CN112725437A - 节律基因蛋白表达和rna甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用。本发明通过检测节律基因的蛋白表达量、RNA甲基化修饰水平判断细胞衰老，并区分早衰和复制性衰老。本发明还提供了一种衰老检测试剂盒。本发明可用于早衰、复制性衰老以及年龄相关疾患的评估，具有广阔的应用前景；对于氧化应激引起的组织细胞早衰和复制性衰老均可以准确检测，并有效区别。

Description

节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用。

背景技术

当前，世界人口老龄化程度不断增加，联合国预期二十一世纪人口老龄化比率超过上一世纪。自1950年来，全球60岁以上的老年人增加3倍，2000年达6亿，2006年超过7亿。预期到2050年，老龄人口将达21亿。目前我国是世界上唯一老年人口超过两亿的国家，2020至2050年60岁及以上人口将从2.63 亿升高至5.22亿，占总人口比重的39.5％。同时，我国健康的老龄化程度偏低，老年人口患重大疾病的风险较大。《“健康中国2030”规划纲要》提出，建设健康中国，坚持预防为主，推行健康文明的生活方式，营造绿色安全的健康环境，减少疾病发生。

目前研究认为，衰老是干细胞衰退、DNA退化、饮食精神因素、衰老基因活跃等综合因素的结果，尚未形成统一的衰老理论。而环境因素能加速细胞衰老，进而启动机体衰老。50-75％的衰老发生及其进展与非遗传因素相关，在多种不同的外源因素诱导下，紫外线、DNA损伤、化疗或氧化应激等均可诱导细胞发生提前衰老，这些急性或慢性损伤均可导致细胞形态加速改变，发生早衰。早衰使得人体器官功能下降，疾病风险增加，罹患如动脉粥样硬化、骨关节炎、阿尔茨海默病、老年性黄斑变性、卵巢早衰、2型糖尿病和癌症等，从而降低生活质量。

细胞衰老是一种不可逆的生长停滞现象，而环境外源因素引起的早衰在一定程度上可逆。因此，早期鉴定衰老的发生及环境外源因素诱导的早衰，筛选并鉴定衰老相关的生物标志物，是实现精准医学时代的精准筛查和早期诊断的关键措施，预防早衰发生或使其逆转，及早预防年龄相关病患，有望改善健康寿命。衰老与年龄相关疾患密切相关，衰老表型相关生物标志物的丰度在年龄相关疾患进展中发生改变，可作为疾病早期的生物学标志及临床干预靶标。

目前，在细胞衰老研究中涉及的检测指标包括衰老相关的β-半乳糖苷酶、端粒和端粒酶、衰老相关的异染色质灶、衰老相关的分泌表型、活性氧簇以及肿瘤抑制基因p53和p16等。这些检测指标在衰老研究中被广泛应用，各具特点。然而，关于细胞早衰的检测，目前还是空白。本发明的目的为解决目前在衰老及早衰领域诊断标志物的欠缺，为细胞早期衰老及年龄相关疾患的早期预防和靶向治疗提供参考依据。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种衰老检测试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用，所述衰老包括复制性衰老(即正常衰老过程)和氧化应激诱导的早衰。

所述细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞；优选为人胚肺成纤维细胞。

所述衰老检测试剂盒是通过检测细胞中节律基因蛋白的表达量和RNA甲基化修饰水平判断细胞衰老。

所述节律基因为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2。

当检测到细胞中所述ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2中的一种或至少两种蛋白低表达，和/或所述PER2的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞进入衰老状态。

进一步，当检测到进入衰老状态的细胞中所述ADCY9的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞早衰；未检测到细胞中所述ADCY9的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞复制性衰老。

所述蛋白的表达量采用相对定量分析法统计，通过蛋白条带的灰度分析，获得不同细胞表达条带的灰度值，以22PDL年轻细胞组为对照，设为1，其他细胞表达水平与22PDL年轻细胞组灰度值相比较；蛋白和内参表达量通过 Western blot检测获得。

所述RNA甲基化修饰的水平采用免疫共沉淀联合测序分析检测得到，以22PDL年轻细胞组为对照。

所述22PDL年轻细胞组的定义为：继代培养细胞最终的群体倍增水平 (PDL)为22的细胞，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

一种衰老检测试剂盒，包括细胞中节律基因蛋白表达量检测试剂，和/或 m⁶A RNA甲基化修饰水平检测试剂。

所述的蛋白表达量检测试剂为Western blot半定量检测试剂。

所述的m⁶A RNA甲基化修饰水平检测试剂为RNA甲基化免疫共沉淀检测试剂。

上述衰老检测试剂盒在非治疗诊断目的检测衰老中的应用。

所述应用包括取待测细胞，提取细胞总蛋白，采用上述衰老检测试剂盒进行蛋白半定量，和/或提取待测细胞总RNA，采用上述衰老检测试剂盒进行m⁶A RNA甲基化水平检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明将节律基因的蛋白的表达量、以及节律基因RNA甲基化修饰作为细胞衰老标志物，用于早衰和复制性衰老以及年龄相关疾患的评估，具有广阔的应用前景。

2、本发明对于氧化应激引起的组织细胞早衰和复制性衰老均可以准确检测，并有效区别。

附图说明

图1是衰老相关的β-半乳糖苷酶染色结果图；其中，A为照片图(×20，标尺：200μm)；B为染色后蓝染细胞的比率统计结果，均数±标准差，n＝3，*P ＜0.05，ns为差异无统计学意义(P＞0.05)，与22PDL或49PDL相比。

图2是节律基因在复制性衰老和早衰细胞模型中蛋白的表达统计图；其中， A为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2在衰老过程中各组细胞的蛋白表达； B为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2各蛋白条带灰度值定量的差异表达；均数±标准差，n＝3，*P<0.05，ns为差异无统计学意义，与年轻细胞组22PDL 或复制性衰老组49PDL相比。

图3节律基因在早衰和复制性衰老细胞模型中的m⁶A RNA甲基化分布情况图；其中，A为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2在衰老细胞中m⁶A RNA 甲基化状态，黑色数据分别来自22PDL、49PDL和PSp的m⁶A-免疫沉淀库，浅灰色数据来自对照(输入)库，箭头表示转录方向，y轴阅读高度均为60，浅灰色框突出显示m⁶A峰的位置；B为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2在衰老细胞中m⁶A RNA甲基化水平分析图，m⁶A RNA甲基化水平的富集倍数来自甲基化RNA免疫沉淀测序结果，y轴为相对m⁶A峰富集倍数，即基因内各个 m⁶A峰富集倍数的平均值，n＝3，*P<0.05，ns为差异无统计学意义(P>0.05)，与22PDL或49PDL相比；PRKACB仅在22PDL出现一个m⁶A峰，富集倍数(10.7) 低，不做统计学分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)细胞培养

人胚肺成纤维细胞(来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心) 置于温度37℃、相对湿度95％及CO₂体积分数为5％的细胞培养箱中无菌培养。培养液为L-DMEM低糖培养基。当细胞融合度达到90％时，按实际需要进行细胞传代(1：2，1：3或1：4)，并进行细胞计数。群体倍增水平(population doubling levels，PDL)的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中n为继代培养细胞最终的PDL，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

(2)早衰细胞模型和复制性衰老细胞模型

复制性衰老细胞模型：正常人胚肺成纤维细胞在体外连续传代培养至 52PDL时，细胞停止增殖，呈现深度的复制性衰老状态。根据体外细胞培养年龄的定义：当培养细胞PDL小于或等于其寿命的50％时，获得年轻细胞；大于或等于90％时，获得衰老细胞；介于50％～90％之间时，获得中年细胞。本实验人胚肺成纤维细胞HEFs复制性衰老模型中，细胞分组为年轻细胞组22PDL，中年细胞组35PDL，复制性衰老细胞组49PDL(参考发明人发表文章，参考毒理学杂志,2009,23(01):1-4)。

早衰细胞模型：利用年轻细胞组22PDL进行H₂O₂染毒，将相同数目的 22PDL接种至细胞培养瓶中(1：3传代)，待细胞增长至其50％融合度时，使用终浓度400μmol/L H₂O₂染毒4d，每天固定时间染毒一次，每次染毒2h。连续染毒4d获得细胞早衰起始组(prematuresenescence initiation group，PSi)；连续染毒4d后，换回不染毒的L-DMEM低糖培养基继续培养7d后获得细胞早衰持续组(premature senescence persistence group，PSp)。

(3)衰老细胞表型鉴定

利用β-半乳糖苷酶染色实验观察并验证步骤(2)中复制性衰老细胞和早衰细胞的衰老状态。操作步骤如下：

1)吸除6孔板中培养细胞的细胞培养液，用1×PBS洗涤1次，加入1mLβ- 半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；

2)吸除细胞固定液，用1×PBS洗涤细胞3次，每次3min；

3)吸除1×PBS，每孔加入1mL染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A10μL+β- 半乳糖苷酶染色液B10μL+β-半乳糖苷酶染色液C 930μL+X-Gal溶液50μL)；

4)用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，置于37℃无二氧化碳培养箱中孵育过夜；

5)在普通光学显微镜下观察细胞衰老情况。每组细胞选取显微镜下3处不同的视野观察，计算每个视野中细胞总数和蓝染细胞数，最后计算蓝染细胞数占细胞总数的比率。

(4)Western blot蛋白表达水平测定

4.1细胞总蛋白的提取和蛋白定量

细胞总蛋白提取：收集步骤(2)中的复制性衰老细胞和早衰细胞，每100 万细胞加入含1％(v/v)PMSF的RIPA裂解液60μL，轻轻吹打，置于冰上裂解 10min，震荡，重复3次，4℃，15000rpm，离心5min，将上清液转移至新的1.5mL 离心管，即得到相应蛋白样品。

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物公司)操作说明对上述制备的蛋白样品进行定量：

蛋白标准品的准备：取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为1mg/mL；

BCA工作液的配制：按照50:1的体积比加入试剂A和试剂B，充分混匀；

蛋白浓度检测：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL；加入20μL样品，每组平行设置3 个复孔；各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min；用酶标仪测定562nm 处的吸光度；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

4.2SDS-PAGE电泳分离蛋白

1)制备SDS-PAGE电泳分离胶

2)制备SDS-PAGE电泳浓缩胶

3)将分离胶缓慢灌注于事先装配好的制胶板中，加至小玻板2/3宽处时加入无水乙醇封胶，室温静置30min，去除无水乙醇，灌注浓缩胶后迅速插入齿梳，静置30～45min，待其凝固；

4)电泳装置装配好后，在左边加入1μL marker后，依次在各上样孔加入 20μg蛋白样品，最后在右边加入5μL marker作为指示蛋白；

5)设定恒定电压为80V电泳20min后，待溴酚蓝指示蛋白迁移到浓缩胶和分离胶交界处时，调节电压120V，电泳60min，直至溴酚蓝指示蛋白到达胶底后停止电泳。

4.3转膜(湿转)

1)取下胶板，根据指示蛋白准确切取目的蛋白的胶带；

2)准备与胶带面积相当的PVDF膜，PVDF膜在100％(v/v)甲醇中激活 10s，然后放进蒸馏水中漂洗3min，再转移至转膜液中平衡5min。同时将2张滤纸放入转膜液中浸泡5min；

3)制作传统“三明治”夹心结构，层层对齐，不留气泡，将转膜系统置于盛有转膜缓冲液的电泳仪中，设定恒定电压200mA，冰水浴转膜60min。

4.4免疫反应

1)湿转终止后，PVDF膜剪角以示正反，TBST漂洗2次，封闭液摇床缓慢轻摇封闭4h或4℃冰箱封闭过夜；

2)将PVDF膜取出，置于按照1:1000的比例稀释后的一抗抗体(分别为 ADCY9(ab191423)、CREB1(ab32515)和PER2(ab179813)，均为英国Abcam 公司提供，PRKACB(12232-1-AP，美国Proteintech公司))中，内参为β-actin (ab8226)，室温下摇床缓慢轻摇孵育2h或4℃孵育过夜；

3)用TBST冲洗PVDF膜3次，每次10min；

4)根据一抗的种属来源选取二抗，二抗均为anti-rabbit IgG(ab6721，英国Abcam公司)，将二抗按照1:5000比例稀释，室温摇床缓慢轻摇1h；

5)二抗孵育结束后，用TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。

6)将PVDF膜放置显影板上，等量混合ECL显影液的A液和B液，均匀滴至PVDF膜表面，进行自动曝光，拍照保存；

7)利用Image-Pro Plus 6.0软件对蛋白条带进行半定量分析。

(5)甲基化RNA免疫共沉淀

5.1RNA提取

1)利用预冷1×PBS刮取25cm²细胞培养瓶的细胞(步骤(2)中复制性衰老细胞和早衰细胞)，2000rpm，4℃，离心5min，弃上清；

2)加入2mL trizol，吹打混匀，孵育5min；

3)加入0.2mL氯仿，上下摇动EP管15s；

4)4℃，12000×g，离心15min；

5)取400μL上清至新EP管；

6)加400μL异丙醇；

7)室温孵育10min；

8)4℃，12000×g，离心10min，弃上清；

9)加入1mL 75％(v/v)乙醇；

10)涡旋10s，4℃，7500×g，离心5min，弃上清，自然晾干5～10min；

11)加入20μL DEPC水，混匀，利用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度；

12)分装4μL RNA样品用于完整性鉴定试验，剩余样品置于-20℃冰箱保存。

5.2RNA完整性鉴定

1)配制1.5％琼脂糖凝胶：将0.6g琼脂糖粉，8mL 5×TBE缓冲液和32mL 纯水加入到100mL锥形瓶中；

2)用塑料薄膜手套封住锥形瓶口，置于微波炉中加热至溶液澄清透明；

3)取出锥形瓶，待温度降至37℃左右时，加入2μL Goldview，轻轻摇晃，置于制胶板中，等待凝固；

4)将凝胶置于盛有300mL 1×TBE电泳液的水平电泳槽中，小心拔除胶梳后，点样(4μL RNA样品+1μL 5×RNA Loading buffer)；

5)电泳：120V，30min；

6)在全自动数码凝胶图像分析系统中观察RNA条带。

5.3RNA片段化

1)用DEPC水将300μg步骤5.1得到的RNA的浓度调节至约1μg/μL，按照18μL体积等量分配到200μL薄壁PCR管中，加入2μL Fragmentation Buffer 10×，吹打混合；

2)将以上PCR管置于94℃预热的热循环仪中，孵育5min。孵育终止后立即向每支PCR中加入2μL 0.5mol/L EDTA。涡旋并旋转试管，将其放在冰上。分批操作，每批五个试管，重复以上步骤，直到所有RNA片段化；

3)收集所有试管的内容物于EP管中，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠 (pH5.2)，糖原(最终100μg/mL)和2.5体积的100％乙醇。混合内容物，并于 -80℃孵育过夜；

4)4℃，15,000g离心25min，弃上清液，1mL 75％(vol/vol)乙醇洗涤沉淀，4℃，15,000g，离心15min；

5)小心吸出上清液，自然晾干，将沉淀重悬于300μL DEPC水中。

5.4验证碎片后大小分布

通过NanoDrop分光光度计测量片段化的RNA浓度，并通过1.5％(wt/vol) 琼脂糖凝胶检查0.5μg RNA的量及分布，产生以～100nt为中心的RNA片段为成功片段化RNA的标志。

5.5磁珠制备，应用MeRIP(美国Millipore公司)试剂盒进行操作。

1)制备5mL 1×IP缓冲液，用4mL DEPC水稀释1mL 5×IP缓冲液，置于新的离心管，冰上保存；

2)标记适当数量的RNA甲基化免疫沉淀反应1.5mL EP管。抗m⁶A抗体 (美国Millipore公司)和阴性对照正常小鼠IgG(美国Millipore公司)各1管；

3)重悬Magna ChIP蛋白A/G磁珠，翻转或吹打，充分分散至没有肉眼可见的成团珠子，对于上述步骤2)中计划的每个反应，需要50μL Magna ChIP蛋白A/G磁珠；

4)将原始磁珠体积10倍的第1步制备的1×IP缓冲液加入MeRIP样品中(在每50μL体积原始磁珠加入500μL MeRIP稀释缓冲液)，并上下轻轻移动混合磁珠，直至完全重悬珠子，置于磁力分离架上1min。

5)弃上清，避免抽吸磁珠，从磁铁上拆下管子；

6)重复步骤4和步骤5进行另一次清洗；

7)每50μL原始磁珠量的磁珠重悬于200μL 1×IP缓冲液中，转移至1.5mL EP 管，并添加10μg抗m⁶A抗体；

8)室温旋转孵育30min；

9)短暂离心，放置在磁力分离架上1min，去除上清液；

10)从磁体上卸下EP管，分别加入0.5mL的1×IP缓冲液，并轻轻吹打数次以完全重悬磁珠，将1.5mL EP管放在磁力分离架上1min，去除上清液；

11)重复步骤10，共进行3次洗涤，确保去除上清液，仅保留珠子；

12)从磁铁上取下EP管，放置在冰上，关闭管盖，以免珠子变干。这些样本将在以下免疫沉淀中使用。

5.6免疫沉淀(MeRIP)

1)取出30μg总RNA(即步骤5.1提取的总RNA)(10％作为对照)，并将其放入标有“RNA对照”的新灭菌的EP管中，-80℃保存，该对照样品将用于RNA甲基化测序的输入对照；

2)按照以下表格准备300μg总RNA的1000μL MeRIP反应混合物；

表1

3)向每个磁珠-抗体管(即步骤5.5中12)得到的样品)中加入500μL MeRIP 反应混合物，轻轻吹打至完全重悬磁珠，置于冰上；

4)所有试管置于4℃旋转孵育2h；

5)短暂离心MeRIP反应混合物，放在磁力分离架上1min；

6)弃上清，避免倒吸磁珠；

7)从磁铁上取下EP管。加入事先制备的500μL冷1×IP缓冲液，轻轻吹打以完全重悬磁珠；

8)将EP管放在磁力分离架上1min，弃除上清液；

9)重复上述洗涤程序(步骤7至步骤8)2次，共3次；

10)将EP管放在冰上，并立即按照以下步骤5.7进行洗脱。

5.7洗脱

1)溶解10mg N6-甲基腺苷、5'单磷酸钠盐(m⁶A)(由MeRIP试剂盒提供) 在1.3mLDEPC水中，制备成20mmol/L m⁶A。150μL等分试样后，在-20℃下储存；

2)每个样品制备225μL洗脱缓冲液，45μL 5×IP缓冲液，将75μL步骤1 中制备的20mmol/L m⁶A，3.5μL RNase抑制剂和101.5μL DEPC水混合制备；

3)添加100μL洗脱缓冲液于事先制备的磁珠(步骤5.6)中。轻轻吹打至完全重悬珠子；

4)将所有EP管在4℃下连续振荡孵育1h；

5)短暂离心MeRIP反应混合物，放在磁力分离架上1min；

6)将含有洗脱RNA片段的上清液转移至新的1.5mL EP管中；

7)重复步骤3-6，合并来自同一样品的所有洗脱液，总洗脱体积为200μL。

5.8纯化洗脱

1)按照RNeasy mini Kit试剂盒(Qiagen)，将样品(200μL)置于新的15mL 锥形管中，加入700μL Buffer RLT，充分混合；

2)加入1400μL 96-100％乙醇，吹打混合。立即进入步骤3；

3)将700μL样品转移到2mL收集管中的RNeasy MinElute旋转柱中，轻轻合上盖子，≥8000×g(≥10,000rpm)离心15s。丢弃流通物。并将另外的700μL 样品转移到离心管中。丢弃流通物。重复该过程，直到所有样品都已上样。

4)将RNeasy MinElute旋转柱置于新的2mL收集管。将500μL缓冲液RPE 加到离心柱上。轻合上盖子，≥8000×g(≥10,000rpm)离心15s，以洗涤离心柱膜，丢弃流通物。在步骤5中重复使用收集管；

5)将500μl 80％乙醇添加到RNeasy MinElute离心柱中。轻轻合上盖子，并以≥8000×g(≥10,000rpm)的速度离心2min，以洗涤离心柱膜。弃流通液和收集管；

6)将RNeasy MinElute旋转柱置于新的2mL收集管，并打开离心柱的盖子，全速离心5min，丢弃流通液和收集管；

7)将RNeasy MinElute旋转柱置于新的1.5mL收集管。将14μL DEPC水添加到离心柱膜中心。轻合上盖子，并全速离心1min洗脱RNA，-80℃储存。

(6)m⁶A RNA甲基化测序

1)构建测序文库：根据试剂盒说明，使用Ribo-Zero rRNA Removal Kits(Illumina，美国)和TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina，美国)预处理步骤(5)得到的RNA。

2)文库质控：使用BioAnalyzer 2100仪器(Agilent Technologies，美国)进行文库的质控和定量。每组样品20μL，共136ng，浓度为10nmol/L。

3)测序：根据Illumina HiSeq 4000说明，委托上海云序生物科技有限公司进行文库的高通量测序。

4)数据分析：测序后，使用Q30质控，收获双端高质量reads。人类参考基因组UCSCHG19(GRCh37，GCA_000001405.1)作为比对基因组。

(8)统计分析

所有实验数据均采用相对定量后进行分析，以均数±标准差的形式表示。使用Excel 2016和GraphPad Prism 7软件进行绘图。应用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行统计学分析，应用单因素方差分析及Dunnett t检验进行组间差异性比较，均采用双侧检验，检验水准α＝0.05，P<0.05，差异有统计学意义。

结果

(1)细胞形态学观察及β-半乳糖苷酶染色鉴定

从图1A可知，复制性衰老细胞49PDL和400μmol/L H₂O₂诱导细胞持续早衰PSp组细胞生物学性状明显改变，体积变大，扁平，有空泡，核变大，颗粒物增多，细胞间隙增宽。49PDL组细胞β-半乳糖苷酶染色后，细胞呈现蓝绿色变化，蓝染细胞的阳性率随增龄呈上升趋势，其中22PDL为0.0％，35PDL为 5.2％，而49PDL升高至91.9％(P<0.05)；对于H₂O₂诱导的细胞早衰起始组PSi 蓝染细胞比率为66.5％，而PSp达到91.3％，均高于22PDL，差异有统计学意义 (P<0.05)；PSp和49PDL之间蓝染细胞比率无明显差异(P>0.05)，详见图1B。

(2)节律相关基因在复制性衰老和早衰细胞模型中蛋白的表达

在细胞复制性衰老和H₂O₂诱导细胞早衰中蛋白表达变化如图2A和2B所示。在细胞复制性衰老中，与年轻细胞组22PDL相比，ADCY9蛋白表达在35PDL 和49PDL中分别降低51.4％和48.9％，PRKACB蛋白表达在35PDL和复制性衰老细胞组49PDL中分别降低80.5％和46.2％，CREB1蛋白表达在35PDL和 49PDL中分别降低89.5％和45.8％，PER2蛋白表达在35PDL和49PDL中分别降低50.3％和91.9％，差异均具有统计学意义(P<0.05)。H₂O₂诱导的早衰细胞， ADCY9蛋白表达在PSi和PSp中分别降低51.9％和84.1％，PRKACB的蛋白表达在PSi和PSp中分别降低99.5％和76.1％，CREB1蛋白表达在PSi中降低 63.6％，在PSp中低表达，均具有统计学差异(P<0.05)。PER2的蛋白表达在 PSi和PSp中也呈低表达(P<0.05)；与49PDL相比，PSp的ADCY9(P<0.05) 和PRKACB(P<0.05)蛋白表达分别降低69.0％和55.5％，CREB1(P<0.05)的蛋白表达明显降低，PER2的蛋白表达在49PDL和PSp间均是低表达，两者之间无显著改变(P>0.05)。

(3)节律基因在细胞衰老过程中m⁶A RNA甲基化分析

从表2可知，22PDL、49PDL和PSp中，ADCY9的RNA甲基化m⁶A峰个数分别为3、4和3个。各组最大富集倍数从大到小分别为年轻细胞组22PDL (1520.5)、复制性衰老细胞组49PDL(116.7)和细胞早衰持续组PSp(48.9)， PSp的m⁶A富集程度均比22PDL和49PDL低；PRKACB仅在22PDL中呈现一个m⁶A甲基化峰，富集倍数为10.7倍；CREB1在22PDL、49PDL和PSp中甲基化峰数分别为1、2和1个，三组最大甲基化富集倍数分别为157.4、134.1和 58.6倍；PER2在22PDL、49PDL和PSp中均存在1个甲基化位点，m⁶A峰富集倍数分别为630.2、359.1和367.8倍。以上数据表明细胞衰老的不同阶段存在上述节律基因的RNA甲基化修饰。

表2衰老相关节律基因RNA甲基化的富集情况

对于差异RNA甲基化峰的分布特征，在22PDL、49PDL和PSp中，ADCY9 的5'UTR和CDS附近均存在m⁶A RNA甲基化位点，而49PDL和PSp在CDS 附近靠近3'UTR侧新增1个甲基化位点，5'UTR附近仅保留1个甲基化位点； PRKACB仅在22PDL中存在1个甲基化位点，分布在3'UTR附近，49PDL和 PSp中甲基化位点消失；CREB1在22PDL、49PDL和PSp的5'UTR附近均发现1个甲基化位点，单独在49PDL中发现3'UTR附近存在1个甲基化位点；PER2 在22PDL、49PDL和PSp的3'UTR附近分别发现1个甲基化位点。差异RNA 甲基化位点的分布详见图3A。以上数据表明各节律基因的RNA甲基化峰在 mRNA的分布特征。

对于总富集倍数的变化规律，综合每组所有的甲基化峰值，计算m⁶A峰相对富集倍数，分析各组m⁶A甲基化的整体水平，结果如图3B所示。复制性衰老细胞中，与22PDL相比，49PDL中ADCY9的mRNA m⁶A甲基化水平无明显改变(P>0.05)。H₂O₂诱导早衰细胞中PSp降低64.7％(P<0.05)；再是，与49PDL 相比，PSp中ADCY9的mRNA m⁶A甲基化水平降低49.4％(P<0.05)。PRKACB 仅在22PDL出现一个RNA甲基化m⁶A峰，表明其m⁶A甲基化仅在年轻细胞阶段出现。CERB1 m⁶A RNA甲基化水平的富集倍数在22PDL、49PDL和PSp三组之间无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。相比于22PDL，PER2 m⁶A RNA 甲基化水平的富集倍数在49PDL和PSp中分别降低59.8％和53.3％，差异均具有统计学意义(P<0.05)，49PDL和PSp之间无差异(P>0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.节律基因蛋白表达和RNA甲基化修饰在制备衰老检测试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述衰老包括复制性衰老和氧化应激诱导的早衰；

所述细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞为人胚肺成纤维细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，

所述衰老检测试剂盒是通过检测细胞中节律基因蛋白的表达量和RNA甲基化修饰水平判断细胞衰老。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

所述节律基因为ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2；

当检测到细胞中所述ADCY9、PRKACB、CREB1和PER2中的一种或至少两种蛋白低表达，和/或所述PER2的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞进入衰老状态。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当检测到进入衰老状态的细胞中所述ADCY9的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞早衰；未检测到细胞中所述ADCY9的m⁶A RNA甲基化含量降低，表明细胞复制性衰老。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

所述蛋白的表达量采用相对定量分析法统计，通过蛋白条带的灰度分析，获得不同细胞表达条带的灰度值，以22PDL年轻细胞组为对照，设为1，其他细胞表达水平与22PDL年轻细胞组灰度值相比较；蛋白和内参表达量通过Western blot检测获得；

所述RNA甲基化修饰的水平采用免疫共沉淀联合测序分析检测得到，以22PDL年轻细胞组为对照；

所述22PDL年轻细胞组的定义为：继代培养细胞最终的群体倍增水平PDL为22的细胞，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

8.一种衰老检测试剂盒，其特征在于，包括细胞中节律基因蛋白表达量检测试剂，和/或m⁶A RNA甲基化修饰水平检测试剂。

9.根据权利要求8所述的衰老检测试剂盒，其特征在于，

所述的蛋白表达量检测试剂为Western blot半定量检测试剂；

所述的m⁶A RNA甲基化修饰水平检测试剂为RNA甲基化免疫共沉淀检测试剂。

10.权利要求8或9所述的衰老检测试剂盒在非治疗诊断目的检测衰老中的应用，其特征在于，所述应用包括取待测细胞，提取细胞总蛋白，采用上述衰老检测试剂盒进行蛋白半定量，和/或提取待测细胞总RNA，采用上述衰老检测试剂盒进行m⁶A RNA甲基化水平检测。

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