌直接拌入种子中，使用十分方便。

Description

一种固氮根瘤菌剂的生产方法

技术领域

本发明涉及一种固氮根瘤菌剂的生产方法，产品主要用于豆科作物种植方面的微生物制剂，属于农业微生物技术领域。

背景技术

根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 　　大豆、花生等属于豆科植物。它们的根瘤中，有能固氮的根瘤菌与之共生。根瘤菌将空气中的氮转化为植物能吸收的含氮物质，如氨，而植物为根瘤菌提供有机物。 　　 　　豆科植物幼苗期间的分泌物吸引了分布在其根附近的根瘤菌，使其聚集在根毛周围大量繁殖，随后，根瘤菌产生的分泌物使根毛卷曲、膨胀，并使部分细胞壁溶解，根瘤菌由壁被溶解处侵入根毛，在根毛中滋生，聚集成带，外被粘液和根细胞分泌的纤维素，形成侵入线。侵入线为管状结构，根瘤菌沿其侵入根的皮层并迅速在该处繁殖，皮层细胞受刺激亦迅速分裂，致使根部形成局部突起，即成根瘤。根瘤菌居于根瘤中央的薄壁细胞内，逐渐破坏其核与细胞质，本身转变为拟菌体；同时该区域周围分化出与根维管束相连的输导组织、外围薄壁组织鞘和内皮层。拟菌体通过输导组织从皮层细胞吸收碳水化合物、矿物盐类和水进行繁殖，同时进行固氮作用。同时由于根瘤的脱落、残留以及一部分分泌到土壤中的氮，可以增加土壤肥力。生产上用豆科植物与其他作物间作、轮作，就是利用根瘤菌的固氮作用。 　　根瘤菌可以将大气中的无机氮转化为有机氮，但是它从植物体内获取营养，在生态系统中为消费者。

　　当豆科植物在幼苗期，土壤中的根瘤便被其根毛分泌的有机物吸引而聚集在根毛的周围，并大量繁殖。同时产生一定的分泌物，这些分泌物刺激根毛，使其先端卷曲和膨胀，同时，在根菌瘤分泌的纤维素酶的作用下，根毛细胞壁发生内陷溶解，随即根瘤菌由此侵入根毛。 在根毛内，根瘤菌分裂滋生，聚集成带，外面被一层粘液所包，形成为感染丝，并逐渐向根的中轴延伸。同时，在根瘤菌的刺缴下，根细胞相应地分泌出一种纤维素，包围于感染丝之外，形成了具有纤维素鞘的内生管，又称侵入线。根瘤菌顺侵入线进入幼根的皮层中。

　　在皮层内，根瘤菌迅速分裂繁殖，皮层细胞受到根瘤菌侵入的刺缴，也迅速分裂，产生大量的新细胞。致使皮层出现局部的膨大。这种膨大的部分，包围着聚生根瘤菌的薄壁组织，从而形成了外向突出生长的根瘤。

　　之后，含有根瘤菌的薄壁细胞的细胞核和细胞质逐渐被根瘤菌所破坏而消失，根瘤菌相应地转为拟菌体（bacterioid）。

　　主根瘤菌刚刚进入豆科植物根部的时候，并不能固氮，只能发展到拟菌体阶段，才能进行固氮作用。

　　在根瘤内，根瘤菌从豆科植物根的皮层细胞中吸取碳水化合物、矿质盐类及水分。以进行生长和繁殖。同时它们又把空气中游离的氮通过固氮作用固定下来，转变为植物所能利用的含氮化合物，供植物生活所需。这样，根瘤菌与根便构成了互相依赖的共生关系。

　　由于根菌瘤在生活过程中分泌一些有机氮到土壤中，加之，根瘤在植物的生长末期会自行脱落，从而大大提高了土壤的肥力。据估测，一亩苜蓿年均可积累40斤氮肥，相当于200斤硫铵。并可增加土壤中的腐殖质。

　　由于有些土壤中没有与豆科植物共生的根瘤菌，同时不同豆科植物需要与不同类型的根瘤共生，因此在农业上采取在播种豆科植物时，将其与根瘤菌制剂搅抖，以便给豆科作物形成根瘤创造条件。据调查，采用该方法播种，可使大豆、花生增产10%以上。

　　自然界上，除豆科植物外，还有非豆科的几十个属100多种植物能形成根瘤，并能固氮。目前对非豆科植物的根瘤研究引起了很大的重视，潜力很大。

　　虽然空气成分中约有80%的氮，但一般植物无法直接利用，花生、大豆、苜蓿等豆科植物，通过与根瘤菌的共生固氮作用，才可以把空气中的分子态氮转变为植物可以利用的氨态氮。在种子发芽生根后，根瘤菌从根毛入侵根部，在一定条件下，形成具有固氮能力的根瘤，在固氮酶的作用下，根瘤中的类菌体将分子态氮转化为氨态氮，与此同时，每个根瘤就是一座微型氮肥厂，源源不断地把氮输送给植株利用。豆科作物周围的土著根瘤菌数量很少，难以满足作物生长的需要。根瘤菌剂给农作物生产的氮肥不会有环境污染，不需长途运输，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%。 当豆科作物萌发并长出根毛后，根瘤菌受根毛分泌的凝集素的刺激和吸引，大量聚集在根际和根表上。根毛与根瘤菌接触后，首先是细胞壁变软，发生根毛卷曲，然后是细胞壁内陷，根瘤菌随之侵入根毛，直至根的皮层，根瘤菌在皮层大量繁殖并转变为类菌体，此时根部皮层大量增生，形成瘤状组织，最后突出根部形成根瘤，当有效根瘤的剖面呈粉红色时，说明根瘤进 入成熟阶段，开始固氮，并向植株提供氮素。

　　例如：人工接种根瘤的花生每年每平方米的固氮量为7.2-12.4g即每亩花生可以从固氮作用中获得相当于10-17公斤尿素的氮，特别在贫瘠土壤中，人工接种根瘤菌所需的氮素养分有2/3来自于共生固氮。仅1/3是从土壤吸收来的。根瘤每天固定的氮素有94%供给植株，仅有6%留在根瘤中。花生植株不断地从根瘤中得到氮素供应，终身受益。

　　中国地域辽阔豆科作物种类繁多，每年大面积种植花生、大豆、豌豆、蚕豆、绿豆及苜蓿、沙打旺等豆科牧草几十种之多。这些豆科作物和地球上所有的生物一样，在生长中离不开氮这一生命要素。 根瘤菌剂能大量减少化肥的使用量，改善农产品品质，使农产品达到AA级绿色食品要求；有效提高农作物的产量；无任何不良副作用，不构成重金属污染；施用成本只有化肥的十分之一,根瘤菌剂还具有培肥地力，改良土壤结构，肥地养地之功能，所以根瘤菌在豆科作物种植中的作用是其他任何肥料措施无法替代的，具有十分重要的地位。但是，根瘤菌的规模培养和保存技术一直没有得到攻克，它的产品化、商业化过程一直进展很慢。

发明目的

本发明的目的在于提供一种可大量生产根瘤菌菌剂，且保存条件简单，保存时间长，并可实现根瘤菌的产品化、商业化。

发明内容

一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于主要包括以下步骤：

a、准备好氧发酵器。好氧发酵器底部均匀布置气管，由气泵供气，保证培养液中溶氧不低于5mg/l,装入五分之三体积的蒸馏水，把无纺布均匀布置于

好氧发酵器的水体中，直接泼洒根瘤菌种于水体。

b、采用含有低分子有机碳源的培养基，促进根瘤菌的附着生长;

c、定期补充低分子有机碳源和氮源，定期洗脱无纺布上面的根瘤细菌；

d、用低溶氧、低pH值、密封条件保存收集液；

e、检测后装入包装容器。

本发明的目的还可以通过以下措施来达到：无纺布为一种柔软、多孔、致密的薄层化工纤维，可采用PVC纤维棉。低分子有机碳源培养基的成分为醋酸纳0.5〜lkg/m³、碳酸氢钠0.5kg/m³、硫酸铵2kg/m³、憐酸二氧1kg/m³、硫酸镁0.5kg/m³、氣化钾0.5kg/m³、氯化钠0.1kg/m³、硫酸亚铁0.5kg/m³,维生素、矿物元素、氨基酸预混料10g/m³,培养液的pH值为7.5。第一次收集时间为10天后，洗脱软性纤维上的根瘤细菌，连续培养、收集，每三天补充一次碳源和氮源，每三天从软性纤维上洗脱一次根瘤细菌。培养液的pH值低于7.0时，加入碳酸氢钠0.5kg/m³,使培养液的pH值达到7.8,碱度高于4mmol/l,培养液水温尽量高于25℃。根瘤细菌的稳定处理是用0.01M盐酸降低洗脱液的pH值至6.5,然后密封存储，至洗脱液中溶氧在1mg/l。

本发明相比现有技术具有如下优点：活菌生长旺盛、连续收集量大，保存条件简单，保存时间长，可以实现根瘤细菌（液体）的产品化、商业化。实际使用该产品时，只需要将根瘤菌拌入肥料中，直接给豆科作物施肥，，一定时间后，根瘤菌开始在豆科作物的根部繁殖生长，并从土壤有机物中吸取营养。

具体实施方式

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

具体操作工艺如下：

（1）准备好氧发酵器。选用深度大约1米的大规格塑料池，底部均匀布置气管，由气泵供气。气体经过空气过滤系统，尽量减少空气中的细菌和杂质。保证培养液中溶氧不低于6mg/l。装入4/5体积的蒸馏水。

（2）准备无纺布。材料为一种柔软、多孔、致密的薄层化工纤维（PVC纤维棉），规格为30X10X3cm(长X宽X厚），均匀布置于发酵器的水体中。每个载体的基本参数经测量为：几何表面积840cm2，比重0.8±0.1kgnf3,比表面积≥93.3m2m-³,孔隙率69.8%0

（3）准备有机碳源培养基。培养液的pH要求在7.5左右。培养基成分为：醋酸钠0.5〜1kg/m³,碳酸氢钠0.5kg/m³,硫酸铵2kg/m³,磷酸二氢钙lkg/m³，硫酸镁0.5kg/m³,氯化钾0.5kg/m³,氯化钠0.1kg/m³，硫酸亚铁0.5kg/m³,维生素、矿物元素、氨基酸预混料10g/m³。

（4）第一次收集时间。大约10天后，洗脱软性纤维上的根瘤细菌。

（5）连续培养、收集。每3天补充1次碳源和氮源（醋酸钠0.5〜1kg/m³,硫酸铵2kg/m³,亚硝酸钠2kg/m³)。每3天从无纺布上洗脱一次根瘤细菌。

（6）培养过程技术管理。如果培养液出现pH低于7.0时，加入碳酸氢钠0.5kg/m³使培养液的pH达到7.8左右、碱度高于4mmol/l。依据根瘤细菌产量情况，不定期补充其它培养基成分。培养液水温尽量高于25℃,低于此温度细菌产量将降低。

（7）根瘤细菌的稳定处理。用0.01M盐酸降低洗脱液的pH至6.5左右。然后密封存储，至洗脱液中溶氧在1mg/l左右。这时根瘤细菌已经处于自我抑制状态，可以较长时间存活。

（8）根瘤细菌（液体）的产品化。稳定处理后的洗脱液经检测后装入塑料包装桶（5 l)，检测指标主要为根瘤单胞菌数量、溶氧和pH。使用前不要开启盖子，开启后尽快用完。

(9) 根瘤菌在使用时，直接与种子拌在一起，按1:100的比例，即一公斤菌种拌一百公斤种子，直接点种即可。

根瘤菌菌种可以市购，各农科院，农业院校微生物室都有菌种。

根据实验测算，根瘤细菌与有机肥料一起包装保存（1:500）的比例，室温下，60天后测定菌数1010个/克。存放90天有效活菌数超过2011个/克，200天仍然有965个/克，证明细菌有很强的活性。

Claims (5)

1.一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于主要包括以下步骤：

a、准备好氧发酵器，好氧发酵器底部均匀布置气管，由气泵供气，保证培养液中溶氧不低于5mg/l，装入五分之三体积的蒸馏水，把无纺布均匀布置于好氧发酵器的水体中，直接泼洒根瘤菌菌种于水体；

b、采用含有低分子有机碳源的培养基，促进根瘤菌的附着生长；

c、定期补充低分子有机碳源和氮源，定期洗脱无纺布上面的根瘤菌；

d、用低溶氧、低pH值、密封条件保存收集液；

e、检测后装入包装容器。

2.根据权利要求1所述的一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于：无纺布为—种柔软、多孔、致密的薄层化工纤维，可采用PVC纤维棉。

3.根据权利要求1所述的一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于：低分子有机碳源培养基的成分为醋酸纳0.5〜1kg/m³、碳酸氢钠0.5kg/m³、硫酸铵2kg/m³、磷酸二氢钙1kg/m³、硫酸镁0.5kg/m³、氯化钾0.5kg/m³、氯化钠0.1kg/m³、硫酸亚铁0.5kg/m³,维生素、矿物元素、氨基酸预混料10g/m³，培养液的pH值为7.5。

4.根据权利要求1所述的一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于：第一次收集时间为10天后，洗脱软性纤维上的根瘤菌，连续培养、收集，每三天补充一次碳源和氮源，每三天从无纺布上洗脱一次根瘤细菌。

5.根据权利要求1所述的一种固氮根瘤菌剂的生产方法，其特征在于：根瘤细菌的稳定处理是用0.01M盐酸降低洗脱液的pH值至6.5，然后密封存储，至洗脱液中溶氧在1mg/l。