CN111041104A

CN111041104A - 用于评估目标对象衰老状况以及用于评估制品抗衰老作用的组合物及其用途

Info

Publication number: CN111041104A
Application number: CN201811050148.0A
Authority: CN
Inventors: 马竣; 韩晓亮; 王建铭; 黄昊; 李永君; 马肖
Original assignee: Biochain Beijing Science and Technology Inc
Current assignee: Biochain Beijing Science and Technology Inc
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-10-11
Also published as: CN111041104B

Abstract

本发明提供了一种用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的组合物，所述组合物包括：用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸，其中，所述目标基因为SCGN基因和ITGA2B基因。本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及所述组合物在制备用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的试剂盒中的用途。

Description

用于评估目标对象衰老状况以及用于评估制品抗衰老作用的组合物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在评估细胞、组织、或人体衰老状况，及监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估中的用途，具体地涉及一种用于检测目标基因靶序列甲基化状态水平的组合物及其相应的试剂盒和用途。

背景技术

衰老是人体随着时间的推移而自发的一个必然过程。这是一个复杂的自然现象，表现为结构退行性变、机能衰退，适应性和抵抗力减退等生理和病理变化。衰老是不可避免的，但延缓衰老却是可能的；通过合理饮食，平衡营养能够达到延缓衰老、延长寿命。

目前，衰老的生物学机制存在多种理论，包括：1)体细胞突变学说；2) 自由基学说；3)生物分子交联学说；4)免疫学说；5)端粒学说。近年来，随着表观遗传学的发展，大量研究显示衰老与表观遗传机制密切相关------基因组DNA的甲基化调控随着年龄的增长发生复杂变化，进而导致大量基因表达发生异常。这一理论很好地解释了随着时间的推移，机体所发生的结构退行性变、机能衰退、疾病发生等现象。因此利用表观遗传机制，特别是基因组DNA的甲基化，能够对衰老程度进行评估、对衰老进程进行检测、对抗衰老药物、营养品、或保健品的功效进行评估。

发明内容

衰老是生物体随着时间的推移而自发的一个必然过程。同时，衰老在生物个体间存在巨大的个体差异。因此，准确、便捷地评估衰老状态、监测衰老进程是健康管理的重要组成部分。此外，面对众多抗衰老保健品和营养品，如何有效评估其功效、如何实现个体化防衰老是保健品和营养品消费领域需要解答的重要科学问题。

本发明针对目前抗衰老保健品和营养品产业缺乏有效、便捷的功效评估技术，基于人体组织和细胞基因组DNA甲基化调控与衰老相关的生物学机制，提供了一种用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的组合物及其用途。本发明提供的组合物能够方便、可靠地评估人体衰老状况、监测人体衰老进程、并能够监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估。本发明还提供了包含所述组合物的试剂盒及其用途。

具体来说，本发明涉及以下内容：

1.一种用于评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的组合物，所述组合物包括：

用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸，

其中，所述目标基因为SCGN基因和/或ITGA2B基因。

在本发明中，甲基化水平是指目标基因靶序列在完全甲基化和完全去 (未)甲基化之间的任意状态，如下文所述，可以通过百分比来表示，例如完全甲基化是指甲基化水平为100％，完全去(未)甲基化是指甲基化水平为0，甲基化水平可以是0～100％之间的任意数值。

2.根据项1所述的组合物，其中，所述SCGN基因靶序列如SEQ ID NO: 1-6中任一项所示。

SEQ ID NO 1：SCGN基因甲基化状态受年龄调控的序列

GATAGCGAAAGAAGCAGGAGAGCAAGTCAAGAAATACGGTGAAGGAGTCCTTCCCAAAGTTGTCTAGGTCCTTCCGCGCCGGTGCCTGGTCTTCGTCGTCAACACCATGGACAGCTCCCGGGAACCGACTCTGGGGCGCTTGGACGCCGCTGGCTTCTGGCAGGTCTGGCAGCGCTTTGATGCGGATGG TGAGTA

SEQ ID NO 2：SEQ ID NO 1的互补序列

TACTCACCATCCGCATCAAAGCGCTGCCAGACCTGCCAGAAGCCAGCGGCGTCCAAGCGCCCCAGAGTCGGTTCCCGGGAGCTGTCCATGGTGTTGACGACGAAGACCAGGCACCGGCGCGGAAGGACCTAGACAACTTTGGGAAGGACTCCTTCACCGTATTTCTTGACTTGCTCTCCTGCTTCTTTC GCTATC

SEQ ID NO 3：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列

GATAGCGAAAGAAGTAGGAGAGTAAGTTAAGAAATACGGTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAGGTTTTTTCGCGTCGGTGTTTGGTTTTCGTCGTTAATATTATGGATAGTTTTCGGGAATCGATTTTGGGGCGTTTGGACGTCGTTGGTTTTTGGTAGGTTTGGTAGCGTTTTGATGCGGATGGTGAG TA

SEQ ID NO 4：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列

TATTTATTATTCGTATTAAAGCGTTGTTAGATTTGTTAGAAGTTAGCGGCGTTTAAGCGTTTTAGAGTCGGTTTTCGGGAGTTGTTTATGGTGTTGACGACGAAGATTAGGTACCGGCGCGGAAGGATTTAGATAATTTTGGGAAGGATTTTTTTATCGTATTTTTTGATTTGTTTTTTTGTTTTTTTCGTTATT

SEQ ID NO 5：处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列

GATAGTGAAAGAAGTAGGAGAGTAAGTTAAGAAATATGGTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAGGTTTTTTTGTGTTGGTGTTTGGTTTTTGTTGTTAATATTATGGATAGTTTTTGGGAATTGATTTTGGGGTGTTTGGATGTTGTTGGTTTTTGGTAGGTTTGGTAGTGTTTTGATGTGGATGGTGAGT A

SEQ ID NO 6：处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列

TATTTATTATTTGTATTAAAGTGTTGTTAGATTTGTTAGAAGTTAGTGGTGTTTAAGTGTTTTAGAGTTGGTTTTTGGGAGTTGTTTATGGTGTTGATGATGAAGATTAGGTATTGGTGTGGAAGGATTTAGATAATTTTGGGAAGGATTTTTTTATTGTATTTTTTGATTTGTTTTTTTGTTTTTTTTGTTATT

3.根据项1所述的组合物，其中，所述ITGA2B基因靶序列如SEQ ID NO:7-12中任一项所示。

SEQ ID NO 7：ITGA2B基因甲基化状态受年龄调控区域

TTTGCCTAGGGGAGCCTTCCCTGACTCCTCAGGCTGGCCGCGTGGGCTAACACACGTAGGCACAGCATTGAGCACACTGTTTACTCTTGGTCCGTTCACAGGATTGTGTAAATGAGTCCCTTGGGAGCAAGGCTCCTTGCTACAGCCCTAGAGACTACCCAAGAGTCCAATGTGTAGTACG

SEQ ID NO 8：SEQ ID NO 7的互补序列

CGTACTACACATTGGACTCTTGGGTAGTCTCTAGGGCTGTAGCAAGGAGCCTTGCTCCCAAGGGACTCATTTACACAATCCTGTGAACGGACCAAGAGTAAACAGTGTGCTCAATGCTGTGCCTACGTGTGTTAGCCCACGCGGCCAGCCTGAGGAGTCAGGGAAGGCTCCCCTAGGCAAA

SEQ ID NO 9：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列

TTTGTTTAGGGGAGTTTTTTTTGATTTTTTAGGTTGGTCGCGTGGGTTAATATACGTAGGTATAGTATTGAGTATATTGTTTATTTTTGGTTCGTTTATAGGATTGTGTAAATGAGTTTTTTGGGAGTAAGGTTTTTTGTTATAGTTTTAGAGATTATTTAAGAGTTTAATGTGTAGTACG

SEQ ID NO 10：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列

CGTATTATATATTGGATTTTTGGGTAGTTTTTAGGGTTGTAGTAAGGAGTTTTGTTTTTAAGGGATTTATTTATATAATTTTGTGAACGGATTAAGAGTAAATAGTGTGTTTAATGTTGTGTTTACGTGTGTTAGTTTACGCGGTTAGTTTGAGGAGTTAGGGAAGGTTTTTTTAGGTAAA

SEQ ID NO 11：处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列

TTTGTTTAGGGGAGTTTTTTTTGATTTTTTAGGTTGGTTGTGTGGGTTAATATATGTAGGTATAGTATTGAGTATATTGTTTATTTTTGGTTTGTTTATAGGATTGTGTAAATGAGTTTTTTGGGAGTAAGGTTTTTTGTTATAGTTTTAGAGATTATTTAAGAGTTTAATGTGTAGTATG

SEQ ID NO 12：处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列

TGTATTATATATTGGATTTTTGGGTAGTTTTTAGGGTTGTAGTAAGGAGTTTTGTTTTTAAGGGATTTATTTATATAATTTTGTGAATGGATTAAGAGTAAATAGTGTGTTTAATGTTGTGTTTATGTGTGTTAGTTTATGTGGTTAGTTTGAGGAGTTAGGGAAGGTTTTTTTAGGTAAA

在本发明中，通过DNA甲基化转移酶处理目标基因的靶序列以后可以得到一个完全甲基化的序列(即甲基化水平为100％的序列)，例如SEQ ID NO 3、4，或者SEQ ID NO 9、10。在本发明中，直接利用全基因组的白细胞基因组DNA扩增的目标基因靶序列是完全去(或者也可以称为完全未)甲基化的序列(即甲基化水平为0％的序列)，例如SEQ ID NO 5、6，或者例如SEQ ID NO 11、12。在本发明中的所有样品检测的甲基化水平均处于这两种状态之间，即可以取0％至100％之间的任意数值，其范围在0～100％。

4.根据项1～3中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括：

所述目标基因靶序列中的至少9个核苷酸的片段，

所述片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

5.根据项1～4中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括：

在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列中的至少15个核苷酸的片段，

所述片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

6.根据项1～5中任一项所述的组合物，其还包括：

将目标基因靶序列5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。

7.根据项4所述的组合物，其中，

所述至少9个核苷酸的片段引物，其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示或者其序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

SEQ ID NO 13：SCGN基因引物F

GAGAGTAAGTTAAGAAATAC

SEQ ID NO 14：SCGN基因引物R

CCAAACACCGACGCG

SEQ ID NO 15：ITGA2B基因引物F

TGATTTTTTAGGTTGGTTGT

SEQ ID NO 16：ITGA2B基因引物R

CCTATAAACAAACCAAAAATAAACAATAT

8.根据项5所述的组合物，其中，

所述至少15个核苷酸的片段探针，其序列如SEQ ID NO:17所示或者其序列如SEQID NO:18所示。

SEQ ID NO 17：SCGN基因探针P

GTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAG

SEQ ID NO 18：ITGA2B基因探针P

GTGGGTTAATAATGTAGGTATAG

9.根据项1～8中任一项所述的组合物，其中，

所述目标对象选自细胞、组织或人。

10.根据项1～9中任一项所述的组合物，其中，

所述制品选自药物、营养品、或保健品。

11.一种用于检测目标基因靶序列甲基化水平的寡核苷酸，其包括：

所述SEQ ID NO:1-12序列中任一项中的至少9个核苷酸，以及

所述至少9个核苷酸中包含至少一个CpG二核苷酸位点的片段。

12.根据项11所述的寡核苷酸，其还包括：

在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO:1-12序列中任一项中的至少15个核苷酸，以及

所述至少15个核苷酸中包含至少一个CpG二核苷酸位点的片段。

13.一种用于检测SCGN基因靶序列甲基化水平的寡核苷酸，其包括：

SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列。

14.根据项13所述的寡核苷酸，其还包括：

SEQ ID NO:17的序列。

15.一种用于检测ITGA2B基因靶序列甲基化水平的寡核苷酸，其包括：

SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的序列。

16.根据项15所述的寡核苷酸，其还包括：

SEQ ID NO:18的序列。

17.SCGN基因靶序列在制备用于评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的试剂盒中的用途。

18.ITGA2B基因靶序列在制备用于评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的试剂盒中的用途。

19.一种试剂盒，其包括项1～10中任一项所述的组合物或包括项11～16 中任一项所述的寡核苷酸。

20.根据项19所述的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种其它组分：

三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。

21.根据项19或20所述的试剂盒，其还包含：说明书。

22.根据项19～21中任一项所述的试剂盒，其中，

所述目标对象选自细胞、组织或人。

23.根据项19～22中任一项所述的试剂盒，其中，

所述制品选自药物、营养品、或保健品。

24.根据项1～10中任一项所述的组合物或项11～16中任一项所述的寡核苷酸在用于制备用于评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的试剂盒中的用途。

25.根据项17、18以及24中任一项所述的用途，其中，所述用于评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的试剂盒通过包括如下步骤的方法来实施检测：

1)分离待测目标对象样品中的包括目标基因靶序列或其片段的DNA样品；

2)确定所述目标基因靶序列的甲基化水平；

3)通过所述目标基因靶序列的甲基化水平的检测结果评估目标对象的衰老状况，和/或用于评估制品的抗衰老作用。

26.根据项25所述的用途，其中，所述方法包括如下步骤：

提取待测目标对象的基因组DNA；

使用试剂处理提取的基因组DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；

将试剂处理过的DNA样品与DNA聚合酶和目标基因靶序列的引物接触，并进行DNA聚合反应；

用探针检测扩增产物；以及

基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG 二核苷酸的甲基化水平；

基于目标基因Ct与内参基因Ct的差值(dCt)确定所述目标基因靶序列的甲基化水平；

通过所述目标基因靶序列的甲基化水平的检测结果评估目标对象的衰老状况，及评估制品的抗衰老作用。

在本发明中，甲基化水平的检测结果通常是指甲基化水平的变化，即，通常，会首先对目标对象一个状态下的目标基因靶序列的甲基化水平进行检测，即进行上述的步骤确定该状态下的甲基化水平，随后，会对目标对象另一个状态下的目标基因靶序列的甲基化水平进行检测，即进行上述的步骤确定另一个状态下的甲基化水平，然后基于前后两个状态的甲基化水平的检测数据来评估两个状态下甲基化水平的变化，该变化可以显示两个状态之间的差异。这两个状态，可以是例如，通过所述制品处理目标对象前和处理目标对象后，或者是目标对象经受某个过程之前的状态和之后的状态。

27.根据项26所述的用途，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。

28.根据项17、18以及24中任一项所述的用途，其中，

所述目标对象选自细胞、组织或人。

29.根据项17、18以及24中任一项所述的用途，其中，

所述制品选自药物、营养品、或保健品。

30.一种评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的方法，其包括如下步骤：

分离待测目标对象中的包括目标基因靶序列或其片段的DNA样品；

确定所述目标基因靶序列的甲基化水平；以及

通过所述目标基因靶序列的甲基化水平的检测结果评估目标对象的衰老状况和/或评估制品抗衰老作用。

31.一种评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用的方法，其包括如下步骤：

提取待测目标对象的基因组DNA；

用探针检测扩增产物；以及

32.根据项30或31所述的方法，其中，

所述目标基因选自：SCGN基因以及ITGA2B基因。

33.根据项32所述的方法，其中，所述SCGN基因的靶序列的序列如 SEQ ID NO:1-6所示。

34.根据项32所述的方法，其中，所述ITGA基因的靶序列的序列如 SEQ ID NO:7-12所示。

35.根据项31所述的方法，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。

36.根据项31所述的方法，其中，所述引物为：

所述SEQ ID NO:1-6中任一项的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG 二核苷酸位点的片段；和/或

所述SEQ ID NO:7-12的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸位点的片段。

37.根据项31所述的方法，其中，所述探针为：

在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO:1-6中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或

在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO:7-12的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。

38.根据项36所述的方法，其中，所述引物为SEQ ID NO:13-14和SEQ ID NO:15-16的序列。

39.根据项37所述的方法，其中，所述探针为SEQ ID NO:17的序列 SEQ ID NO:18的序列。40.根据权利要求30或31所述的方法，其中，

所述目标对象选自细胞、组织或人。

41.根据项30或31所述的方法，其中，

所述制品选自药物、营养品、或保健品。

在本发明中，通过目标基因靶序列甲基化水平的变化可以来评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品的抗衰老作用。在本发明中，SCGN基因甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关，即SCGN基因的甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关，即SCGN基因甲基化水平的数值增加表示年龄增长，或由于某些刺激导致的更为衰老的状态。

ITGA2B基因甲基化与年龄(衰老)呈显著性负相关，即：ITGA2B基因的甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关，即ITGA2B基因甲基化水平的数值降低表示年龄增长，或由于某些刺激导致的更为衰老的状态。

在本发明中，SCGN基因的甲基化水平下降，ITGB2A基因的去甲基化水平下降(即甲基化水平上升)表示衰老状况得到缓解，或者抗衰老物质发挥作用，反之亦然。

本发明的发明人利用表观基因组学和生物信息学技术，通过分析人体细胞基因组DNA甲基化数据和年龄的相关性，发现两个与衰老相关的甲基化基因，并确定了这两个基因随衰老发生甲基化变化的靶序列；进一步，本发明的发明人发现，通过这两个衰老相关甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测这两个基因的甲基化状态；通过在检测体系中加入内参基因ACTB 特异的引物和探针，能够对这两个基因靶序列的甲基化水平进行相对定量分析。对外周血白细胞基因组DNA的检测显示：本发明描述的组合物和检测方法能够灵敏和特异地检测到衰老和这两个基因靶序列甲基化水平的相关性。此外，使用本发明描述的组合物和检测方法，本发明的发明人证实了目标基因靶序列的甲基化水平的变化反应了抗衰老物质的功效。因此，本发明提供了一种可用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的组合物和检测方法。

本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。

附图说明

本发明的上述及其它特征将通过下面结合附图及其详细描述作进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本发明的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。

图1显示SCGN和ITGA2B两个目标基因的甲基化与年龄的相关性，其中，图1A显示SCGN基因甲基化与年龄(衰老)呈显著性正相关，即SCGN 基因的甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关；图1B显示ITGA2B基因甲基化与年龄(衰老)呈显著性负相关，即：ITGA2B基因的甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关。

图2为使用本发明提供的组合物和检测方法对人体细胞基因组DNA全基因组扩增产物(完全去(或者完全未)甲基化基因组DNA)和DNA甲基转移酶处理后的人体细胞基因组DNA(完全甲基化基因组DNA)的检测。图2A显示对人体细胞基因组DNA全基因组扩增产物，SCGN甲基化基因检测呈阴性，SCGN甲基化基因检测呈阳性；图2B显示对DNA甲基转移酶处理后的人体细胞基因组DNA全基因组扩增产物，SCGN甲基化基因检测呈阴性； ITGA2B去甲基化基因检测呈阳性。

图3为使用本发明提供的组合物和检测方法对人体白细胞基因组DNA 的检测。图3A显示SCGN基因的甲基化与年龄/衰老呈正相关，即：甲基化 SCGN基因的检测Ct值与内参基因ACTB的检测Ct值之差dCt(SCGN)与年龄呈负相关；图3B显示ITGA2B基因的去甲基化与年龄/衰老呈正相关，即：去甲基化ITGA2B基因的检测Ct值与内参基因ACTB的检测Ct值之差dCt(ITGA2B)与年龄呈负相关；图3C显示dCt(SCGN)与dCt(ITGA2B)的几何平均值与年龄相关性的显著性远高于dCt(SCGN)和dCt(ITGA2B)单独与年龄的相关性，同时也高于dCt(SCGN)与dCt(ITGA2B)的算数平均值与年龄的相关性。

图4为使用本发明提供的组合物和检测方法对使用已知抗衰老物质，如：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子酸(GA)，处理人体细胞前、后的基因组DNA的检测。结果显示：使用抗衰老物质(EGCG和GA)处理后，人体细胞基因组DNA中SCGN基因的甲基化水平下降，ITGB2A基因的去甲基化水平下降(即甲基化水平上升)。

具体实施方式

一方面，本发明提供了一种用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因靶序列内甲基化水平的核酸，其中，所述目标基因为SCGN基因和ITGA2B基因。

本发明提供了一组在衰老过程中甲基化水平发生变化、且其甲基化水平的变化可在抗衰老物质作用下发生逆转的目标基因靶序列，该靶序列包括 SCGN基因和ITGA2B基因的靶序列，SCGN基因的靶序列如SEQ ID NO:1-6 中任一项所示，ITGA2B基因的靶序列如SEQID NO:7-12中任一项所示。

SEQ ID NO 1：SCGN基因甲基化状态受年龄调控的序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列

SEQ ID NO 2：SEQ ID NO 1互补序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列

SEQ ID NO 3：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列

SEQ ID NO 4：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列

SEQ ID NO 5：处于完全去(或者也可以称为完全未)甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列

SEQ ID NO 6：处于完全去(或者也可以称为完全未)甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的SCGN基因的靶序列TATTTATTATTTGTATTAAAGTGTTGTTAGATTTGTTAGAAGTTAGTGGTGTTTAAGTGTTTTAGAGTTGGTTTTTGGGAGTTGTTTATGGTGTTGATGATGAAGATTAGGTATTGGTGTGGAAGGATTTAGATAATTTTGGGAAGGATTTTTTTATTGTATTTTTTGATTTGTTTTTTTGTTTTTTTTGTTATT

SEQ ID NO 7：ITGA2B基因甲基化状态受年龄调控区域，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

SEQ ID NO 8：SEQ ID NO 7互补序列，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

SEQ ID NO 9：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

SEQ ID NO 10：处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

SEQ ID NO 11：处于完全去(或者也可以称为完全未)甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

SEQ ID NO 12：处于完全去(或者也可以称为完全未)甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列，本文中所称的ITGA2B基因的靶序列

如上所述，在本发明中，甲基化水平是指目标基因靶序列在完全甲基化和完全去(未)甲基化之间的任意状态，可以通过百分比来表示，例如完全甲基化是指甲基化水平为100％，完全去(未)甲基化是指甲基化水平为0，甲基化水平可以是0～100％之间的任意数值。

当然，本领域技术人员完全可以理解例如当完全甲基化是指甲基化水平为1，完全去(未)甲基化是指甲基化水平为0，甲基化水平可以是0～1之间的任意数值。即甲基化水平是相对于完全甲基化和完全未甲基化之间的一个相对数值。

在本发明中，通过DNA甲基化转移酶处理目标基因的靶序列以后可以得到一个完全甲基化的序列(即甲基化水平为100％的序列)，例如SEQ ID NO 3、4，或者SEQ ID NO 9、10。在本发明中，直接利用全基因组的白细胞基因组DNA扩增的目标基因靶序列是完全去(或者也可以称为完全未)甲基化的序列(即甲基化水平为0％的序列)，例如SEQ ID NO 5、6，或者例如SEQ ID NO 11、12。在本发明中的所有样品检测的甲基化水平均处于这两种状态之间，即可以取0％至100％之间的任意数值。

因此，在本发明中，目标基因靶序列的甲基化水平可以通过0～100％之间的任意数值来表示。

优选地，用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括目标基因靶序列SEQ IDNO 1-2和SEQ ID NO 7-8中至少9个核苷酸的片段，其中所述片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。在某些优选实施方式中，如使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括对目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列SEQID NO 3-6和 SEQ ID NO 9-12中的至少9个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

更优选地，用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列SEQ ID NO 1-2和SEQ ID NO 7-8 中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。在某些优选实施方式中，如：使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA 进行转化，用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括在中等严紧或严紧条件下，杂交于目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后序列SEQ IDNO 3-6和SEQ ID NO 9-12中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

优选地，所述组合物还包括将目标基因靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。更优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐。

优选地，所述组合物包括如下的引物和探针中的一种或多种：

SEQ ID NO 13：SCGN基因引物F

GAGAGTAAGTTAAGAAATAC

SEQ ID NO 14：SCGN基因引物R

CCAAACACCGACGCG

SEQ ID NO 15：ITGA2B基因引物F

TGATTTTTTAGGTTGGTTGT

SEQ ID NO 16：ITGA2B基因引物R

CCTATAAACAAACCAAAAATAAACAATAT

SEQ ID NO 17：SCGN基因探针P

GTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAG

SEQ ID NO 18：ITGA2B基因探针P

GTGGGTTAATAATGTAGGTATAG

另一方面，本发明提供了包括所述组合物的试剂盒。该试剂盒还包含选自下述的至少一种其它组分：三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。

本发明还涉及SCGN基因靶序列和ITGA2B基因靶序列在制备用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的试剂盒中的用途。

其中，所述ITGA2B为整合素A2B基因，英文名称integrin subunit alpha 2b，位于人类的第17号染色体的q21.31区域，属于整合素的alpha链基因家族。

所述SCGN基因为促分泌素基因，英文名称secretagogin，位于人类的第6号染色体的p22.2区域。该基因所编码的蛋白是一种钙合分泌蛋白，参与钙离子调控和细胞增殖。

再一方面，本发明提供了一种评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的方法，所述方法包括以下步骤：

1)分离待测人体样品中的目标基因靶序列或其片段；

2)确定所述目标基因靶序列的甲基化水平；

3)通过所述目标基因靶序列的甲基化水平的检测结果评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估。

根据某些优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：

1)提取待测人体样品的基因组DNA；

2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；

3)将经步骤2)处理过的DNA样品与DNA聚合酶和所述目标基因靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；

4)用探针检测扩增产物；以及

5)基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列中至少一个 CpG二核苷酸的甲基化水平。

6)在采用实时定量PCR的情况下，基于所述扩增反应的循环阈值Ct(Cp) 值、或经内参(如：ACTB基因)基因调整后的delta Ct(Cp)值，确定所述目标基因靶序列中至少一个CpG二核苷酸的甲基化水平。

优选地，典型的引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自 SEQ ID NO:1-6和SEQID NO:7-12中的至少9个核苷酸的片段。

优选地，所述引物、探针和/或阻断剂中的一种或多种如下所示：

SEQ ID NO 13：SCGN基因引物F

GAGAGTAAGTTAAGAAATAC

SEQ ID NO 14：SCGN基因引物R

CCAAACACCGACGCG

SEQ ID NO 15：ITGA2B基因引物F

TGATTTTTTAGGTTGGTTGT

SEQ ID NO 16：ITGA2B基因引物R

CCTATAAACAAACCAAAAATAAACAATAT

SEQ ID NO 17：SCGN基因探针P

GTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAG

SEQ ID NO 18：ITGA2B基因探针P

GTGGGTTAATAATGTAGGTATAG

并且，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法：使用耐热DNA 聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。

据某些优选实施方式，所述目标基因靶序列中至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平是由PCR反应的循环阈值Ct(Cp)值确定的。通过利用PCR 反应分析生物样本中DNA的方法，能方便地实现针对目标基因靶序列甲基化水平的检测，并且能根据PCR反应的循环阈值Ct(Cp)值来快速、便捷地判断目标基因靶序列甲基化水平的变化。

在本发明中，甲基化水平的检测结果通常是指甲基化水平的变化，即，通常，会首先对目标对象一个状态下的目标基因靶序列的甲基化水平进行检测，即进行上述本发明步骤来确定该状态下的甲基化水平，随后，会对目标对象另一个状态下的目标基因靶序列的甲基化水平进行检测，即进行上述本发明步骤来确定另一个状态下的甲基化水平，然后基于前后两个状态的甲基化水平的检测数据来评估两个状态下甲基化水平的变化，该变化可以显示两个状态之间的差异。这两个状态，可以是例如，通过所述制品处理目标对象前和处理目标对象后，或者是目标对象经受某个过程之前的状态和之后的状态。

具体来说，可以是目标对象在施用了药物、营养品、或保健品前后，可以用于评估该药物、营养品、或保健品的抗衰老作用。

如上所述，目标对象经受的某个过程具体来说，该过程可以是时间的变化，或者该过程可能是经受辐射处理，经受药物治疗处理，经受心理上的变化等等。

在本发明中，通过目标基因靶序列甲基化水平的变化可以来评估目标对象衰老状况和/或用于评估制品抗衰老作用。在本发明中，SCGN基因甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性正相关，即SCGN基因的甲基化水平与年龄(衰老) 呈显著性正相关，即SCGN基因甲基化水平的数值增加表示年龄增长，或更为衰老的状态。

ITGA2B基因甲基化与年龄(衰老)呈显著性负相关，即：ITGA2B基因的甲基化水平与年龄(衰老)呈显著性负相关，即ITGA2B基因甲基化水平的数值降低表示年龄增长，或更为衰老的状态。

所述的人体样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选的生物样品为人体外周血白细胞。

本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。典型地，所述的试剂盒包括用于容纳人体样品的容器。并且，所述的试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。

本发明提供了一种通过检测目标基因靶序列的甲基化水平来评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的方法。本发明人发现，人体基因组DNA 中SCGN基因和ITGA2B基因靶序列的甲基化水平与人体衰老相关；并且在抗衰老物质的作用下，能够发生逆转性变化。因此本申请提供了一种通过检测样本中的SCGN基因和ITGA2B基因靶序列甲基化水平来评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的方法。

本发明还提供一种能够灵敏和特异地检测目标基因靶序甲基化水平的组合物；以及一种可用于评估细胞、组织、或人体衰老状况，及用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的方法和试剂盒。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

下述描述为本发明的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。第一组实施方案公开了目标基因和目标基因靶序列；第二组实施方案公开了用于检测目标基因靶序列甲基化水平的组合物，包括用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸；第三组实施方案公开了一种通过检测目标基因靶序列甲基化水平评估细胞、组织、或人体衰老状况的方法和用途；第四组实施方案公开了一种通过检测目标基因靶序列甲基化水平监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的方法和用途。

优选地，所述核酸检测的序列包括所述目标基因靶序列SEQ ID NO:1-2 和SEQ IDNO:7-8中至少9个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点；在某些优选实施方式中，如：使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，所述核酸检测的序列包括对目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO:3-6和SEQ ID NO:9-12中的至少 9个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点；

更优选地，所述核酸检测的序列分别包括在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:7-8的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点；在某些优选实施方式中，如：使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，所述核酸检测的序列包括在中等严紧或严紧条件下，杂交于目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后序列SEQ ID NO:3-6和SEQ ID NO:9-12中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

在某些实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。优选地，该试剂是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中， 5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应；在随后的碱性水解后，没有甲基化的胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶；但在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。由此原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的5-甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定目标基因靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化水平。此外，本发明的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG二核苷酸序列的甲基化水平时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG二核苷酸序列的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)。相应地，术语甲基化水平还应被认为是指反映CpG二核苷酸序列去甲基化和/或甲基化状态的值。

在某些实施方式中，本申请的方法具体包括：1)提取待测生物样品的基因组DNA；2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5 位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；3)将经步骤2)处理过的DNA 样品与DNA聚合酶和所述目标基因靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；4)用探针检测扩增产物； 5)以及基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个 CpG二核苷酸的甲基化水平。

典型地，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法：使用耐热DNA 聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5-3’外切酶活性的聚合酶；使用PCR；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。优选地，用PCR方式来测定甲基化水平，诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA) 等测定方法被用于测定目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化水平。其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR 引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增水平以及在荧光检测扩增水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化水平的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的CpG二核苷酸的荧光探针存在下，PCR反应提供了去甲基化和/或甲基化特异的扩增。用于起始DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等。TaqMan探针为荧光报道物(Reporter)和淬灭分子(Quencher)双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan探针。 Taq聚合酶5至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂可以包括，但不限于：用于目标基因靶序列PCR引物；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶等。

实施例

实施例1

通过256例人体外周血白细胞基因组DNA的全基因组甲基化芯片 (Illumina公司的HumanMethylation450k芯片)数据与相应个体年龄的相关性分析，本发明人发现SCGN基因的甲基化和ITGA2B基因的去甲基化与年龄呈现显著的正相关性(分析结果如图1所示)。进一步地，本发明人通过分析 SCGN基因和ITGA2B基因在全基因组甲基化芯片上的探针序列及相应的甲基化率数据，发现了这两个目标基因在人体衰老过程中发生甲基化水平变化最显著的序列片段，从而确定为这两个目标基因的靶序列：

SCGN基因的靶序列如SEQ ID NO:1-6所示。

SEQ ID NO 1：SCGN基因甲基化状态受年龄调控的序列

SEQ ID NO 2：SEQ ID NO 1互补序列

SEQ ID NO 5：处于完全去甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列

SEQ ID NO 6：处于完全去甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列

ITGA2B基因的靶序列如SEQ ID NO:7-12所示。

SEQ ID NO 7：ITGA2B基因甲基化状态受年龄调控区域

SEQ ID NO 8：SEQ ID NO 7互补序列

SEQ ID NO 11：处于完全去甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列

SEQ ID NO 12：处于完全去甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列

实施例2

第一步：获得待分析的人体样品的DNA。该来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。然后通过现有技术中的任何标准手段来分离，从所述样品分离DNA。简言之，当DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白质降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。一旦核酸被提取，就将DNA用于分析。

在本实施方案中，人体样本DNA为DNA甲基转移酶处理的白细胞基因组DNA和全基因组扩增的白细胞基因组DNA。DNA甲基转移酶处理的白细胞基因组DNA的目标基因靶序列为完全甲基化状态，因此DNA甲基转移酶处理的白细胞基因组DNA是目标基因靶序列甲基化状态的阳性参考品。全基因组扩增的白细胞基因组DNA的目标基因靶序列为完全去甲基化状态，因此全基因组扩增的白细胞基因组DNA是目标基因靶序列甲基化水平的阴性参考品。

第二步：将上述两种DNA样品分别处理，以使得在5位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。优选地，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。优选地，该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，例如但不限于色原烷衍生物，如6-羟基-2,5,7,8,- 四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物，例如没食子酸。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤。

第三步：采用本发明的引物以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。优选地，所述扩增产物的长度为50至150个碱基对。直接或间接地检测通过扩增获得的片段。优选的是标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。

根据目标基因靶序列SEQ ID NO:1-6和SEQ ID NO:7-12，在本发明中设计了用于检测SCGN基因和ITGA2B基因这两个目标基因靶序列甲基化水平的引物、和探针序列(SEQID NO:13-18)：

优选地，所述引物、探针中的一种或多种如下所示：

SEQ ID NO 13：SCGN基因引物F

GAGAGTAAGTTAAGAAATAC

SEQ ID NO 14：SCGN基因引物R

CCAAACACCGACGCG

SEQ ID NO 15：ITGA2B基因引物F

TGATTTTTTAGGTTGGTTGT

SEQ ID NO 16：ITGA2B基因引物R

CCTATAAACAAACCAAAAATAAACAATAT

SEQ ID NO 17：SCGN基因探针P

GTGAAGGAGTTTTTTTTAAAGTTGTTTAG

SEQ ID NO 18：ITGA2B基因探针P

GTGGGTTAATAATGTAGGTATAG

在本发明中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、 0.1-1U Taq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1-10mM的MgCl2和2XPCR 缓冲至最终的2μl至100μl的体积。在85至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在45至80℃下退火及延伸5至90秒，在85至99℃下变性5至90秒。通过仅仅在去甲基化和/或甲基化的目标基因靶序列上观测扩增，用与含5-甲基胞嘧啶的目标基因靶序列的CpG岛区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且，在某些具体实施方式中，可以以β肌动蛋白基因(ACTB)作为PCR的内参，通过使用与β肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。

实验结果显示如图2所述：使用本发明提供的组合物和检测方法能够特异性地检测处于甲基化状态的SNGC基因靶序列和处于去甲基化状态的 ITGA2B基因靶序列，即：对DNA甲基化转移酶处理的白细胞基因组DNA(目标基因靶序列甲基化状态的阳性参考品)的检测中，SCGN基因靶序列显示发生扩增，即：特异地检测到处于完全甲基化状态的SCGN基因靶序列；而对全基因组扩增的白细胞基因组DNA(目标基因靶序列甲基化状态的阴性参考品)的检测，ITGA2B基因靶序列显示发生扩增，即特异地检测到处于完全去甲基化状态的ITGA2B基因靶序列。

实施例3

使用本发明提供的组合物和检测方法，对一定数量不同年龄阶段的人体外周血白细胞基因组DNA样本进行检测。

本实施例包括以下步骤：

首先，得到57例不同年龄阶段的正常人外周血样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取受测样本中白细胞基因组DNA，并对所述DNA样品预处理以使得在5位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行。具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒完成的。

然后，上述经过处理的57例DNA样本中加入上述的目标基因引物和探针组合，通过PCR检测目标基因靶序列的甲基化水平。其中，本实验例中采取的PCR在Life Technologies仪器(7500)上进行。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng、450nM引物和阻断剂、225nM探针、1UTaq 聚合酶、200μM的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的 50μl的体积。在94℃持续20分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在在55.5℃退火及延伸35秒，在93℃变性30秒。最后，分别测得57例正常人的DNA 样本对于目标基因靶序列的实时PCR的Ct值。

实验结果显示如图3所述：SCGN基因靶序列的Ct值与ACTB基因的Ct值之差，即：delta Ct(SCGN)，与年龄呈显著性的相关性；ITGA2B基因靶序列的Ct值与ACTB基因的Ct值之差，即：delta Ct(ITGA2B)，与年龄呈显著性的相关性；进一步的分析发现，当使用SCGN基因靶序列的Ct值和ITGA2B基因靶序列的Ct值的几何平均值进行delta Ct的计算时，deltaCt 呈现了与年龄更加显著的相关性。因此，本发明提供的组合物和检测方法能够用于细胞、组织、或人体衰老状况的评估。

实施例4

使用本发明提供的组合物和检测方法，对使用已知抗衰老物质处理人体细胞前、后的基因组DNA进行检测。

本实施例包括以下步骤：

首先，按照人体细胞培养的标准方法进行HCT116和HepG细胞株的培养。然后，分别使用1/2IC50浓度的已知抗衰老物质，包括：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子酸(GA)，以及空白培养基对照进行处理。 48小时后，收集细胞，并提出细胞基因组DNA。

然后对所述DNA样品预处理以使得在5位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行。具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒完成的。

然后，上述经过处理的DNA样本中加入上述的目标基因引物和探针组合，通过PCR检测目标基因靶序列的甲基化水平。其中，本实验例中采取的PCR在Life Technologies仪器(7500)上进行。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng、450nM引物和阻断剂、225nM探针、1UTaq 聚合酶、200μM的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的 50μl的体积。在94℃持续20分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在在55.5℃退火及延伸35秒，在93℃变性30秒。最后，分别测得各DNA样本对于目标基因靶序列的实时PCR的Ct值。

结果显示：使用已知抗衰老物质(EGCG和GA)处理后，人体细胞基因组DNA中SCGN基因的甲基化水平下降，ITGB2A基因的去甲基化水平下降。因为SCGN基因的甲基化和ITGB2A基因的去甲基化水平与衰老呈正相关性，SCGN基因的甲基化和ITGB2A基因的去甲基化水平的下降说明抗衰老物质(EGCG和GA)处理后人体细胞的衰老程度降低。因此，本发明提供的组合物和检测方法能够用于监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估。

综上所述，本申请利用以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及上述检测方法，通过检测目标基因靶序列及其片段甲基化水平变化的核酸序列，实现了客观、便捷地评估细胞、组织、或人体衰老状况，及监测药物、营养品、或保健品对细胞、组织、或人体的抗衰老作用和功效评估的用途。

尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

序列表

<110> 博尔诚(北京)科技有限公司

<120> 用于评估目标对象衰老状况以及用于评估制品抗衰老作用的组合物及其用途

<130> PB00255

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCGN基因甲基化状态受年龄调控的序列

<400> 1

gatagcgaaa gaagcaggag agcaagtcaa gaaatacggt gaaggagtcc ttcccaaagt 60

tgtctaggtc cttccgcgcc ggtgcctggt cttcgtcgtc aacaccatgg acagctcccg 120

ggaaccgact ctggggcgct tggacgccgc tggcttctgg caggtctggc agcgctttga 180

tgcggatggt gagta 195

<210> 2

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO 1的互补序列

<400> 2

tactcaccat ccgcatcaaa gcgctgccag acctgccaga agccagcggc gtccaagcgc 60

cccagagtcg gttcccggga gctgtccatg gtgttgacga cgaagaccag gcaccggcgc 120

ggaaggacct agacaacttt gggaaggact ccttcaccgt atttcttgac ttgctctcct 180

gcttctttcg ctatc 195

<210> 3

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 3

gatagcgaaa gaagtaggag agtaagttaa gaaatacggt gaaggagttt tttttaaagt 60

tgtttaggtt ttttcgcgtc ggtgtttggt tttcgtcgtt aatattatgg atagttttcg 120

ggaatcgatt ttggggcgtt tggacgtcgt tggtttttgg taggtttggt agcgttttga 180

tgcggatggt gagta 195

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 4

tatttattat tcgtattaaa gcgttgttag atttgttaga agttagcggc gtttaagcgt 60

tttagagtcg gttttcggga gttgtttatg gtgttgacga cgaagattag gtaccggcgc 120

ggaaggattt agataatttt gggaaggatt tttttatcgt attttttgat ttgttttttt 180

gtttttttcg ttatt 195

<210> 5

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 1在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 5

gatagtgaaa gaagtaggag agtaagttaa gaaatatggt gaaggagttt tttttaaagt 60

tgtttaggtt tttttgtgtt ggtgtttggt ttttgttgtt aatattatgg atagtttttg 120

ggaattgatt ttggggtgtt tggatgttgt tggtttttgg taggtttggt agtgttttga 180

tgtggatggt gagta 195

<210> 6

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 2在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 6

tatttattat ttgtattaaa gtgttgttag atttgttaga agttagtggt gtttaagtgt 60

tttagagttg gtttttggga gttgtttatg gtgttgatga tgaagattag gtattggtgt 120

ggaaggattt agataatttt gggaaggatt tttttattgt attttttgat ttgttttttt 180

gttttttttg ttatt 195

<210> 7

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA2B基因甲基化状态受年龄调控区域

<400> 7

tttgcctagg ggagccttcc ctgactcctc aggctggccg cgtgggctaa cacacgtagg 60

cacagcattg agcacactgt ttactcttgg tccgttcaca ggattgtgta aatgagtccc 120

ttgggagcaa ggctccttgc tacagcccta gagactaccc aagagtccaa tgtgtagtac 180

g 181

<210> 8

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO 7的互补序列

<400> 8

cgtactacac attggactct tgggtagtct ctagggctgt agcaaggagc cttgctccca 60

agggactcat ttacacaatc ctgtgaacgg accaagagta aacagtgtgc tcaatgctgt 120

gcctacgtgt gttagcccac gcggccagcc tgaggagtca gggaaggctc ccctaggcaa 180

a 181

<210> 9

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 9

tttgtttagg ggagtttttt ttgatttttt aggttggtcg cgtgggttaa tatacgtagg 60

tatagtattg agtatattgt ttatttttgg ttcgtttata ggattgtgta aatgagtttt 120

ttgggagtaa ggttttttgt tatagtttta gagattattt aagagtttaa tgtgtagtac 180

g 181

<210> 10

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 10

cgtattatat attggatttt tgggtagttt ttagggttgt agtaaggagt tttgttttta 60

agggatttat ttatataatt ttgtgaacgg attaagagta aatagtgtgt ttaatgttgt 120

gtttacgtgt gttagtttac gcggttagtt tgaggagtta gggaaggttt ttttaggtaa 180

a 181

<210> 11

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 7在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 11

tttgtttagg ggagtttttt ttgatttttt aggttggttg tgtgggttaa tatatgtagg 60

tatagtattg agtatattgt ttatttttgg tttgtttata ggattgtgta aatgagtttt 120

ttgggagtaa ggttttttgt tatagtttta gagattattt aagagtttaa tgtgtagtat 180

g 181

<210> 12

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 处于完全去(未)甲基化状态的SEQ ID NO 8在亚硫酸氢盐处理后的序列

<400> 12

tgtattatat attggatttt tgggtagttt ttagggttgt agtaaggagt tttgttttta 60

agggatttat ttatataatt ttgtgaatgg attaagagta aatagtgtgt ttaatgttgt 120

gtttatgtgt gttagtttat gtggttagtt tgaggagtta gggaaggttt ttttaggtaa 180

a 181

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCGN基因引物F

<400> 13

gagagtaagt taagaaatac 20

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCGN基因引物R

<400> 14

ccaaacaccg acgcg 15

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA2B基因引物F

<400> 15

tgatttttta ggttggttgt 20

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA2B基因引物R

<400> 16

cctataaaca aaccaaaaat aaacaatat 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCGN基因探针P

<400> 17

gtgaaggagt tttttttaaa gttgtttag 29

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA2B基因探针P

<400> 18

gtgggttaat aatgtaggta tag 23

Claims

用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸，

其中，所述目标基因为SCGN基因和/或ITGA2B基因。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述SCGN基因靶序列如SEQ ID NO:1-6中任一项所示。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述ITGA2B基因靶序列如SEQ ID NO:7-12中任一项所示。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括：

所述目标基因靶序列中的至少9个核苷酸的片段，

所述片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因靶序列甲基化水平的核酸包括：

所述片段包含至少一个CpG二核苷酸位点。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其还包括：

7.根据权利要求4所述的组合物，其中，

8.根据权利要求5所述的组合物，其中，

所述至少15个核苷酸的片段探针，其序列如SEQ ID NO:17所示或者其序列如SEQ IDNO:18所示。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，

所述目标对象选自细胞、组织或人。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的组合物，其中，

所述制品选自药物、营养品、或保健品。