CN113265454A - 基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组dna加合物的方法 - Google Patents

基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组dna加合物的方法 Download PDF

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CN113265454A CN202110460942.8A CN202110460942A CN113265454A CN 113265454 A CN113265454 A CN 113265454A CN 202110460942 A CN202110460942 A CN 202110460942A CN 113265454 A CN113265454 A CN 113265454A
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Abstract

本发明公开了一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，采用斑点杂交技术检测DNA加合物总量，优化各试验条件，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态，再引入染色质免疫共沉淀测序技术原理，利用抗原抗体的特异识别反应，在建立的染毒细胞中，产生了BPDE‑DNA加合物的DNA片段文库，通过测序技术得到伤害图谱，明确全基因组中DNA加合物所在位点，以筛选与BPDE引发肺癌相关的基因，通过BPDE‑DNA加合物抗体结合，特异性地富集BPDE作用的DNA片段进行测序，从而为进一步筛选B[a]P致癌的关键通路和靶点提供了更全面确切的信息。

Description

基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组 DNA加合物的方法
技术领域
本发明涉及BPDE加合基因的检测、鉴定技术领域，更具体地，涉及一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法。
背景技术
苯并[a]芘(B[a]P)，作为烟草、烟雾和环境中常见的多环芳烃之一，是一种典型的DNA损伤致癌物，由于其极强的致突变、致癌作用，国内外均将其列为环境污染的监测项目之一。苯并[a]芘7,8-二醇9,10-环氧苯并[a]芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide，BPDE)是B[a]P的最终代谢产物，可以与DNA共价结合，与鸟嘌呤形成脱嘌呤加合物，以及与DNA磷酸主链形成磷酸三脂加合物，从而破坏生物大分子如DNA和蛋白质的结构和功能。该活性代谢物与DNA共价结合，在细胞内形成共价BPDE-DNA加合物，最终导致DNA链的断裂，还可以进一步发生突变，例如碱基置换、碱基缺失等等，这一系列反应被认为与肿瘤的发生有关。流行病学研究表明非小细胞肺癌、鼻咽癌与BPDE-DNA加合物水平升高显著相关。
检测致癌物的DNA加合物能在人接触有关致癌物后，提供体内环境相互作用及生物有效作用剂量的信息，目前DNA加合物的监测已被广泛应用于人群调查，可以在一个接触环境中，作为致癌物DNA损伤的生物标志物。但在大量未修饰核苷的情况下，很难特异性地检测出微量DNA损伤。常用的DNA加合物检测方法包括32P-后标记法、色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、免疫学法等。早期的研究利用放射性标记的致癌物，通过分离DNA和定量放射性来测定DNA损伤水平。BPDE致突变、致癌是一个具有复杂连锁反应的过程，目前已研究的结论建立在仅对很少一部分基因进行分析的基础上，信息非常有限。而那些在肿瘤发生、发展过程中起关键作用的基因变化还不明确。因此，要阐明BPDE的致突变、致癌机制，首先需要揭示全部基因变异的规律，全面了解细胞对BPDE的应答反应，即明确全基因组与BPDE的相互作用。
染色质免疫共沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing,CHIP-Seq)是一种研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，是将ChIP与测序技术相结合，在全基因组范围内分析DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的高通量技术，可以应用到任何物种的基因组序列，并能确切得到每一个片段的序列信息，比起基于阵列的前代芯片具有更高的分辨率、更少的噪声和更大的覆盖范围。随着技术不断完善普及，测序成本持续降低，该技术已经在科学研究及临床诊断等各个方面得到广泛应用，成为研究基因调控和表观遗传机制不可或缺的工具。目前该项技术，主要运用于研究活体细胞中蛋白质和DNA相互作用谱，基本原理是在活细胞状态下将蛋白质-DNA复合体交联固定，然后随机切断为一定长度的染色质小片段，接着通过免疫学方法沉淀此复合体，最后特异性地富集目的蛋白所结合的DNA片段，通过对富集到的片断进行纯化、扩增与检测，从而获得与蛋白质相互作用的DNA具体片段信息。
既往已对BPDE-DNA加合物有较多的研究，但主要针对单基因单位点展开，对于B[a]P基因组损伤的全貌涉足较少。仅中国专利CN 110066863 A公开了一种基于于染色质免疫共沉淀技术原理，通过Anti-BPDE抗体对富集到的BPDE-DNA加合物进行高通量测序以构建B[a]P加合物靶基因位点精准定位技术，其是在细胞裂解后，通过选取部分裂解细胞的片段进行染毒，并不能反应真实的BPDE-DNA加合物生成情况，且由于过程中的各种处理均会对细胞中BPDE-DNA加合物的总量造成影响，其在缺乏DNA加合物总量检测、评价方法的情况下，容易造成DNA加合物的损失，从而导致信息丢失，无法更加全面揭示B[a]P对全基因组DNA序列的损伤。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，包括如下步骤：
S1.对细胞进行BPDE急性染毒，构建急性染毒模型；通过不同浓度的染毒剂量及不同染毒时间，检测细胞活力及染毒细胞中所有DNA断裂情况，观察BPDE引起的DNA断裂损伤情况，确定初步染毒剂量和染毒时间；所述细胞为DNA亲核位点能够与BDPE共价结合形成加合物的细胞；
S2.采用斑点杂交技术检测染毒细胞中BPDE-DNA加合物含量，确定急性染毒模型最佳染毒剂量和染毒时间及超声波裂解染毒细胞获取DNA片段的最佳超声条件，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态；
S3.采用BPDE-DNA adduct抗体，通过免疫共沉淀技术获得与BPDE发生共价结合的DNA片段，通过高通量测序技术得到BPDE与基因组DNA相互作用所形成的加合物图谱。
本发明首先通过建立细胞BPDE染毒模型，而并不仅仅是只选取部分裂解细胞的片段进行染毒；再采用斑点杂交技术检测DNA加合物总量，优化各试验条件，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态；再引入染色质免疫共沉淀测序技术原理，从研究方法上建立起DNA加合物的高通量检测和分析技术，揭示多环芳烃类环境致癌物与DNA作用的损伤全貌，从理论上为DNA加合物这一重要的环境致癌和致遗传损伤机制提供全面深入的实验依据。利用抗原抗体的特异识别反应，在建立的染毒细胞中，产生了BPDE-DNA加合物的DNA片段文库，通过测序技术得到伤害图谱，明确全基因组中DNA加合物所在位点，以筛选与BPDE引发肺癌相关的基因，通过BPDE-DNA加合物抗体结合，特异性地富集BPDE作用的DNA片段进行测序，从而为进一步筛选B[a]P致癌的关键通路和靶点提供了更全面确切的信息。
优选地，步骤S1所述细胞活力通过CCK-8检测。
优选地，步骤S1所述DNA断裂损伤情况采用单细胞凝胶电泳实验检测。
优选地，所述细胞为人正常肺上皮细胞BEAS-2B。
优选地，所述染毒剂量和染毒时间为2μM/12h。
优选地，所述超声条件为Peak Incident Power 50watt，Duty Factor 20％，Cycles/Burst 200，Temperature Set Point 4℃-6℃，Duration 600s。
本发明选取苯并芘(B[a]P)作为多环芳烃类环境致癌物的代表，通过不同浓度的染毒剂量及不同染毒时间，检测染毒细胞中所有DNA断裂情况，观察BPDE引起的DNA断裂损伤情况，基于所有DNA断裂片段进行后续分析，而并不仅仅是只选取部分裂解细胞的片段进行染毒。BPDE通过与DNA链结合，形成BPDE-DNA加合物干扰DNA复制来损伤细胞，以斑点杂交技术(Dot blot实验)检测各处理组细胞中BPDE-DNA加合物的总量，通过探讨加合物形成的峰度来进一步确定最适宜的浓度，保证该浓度下生成的加合物最多，获得全基因组最大范围的DNA加合状态，选定最适染毒浓度、时间作为急性染毒模型。同时为得到合适长度的DNA片段而尽可能减少超声过程中的DNA加合物损失，通过对超声条件进行探索，通过对DNA纯度、含量的检测以及1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果分析，摸索到最适合的超声条件。为明确BPDE-DNA加合物作用的主要位点，对收集到的DNA片段进行CHIP-seq测序文库构建，以及对获得的全基因组DNA加合物图谱与公开数据库中肺癌突变图谱的联合分析，富集筛选出BPDE-DNA加合物主要作用的基因位点，并选取部分基因进行功能验证。ChIP-Seq结果明确了差异核苷酸序列的存在，说明该发明成功建立了基于活细胞全基因组的高效、特异筛选BPDE致癌相关基因的新方法。
本发明还提供任一所述方法在筛选苯并[a]芘致癌的关键通路和靶点中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，通过建立细胞BPDE染毒模型，而并不仅仅是只选取部分裂解细胞的片段进行染毒，并通过结合细胞增殖情况、加合物形成情况及细胞DNA损伤情况等全面分析以得到最适宜、最优浓度下的DNA链作为研究基础，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态。本发明创新性联合斑点杂交(Dot blot)和染色质免疫共沉淀测序(CHIP-Seq)技术的思路和方法，实现全基因组范围和单碱基水平上化学致癌物-DNA加合物位点的检测分析，获得的信息丰富，全面揭示B[a]P对全基因组DNA序列的损伤，从而为进一步筛选B[a]P致癌的关键通路和靶点提供了更全面确切的信息，为进一步探讨BPDE致癌机制奠定基础。
附图说明
图1为BEAS-2B细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为BPDE暴露造成BEAS-2B细胞内BPDE-DNA加合物生成。A,B：BPDE暴露12h及24h后细胞BPDE-DNA加合物含量变化及灰度分析图；C,D：BPDE暴露2h,4h,8h及12h后细胞BPDE-DNA加合物含量变化及灰度分析图。(*表示与对照组比较，P<0.05)。
图3为BEAS-2B细胞基因组DNA超声后琼脂糖凝胶电泳图。A：超声不同时间的DNA琼脂糖凝胶电泳图；B：超声不同时间的BPDE-DNA加合物含量变化图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
(一)实验材料
1、细胞系及受试物
人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自美国模式培养物研究所(American Type CultureCollection，ATCC)和BPDE标准品购自美国国家癌症研究所化学致癌物标准品贮藏室。
2、主要试剂
(1)细胞培养：胰蛋白酶、PBS、青-链霉素双抗等均购自吉诺生物有限公司，GibcoDMEM/F12培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)、胎牛血清FBS(浙江天杭生物公司)、二甲基亚砜DMSO(美国MP Biomedicals公司)。
(2)细胞增殖能力检测：CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)。
(3)单细胞凝胶电泳实验：Triton X-100(美国MP Biomedicals公司)、分析纯Trisbase(中国青岛生工公司)、低熔点琼脂糖及正常熔点琼脂糖(中国翊圣公司)、核酸红NA-Red(中国广州碧云天公司)、EDTA(美国Sigma-Aldrich公司)。
(4)Dot blot：哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒、带正电荷的尼龙膜、辣根过氧化物标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、BeyoECL Plus超敏化学发光试剂盒等购自中国广州碧云天公司，Anti-BPDE Monoclonal Antibody(clone 8E11)购自美国Trevigen公司。
(5)ChIP：Covaris M220非接触式超声波破碎仪配套耗材(美国Covaris公司)、牛血清白蛋白BSA(中国北京天根公司)、DynabeadsTM Protein G for Immunoprecipitation(美国Thermo Fisher Scientific公司)、NP40(美国MP Biomedicals公司)、LiCl(美国Sigma-Aldrich公司)。
(6)qRT-PCR：TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)、GoScriptTM ReverseTranscription System(美国promega公司)、
Figure BDA0003042218340000051
qPCR Master Mix(美国promega公司)、0.2mL、1.5mL、2mL EP管及0.2mL八联排平盖薄壁管(美国Axygen公司)。
(7)其他化学试剂：Tris平衡苯酚、NaOH、HCl、NaCl、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、甲醇等均为广州化学试剂厂分析纯产品。
3、主要仪器
LS-75HD立式压力蒸汽消毒器(中国江阴滨江公司)、高温恒温鼓风干燥箱(中国上海福玛公司)、超纯水系统(millipore)、超净工作台(美国Thermo Scientific公司)、细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)、CoolCell程序降温盒(美国Biocision公司)、-80℃超低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)、液氮罐(中国四川乐山公司)、电热恒温水浴箱(中国苏州长风公司)、低速离心机(ScanSpeed)、制冰机(SANYO)、BSA124S分析天平(Sartorius)、pH计(Mettler Toledo)、持久低温操作平台模块(美国Biocision公司)、倒置显微镜(Nikon)、EVOS无目镜显微镜(AMG)、冰箱(Haier，Samsung)、Heraeus Fresco17冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)、BG-thermoRT恒温仪(Baygene)、ND-1000紫外/可见光分光光度计(Nanodrop Technoligies)、Veriti 96well thermal Cycler(AppliedBiosystems)、AB-7500PCR仪(Applied Biosystems)、TS-2000A脱色摇床(其林贝尔)、LX-300迷你离心机(其林贝尔)、VORTEX-5旋涡混合器(其林贝尔)、电泳电源(Bio-Rad)、垂直电泳槽(Bio-Rad)、水平电泳槽(Bio-Rad)、湿式转膜槽(Bio-Rad)、BLT GV1500 Pro全自动凝胶成像系统及Gel View 6000高灵敏化学发光成像系统(中国广州博鹭腾公司)、LI-COROdyssey近红外成像系统(美国LI-COR公司)、Epoch多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)、Covaris M220非接触式超声波破碎仪及配套耗材(美国Covaris公司)、微量移液器及配套耗材(德国Eppendorf公司)、10cm培养皿(德国Eppendorf公司)、6cm培养皿及96孔板(美国Corning公司)、15mL及50mL离心管(美国Corning公司)、0.2mL、1.5mL、2mLEP管及0.2mL八联排平盖薄壁管(美国Axygen公司)。
4、主要溶液配制
(1)含5％FBS和1％双抗的DMEM/F12完全培养基：500mL DMEM/F12培养基中加入26mL的FBS和2.6mL青链霉素双抗，4℃存放备用。
(2)细胞冻存液：DMEM/F12:FBS:DMSO＝7:2:1的体积比例混匀，4℃存放备用。
(3)BPDE存储液：DMSO加入到100mg BPDE标准品棕色瓶中，用微量移液器混匀配制成浓度为1mM的BPDE母液，分装后于-20℃保存。
(4)1.0％正常熔点琼脂糖溶液：用电子天平称取1.0g正常熔点琼脂糖，放入有100mL PBS缓冲溶液的烧杯中，杯口用牛皮纸密封，置于微波炉加热2min，取出摇匀后再加热1min。
(5)0.7％低熔点琼脂糖溶液：用电子天平称取0.21g低熔点琼脂糖，加入30mL PBS缓冲溶液，杯口牛皮纸密封，置于微波炉加热1min。
(6)1M NaOH：用电子天平称取4g NaOH，蒸馏水溶解后，定容至100mL，在室温下保存，用于调节溶液pH。
(7)细胞裂解液母液：用电子天平称取3.5g NaOH用300mL蒸馏水溶解后再加入73.05g NaCl、18.612g Na2EDTA、0.6056g Tris base，用1M NaOH调节pH至pH＝10，蒸馏水定容至500mL，最终配置成含有2.5M NaCl，10mM Tris的细胞裂解液母液，可在室温下存放。
(8)细胞裂解液应用液：每445mL细胞裂解液母液中加入DMSO 50mL和Triton X-100 5mL，充分搅拌均匀后，置于4℃冷藏1h，现配现用。
(9)电泳缓冲液：用电子天平称取6g NaOH，0.187g Na2EDTA，加蒸馏水500mL溶解后配置成含有1mM Na2EDTA的碱性电泳液，于4℃冷藏。
(10)Tris-HCl(pH＝7.5)：用电子天平称取24.228g Tris base，用少量蒸馏水溶解，浓HCl调节pH至7.5，定容至500mL。
(11)NA-Red染色液：原液与蒸馏水按照1：200比例配置，4℃避光保存。
(12)Tris-HCl(PH＝8.0)：用电子天平称取24.228g Tris base，用少量蒸馏水溶解，浓HCl调节pH至8.0，定容至500mL。
(13)Blocking Buffer：在PBS溶液中加入0.5％BSA，混合均匀，于4℃冷藏保存。
(14)ChIP试剂如下表1所示：
表1 ChIP试剂配制
Figure BDA0003042218340000071
Figure BDA0003042218340000081
(15)1×TBS：1包TBS粉剂溶于超纯水，调整pH至7.6后定容至2L并于室温保存。
(16)TBST洗膜液：1L 1×TBS中加入1mL Tween-20混匀，室温保存。
(17)75％乙醇：按照3:1的体积比混合无水乙醇与超纯水，4℃存放。
实施例1
一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，包括如下步骤：
(一)实验方法
1、BPDE染毒设计
染毒浓度设为0、0.5、1、2、4、8μM，染毒时间设为12h、24h和36h。将1mM的BPDE母液用含5％FBS的DMEM/F12完全培养基将其配制成相应染毒浓度。当BEAS-2B细胞处于对数生长期，生长汇合度达70％时，弃旧培养液，用PBS清洗后加入含相应浓度BPDE的培养液继续培养细胞。DMSO在最终染毒培养液中的体积分数不超过5/1000。
2、CCK-8检测细胞活力
取对数生长期BEAS-2B细胞接种于96孔板，接种浓度为104个/孔，培养24h后细胞正常生长至50％～70％融合度；按设计染毒浓度及时间做BPDE染毒处理，每组设5个复孔；染毒结束后，弃去孔板中染毒培养液，用PBS轻柔洗涤2次；将CCK-8检测试剂与新鲜培养液按照1:10体积比混合均匀，每孔加入110μl混合液；将培养板置于培养箱中孵育2h；用Synergy酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
3、单细胞凝胶电泳实验检测DNA损伤
(1)玻片预处理：载玻片、盖玻片充分泡酸24h后，流水冲洗10min、蒸馏水冲洗2次，烘干备用。
(2)制备第一层胶：取正常熔点琼脂1g加入100mL PBS溶液，加热溶化后配成1.0％正常熔点琼脂糖溶液，60～70℃保温，洁净磨砂玻片趁热垂直插入琼脂糖溶液中约3s，观察载玻片表面凝胶是否悬挂均匀，毛玻璃面朝上水平放置在载玻片架上待琼脂糖冷却变硬。
(3)制备第二层胶：用PBS溶液配置0.7％低熔点琼脂糖溶液(37℃水浴箱保温)，取新鲜制备细胞悬液(细胞密度调节1×106cells/mL)30μL与50μL低熔点琼脂糖溶液在EP管中充分混匀，迅速滴在第一层琼脂糖胶上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min，轻轻推去盖玻片。
(4)细胞裂解：将玻片完全浸入4℃预冷的裂解液中，4℃避光裂解2h。
(5)碱解旋：取出玻片，用蒸馏水轻柔清洗2次，放置在水平电泳槽中，加入碱性电泳液，冰浴避光静置20min，待DNA解旋。
(6)电泳：恒压电压25V，电泳30min，通过调节电泳液液面高度使电流维持约300mA，期间注意冰浴避光。
(7)中和：电泳完毕后，取出载玻片置于染色托盘，倒入Tris-HCl(pH 7.5)溶液没过载玻片，静置5min，重复3次。
(8)染色：中和后的载玻片于室温下晾干后，取NA-Red染色液50μl滴在胶面上，盖上干净盖玻片。
(9)镜检拍照：于24h内在荧光显微镜下观察并拍照，激发波长510～560nm,滤过波长690nm，以200倍拍摄单细胞影像。采用CASP彗星分析软件测量各组彗星尾长(Taillength,TL)、Olive尾矩(Olive tail moment,OTM)、彗星尾DNA(Tail DNA％)百分含量。
4、Dot blot实验检测BPDE-DNA加合物含量
(1)染毒处理：取对数生长期BEAS-2B细胞接种3×105个/孔于6孔板，培养至正常生长阶段后，按设计染毒浓度及时间做BPDE染毒处理，每组设3个平行孔。
(2)细胞收集：用PBS洗涤细胞两次，胰蛋白酶消化细胞，离心，弃上清。
(3)细胞总DNA的提取及质量分析，按试剂盒说明书操作如下：a)每1mL样品裂解液中加入5μL蛋白酶K，混匀；b)每106个细胞中加入500μL添加了蛋白酶K的样品裂解液，颠倒混匀数次，充分裂解细胞；c)50℃水浴裂解过夜；d)加入500μL Tris平衡苯酚抽提样品；e)吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积Tris平衡酚再抽提一次；f)吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积氯仿再抽提一次；g)吸出约300μL上清液，加入60μL 10M醋酸铵和600μL无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生；h)10,000g离心1分钟，弃上清,加入70％乙醇洗涤DNA沉淀两次；i)尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入50-100μLNuclease Free Water溶解DNA。
(4)DNA浓度测定：以无RNase水为空白对照，用ND-1000紫外/可见光分光光度计检测DNA浓度、OD260、OD280及OD230。OD260/OD280和OD260/OD230值均≥1.8代表DNA样本质量佳。
(5)上样：将各处理组DNA稀释成相同浓度，点在尼龙膜上，95℃烘干5min。
(6)封闭：随后将尼龙膜放入预先配制好的含5％脱脂奶粉的封闭液中，室温下，置于水平摇床缓慢振摇约1h。
(7)孵育一抗：用含5％BSA的一抗稀释液按照1：1000比例稀释Anti-BPDEMonoclonal Antibody(clone 8E11)。将封闭好的尼龙膜转移至配好的一抗应用液中，4℃下，水平摇床缓慢振摇过夜。
(8)孵育二抗：回收一抗应用液，用TBST浸洗尼龙膜，水平摇床振荡清洗3次，每次10min。按1:500稀释比例用TBS稀释辣根过氧化物标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，室温下孵育尼龙膜1h。孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次10min。
(9)膜扫描：在Gel View 6000高灵敏化学发光成像系统上，进行尼龙膜的扫描，并进行灰度值分析。
5、ChIP富集含有BPDE-DNA加合物的片段
(1)收集染毒处理后的细胞：步骤同上4(1)(2)。
(2)超声波裂解细胞：a)每1mL ChIP buffer中加入5μL蛋白酶K，混匀；b)每106个细胞中加入500μL添加了蛋白酶K的ChIP buffer，颠倒混匀数次，充分裂解细胞；c)移入超声管中，置于Covaris M220非接触式超声波破碎仪，按摸索出来的条件超声10min。
(3)样品检测：取10μl超声后样品与20μl TE buffer混合，添加0.1％SDS后煮沸15min。于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测片段是否合格。
(4)样品input：取50μl超声后样品加入1％Triton-X100，18000g离心10min后取上清置于-20℃保存。
(5)样品ChIP：将超声后样品与磁珠混合后于4℃摇动4h～12h，取出后分别用加入洗涤液1，2，3各洗涤5min，最后加入TE buffer洗涤一次。于960×g离心3min，弃去TEbuffer，加入elution buffer 200μl，65℃水浴30min，每10min摇动混匀1次。
(6)提取DNA并测定浓度纯度：步骤同上4(3)c-i及(4)。input同样操作。
6、细胞总RNA的提取及质量分析
(1)收集并裂解细胞：弃去旧培养基，用PBS清洗细胞一次，向培养皿中加入TRIzol试剂(6cm培养皿加入量为1.0mL，10cm培养皿为2.0mL)，立即反复吹打，使TRIzol与细胞充分接触并消化，当看不见成团的细胞块，裂解液呈现清亮且不粘稠的状态时，细胞即被裂解完全。将细胞裂解液转移至1.5mL RNase-free离心管中。
(2)RNA分离：按每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿，小心盖好离心管，剧烈振荡15s，室温下静置10min。4℃、12000×g，离心15min。
(3)RNA沉淀：离心后EP管中液体分为三层：上层为无色水相、中间相及底层有机相。RNA主要集中在上层水相中。吸取上层水相(约300～500μl)至新的1.5mL EP管中。按每使用1mL TRIzol加入500μl异丙醇的比例加入异丙醇，颠倒混匀，室温下静置10min。4℃、12000×g，离心10min。
注意事项：在转移水相时，切勿被中间相及底层有机相污染移液枪头。
(4)RNA洗涤：弃上清，用预冷75％乙醇洗涤RNA沉淀一次。按每使用1mL TRIzol加入1mL乙醇的比例加入预冷75％乙醇。涡旋混匀后，4℃、12000×g，离心5min。弃上清，加入1mL预冷无水乙醇，涡旋混匀，4℃、12000×g，离心5min，弃去上清。
(5)RNA溶解：打开离心管盖，倒置于超净台上晾干5～10min，加入20～50μl无RNase水，56℃金属浴10min助溶。
(6)RNA浓度测定：以无RNase水为空白对照，用ND-1000紫外/可见光分光光度计检测RNA浓度、OD260、OD280及OD230。OD260/OD280和OD260/OD230值均近似2，代表RNA样本质量佳
(7)RNA保存：将RNA分装保存于-80℃，避免反复冻融。
7、qPCR实时定量检测RNA表达水平
(1)反转录反应体系
使用GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒，步骤如下：
1)按下表配制模板RNA与逆转录引物的混合液：
表2模板RNA与逆转录引物的混合液配制
Figure BDA0003042218340000121
*反应体系可按比例放大
2)将RNA模板与引物的混合液70℃变性5min，完成后置于冰上5min。
3)按下表配制反转录混合液：
表3反转录混合液配制
Figure BDA0003042218340000122
4)向模板RNA与引物的混合液中加入反转录混合液。
5)按下列程序进行cDNA第一链的合成：
表4 cDNA第一链合成
Figure BDA0003042218340000123
6)cDNA合成结束后可立即进行后续qPCR基因定量，也可储存于-20℃备用。
(2)qPCR反应体系
使用
Figure BDA0003042218340000131
qPCR Master Mix试剂盒，步骤如下：
1)按下表配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后各加入2μl*DNA模板：
表5 PCR反应混合液配制
Figure BDA0003042218340000132
*DNA模板的添加量通常在100ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，DNA模板的加入量需要调整。
2)PCR反应液配制完成后，进行Real Time PCR反应，实验采用两步法，每个样品做三管重复。ABI7500实时定量PCR反应条件：
表6 ABI7500实时定量PCR反应条件
Figure BDA0003042218340000133
3)实验结果分析：结果用2-ΔΔCt法分析基因表达改变，即用2-ΔΔCt表示基因的相对表达量，ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。目的基因的相对表达量(处理vs对照)＝2-ΔΔCt。
4)各个基因qPCR引物序列如下：
表7各个基因qPCR引物序列
Figure BDA0003042218340000141
以上引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
(二)结果
1、BPDE暴露降低BEAS-2B细胞活力，造成细胞DNA损伤
为探讨BPDE对BEAS-2B细胞活力的影响，以0、0.5、1、2、4、8μM浓度BPDE分别染毒BEAS-2B细胞12h、24h和36h后，使用CCK-8试剂盒检测各处理组细胞的活力。CCK-8试剂盒检测细胞活力结果显示，与对照组比较，BPDE暴露降低BEAS-2B细胞活力(P<0.05)，而且BPDE对BEAS-2B细胞增殖具有剂量和时间依赖性抑制作用。彗星实验结果显示，BPDE暴露造成BEAS-2B细胞DNA损伤，且有时间和剂量依赖效应。随着BPDE染毒浓度的增加，细胞的Olive尾矩值逐渐增大，并呈明显的剂量-依赖关系，说明BPDE可引起DNA断裂损伤，且损伤程度与染毒剂量有关。
2、BPDE暴露造成细胞内BPDE-DNA加合物生成
BPDE通过与DNA链结合，形成BPDE-DNA加合物干扰DNA复制来损伤细胞。为探讨BPDE对BEAS-2B细胞BPDE-DNA加合物生成的影响，以0、0.5、1、2μM浓度BPDE分别染毒BEAS-2B细胞12h和24h后，提取DNA并检验其质量，以Dot blot实验检测各处理组细胞BPDE-DNA加合物的含量。
提取的BEAS-2B细胞基因组DNA溶液，经EpochTM微孔板分光光度计检测DNA纯度及含量结果如下：
表8 DNA纯度及含量
Figure BDA0003042218340000151
A260/A280的比值均大于1.8，DNA浓度均大于200ng/μl。经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，DNA条带较亮，条带完整性好，未见明显的弥散区(图1)。说明提取的细胞基因组DNA完整性好，纯度亦较高，可以用于后续实验。
Dot blot结果显示，对照组无BPDE-DNA加合物生成(低于检出限)，各浓度处理组细胞都有BPDE-DNA加合物生成，而且BPDE-DNA加合物含量随着染毒剂量增加而增加(见图2A，B)。在各剂量组中，2μM浓度的BPDE染毒12h造成的BPDE-DNA加合物生成最多，1μM/12h组次之，两组都高于处理24h的各染毒组。但BPDE-DNA加合物生成不是单纯随着时间延长而减少，而是一个先增加再减少的过程，在12h时生成量达到最高(见图2C，D)。拟选定2μM/12h处理作为急性染毒剂量进行后续实验。
3、ChIP-Seq全基因组筛选BPDE-DNA加合物作用位点
BPDE暴露导致细胞内形成共价BPDE-DNA加合物，造成BEAS-2B细胞DNA断裂，可能影响了细胞中部分基因的表达，为明确BPDE-DNA加合物作用的主要位点，我们使用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，共价沉淀含有BPDE-DNA加合物的基因片段。
首先，为得到合适长度的DNA片段而尽可能减少超声过程中DNA加合物的损失，需要对超声条件进行探索。将收集好的细胞与ChIP buffer混合后置于Covaris M220非接触式超声波破碎仪，分别超声5min、10min和15min。经EpochTM微孔板分光光度计检测DNA纯度及含量结果如下：
表9 DNA纯度及含量
Figure BDA0003042218340000152
Figure BDA0003042218340000161
随着超声时间的延长，得到的DNA片段越短，但因为超声造成的直接断裂和间接影响温度等原因，可能对加合物造成的损失也越多。经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察：超声后的泳道上可见200-1031bp之间呈弥散模糊状条带，说明基因组DNA已被超声成短的片段，可以用于免疫磁性分离(如图3A)。而Dot blot结果显示BPDE-DNA加合物随着超声时间延长损失加剧(图3B)。
经摸索得到最适超声条件如下：
表10最适超声条件
Figure BDA0003042218340000162
将含有BPDE-DNA加合物的基因片段CHIP-纯化-扩增-高通量测序，得到1846个差异基因，即是细胞内形成共价BPDE-DNA加合物的1846个主要位点，其中蛋白质编码转录本1067个，非编码转录本537个，假基因199个，不明确的转录本43个。
4、BPDE暴露致BEAS-2B细胞DNA修复基因改变
大多数物种已经开发了适应性的DNA修复系统，以抵御来自环境危害的基因组损伤，并在进化过程中有效保持基因组的完整性。有效的DNA修复系统是消除BPDE-DNA加合物的关键，DNA修复效率的降低与癌症发展的高风险相关。通过查阅文献，我们在1067个差异蛋白质编码基因中，发现16个DNA损伤修复相关基因(见表11)。经qRT-PCR验证，发现其在BPDE染毒后出现不同程度的表达下调。其中BRCA1、RAD51C、RECQL5、RPL27、EIF4A3、EME1、KPNA2、TP53、LIG3等9个基因的表达量，随着染毒剂量的上升而下调，表现出一定的剂量-依赖关系。因此我们猜测，是否BPDE-DNA加合物的形成，影响了关键DNA修复蛋白的表达，导致DNA修复不能正常进行。
表11 DNA损伤修复相关基因
Figure BDA0003042218340000163
Figure BDA0003042218340000171
Figure BDA0003042218340000181
上述结果说明，发明成功建立了基于活细胞全基因组的高效、特异筛选BPDE致癌相关基因的新方法，且获得的信息丰富，全面揭示B[a]P对全基因组DNA序列的损伤，从而为进一步筛选B[a]P致癌的关键通路和靶点提供了更全面确切的信息，为进一步探讨BPDE致癌机制奠定基础。

Claims (7)

1.一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.对细胞进行BPDE急性染毒，构建急性染毒模型；通过不同浓度的染毒剂量及不同染毒时间，检测细胞活力及染毒细胞中所有DNA断裂情况，观察BPDE引起的DNA断裂损伤情况，确定初步染毒剂量和染毒时间；所述细胞为DNA亲核位点能够与BDPE共价结合形成加合物的细胞；
S2.采用斑点杂交技术检测染毒细胞中BPDE-DNA加合物含量，确定急性染毒模型最佳染毒剂量和染毒时间及超声波裂解染毒细胞获取DNA片段的最佳超声条件，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态；
S3.采用BPDE-DNA adduct抗体，通过免疫共沉淀技术获得与BPDE发生共价结合的DNA片段，通过高通量测序技术得到BPDE与基因组DNA相互作用所形成的加合物图谱。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述细胞活力通过CCK-8检测。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述DNA断裂损伤情况采用单细胞凝胶电泳实验检测。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞为人正常肺上皮细胞BEAS-2B。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述染毒剂量和染毒时间为2μM/12h。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述超声条件为Peak Incident Power50watt，Duty Factor 20％，Cycles/Burst 200，Temperature Set Point 4℃-6℃，Duration 600s。
7.权利要求1-6任一所述方法在筛选苯并[a]芘致癌的关键通路和靶点中的应用。
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