JP2022546504A - 肺新生物形成を有する疑いのある対象におけるメチル化されたｄｎａ、ｒｎａ、及びタンパク質の特性決定 - Google Patents

肺新生物形成を有する疑いのある対象におけるメチル化されたｄｎａ、ｒｎａ、及びタンパク質の特性決定 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、新生物形成の検出に関連する技術であり、特に、肺癌などの新生物の検出のための方法、組成物、及び関連する使用に関連する技術であるが、これらに限定されない。

Description

本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／８９２，４２６号に基づく優先権を主張する。
本明細書で提供されるのは、新生物形成の検出に関連する技術であり、特に、肺癌などの新生物の検出のための方法、組成物、及び関連する使用に関連する技術であるが、これらに限定されない。本発明の態様は、患者の血液からの抽出物をアッセイすることによって肺癌を検出するためのシステム及び方法に関する。特に、実施形態は、免疫細胞ＲＮＡ発現または循環セルフリーＲＮＡレベルを検出することにより、異なるステージの肺癌の進行を判定するためのシステム及び方法を含む。
肺癌は、依然として、米国におけるがんによる死亡の中で最も多く、効果的なスクリーニング手法が切実に必要とされている。肺癌だけでも年間２２１，０００人の死亡の原因となっている。治療法は存在するが、治療の有効性が損なわれる時点まで疾患が進行して初めて患者に投与されることが多い。
がん治療における主要な課題は、疾患の初期段階で患者を同定することである。これは現在の方法では困難である。なぜなら、初期の癌性細胞集団または前癌性細胞集団は無症候性であり得、生検によってアクセスするのが困難な領域に位置する場合があるためである。よって、無症候性であり得る初期ステージを含め、疾患の全てのステージを同定するために使用され得る、ロバストで低侵襲性のアッセイは、がんの治療に実質的な利益をもたらすであろう。
本明細書で開示されるシステム、デバイス、キット、組成物、及び方法は、各々、いくつかの態様を有し、それらのうちの単一のものが、それらの望ましい属性の唯一の理由となるものではない。クレームの範囲を制限することなく、いくつかの顕著な特徴をここで簡潔に説明する。より少ない、追加の、及び／または異なる構成要素、ステップ、特徴、目的、利益、及び利点を有する実施形態を含め、多数の他の実施形態も想定される。構成要素、態様、及びステップは、異なるかたちで配置され順序付けられてもよい。この説明を考慮すれば、特に「発明を実施するための形態」と題するセクションを読めば、本明細書で開示されるデバイス及び方法の特徴が、他の公知のデバイス及び方法と比べて、どのように利点をもたらすかが理解されよう。
本技術は、複数の異なるタイプのマーカー分子についてサンプル（複数可）を分析することを含む、対象由来のサンプルまたはサンプルの組み合わせの特性決定を行う方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本技術は、対象から得られたサンプルにおけるＤＮＡ中の少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定することを含む方法を提供し、対象から得られたサンプル中の少なくとも１つのＲＮＡマーカーの量を測定すること、及び対象から得られたサンプル中の少なくとも１つのタンパク質マーカーの存在または非存在についてアッセイすることのうちの１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態において、対象由来の単一のサンプルが、メチル化マーカーＤＮＡ（複数可）、マーカーＲＮＡ（複数可）、及びマーカータンパク質（複数可）について分析される。
ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはタンパク質マーカーの分析は、いずれかの特定の技術の使用に限定されない。ＤＮＡ及びＲＮＡを分析する方法は、例えば、増幅及びプローブハイブリダイゼーションを含む核酸検出アッセイを含むが、これらに限定されない。タンパク質を分析する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）検出、タンパク質免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫染色などを含むが、これらに限定されない。
一実施形態は、対象、例えば、ヒトにおける、肺癌を検出する及び／または肺癌リスクを判定する手段として、対象由来のサンプル、例えば、対象からサンプリングされた血液の特性決定を行う方法である。この方法は、ヒト由来の血液サンプルを用意すること、血液サンプル中の標的遺伝子Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）、セレクチンＬ（ＳＥＬＬ）、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤＩ４）、アポリポタンパク質Ｂ ＭＲＮＡ編集酵素触媒サブユニット３Ａ（ＡＰＯＢＥ３ＣＡ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、ホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＹＭＰ）、及び／またはスペルミジン／スペルミンＮ１－アセチルトランスフェラーゼ１（ＳＡＴ１）の標的遺伝子発現レベルを検出すること、血液サンプル中の参照遺伝子の参照遺伝子発現レベルを検出すること、ならびに、検出された標的遺伝子発現レベルを、検出された参照遺伝子発現レベルと比較して、肺新生物形成の存在または非存在を判定すること、または肺癌を有するヒトのリスクを判定することを含む。
いくつかの実施形態において、本技術は、対象からサンプリングされた血液中の１つまたは複数の遺伝子発現産物の量を測定する方法であって、
ａ）対象からサンプリングされた血液から、
ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現の産物である、少なくとも１つの遺伝子発現マーカー、ならびに、
ｉｉ）少なくとも１つの参照マーカー
を抽出することと、
ｂ）ａ）で抽出された少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量及び少なくとも１つの参照マーカーの量を測定することと、
ｃ）少なくとも１つの参照マーカーの量に対するパーセンテージとしての、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量の値を算出することであって、値は、対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を示す算出することと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、抽出することは、全血、白血球を含む血液製剤、及び血漿を含む血液製剤から選択されるサンプルからマーカーを抽出することを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、タンパク質またはＲＮＡを含み、特定の好ましい実施形態では、対象からサンプリングされた血液から抽出されるＲＮＡは、循環セルフリーＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、対象からサンプリングされた血液から抽出されるＲＮＡは、免疫細胞によって発現されたＲＮＡを含む。本明細書で上述した実施形態のいずれかにおいて、対象からサンプリングされた血液から抽出されるＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み得る。
本技術は、単一の遺伝子発現マーカーの測定に限定されず、本技術は、例えば、本明細書以下で詳細に説明するように、測定データを組み合わせて分析できるように、複数の遺伝子発現マーカーの測定を包含する。いくつかの実施形態において、本技術は、例えば、本技術を適用する際の便宜または効率のために、限定されたマーカーのセットの測定に適用される。例えば、上述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、または９つの遺伝子発現マーカーからなり得る。
上述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの参照マーカーは、ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質を含み得る。特定の好ましい実施形態において、少なくとも１つの参照マーカーは、ＲＮＡを含む。特定の実施形態において、参照マーカーは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及びＵ６ ｓｎＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む。
上述の実施形態のいずれかに適用される場合、本技術は、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を測定することが、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、質量ベースの分離、及び標的捕捉、定量的パイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）検出、ならびにタンパク質免疫沈降のうちの１つまたは複数を使用することを含む実施形態を包含する。特定の実施形態において、測定は、マルチプレックス増幅を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡも分析される。本明細書で提供されるのは、正常な肺組織及び良性結節では陰性のままでありながら、全てのタイプの肺癌のきわめて高度な識別を達成する、組織または血漿でアッセイされるメチル化マーカーの集合である。この集合から選択されるマーカーは、単独で、またはパネルにおいて、例えば、血液または体液の特性決定を行うために使用することができ、肺癌スクリーニング及び良性結節からの悪性結節の識別に適用される。いくつかの実施形態において、パネルにおけるマーカーは、ある形態の肺癌を別の形態の肺癌から区別するために、例えば、肺腺癌もしくは大細胞癌の存在を肺小細胞癌の存在から区別するために、または病理混合型癌を検出するために使用される。本明細書で提供されるのは、対象から採取されたサンプルから検出されたときに高いシグナル対ノイズ比及び低いバックグラウンドレベルをもたらすマーカーをスクリーニングするための技術である。
ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から選択されるアノテーションを有するメチル化マーカー及び／またはマーカーのパネル（例えば、染色体領域（複数可））が、肺癌サンプルにおけるメチル化マーカーのメチル化状態を、正常な（非癌性の）サンプルにおける対応するマーカーと比較することにより、複数の研究で同定された。
本明細書に記載されるように、本技術は、肺癌を高度に識別し、いくつかの実施形態では肺癌のタイプを識別する、いくつかのメチル化マーカー及びそれらのサブセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のマーカーのセット）を提供する。
したがって、対象からサンプリングされた血液中の１つまたは複数の遺伝子発現産物の量を測定する上述の実施形態のいずれかの技術は、
ｄ）対象からサンプリングされた血液から、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡ及び少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡを抽出することと、
ｅ）少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することであって、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む測定することと、
ｆ）少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡの量を測定することと、
ｇ）参照マーカーＤＮＡの量に対するパーセンテージとしての、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量の値を算出することであって、値は、対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す算出することと
をさらに含み得る。
本技術は、あるメチル化マーカーＤＮＡの測定に限定されず、本技術は、例えば、本明細書以下で詳細に説明するように、異なるメチル化マーカーＤＮＡの測定データを互いと組み合わせて、及び／またはＲＮＡ及び／またはタンパク質遺伝子発現マーカーの測定データと組み合わせて分析できるように、複数のメチル化マーカーＤＮＡの測定を包含する。いくつかの実施形態において、本技術は、例えば、本技術を適用する際の便宜または効率のために、限定されたメチル化マーカーＤＮＡのセットの測定に適用される。例えば、上述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のメチル化マーカーＤＮＡからなり得る。特定の実施形態において、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＢＡＲＸ１、ＦＬＪ４５９８３、ＨＯＰＸ、ＺＮＦ７８１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む。上述のうち任意の特定の実施形態において、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、ＦＰＲ１、ＰＡＤＩ４、及びＳＥＬＬから選択されるマーカー遺伝子の発現の産物を含む。
特定の実施形態において、対象からサンプリングされた血液から抽出されるＤＮＡは、循環セルフリーＤＮＡを含む。他の実施形態では、ＤＮＡは細胞ＤＮＡを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量の値を算出するために使用される少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡは、好ましくは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択され得る。
上述のメチル化マーカーＤＮＡを測定するための実施形態のいずれかには、ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式でＤＮＡを選択的に修飾する試薬でメチル化マーカーＤＮＡが処理される実施形態が含まれる。いくつかの実施形態において、試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素を含み、特定の好ましい実施形態では、バイサルファイト試薬は、重亜硫酸アンモニウムを含む。
メチル化マーカーＤＮＡの量を測定するいずれかの特定の方法に本技術を限定するものではないが、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することは、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉のうちの１つまたは複数を使用することを含み、特定の好ましい実施形態では、測定は、マルチプレックス増幅を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及びバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つまたは複数の方法を使用することを含む。
本技術の実施形態は、対象からサンプリングされた血液の特性決定を行う方法であって、
ｉ）対象からサンプリングされた血液を処理して抽出ＤＮＡ及び抽出ＲＮＡを生成することと、
ｉｉ）抽出ＲＮＡ中の２つ以上のマーカーＲＮＡの量を測定することであって、マーカーＲＮＡは、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１ ＲＮＡから選択される測定することと、
ｉｉｉ）抽出ＲＮＡ中の少なくとも１つの参照ＲＮＡの量を測定することであって、参照ＲＮＡは、ＣＡＳＣ３Ａ、ＳＫＰ１、及びＳＴＫ４から選択される測定することと、
ｉｖ）少なくとも１つの参照ＲＮＡの量に対するパーセンテージとしての、２つ以上のマーカーＲＮＡの各々の量の値を算出することであって、各マーカーＲＮＡの値は、対象からサンプリングされた血液中のマーカーＲＮＡの量を示す算出することと、
ｖ）抽出ＤＮＡをバイサルファイト試薬で処理して、バイサルファイト処理済みＤＮＡを生成することと、
ｖｉ）バイサルファイト処理済みＤＮＡ中の２つ以上のメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することであって、メチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９遺伝子から選択される測定することと、
ｖｉｉ）バイサルファイト処理済みＤＮＡ中の少なくとも１つの参照ＤＮＡの量を測定することであって、少なくとも１つの参照ＤＮＡは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される測定することと、
ｖｉｉｉ）バイサルファイト処理済みＤＮＡ中で測定された参照ＤＮＡの量に対するパーセンテージとしての、２つ以上のメチル化マーカーＤＮＡの各々の量の値を算出することであって、各メチル化マーカーＤＮＡの値は、対象からサンプリングされた血液中のメチル化マーカーＤＮＡの量を示す算出することと
を含む方法を提供する。
本明細書で上述したＤＮＡ及びＲＮＡの分析を含む実施形態は、単一の採血チューブまたは採血バッグを含むがこれらに限定されない単一の採血デバイスに採取された血液からＤＮＡ及びＲＮＡが単離される実施形態を包含する。
本明細書で上述した実施形態のいずれも、対象が肺新生物を有するか、もしくは有する疑いがある実施形態、及び／または、本技術が、上述の測定方法を使用して算出された値に基づいて対象における肺癌のリスクを評価することを含む実施形態を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量及び／または少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量は、対象の肺癌リスクを示す。
いくつかの実施形態において、マーカーのメチル化状態をアッセイするための設計は、アッセイ技術によって精査されるマーカーの標的領域における個々のＣｐＧ遺伝子座でのバックグラウンドメチル化を分析することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、疾患、例えばがんと診断された対象から単離されたサンプルにおける、マーカーＤＮＡの多数の個々のコピー（例えば、１０，０００超、好ましくは１００，０００超の個々のコピー）を検査して、メチル化の頻度を判定し、これらのデータを、疾患のない対象から単離されたサンプルにおけるマーカーＤＮＡの同様に多数の個々のコピーと比較する。より高いシグナル対ノイズ、例えば、高い検出可能メチル化及び／または低減したバックグラウンドメチル化を有するＣｐＧ遺伝子座が、アッセイ設計における使用のために選択され得るように、サンプルにおけるマーカーＤＮＡ中の個々のＣｐＧ遺伝子座における疾患関連メチル化及びバックグラウンドメチル化の頻度を比較することができる。例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，６３７，７９２号及び同第１０，５１９，５１０号を参照のこと。いくつかの実施形態では、アッセイ結果に基づいてマーカーを「メチル化」または「非メチル化」と分類するには、ＣｐＧ遺伝子座の全てが事前に判定されたメチル化ステータスを有する必要がある（例えば、全てがメチル化されている必要がある、またはメチル化されているものがあり得ない）ように、シグナル対ノイズの高いＣｐＧ遺伝子座の一群（例えば、マーカー領域内の２、３、４、５、またはそれ以上の個々のＣｐＧ遺伝子座）が、アッセイにより同時に精査される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの遺伝子発現マーカー及び／または少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量または存在もしくは非存在を測定することから選択される、アッセイのための試薬または材料を備えるキットが提供される。少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、ＲＮＡマーカーまたはタンパク質マーカーであり得る。
例えば、特定のキットの実施形態は、
ａ）対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を測定するための試薬セットであって、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現から生成される試薬セット、
ｂ）対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定するための試薬セット
を提供する。
いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つの遺伝子発現マーカー及び少なくとも１つの参照マーカーを血液から抽出するための試薬セットをさらに備える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、ＲＮＡ及びタンパク質のうちの１つまたは複数を含み、少なくとも１つの参照マーカーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態において、キットは、
ｉ）少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択される遺伝子発現マーカーに関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、参照マーカーに特異的にハイブリダイズし、参照マーカーは参照核酸である少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド
を備える。
上述のキットの実施形態において、遺伝子発現マーカーに関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または増幅ＤＮＡから選択される。特定の実施形態において、参照核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含み、いくつかの実施形態では、参照遺伝子発現マーカーは、好ましくは、ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質を含む。
上述の実施形態のいずれかにおいて、本技術のキットは、
ｃ）対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定するための試薬セットであって、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む試薬セット
をさらに備え得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定するための試薬セットは、
ｉ）少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のメチル化メーカー遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチド
を含む。
上述のキットの実施形態は、少なくとも１つの第４のオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、少なくとも１つの第４のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、参照マーカーＤＮＡ、好ましくは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される参照マーカーＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、メチル化メーカー遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖及び参照マーカーＤＮＡのうちの少なくとも１つは、バイサルファイト処理済みＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、上述したキットは、ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式でＤＮＡを選択的に修飾する試薬をさらに備える。特定の実施形態において、ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式でＤＮＡを選択的に修飾する試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素を含む。特定の好ましい実施形態において、バイサルファイト試薬は、重亜硫酸アンモニウムを含む。
上記で提供されるキットの実施形態は、少なくとも１つの第１、第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、捕捉オリゴヌクレオチド、核酸プライマーペア、核酸プローブ、及び侵襲性オリゴヌクレオチドから選択されるキットをさらに包含し、特定の実施形態において、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、共有結合または非共有結合（例えば、ビオチン－ストレプトアビジン結合または抗原－抗体結合）によって、固体支持体に結合している。好ましい実施形態では、固体支持体は磁気ビーズである。
本明細書で上述した技術のキットのいずれかの実施形態は、
ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現の遺伝子発現マーカー産物から第１の増幅ＤＮＡを生成するための第１のプライマーペアと、
ｉｉ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第１のプローブと、
ｉｉｉ）第２の増幅ＤＮＡを生成するための第２のプライマーペアと、
ｉｖ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第２のプローブと、
ｖ）逆転写酵素と、
ｖｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
を備えるキットを含む。
いくつかの実施形態において、第２の増幅ＤＮＡは、メチル化マーカー遺伝子または参照マーカー核酸から生成される。
特定の実施形態において、第１のプローブは、前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含み、いくつかの実施形態において、第２のプローブは、前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第２のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む。本技術のキットは、
ｖｉｉ）前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット、
ｖｉｉｉ）前記第２のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット
のうちの１つまたは複数をさらに備え得る。
本明細書で上述したキットのいずれも、フラップエンドヌクレアーゼをさらに備え得る。特定の好ましい実施形態において、フラップエンドヌクレアーゼは、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ、例えば、古細菌生物由来の耐熱性ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼである。
本技術の適用は、さらに組成物を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本技術は、
ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択される遺伝子の発現の遺伝子発現マーカー産物から、第１の増幅ＤＮＡを生成するための第１のプライマーペアと、
ｉｉ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第１のプローブと、
ｉｉｉ）第２の増幅ＤＮＡを生成するための第２のプライマーペアと、
ｉｖ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第２のプローブと、
ｖ）逆転写酵素と、
ｖｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、組成物は、対象からサンプリングされた血液から抽出された核酸をさらに含み、対象は、好ましくは、肺新生物を有するか、もしくは有する疑いがあるか、または肺癌を有するリスクがある。組成物のいくつかの実施形態において、核酸は、
－ 細胞ＲＮＡ、
－ 循環セルフリーＲＮＡ、
－ 細胞ＤＮＡ、
－ 循環セルフリーＤＮＡ
のうちの１つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態において、第２のプライマーペアは、メチル化マーカー遺伝子または参照マーカー核酸から、第２の増幅ＤＮＡを生成する。特定の好ましい実施形態において、第２のプライマーペアは、
－ ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されたＲＮＡ、
－ Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及びＵ６ ｓｎＲＮＡから選択されるＲＮＡ、
－ Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択されるＤＮＡ
から選択される参照核酸から、第２の増幅ＤＮＡを生成する。
特定の実施形態において、第２のプライマーペアは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から選択されるメチル化マーカー遺伝子から、第２の増幅ＤＮＡを生成するように選択される。
当業者には、上記の組成物が、２つのプライマーペアに限定されず、複数の異なる遺伝子発現マーカーから増幅ＤＮＡを生成するためのいくつかの異なるプライマーペア、及び／または、複数の異なるメチル化マーカー遺伝子から増幅ＤＮＡを生成するためのいくつかの異なるプライマーペアを含む組成物を包含することが認識されよう。組成物は、複数の異なる参照マーカー核酸から増幅ＤＮＡを生成するためのいくつかの異なるプライマーペアをさらに含み得る。
上述の組成物において、第１のプローブ及び／または第２のプローブは、フルオロフォアを含む検出部分を含む。特定の実施形態において、本技術のプローブは、プローブがインタクトであるとき、例えば、５’ヌクレアーゼによって切断されていないとき、フルオロフォアからの発光がクエンチされるように、フルオロフォア及びクエンチ部分で標識され得る。
いくつかの実施形態において、第１のプローブは、前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む、及び／または、第２のプローブは、前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第２のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む。特定の実施形態において、組成物は、
ｖｉｉ）第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット、
ｖｉｉｉ）第２のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット
のうちの１つまたは複数をさらに含む。
上述の組成物のいずれも、フラップエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ、例えば、古細菌生物由来の耐熱性ＦＥＮ－１をさらに含み得る。
特定の実施形態において、上述の組成物は、Ｍｇ＋＋、例えば、ＭｇＣｌ２を含むバッファーを含む。好ましくは、組成物は、標準的なＰＣＲバッファーと比較して比較的高いＭｇ＋＋及び低いＫＣｌ（例えば、６～１０ｍＭ、好ましくは７．５ｍＭのＭｇ＋＋、及び０．０～０．８ｍＭのＫＣｌ）を有するＰＣＲ－フラップアッセイバッファーを含む。
本技術の実施形態は、本明細書で上述した組成物のうちのいずれか１つを含む反応混合物をさらに含む。
いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも２つのアッセイのための試薬または材料を備え、アッセイは、１）少なくとも１つのメチル化ＤＮＡマーカー；２）少なくとも１つのＲＮＡマーカー；及び／または３）少なくとも１つのタンパク質マーカーの量または存在もしくは非存在を測定することから選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つのメチル化ＤＮＡマーカーは、ＢＡＲＸ１、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＺＮＦ６７１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＨＯＸＡ９、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ７８１、ＰＴＧＤＲ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＥＭＸ１、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２ａ、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、ＺＤＨＨＣ１、ＺＮＦ３２９、ＩＦＦＯ１、及びＨＯＰＸからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、少なくともＲＮＡ発現マーカーは、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１からなる群から選択される遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタンパク質は、抗原、例えば、がん関連抗原を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタンパク質は、抗体、例えば、がん関連抗原に対する自己抗体を含む。
いくつかの実施形態において、前記混合物中のオリゴヌクレオチドは、レポーター分子を含み、好ましい実施形態において、レポーター分子は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、フラップ配列を含む。いくつかの実施形態において、混合物は、ＦＲＥＴカセット、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ、及び／または耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは細菌ＤＮＡポリメラーゼのうちの１つまたは複数をさらに含む。
［定義］
本発明の技術の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句を下記に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の随所に記述されている。
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、以下の用語は、文脈上特に明記されていない限り、本明細書に明示的に関連付けられる意味を取る。本明細書で使用される「一実施形態において」という語句は、必ずしも同一の実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態では」という語句は、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。よって、後述するように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。
さらに、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、文脈上特に明記されていない限り、包括的な「または（ｏｒ）」の操作詞であり、「及び／または」という用語と均等である。「に基づく」という用語は、文脈上特に明記されていない限り、排他的ではなく、記載されていない追加の要素に基づくことを許容する。さらに、本明細書全体を通して、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の指示対象を含む。「中の（ｉｎ）」の意味は、「中の（ｉｎ）」及び「上の（ｏｎ）」を含む。
本出願の特許請求の範囲で使用される「から本質的になる」という移行句は、Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ， ５３７ Ｆ．２ｄ ５４９， ５５１－５２， １９０ ＵＳＰＱ ４６１， ４６３ （ＣＣＰＡ １９７６）で説明されているように、請求項の範囲を、請求項に係る発明の特定の材料またはステップ及び「基本的かつ新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。例えば、列挙された要素「から本質的になる」組成物は、列挙されていない夾雑物が存在しても、純粋な組成物、すなわち、列挙された構成要素「からなる」組成物と比較して、列挙された組成物の機能を変化させないようなレベルで、夾雑物を含み得る。
「することができる（ｃａｎ）」、「し得る（ｃｏｕｌｄ）」、「し得る（ｍｉｇｈｔ）」、または「してもよい（ｍａｙ）」などの条件付き文言は、特に明記しない限り、または使用される文脈内で別様に理解されない限り、一般に、特定の実施形態が特定の特徴、要素、及び／またはステップを含むが、他の実施形態はこれらを含まないことを示すよう意図される。よって、そのような条件付き文言は、一般に、特徴、要素、及び／またはステップが１つまたは複数の実施形態に何らかのかたちで必要とされること、あるいは１つまたは複数の実施形態が、ユーザ入力またはプロンプトの有無にかかわらず、これらの特徴、要素、及び／またはステップが任意の特定の実施形態に含まれるかどうか、または任意の特定の実施形態で行われるかどうかを判断するための論理を必然的に含むことを意味することを意図するものではない。
「Ｘ、Ｙ、及びＺのうちの少なくとも１つ」という語句などの接続的文言は、特に明記しない限り、一般に使用される文脈で、項目、用語などがＸ、Ｙ、またはＺのいずれであってもよいことを意味するよう理解される。よって、このような接続的文言は、一般に、特定の実施形態が少なくとも１つのＸ、少なくとも１つのＹ、及び少なくとも１つのＺの存在を必要とすることを意味することを意図するものではない。
本明細書で使用される程度の文言、例えば「およそ」、「約」、「概」、及び「実質的に」などの用語は、記載された値、量、または特性に近く、依然として所望の機能を果たす、または所望の結果を達成する値、量、または特性を表す。
本明細書で使用される場合、「メチル化」とは、Ｃ５位もしくはＮ４位のシトシンのシトシンメチル化、Ｎ６位のアデニン、または他のタイプの核酸のメチル化を指す。典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ増幅法は、増幅テンプレートのメチル化パターンを保持しないため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたＤＮＡは、通常、非メチル化型である。しかしながら、「非メチル化ＤＮＡ」または「メチル化ＤＮＡ」は、それぞれ、元のテンプレートが非メチル化型であった増幅ＤＮＡ、または元のテンプレートがメチル化型であった増幅ＤＮＡを指す場合もある。
したがって、本明細書で使用される「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」とは、ヌクレオチド塩基にメチル部分が存在し、このメチル部分が認識されている典型的なヌクレオチド塩基には存在しないことを指す。例えば、シトシンは、そのピリミジン環にメチル部分を含まないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含む。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例において、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含む；しかしながら、チミンはＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるため、本明細書の目的では、チミンは、ＤＮＡに存在する場合、メチル化ヌクレオチドとはみなされない。
本明細書で使用される場合、「メチル化核酸分子」は、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、核酸分子の「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化ステータス」とは、核酸分子中の１つまたは複数のメチル化ヌクレオチド塩基の存在または非存在を指す。例えば、メチル化シトシンを含む核酸分子は、メチル化されているとみなされる（例えば、核酸分子のメチル化状態は、メチル化型である）。いかなるメチル化ヌクレオチドも含まない核酸分子は、非メチル化型とみなされる。いくつかの実施形態において、核酸は、特定の遺伝子座（例えば、特定の単一ＣｐＧジヌクレオチドの遺伝子座）または遺伝子座の特定の組み合わせにおいてメチル化されていなければ、同じ遺伝子または分子中の他の遺伝子座でメチル化されていても、「非メチル化型」と特性決定され得る。
特定の核酸配列のメチル化状態（例えば、本明細書に記載される遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）は、配列内の全塩基のメチル化状態を示す場合もあれば、または配列内の塩基のサブセット（例えば、１つまたは複数のシトシン）のメチル化状態を示す場合もあり、あるいは、配列内でメチル化が生じる位置の正確な情報を提供するか否かにかかわらず、配列内の領域のメチル化密度に関する情報を示す場合もある。本明細書で使用される場合、「マーカー遺伝子」及び「マーカー」という用語は、マーカー領域がＤＮＡのコード領域内にあるか否かにかかわらず、ある状態、例えば、がんに関連する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質（または他のサンプル成分）を指すよう同義に使用される。マーカーは、例えば、調節領域、フランキング領域、遺伝子間領域などを含み得る。同様に、サンプルの任意の成分、例えばタンパク質、ＲＮＡ、炭水化物、小分子などに関して使用される「マーカー」という用語は、サンプル中でアッセイする（例えば、測定または別様に特性決定する）ことができ、かつ対象または対象由来のサンプルの状態に関連する成分を指す。「メチル化マーカー」という用語は、遺伝子またはＤＮＡのメチル化状態が、ある状態、例えばがんに関連している、遺伝子またはＤＮＡを指す。
核酸分子中のヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子中の特定の遺伝子座におけるメチル化ヌクレオチドの存在または非存在を指す。例えば、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンであるときにメチル化型である。同様に、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（そして５－メチルシトシンではない）ときに非メチル化型である。
メチル化ステータスは、場合により、「メチル化値」（例えば、メチル化頻度、割合、比、パーセントなどを表す）によって表される、または示されることがある。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素による制限消化の後に存在するインタクトな核酸の量を数量化することによって、またはバイサルファイト反応後の増幅プロファイルを比較することによって、またはバイサルファイト処理済み核酸の配列と未処理の核酸の配列とを比較することによって、生成することができる。したがって、値、例えばメチル化値は、メチル化ステータスを表し、したがって、遺伝子座の複数コピーにわたるメチル化ステータスの定量的指標として使用され得る。これは、サンプル中の配列のメチル化ステータスを閾値または基準値と比較することが望ましいときに特に有用である。
本明細書で使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない場合の数と比した、分子または遺伝子座がメチル化されている場合の数を指す。
したがって、メチル化状態は、核酸（例えばゲノム配列）のメチル化の状態を表す。さらに、メチル化状態は、特定のゲノム遺伝子座における核酸セグメントのメチル化に関連する特性を指す。このような特性は、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化Ｃ残基（複数可）の位置、核酸のいずれかの特定の領域全体におけるメチル化Ｃの頻度またはパーセンテージ、及び、例えばアレルの起源における差異に起因する、メチル化におけるアレルの差異を含むが、これらに限定されない。「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化ステータス」という用語は、生物学的サンプル中の核酸のいずれかの特定の領域全体における、メチル化Ｃまたは非メチル化Ｃの相対濃度、絶対濃度、またはパターンも指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合、「高メチル化型」または「メチル化が増加している」ということがある一方、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合、「低メチル化型」または「メチル化が減少している」ということがある。同様に、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域由来または異なる個体由来など）と比較してメチル化されている場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して高メチル化型である、またはメチル化が増加しているとみなされる。代替的に、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域由来または異なる個体由来など）と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して低メチル化型である、またはメチル化が減少しているとみなされる。さらに、本明細書で使用される場合、「メチル化パターン」という用語は、核酸の領域にわたるメチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの集合部位を指す。２つの核酸は、メチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの数が領域全体で同じまたは同様であるが、メチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合、同じまたは同様のメチル化頻度またはメチル化パーセントを有するが、異なるメチル化パターンを有し得る。配列は、メチル化の程度が異なる（例えば、一方のメチル化が他方と比して増加または減少している）、頻度が異なる、またはパターンが異なる場合、「可変メチル化」、または「メチル化における差異」を有する、または「異なるメチル化状態」を有するといわれる。「可変メチル化」という用語は、がん陰性サンプル中の核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した、がん陽性サンプル中の核酸メチル化のレベルまたはパターンにおける差異を指す。手術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンにおける差異を指す場合もある。可変メチル化、及びＤＮＡメチル化の特異的なレベルまたはパターンは、例えば、正確なカットオフまたは予測特性を定義すれば、予後バイオマーカー及び予測バイオマーカーとなる。
メチル化状態の頻度は、個体集団または単一個体由来のサンプルを表すために使用することができる。例えば、５０％のメチル化状態の頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、事例の５０％においてメチル化されており、事例の５０％においてメチル化されていない。このような頻度を使用して、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が個体集団または核酸の集合においてメチル化されている程度を表すことができる。よって、核酸分子の第１の集団またはプールにおけるメチル化が、核酸分子の第２の集団またはプールにおけるメチル化と異なる場合、第１の集団またはプールのメチル化状態の頻度は、第２の集団またはプールのメチル化状態の頻度と異なる。このような頻度は、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が単一の個体においてメチル化されている程度を表すために使用することもできる。例えば、このような頻度を使用して、組織サンプル中の細胞群が、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域においてメチル化型または非メチル化型である程度を表すことができる。
本明細書で使用される「ヌクレオチド遺伝子座」とは、核酸分子中のヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座とは、核酸分子中のメチル化ヌクレオチドの位置を指す。
典型的に、ヒトＤＮＡのメチル化は、シトシンがグアニンの５’に位置している隣接するグアニン及びシトシンを含むジヌクレオチド配列（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも称される）において生じる。ヒトゲノムにおいて、ＣｐＧジヌクレオチド内のほとんどのシトシンはメチル化されているが、ＣｐＧアイランドとして知られる、特定のＣｐＧジヌクレオチドリッチなゲノム領域内では、いくつかはメチル化されていないままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｃｅｌｌ ６２： ５０３－５１４を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧアイランド」は、全ゲノムＤＮＡと比較して増加した数のＣｐＧジヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、少なくとも１００、２００、またはそれ以上の塩基対の長さであり得、ここで、領域のＧ：Ｃ含有量は少なくとも５０％であり、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度の比は０．６である；いくつかの事例において、ＣｐＧアイランドは、少なくとも５００塩基対の長さであり得、ここで、領域のＧ：Ｃ含有量は少なくとも５５％であり、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度の比は０．６５である。予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ２６１－２８１に提示される方法に従って算出することができる。例えば、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って算出することができ、式中、Ｒは、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度の比であり、Ａは、分析される配列内のＣｐＧジヌクレオチドの数であり、Ｂは、分析される配列内のヌクレオチドの総数であり、Ｃは、分析される配列内のＣヌクレオチドの総数であり、Ｄは、分析される配列内のＧヌクレオチドの総数である。メチル化状態は、典型的には、ＣｐＧアイランド中で、例えばプロモーター領域において判定される。しかし、ヒトゲノムにおける他の配列がＣｐＡ及びＣｐＴなどのＤＮＡメチル化を起こしやすいことは理解されよう（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ５２３７－５２４２、Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ （１９７０） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２０４： ３４０－３５１、Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ （１９８５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ２８２７－２８４２、Ｎｙｃｅ （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ４３５３－４３６７、Ｗｏｏｄｃｏｃｋ （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４５： ８８８－８９４を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「メチル化特異的試薬」とは、核酸分子のメチル化状態に応じて核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬を指し、すなわち、メチル化特異的試薬は、核酸分子のメチル化状態を反映する様式で核酸分子のヌクレオチド配列を変化させ得る化合物もしくは組成物または他の薬剤を指す。このような試薬で核酸分子を処理する方法は、核酸分子を試薬と接触させ、必要により追加のステップと併せて、ヌクレオチド配列の所望の変化を達成することを含み得る。このような方法は、非メチル化ヌクレオチド（例えば、各非メチル化シトシン）が異なるヌクレオチドへと修飾されるような様式で適用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、このような試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化して、デオキシウラシル残基を生成することができる。例示的な試薬はバイサルファイト試薬である。
「バイサルファイト試薬」という用語は、本明細書で開示されるように、メチル化型及び非メチル化型のＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するために有用な、バイサルファイト、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む試薬を指す。前記処理の方法は、当技術分野（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５及びＷＯ２０１３／１１６３７５）において知られている。いくつかの実施形態において、バイサルファイト処理は、ｎ－アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などであるがこれらに限定されない変性溶媒の存在下で、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、変性溶媒は、１％～３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、バイサルファイト反応は、クロマン誘導体、例えば、６－ヒドロキシ－２，５，７，８，－テトラメチルクロマン２－カルボン酸、またはトリヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、例えば、没食子酸（参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照のこと）などであるがこれらに限定されない、スカベンジャーの存在下で実施される。特定の好ましい実施形態において、バイサルファイト反応は、例えばＷＯ２０１３／１１６３７５に記載されているように、亜硫酸水素アンモニウムでの処理を含む。
メチル化特異的試薬による核酸ヌクレオチド配列の変化は、各メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドへと修飾された核酸分子をもたらすこともある。
「メチル化アッセイ」という用語は、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を判定するための任意のアッセイを指す。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー（または一緒に使用されるマーカーのセット）の「感度」は、新生物性サンプルと非新生物性サンプルとを区別する閾値を上回るＤＮＡメチル化値を報告するサンプルのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態において、陽性は、閾値（例えば、疾患と関連する範囲）を上回るＤＮＡメチル化値を報告する、組織学的に確認された新生物形成と定義され、偽陰性は、閾値（例えば、疾患なしと関連する範囲）を下回るＤＮＡメチル化値を報告する、組織学的に確認された新生物形成と定義される。したがって、感度の値は、既知の疾患サンプルから得られた所与のマーカーについてのＤＮＡメチル化測定値が疾患関連測定値の範囲内にある確率を反映する。ここで定義されるように、算出された感度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有する対象に適用されたときにその状態の存在を検出する確率の推定を表す。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー（または一緒に使用されるマーカーのセット）の「特異性」は、新生物性サンプルと非新生物性サンプルとを区別する閾値を下回るＤＮＡメチル化値を報告する非新生物性サンプルのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態において、陰性は、閾値（例えば、疾患なしと関連する範囲）を下回るＤＮＡメチル化値を報告する、組織学的に確認された非新生物性サンプルと定義され、偽陰性は、閾値（例えば、疾患と関連する範囲）を上回るＤＮＡメチル化値を報告する、組織学的に確認された非新生物性サンプルと定義される。したがって、特異性の値は、既知の非新生物性サンプルから得られた所与のマーカーについてのＤＮＡメチル化測定値が非疾患関連測定値の範囲内にある確率を反映する。ここで定義されるように、算出された特異性値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有しない患者に適用されたときにその状態の非存在を検出する確率の推定を表す。
本明細書で使用される場合、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子に典型的に存在する４つのヌクレオチド（ＤＮＡの場合はＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡ、ＲＮＡの場合はＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１つのヌクレオチドを指し、典型的に存在するヌクレオチドのメチル化誘導体を含み得る（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、選択されたヌクレオチドの意味には、メチル化型と非メチル化型の両方のＣが含まれる）が、メチル化型の選択されたヌクレオチドとは、典型的にメチル化されているヌクレオチドを具体的に指し、非メチル化型の選択されたヌクレオチドとは、典型的に非メチル化型形態で存在するヌクレオチドを具体的に指す。
「メチル化特異的制限酵素」という用語は、その認識部位のメチル化状態に依存して核酸を選択的に消化する制限酵素を指す。認識部位がメチル化されていない場合またはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素（メチル化感受性酵素）の場合、認識部位が一方または両方の鎖でメチル化されていれば、切断は生じない（または著しく低減した効率で生じる）。認識部位がメチル化されている場合にのみ特異的に切断する制限酵素（メチル化依存性酵素）の場合、認識部位がメチル化されていなければ、切断は生じない（または著しく低減した効率で生じる）。好ましいのは、認識配列がＣＧジヌクレオチドを含む（例えば、認識配列がＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧなどの）メチル化特異的制限酵素である。いくつかの実施形態でさらに好ましいのは、このジヌクレオチド中のシトシンが炭素原子Ｃ５においてメチル化されている場合に切断しない制限酵素である。
「プライマー」という用語は、例えば、制限消化物から核酸断片として天然に発生するか、または合成的に生成されるかにかかわらず、核酸テンプレート鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに好適な温度及びｐＨ）におかれたとき、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、最大の増幅効率のために一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーはまず、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離させるよう処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。一般に、プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さである。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー供給源、及び方法の使用を含む、多くの要因に依存する。
「プローブ」という用語は、精製された制限消化物におけるように天然に発生するか、または合成的に、組換えで、もしくはＰＣＲ増幅によって生成されるかにかかわらず、別の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離において有用である（例えば、「捕捉プローブ」）。本発明で使用される任意のプローブは、いくつかの実施形態において、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光性、放射性、及び発光性のシステムを含むがこれらに限定されない、任意の検出システムにおいて検出可能であるように、任意の「レポーター分子」で標識されてもよいことが想定される。本発明がいずれかの特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
本明細書で使用される「標的」という用語は、例えば、プローブ結合、増幅、単離、捕捉などによって、他の核酸から選別されることが求められる核酸を指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーが結合する核酸の領域を指し、一方、標的ＤＮＡが増幅されないアッセイで使用される場合、例えば、侵襲的切断アッセイのいくつかの実施形態において、標的は、プローブ及び侵襲性オリゴヌクレオチド（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）が結合して侵襲的切断構造を形成する部位を含み、その結果、標的核酸の存在を検出することができる。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。二本鎖核酸に関して使用される場合、「標的」という用語は、二重鎖標的の特定の鎖、例えば、コード鎖に限定されず、例えば、二本鎖遺伝子または参照ＤＮＡの一方または両方の鎖に関して使用され得る。
本明細書で使用される場合、血液由来の核酸に関して使用される「セルフリー」及び「循環セルフリー」という用語は、同義に使用され、血液中に見出されるが血液中の細胞内にはない核酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ種を指す。血液から抽出された核酸に関して本明細書で使用されるこれらの用語は、対象からサンプルを採取する前、及び血液サンプルから核酸を抽出する前の、核酸の性質及び位置を指す。
「マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、マーカー物質の存在、非存在、または状態（例えば、メチル化状態）に基づいて、非正常細胞（例えば、がん細胞）を正常細胞（非癌性細胞）から区別するために使用され得る物質（例えば、核酸、もしくは核酸の領域、またはタンパク質）を指す。本明細書で使用される場合、マーカーの「正常な」メチル化とは、正常細胞、例えば、非癌性細胞に典型的に見られるメチル化の程度を指す。
本明細書で使用される「新生物」という用語は、組織のあらゆる新しく異常な増殖を指し、がんを含むがこれに限定されない。よって、新生物は前悪性新生物または悪性新生物であり得る。
「新生物特異的マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、新生物の存在を示すために使用され得る任意の生物学的な材料または要素を指す。生物学的材料の例は、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜及びミトコンドリア）、及び全細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの事例において、マーカーは、特定の核酸領域（例えば、遺伝子、遺伝子内領域、特定の遺伝子座など）である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」、「マーカー遺伝子座」などと呼ばれることがある。
「サンプル」という用語は、その最も広い意味で使用される。ある意味では、動物の細胞または組織または体液を指す場合がある。別の意味では、生物学的サンプル及び環境的サンプルだけでなく、任意の供給源から得られた標本または培養物を指す。生物学的サンプルは、植物または動物（ヒトを含む）から得ることができ、例えば、液体、固体、組織、及び気体を包含する。環境的サンプルは、表面物質、土壌、水、及び工業用サンプルなどの環境物質を含む。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルのタイプを限定するものと解釈されてはならない。サンプルに関して本明細書で使用される場合、供給源または対象から、例えば患者から採取された「サンプル」という用語は、単一の物理的検体に限定されず、複数の部分で採取されたサンプルも包含し、例えば、血液の「サンプル」は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる採血チューブもしくは他の採血デバイス（例えばバッグ）、または異なる採血デバイスの組み合わせで採取されてもよい。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、本技術によって提供される様々な検査の対象となる生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物を含む。好ましい実施形態において、対象は霊長動物である。さらにより好ましい実施形態において、対象はヒトである。さらに診断方法に関しては、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血性であり、好ましい温血性脊椎動物は哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトと動物の両方の対象を含む。よって、獣医学的治療用途が本明細書で提供される。したがって、本発明の技術は、ヒトなどの哺乳動物、ならびに絶滅の危機に瀕しているために重要なシベリアトラなどの哺乳動物、ヒトによる消費のために農場で飼養される動物などの経済的に重要な動物、及び／またはペットとしてもしくは動物園で飼育される動物といった、ヒトにとって社会的に重要な動物の診断のために提供される。このような動物の例は、ネコ及びイヌなどの肉食動物、ブタ、雄ブタ、及びイノシシを含むブタ類、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなどの反芻動物及び／または有蹄類動物、ひれ足動物、ならびにウマを含むが、これらに限定されない。よって、家畜化されたブタ類、反芻動物、有蹄類動物、ウマ（競走馬を含む）などを含むがこれらに限定されない家畜の診断及び治療も提供される。本明細書において開示される主題は、対象の肺癌を診断するためのシステムをさらに含む。このシステムは、例えば、生物学的サンプルの採取元である対象における肺癌リスクのスクリーニングまたは肺癌の診断のために使用され得る市販のキットとして提供され得る。本発明の技術に従って提供される例示的なシステムは、本明細書に記載されるマーカーのメチル化状態を評価することを含む。
核酸の文脈における「増幅する」または「増幅」という用語は、典型的には少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から始まり、増幅産物またはアンプリコンが一般に検出可能である、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分の複数コピーの生成を指す。ポリヌクレオチドの増幅は、多様な化学的及び酵素的なプロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，４９４，８１０号を参照のこと）における、標的またはテンプレートＤＮＡ分子の１コピーまたは数コピーからの、複数のＤＮＡコピーの生成は、増幅の形態である。さらなるタイプの増幅は、アレル特異的ＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６３９，６１１号を参照のこと）、アセンブリＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９６５，４０８号を参照のこと）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６６２，５９４号を参照のこと）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，３３８，６７１号を参照のこと）、配列間特異的ＰＣＲ、インバースＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｔｒｉｇｌｉａ， ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６：８１８６を参照のこと）、ライゲーション媒介性ＰＣＲ（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５：１８５４－１８５８ （１９９７）、米国特許第５，５０８，１６９号を参照のこと）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） ＰＮＡＳ ９３（１３） ９８２１－９８２６を参照のこと）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１２）： ｅ５７を参照のこと）、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（２３） １１１４１－１１１５６、Ｂａｌｌａｂｉｏ， ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８４（６） ５７１－５７３、Ｈａｙｄｅｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００８） ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：８０を参照のこと）、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｈｉｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（１５） ７３５１－７３６７を参照のこと）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｈｉｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３－４１７、Ｈｉｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６－１０３０を参照のこと）、逆転写ＰＣＲ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｂｕｓｔｉｎ， Ｓ．Ａ． （２０００） Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２５：１６９－１９３を参照のこと）、固相ＰＣＲ、ＴＡＩＬ（ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）ＰＣＲ、及びタッチダウンＰＣＲ（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｄｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９１） １９（１４） ４００８、Ｒｏｕｘ， Ｋ． （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（５） ８１２－８１４、Ｈｅｃｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０（３） ４７８－４８５を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの増幅は、デジタルＰＣＲを使用して達成することもできる（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５；１９９９－２００４， （１９９７）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９６；９２３６－４１， （１９９９）、国際特許公開第ＷＯ０５０２３０９１号Ａ２、米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照のこと；これらは各々、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニングまたは精製なしで、ゲノムまたは他のＤＮＡもしくはＲＮＡの混合物における標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を記載している、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号の方法を指す。標的配列を増幅するこのプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入した後に、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でサーマルサイクリングを正確な順番で行うことからなる。２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすには、混合物を変性し、次いでプライマーを標的分子内の相補配列にアニーリングする。アニーリング後、プライマーをポリメラーゼで伸長させて、新しい相補鎖ペアを形成させる。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長のステップは、所望の標的配列の増幅されたセグメントを高濃度で得るために、何度も繰り返すことができる（例えば、変性、アニーリング及び伸長が１「サイクル」を構成する；多数の「サイクル」を用いてよい）。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対位置によって判定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスの繰り返しの態様のために、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅されたセグメントが混合物中の（濃度に関して）主要な配列になるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われ、「ＰＣＲ産物」または「アンプリコン」である。当業者には、「ＰＣＲ」という用語が、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、単一プライマーＰＣＲ及びＡＰ－ＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）などを使用する、最初に記載された方法の多くの変形を包含することが理解されよう。
本明細書で使用される場合、「核酸検出アッセイ」という用語は、目的の核酸のヌクレオチド組成を判定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイは、ＤＮＡシーケンシング方法、プローブハイブリダイゼーション方法、構造特異的切断アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）であり、例えば、各々があらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，０９０，５４３号、及び同第６，８７２，８１６号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １７：２９２ （１９９９）、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ９７：８２７２ （２０００）、ならびに米国特許第９，０９６，８９３号に記載されている）、酵素ミスマッチ切断方法（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、同第５，９５８，６９２号、同第５，８５１，７７０号）、上述のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分岐ハイブリダイゼーション方法（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，７１０，２６４号、同第５，１２４，２４６号、及び同第５，６２４，８０２号）、ローリングサークル複製（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号、及び同第６，２３５，５０２号）、ＮＡＳＢＡ（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４０９，８１８号）、分子ビーコン技術（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１５０，０９７号）、Ｅ－ｓｅｎｓｏｒ技術（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、同第６，２２１，５８３号、同第６，０１３，１７０号、及び同第６，０６３，５７３号）、サイクリングプローブ技術（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４０３，７１１号、同第５，０１１，７６９号、及び同第５，６６０，９８８号）、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅方法（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２１，００１号、同第６，１１０，６７７号、同第５，９１４，２３０号、同第５，８８２，８６７号、及び同第５，７９２，６１４号）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎａｙ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８， １８９－９３ （１９９１））、及びサンドイッチハイブリダイゼーション方法（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８８，６０９号）を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、標的核酸が増幅され（例えばＰＣＲにより）、増幅された核酸が、侵襲的切断アッセイを使用して同時に検出される。増幅アッセイと組み合わせた検出アッセイ（例えば、侵襲的切断アッセイ）を行うよう構成されたアッセイが、あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第９，０９６，８９３号に記載されている。ＱｕＡＲＴＳ法と呼ばれる、増幅と侵襲的切断を合わせたさらなる検出構成が、例えば、米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、同第９，２１２，３９２号、及び米国特許出願第１５／８４１，００６号に記載されており、これらは各々、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される「侵襲的切断構造」という用語は、ｉ）標的核酸、ｉｉ）上流核酸（例えば、侵襲的または「ＩＮＶＡＤＥＲ」オリゴヌクレオチド）、及びｉｉｉ）下流核酸（例えば、プローブ）を備える切断構造を指し、上流及び下流核酸は、標的核酸の連続領域にアニーリングし、上流核酸の３’部分と、下流核酸と標的核酸との間に生じた二重鎖との間に、重複が生じる。重複は、上流核酸の重複する塩基（複数可）が標的核酸と相補的であるか否かにかかわらず、また、これらの塩基が天然塩基か非天然塩基かにかかわらず、上流及び下流核酸における１つまたは複数の塩基が、標的核酸塩基に対して同じ位置を占めるところで生じる。いくつかの実施形態において、下流の二重鎖と重複する上流核酸の３’部分は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９０，５４３号に開示されているように、例えば芳香環構造などの、非塩基化学部分である。いくつかの実施形態において、核酸のうちの１つまたは複数は、例えば、核酸ステムループなどの共有結合を介して、または非核酸化学結合（例えば、多炭素鎖）を介して、互いに結合していてもよい。本明細書で使用される場合、「フラップエンドヌクレアーゼアッセイ」という用語は、上述のように、「ＩＮＶＡＤＥＲ」侵襲的切断アッセイ及びＱｕＡＲＴＳアッセイを含む。
「プローブオリゴヌクレオチド」または「フラップオリゴヌクレオチド」という用語は、フラップアッセイに関して使用される場合、侵襲性オリゴヌクレオチドの存在下で標的核酸と相互作用して切断構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。
「侵襲性オリゴヌクレオチド」という用語は、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション領域に隣接する位置で標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、侵襲性オリゴヌクレオチドの３’末端は、プローブと標的との間のハイブリダイゼーション領域と重複する部分（例えば、化学部分、あるいは１つまたは複数のヌクレオチド）を含む。侵襲性オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、標的のヌクレオチドと塩基対を形成する場合もしない場合もある。いくつかの実施形態において、侵襲性オリゴヌクレオチドは、その３’末端に、標的鎖にアニーリングするプローブオリゴヌクレオチドの一部分の５’末端に位置する配列と実質的に同じである配列を含む。
本明細書で使用される「フラップエンドヌクレアーゼ」または「ＦＥＮ」という用語は、一方の鎖に一本鎖５’オーバーハングすなわちフラップを含む二重鎖を有するＤＮＡ構造に対して、構造特異的エンドヌクレアーゼとして作用し、この一方の鎖を、もう一方の核酸鎖によって（例えば、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の接合部に重複するヌクレオチドが存在するように）変位させる、核酸分解酵素、典型的には５’ヌクレアーゼのクラスを指す。ＦＥＮは、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの接合部におけるホスホジエステル結合の加水切断を触媒し、オーバーハング、すなわちフラップを遊離させる。フラップエンドヌクレアーゼは、Ｃｅｓｋａ及びＳａｖｅｒｓ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． １９９８ ２３：３３１－３３６）ならびにＬｉｕ ｅｔ ａｌ（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００４ ７３： ５８９－６１５；参照により全体として本明細書に組み込まれている）によって概説されている。ＦＥＮは、個々の酵素、マルチサブユニット酵素である場合もあれば、別の酵素またはタンパク質複合体（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の活性として存在する場合もある。
フラップエンドヌクレアーゼには耐熱性があり得る。例えば、アーカイブの好熱菌生物由来のＦＥＮ－１フラップエンドヌクレアーゼには、典型的に耐熱性がある。本明細書で使用される場合、「ＦＥＮ－１」という用語は、真核生物または古細菌生物由来の非ポリメラーゼフラップエンドヌクレアーゼを指す。例えば、ＷＯ０２／０７０７５５、及び米国特許第７，１２２，３６４号、及びＫａｉｓｅｒ Ｍ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：２１３８７を参照のこと。これらは全て、あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「切断されたフラップ」という用語は、フラップアッセイの切断産物である一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
「カセット」という用語は、フラップ切断反応に関して使用される場合、例えば、フラップ切断アッセイで形成された、一次または第１の切断構造における、フラップまたはプローブオリゴヌクレオチドの切断に応答して検出可能シグナルを生成するよう構成されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせを指す。好ましい実施形態において、カセットは、フラップオリゴヌクレオチドの切断により生成された非標的切断産物にハイブリダイズして、第２の重複する切断構造を形成し、その結果、カセットが、同じ酵素、例えばＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼによって切断され得るようにする。
いくつかの実施形態において、カセットは、ヘアピン部分（すなわち、カセットオリゴヌクレオチドの一部分が反応条件下で同じオリゴヌクレオチドの第２の部分にハイブリダイズして二重鎖を形成する領域）を含む単一のオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、カセットは、反応条件下で二重鎖を形成することができる相補的部分を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも２つ含む。好ましい実施形態において、カセットは、標識、例えばフルオロフォアを含む。特に好ましい実施形態では、カセットは、ＦＲＥＴ効果を生み出す標識された部分を含む。
本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴ」という用語は、蛍光共鳴エネルギー移動、すなわち、複数の部分（例えばフルオロフォア）が、例えば、それらの間で、またはフルオロフォアからフルオロフォア以外（例えばクエンチャー分子）に、エネルギーを移動させるプロセスを指す。状況によっては、ＦＲＥＴは、励起されたドナーフルオロフォアが、より低いエネルギーのアクセプターフルオロフォアに、短距離（例えば約１０ｎｍ以下）の双極子間相互作用を介してエネルギーを移動させることを伴う。他の状況では、ＦＲＥＴは、ドナーからの蛍光エネルギーの損失、及びアクセプターフルオロフォアの蛍光の増加を伴う。さらに他の形態のＦＲＥＴでは、エネルギーが、励起されたドナーフルオロフォアから、非蛍光分子（例えば、「ダーク」クエンチ分子、例えば、「ＢＨＱ」クエンチャー、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと交換され得る。ＦＲＥＴは、当業者に知られており、説明されている（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：８１９、Ｓｅｌｖｉｎ， １９９５， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２４６：３００、Ｏｒｐａｎａ， ２００４ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２１， ４５－５０、Ｏｌｉｖｉｅｒ， ２００５ Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｓ ５７３， １０３－１１０を参照のこと）。
例示的なフラップ検出アッセイでは、侵襲性オリゴヌクレオチド及びフラップオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせて、上述のように重複を有する第１の複合体を生成する。不対の「フラップ」がフラップオリゴヌクレオチドの５’末端に含まれている。第１の複合体は、フラップオリゴヌクレオチドを切断して５’フラップ部分を遊離させる、フラップエンドヌクレアーゼ、例えばＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼの基質である。二次反応では、遊離した５’フラップ産物が、ＦＲＥＴカセット上の侵襲性オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットが切断されるようにフラップエンドヌクレアーゼによって認識される構造を再び作出する。ＦＲＥＴカセットの切断によってフルオロフォアとクエンチャーとが分離すると、バックグラウンドの蛍光を超える検出可能な蛍光シグナルが生成される。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ－フラップアッセイ」という用語は、ＰＣＲによる標的増幅と、増幅された標的ＤＮＡを含む第１の重複切断構造、ならびに、第１の重複切断構造から切断された５’フラップ、及び標識されたレポーターオリゴヌクレオチド、例えば、「ＦＲＥＴカセット」または５’ヘアピンＦＲＥＴレポーターオリゴヌクレオチドを含む、第２の重複切断構造の形成による、増幅ＤＮＡの検出とを組み合わせたアッセイ構成を指す。本明細書で使用されるＰＣＲ－フラップアッセイにおいて、アッセイ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ、標的核酸に相補的な部分を含む一次プローブ、及びＦＲＥＴカセットまたは５’ヘアピンＦＲＥＴレポーターを含む混合物を含み、標的核酸がＰＣＲにより増幅され、増幅された核酸が同時に検出される（すなわち、検出が標的増幅の過程で起こる）。ＰＣＲ－フラップアッセイは、米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、及び同第８，９１６，３４４号に記載されているＱｕＡＲＴＳアッセイ、米国特許第１０，６４８，０２５号に記載されている、より長い標的特異的領域を有するプローブオリゴヌクレオチド（Ｌｏｎｇ ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｓｉｇｎａｌ、「ＬＱＡＳ」）を使用したフラップアッセイ、ならびに米国特許第９，０９６，８９３号の（例えば、同特許の図１に図解されているような）増幅アッセイを含み、これらは各々、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ－フラップアッセイ試薬」という用語は、ＰＣＲ－フラップアッセイにおいて標的配列を検出するための１つまたは複数の試薬を指し、この試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ、及びＦＲＥＴカセットまたは５’ヘアピンＦＲＥＴレポーターを含む混合物中に、標的配列の存在下で標的核酸の増幅及びフラップ切断構造の形成に関与することが可能な核酸分子を含む。
核酸増幅またはシグナル増幅の検出に関して本明細書で使用される「リアルタイム」という用語は、例えばインキュベーションまたはサーマルサイクリング中の反応において、反応の進行中に産物またはシグナルの蓄積を検出または測定することを指す。このような検出または測定は、連続的に行ってもよく、または増幅反応の進行中の複数の別個の点で行ってもよく、または組み合わせであってもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応において、検出（例えば蛍光の検出）は、サーマルサイクリングの全体または一部で連続的に行ってもよく、あるいは１つまたは複数のサイクル中の１つまたは複数の点で一過性に行ってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＣＲまたはＱｕＡＲＴＳ反応のリアルタイム検出は、複数のサイクルの各々、または全てのサイクルにおいて、同じ点（例えば、サイクル中のある時点、またはサイクル中の温度ステップ）で蛍光のレベルを判定することによって達成される。増幅のリアルタイム検出は、増幅反応「中の」検出と呼ばれる場合もある。
本明細書で使用される場合、「定量的増幅データセット」という用語は、標的サンプル、例えば標的ＤＮＡの、定量的増幅中に得られるデータを指す。定量的ＰＣＲまたはＱｕＡＲＴＳアッセイの場合、定量的増幅データセットは、増幅中、例えば複数の、または全てのサーマルサイクル中に得られた、蛍光値の集合である。定量的増幅のデータは、反応中のいずれかの特定の点で収集されたデータに限定されず、蛍光は、各サイクル中の個別の点で、または各サイクル全体で連続的に測定され得る。
リアルタイムＰＣＲ及びＰＣＲ＋ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ中に収集されたデータに関して本明細書で使用される「Ｃｔ」及び「Ｃｐ」という略語は、陽性シグナルを示す所定の閾値をシグナル（例えば蛍光シグナル）が超過するサイクルを指す。シグナル対濃度の決定因子として使用される閾値を算出するためには様々な方法が使用されており、この値は一般に「超過閾値」（Ｃｔ）または「超過点」（Ｃｐ）のいずれかとして表される。本明細書で提示される方法の実施形態では、Ｃｐ値またはＣｔ値のいずれかを使用して、リアルタイムシグナルを分析し、アッセイまたはサンプル中のバリアント及び／または非バリアント構成成分のパーセンテージを判定することができる。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈において、このような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）及び／または補助材料（例えば、バッファー、アッセイを行うための説明書など）の保管、１つの場所から別の場所への輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／または補助材料を収容する１つまたは複数の格納手段（例えば箱）を含む。本明細書で使用される場合、「断片化キット」という用語は、全キット構成要素の小部分を各々が含む２つ以上の別個の容器を備える送達システムを指す。容器は、意図されるレシピエントに一緒に送達されても別々に送達されてもよい。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含んでよく、第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「システム」という用語は、特定の目的で使用するための物品の集合を指す。いくつかの実施形態において、物品は、例えば、物品、紙、または記録可能な媒体（例えば、ＤＶＤ、ＣＤ、フラッシュドライブなど）で提供される情報としての使用説明書を備える。いくつかの実施形態において、説明書は、ユーザをオンラインの場所、例えばウェブサイトに誘導する。
本明細書で使用される場合、「情報」という用語は、事実またはデータのあらゆる集合を指す。インターネットを含むがこれに限定されないコンピュータシステム（複数可）を使用して保存または処理される情報に関して、この用語は、任意のフォーマット（例えば、アナログ、デジタル、光学など）で保存される任意のデータを指す。本明細書で使用される場合、「対象に関連する情報」という用語は、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、核酸配列、遺伝子、メチル化のパーセンテージ、アレル頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型に相関する表現型などを含むがこれらに限定されない、ゲノムに関する情報を指す。「アレル頻度情報」とは、アレルの同一性、アレルの存在と対象（例えばヒト対象）の特性との間の統計的相関、個体または集団におけるアレルの存在または非存在、１つまたは複数の特定の特性を有する個体にアレルが存在する尤度のパーセンテージなどを含むがこれらに限定されない、アレル頻度に関する事実またはデータを指す。
実施例２に記載する肺癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果を比較する表を提示し、各横列は、示されているマーカー領域（染色体ならびに開始位置及び停止位置によって同定されている）の平均値を示す。各組織型（正常（Ｎｏｒｍ）、腺癌（Ａｄ）、大細胞癌（ＬＣ）、小細胞癌（ＳＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＱ）及び未確定癌（ＵＮＤ））の平均メチル化を、正常対象由来のバフィーコートサンプル（ＷＢＣまたはＢＣ））の平均メチル化と比較した比が、各領域について示され、各領域で同定された遺伝子及び転写物が示されている。肺腺癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳの結果を比較する表を提示する。 図１－１の欄を参照。 図１－１の欄を参照。 図１－１の欄を参照。 図１－１の欄を参照。 図１－１の欄を参照。 実施例２に記載する肺癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果を比較する表を提示し、各横列は、示されているマーカー領域（染色体ならびに開始位置及び停止位置によって同定されている）の平均値を示す。各組織型（正常（Ｎｏｒｍ）、腺癌（Ａｄ）、大細胞癌（ＬＣ）、小細胞癌（ＳＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＱ）及び未確定癌（ＵＮＤ））の平均メチル化を、正常対象由来のバフィーコートサンプル（ＷＢＣまたはＢＣ））の平均メチル化と比較した比が、各領域について示され、各領域で同定された遺伝子及び転写物が示されている。肺大細胞癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳの結果を比較する表を提示する。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 図２－１の欄を参照。 実施例２に記載する肺癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果を比較する表を提示し、各横列は、示されているマーカー領域（染色体ならびに開始位置及び停止位置によって同定されている）の平均値を示す。各組織型（正常（Ｎｏｒｍ）、腺癌（Ａｄ）、大細胞癌（ＬＣ）、小細胞癌（ＳＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＱ）及び未確定癌（ＵＮＤ））の平均メチル化を、正常対象由来のバフィーコートサンプル（ＷＢＣまたはＢＣ））の平均メチル化と比較した比が、各領域について示され、各領域で同定された遺伝子及び転写物が示されている。肺小細胞癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳの結果を比較する表を提示する。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 図３－１の欄を参照。 実施例２に記載する肺癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果を比較する表を提示し、各横列は、示されているマーカー領域（染色体ならびに開始位置及び停止位置によって同定されている）の平均値を示す。各組織型（正常（Ｎｏｒｍ）、腺癌（Ａｄ）、大細胞癌（ＬＣ）、小細胞癌（ＳＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＱ）及び未確定癌（ＵＮＤ））の平均メチル化を、正常対象由来のバフィーコートサンプル（ＷＢＣまたはＢＣ））の平均メチル化と比較した比が、各領域について示され、各領域で同定された遺伝子及び転写物が示されている。肺扁平上皮細胞癌に関連するマーカーを選択するためのＲＲＢＳの結果を比較する表を提示する。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 図４－１の欄を参照。 未変換形態及びバイサルファイト変換後形態のアッセイ標的領域の核酸配列、ならびに検出オリゴヌクレオチドを対応する配列番号と共に示す表を提示する。標的核酸、特に標的ＤＮＡ（バイサルファイト変換ＤＮＡを含む）は、便宜上、一本鎖として示されているが、本技術の実施形態は、表示された配列の相補鎖を包含することが理解される。例えば、プライマー及びフラップオリゴヌクレオチドは、示されている標的鎖、または示されている標的鎖に相補的な鎖にハイブリダイズするよう選択され得る。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 図５－１の欄を参照。 血液サンプルを分析してヒトの肺癌リスクを判定する１つの方法の例示的なワークフローを示す。 ＲＮＡ検出によるＦＰＲ１遺伝子発現に焦点を当てた実験のデータを示す。パネルＡは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示すデータの訓練セットの線チャートである。パネルＢは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示す検証データセットの線チャートである。パネルＣは、非喫煙者、正常喫煙者、及び異なるステージの肺癌患者から採取した白血球中のＦＰＲ１ ＲＮＡ発現レベルを示すドットプロットであり、正常喫煙者のタバコに対するわずかな感度を示している。 図７－１の欄を参照。 Ｓ１００Ａ１２遺伝子に焦点を当てた実験のデータを示す。パネルＡは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示すデータの訓練セットの線チャートである。パネルＢは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示す検証データセットの線チャートである。パネルＣは、非喫煙者、正常喫煙者、及び異なるステージの肺癌患者から採取した白血球中のＳ１００Ａ１２ ＲＮＡ発現レベルを示すドットプロットである。 図８－１の欄を参照。 ＭＭＰ９遺伝子に焦点を当てた実験のデータを示す。パネルＡは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示すデータの訓練セットの線チャートである。パネルＢは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示す検証データセットの線チャートであり、ＦＰＲ１と比較した改善を示している。パネルＣは、非喫煙者、正常喫煙者、及び異なるステージの肺癌患者から採取した白血球中のＭＭＰ９ ＲＮＡ発現レベルを示すドットプロットである。 図９－１の欄を参照。 ＳＡＴ１遺伝子に焦点を当てた実験のデータを示す。パネルＡは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示すデータの訓練セットの線チャートである。パネルＢは、真陽性がん率と偽陽性がん率の関係を示す検証データセットの線チャートである。パネルＣは、非喫煙者、正常喫煙者、及び異なるステージの肺癌患者から採取した白血球中のＳＡＴ１ ＲＮＡ発現レベルを示すドットプロットである。 図１０－１の欄を参照。 標的遺伝子としてのＦＰＲ１及び参照遺伝子としてのＳＴＫ４を使用した実験の結果を示す。パネルＡは、ＦＰＲ１比と、ＦＰＲ１断片の１００万当たりのキロベース当たりの正規化（ＦＰＫＭ）との関係を示すドットプロットである。パネルＢは、ＳＴＫ４と比較したＦＰＲ１の真陽性率及び偽陽性率の比を示す線グラフである。 標的遺伝子としてのＳ１００Ａ１２及び参照遺伝子としてのＳＴＫ４を使用した方法の例示的な実施形態を示す。パネルＡは、Ｓ１００Ａ１２比とＳ１００Ａ１２ ＦＰＫＭとの関係を示すドットプロットである。パネルＢは、ＳＴＫ４と比較したＳ１００Ａ１２の真陽性率及び偽陽性率の比を示す線グラフである。 標的遺伝子としてのＭＭＰ９及び参照遺伝子としてのＳＴＫ４を使用した方法の例示的な実施形態を示す。パネルＡは、ＭＭＰ９比とＭＭＰ９ ＦＰＫＭとの関係を示すドットプロットである。パネルＢは、ＳＴＫ４と比較したＭＭＰ９の真陽性率及び偽陽性率の比を示す線グラフである。 肺癌の異なるステージにおける標的遺伝子としてのＳ１００Ａ１２とＭＭＰ９の両方のＲＮＡ発現レベルを比較するデータを示す散布図である。ＦＰＫＭ正規化を使用し、データには、訓練セットと検証セットの両方の全てのサンプルが含まれている。 がん患者、良性患者、及び正常患者における標的遺伝子としてのＳ１００Ａ１２とＳＡＴ１の両方のＲＮＡ発現レベルを比較するデータを示す散布図である。ＦＰＫＭ正規化を使用した。破線の区切り線は、視覚化のみを目的としている。 がん患者、良性患者、及び正常患者における標的遺伝子としてのＳ１００Ａ１２とＴＹＭＰの両方のＲＮＡ発現レベルを比較するデータを示す散布図である。ＳＴＫ４正規化を使用した。破線の区切り線は、視覚化のみを目的としている。
本明細書で提供されるのは、マーカー分析物の選択、ならびに、複数の異なるタイプのマーカー分析物、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質などのマーカー分子についてサンプル（複数可）を分析することを含む、対象由来のサンプルまたはサンプルの組み合わせの特性決定を行う方法に関連する技術である。例えば、いくつかの実施形態において、本技術は、対象から得られたサンプルにおける、特定のメチル化ステータスを有する（例えば、メチル化型または非メチル化型の）ＤＮＡ中の少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定することを含む方法を提供し、対象から得られたサンプル中の少なくとも１つのＲＮＡマーカーの量を測定すること、及び対象から得られたサンプル中の少なくとも１つのタンパク質マーカーの存在もしくは非存在または量についてアッセイすることのうちの１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態において、対象由来の単一のサンプルが、メチル化マーカーＤＮＡ（複数可）、マーカーＲＮＡ（複数可）、及びマーカータンパク質（複数可）について分析される。
様々な実施形態のこの詳細な説明では、説明目的のために、開示される実施形態が十分に理解されるように多数の特定の詳細が記述される。しかしながら、当業者には、これらの様々な実施形態が、これらの特定の詳細があってもなくても実践され得ることが理解されよう。他の例では、構造及びデバイスがブロック図形態で示される。さらに、当業者であれば、方法が提示され実施される特定の順番が例示的であることを容易に理解することができ、この順番を変更しても、本明細書で開示される様々な実施形態の精神及び範囲に依然として含まれ得ることが想定される。
本明細書で参照される全ての特許、出願、公開出願及び他の刊行物は、参照される資料を参照することにより、全体として本明細書に組み込まれる。本明細書において、用語または語句が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開特許及び他の刊行物に記述されている定義に反するか、さもなければ矛盾するかたちで使用される場合、本明細書における使用が、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。下記の説明は、次のセクションに分割される：
Ｉ． ＲＮＡマーカー分析（定量的ＲＮＡ分析及び定量的タンパク質分析を含む）、ならびに
ＩＩ． メチル化マーカー分析
Ｉ． ＲＮＡマーカー分析
Ａ． 定量的ＲＮＡ分析
実施形態は、血液中の核酸発現、特に循環セルフリー核酸または免疫細胞の核酸発現を分析することにより、がんのリスクがある患者が疾患を有し得るかどうかを判定するシステム及び方法に関する。がんを有し得る患者の判定は、ＲＮＡの蓄積または発現レベルをアッセイするための血液由来の検体で行うことができ、このような分析は、発現マイクロアレイ、核酸シーケンシング、ｎＣｏｕｎｔｅｒ、またはリアルタイムＰＣＲによって行うことができる。いくつかの実施形態において、参照核酸のサブセットの発現レベルが、がんを有する患者において増加することが知られている標的核酸のサブセットの発現レベルと比較される。参照核酸のサブセットは、多くの無疾患患者由来の血液を分析し、これらの患者内で安定したレベルで発現される遺伝子を選択することによって見出され得る。参照核酸のサブセットは、複数の組織型（例えば、結腸、肺、腎臓、肝臓など）から採取された固形組織検体を分析し、患者の血液中で安定したレベルで発現される遺伝子を選択することによって見出すこともできる。
一実施形態が図６のフロー図に示されている。示されているように、プロセス１００は、開始段階１０５で始まり、次いで、血液サンプルがヒトから得られる段階１１０に移る。血液サンプルは、肺癌を有する疑いがあるヒト患者から採取してもよいが、患者が肺癌を有することが分かっている場合、がんのタイプまたはステージのより徹底的な分析が所望される場合がある。プロセス１００は次いで段階１１５に移り、ここで、サンプルの劣化を可能な限り最小限に抑えるよう、分析しようとする血液サンプルが室温または氷上の採血チューブで実験室に搬送される。血液サンプルが実験室で受領されると、プロセス１００は、下記でより詳細に説明するように、ＲＮＡが血液から抽出される段階１２０に移る。ＲＮＡが抽出された後、プロセス１００は段階１２５に移り、ここで、サンプル中の特定のＲＮＡのレベルを測定することにより、１つまたは複数の標的遺伝子の遺伝子発現レベルと、場合により１つまたは複数の参照遺伝子の遺伝子発現レベルとが検出される。遺伝子発現を検出し、標的遺伝子及び参照遺伝子を選択する方法については、下記でより詳細に説明する。特定の標的遺伝子の遺伝子発現レベルが判定されたら、プロセス１００は、患者における標的遺伝子発現レベルの測定に基づいて、肺癌を有するまたは発症する患者のリスクを判定するよう、分析が行われる段階１３０に移る。プロセス１００は次いで、終了段階１３５で終了する。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子のサブセットは、がんに罹患した個体から採取された血液または固形腫瘍検体において転写物の蓄積または発現レベルが上昇する遺伝子を分析することによって選択され得る。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子のサブセットは、がんに罹患した個体から採取された血液または固形腫瘍検体において転写物の蓄積または発現レベルが低下する遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、参照遺伝子のサブセットは、正常個体において、転写物の蓄積または発現レベルが、がん患者と比較して変化しない遺伝子を含む。これらの実施形態において、蓄積または発現レベルが血液または固形腫瘍検体中で上昇する標的遺伝子のサブセットは、１つまたは複数の参照遺伝子と組み合わせて選択される。
いくつかの実施形態において、本開示の技術の態様は、がんに罹患した患者では、ホルミルペプチド受容体遺伝子（ＦＰＲ１）、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＳＡＴ１、及びＴＹＭＰのＲＮＡレベルの発現が変化するという発見に関連する。例えば、ＦＰＲ１、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＳＡＴ１、及びＴＹＭＰのＲＮＡレベルは、後述するように、肺癌を有する患者において上昇することが見出された。さらに、ＦＰＲ１のＲＮＡレベルは、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、及びＨＮＲＮＰＡ１といった他の参照遺伝子のＲＮＡレベルと比較して上昇することが示された。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子が分かると、複数の検体から多数の候補を分析し、がん患者からの遺伝子発現において標的遺伝子と参照遺伝子との差が最大であるものを選択することによって、参照遺伝子を選択することができる。いくつかの実施形態において、参照遺伝子は、多くの遺伝子の転写物の蓄積または発現レベルを調べ、最も低い変動性を有するものを見出すことによって選択され得る。いくつかの実施形態において、参照遺伝子は、その個々の蓄積または発現レベルに基づいてではなく、がんにおけるその相対的な蓄積または発現レベルの変化がないことに基づいて選択される。
所与のがんタイプにおける標的遺伝子（及びいくつかの実施形態では参照遺伝子）が分かると、がん患者及びがんがアッセイされる患者から採取された血液中で、発現プロファイルを測定することができる。血漿または白血球は、標準的な採血以上のリスクを呈することなく、多くの一次医療診療所内で採取及び調製され得るので、いくつかの実施形態における標的遺伝子と参照遺伝子との間の相対的なＲＮＡの蓄積または発現レベルは、価値あるがんバイオマーカーであり得る。さらに、いくつかの実施形態における標的遺伝子及び参照遺伝子は、高信頼度でアッセイすることができれば、現在のがんアッセイに対していくつかの利点を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、この方法は、発生初期ステージのがん、少ない症状を呈するがん、良性状態から区別することが困難ながん、または従来の生検アッセイではアクセス可能であり得ない身体領域で発生している可能性のあるがんを検出することができる。
ＲＮａｓｅ活性の増加は、腫瘍によく見られる。このＲＮａｓｅ活性は、腫瘍増殖を阻害し得、がんに対する免疫系の応答の一部であり得る。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを介してがん細胞のアポトーシスを引き起こす場合があり、このアポトーシスは、ＲＮａｓｅ ＬなどのＲＮａｓｅの活性化をもたらし得る。腫瘍増殖に起因する低酸素状態によって引き起こされ得る壊死を介した細胞の死も、ＲＮａｓｅの放出に寄与し得る。肺癌患者の血漿は、増加したＲＮａｓｅ活性を有することが知られている（Ｍａｒａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， （１９７６） “Ｓｅｒｕｍ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ８（６）：５０１－５０５、Ｒｅｄｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９７６） “Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｓｅｒｕｍ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７３（７）：２３０８－２３１０）。肺細胞には血漿中で見出されるものと同様のＲＮａｓｅが含まれることも知られている（Ｎｅｕｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９７８） “Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８：８８－９３）。
血漿中に存在するＲＮａｓｅのレベルが高いほど、遊離ＲＮＡは、より急速に分解されやすくなる。よって、ＲＮａｓｅの放出に起因して、血漿ＲＮＡ調製物中で検出可能なＲＮＡが少なくなる場合がある。全てのＲＮＡは低下したレベルで存在し得るが、遺伝子の正常の変動性が低い場合にのみ、この差を高レベルの正確度で検出することが可能であり得る。例えば、遺伝子の発現の正常範囲が１０～１００単位である場合、１単位の減少を正確に検出することは困難であり得る。しかしながら、遺伝子の発現が通常１０～１１単位である場合、１単位の減少は容易に検出可能である（例えば、１０単位未満のあらゆる値は減少を示す）。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子はＦＰＲ１である。ＦＰＲ１は、肺及びがんにおいて複数の役割を果たす。ＦＰＲ１は、肺線維芽細胞で発現し（ＶａｎＣｏｍｐｅｒｎｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１（４）：２０５０－６）、肺の創傷修復に必要である（Ｓｈａｏ （２０１１） Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４４：２６４－２６９）。線維芽細胞は、腫瘍と戦う免疫細胞の誘引（Ｇｅｍｐｅｒｌｅ （２０１２） ＰＬＯＳＯｎｅ ７（１１）：１－７， ｅ５０１９５）と、腫瘍を保護する間質の生成（Ｗａｎｇ （２００９） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５（２１） ６６３０－６６３８）の両方において重要であることが知られている。ＦＰＲ１は、腫瘍内の他の癌遺伝子の活性を悪化させる場合もある（Ｈｕａｎｇ （２００７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７（１２）：５９０６－５９１３）。肺癌で過剰発現しているという証拠はないが、ＦＰＲ１は、ＲＮＡ安定化によって調節されることが知られている（Ｍａｎｄａｌ （２００７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：２５４２－２５４８、Ｍａｎｄａｌ （２００５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：６０８５－６０９１）。これらの役割を所与とすると、ＦＰＲ１ ＲＮＡは、腫瘍増殖を増大させるために腫瘍細胞によって（例えば、増殖のための創傷修復システムを活性化する、または保護的間質を増殖させることによって）、あるいは免疫応答を増大させる（例えば、さらなる免疫細胞を誘引する）ために免疫細胞によって、意図的に分泌される可能性がある。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、特に自然免疫機能に関連している、カルグラニュリンＣ及びＥＮ－ＲＡＧＥ（細胞外で新たに同定されたＲＡＧＥ結合タンパク質）としても知られるＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）である。Ｓ１００Ａ１２は、食細胞によって発現され、組織炎症部位で放出される。これは、脳損傷後に細胞外空間へ放出された後に炎症誘発性に変わる内因性ＤＡＭＰである。終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、加齢と共に増加する終末糖化産物（ＡＧＥ）の特異的な細胞表面反応部位である。ＡＧＥとＲＡＧＥとの間の相互作用は、慢性炎症に関連付けられている。炎症細胞及び血管細胞でＲＡＧＥ相互作用が起こると、ＭＭＰの発現が増加する。ヒトｓ１００Ａ１２ ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００５６２１として公的に利用可能である。ヒトＳ１００Ａ１２アミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ０５６１２として公的に利用可能である。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、炎症部位への好中球の遊走のプロセスに関与するミエロイド関連タンパク質（ＭＲＰ）を含む。ＭＲＰタンパク質は、Ｓ１００タンパク質のサブファミリーであり、ＭＲＰファミリーの３つのメンバー、すなわち、それぞれ１０．６、１３．５及び１０．４ｋＤａの分子量を有し、好中球のサイトゾルで豊富に発現し、単球ではより低いレベルで発現する、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＳ１００Ａ１２がさらに特性決定されている。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、活性化された内皮細胞、特定の上皮細胞、ケラチノサイト、ならびに好中球及び単球で分化したＨＬ－６０及びＴＨＰ－１によっても発現される。ＭＲＰはシグナルペプチド配列を欠いているため、顆粒ではなくサイトゾルに存在し、サイトゾルタンパク質の最大４０％を占める。３つのＭＲＰは、非共有結合したホモ二量体として存在する。さらに、カルシウムの存在下では、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９が会合して、Ｓ１００Ａ８／Ａ９と呼ばれる非共有結合性のヘテロ二量体を形成する；これらは、ＭＲＰ－８／１４複合体、カルプロテクチン、ｐ２３、及び嚢胞性線維症抗原としても知られている。Ｓ１００Ａ８は、ＭＲＰ－８、Ｌ１抗原軽鎖、及びカルグラニュリンＡとも呼ばれ、Ｓ１００Ａ９は、ＭＲＰ－１４、Ｌ１抗原重鎖、嚢胞性線維症抗原、カルグラニュリンＢ、及びＢＥＥ２２と呼ばれている。Ｓ１００Ａ１２の他の名称は、ｐ６、ＣＡＡＦ１、ＣＧＲＰ、ＭＲＰ－６、ＥＮ－ＲＡＧＥ、及びカルグラニュリンＣである。
Ｓ１００タンパク質のファミリーは、小さな（１０～１４ｋＤａ）酸性カルシウム結合タンパク質の１９メンバーを含む。これらは、一方が他方よりも２つ多くのアミノ酸を有する２つのＥＦハンド型カルシウム結合モチーフの存在を特徴とする。これらの細胞内タンパク質は、タンパク質のリン酸化、酵素活性、Ｃａ２＋ホメオスタシス、及び中間径フィラメントの重合の調節に関与している。Ｓ１００タンパク質は、一般にホモ二量体として存在するが、いくつかはヘテロ二量体を形成し得る。Ｓ１００タンパク質の半数以上は、細胞外空間にも見出され、細胞外空間において、特定の受容体を介してサイトカインのような活性を発揮する；１つは、最近、終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）として特性決定された。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、ミエロイド前駆体の産物である好中球及び単球に発現がほぼ完全に制限されるため、ミエロイド関連タンパク質（ＭＲＰ）と呼ばれるＳ１００タンパク質ファミリーのサブセットに属する。
血清中の高濃度のＭＲＰは、循環好中球の数またはそれらの活性の増加に関連する病状で生じ得る。Ｓ１００Ａ８／Ａ９のレベル上昇（１μｇ／ｍｌ超）は、嚢胞性線維症、結核、及び若年性関節リウマチなどの様々な感染症及び炎症性病状に罹患した患者の血清中で観察される。これらは、関節リウマチ及び痛風に罹患した患者の滑液及び血漿でも非常に高いレベルで発現される。高レベルのＭＲＰ（最大１３μｇ／ｍｌ）は、慢性骨髄性白血病患者及び慢性リンパ性白血病患者の血漿中に存在することも知られている。これらのタンパク質の存在は、さらに、再発患者の血液中の白血病細胞の出現に先行していた。Ｓ１００Ａ８／Ａ９が細胞外に存在することは、ＭＲＰが活発に、あるいは細胞壊死の間に放出され得ることを示唆している。
ＭＲＰはサイトゾルで発現し、これらが代替経路を介して分泌されることが示唆される。細胞外環境に放出されると、ＭＲＰは炎症誘発性機能を発揮する。これらの活性は、他のいくつかのＳ１００タンパク質に共通している。例えば、Ｓ１００は、ニューロンからの炎症誘発性サイトカインＩＬ－６の放出を刺激し、神経突起の伸長を促進する。Ｓ１００Ｌ（Ｓ１００Ａ２）は、好酸球に対して走化性をもち、ソリアシン（Ｓ１００Ａ７）は、好中球及びＴリンパ球に対して走化性をもつが、単球に対しては走化性をもたない。Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、及びＳ１００Ａ８／Ａ９は、好中球に対して走化性をもち、１０－９～１０－１０Ｍで最大の活性を示す。ＣＰ－１０とも呼ばれるマウスＳ１００Ａ８は、１０－１２Ｍの活性で、マウスミエロイド細胞の良好な強力な走化性因子であることが知られている。
さらに、Ｓ１００Ａ１２は、単球及び好中球に対して走化性をもち、マウスマクロファージ細胞株からＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの発現を誘導する。またＭＲＰは、内皮への白血球の接着を刺激する。Ｓ１００Ａ９は、β２インテグリンＭａｃ－１を活性化することにより、フィブリノーゲンへの好中球の接着を刺激する。
最近、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ１２、及びＳ１００Ａ８／Ａ９もフィブリノーゲンへの好中球の接着を刺激することが実証された。Ｓ１００Ａ１２と共にインキュベートした内皮細胞は、ＩＣＡＭ－１及びＶＣＡＭ－１の表面発現を増加させ、その結果、リンパ球が内皮細胞に接着した。この誘導は、ＮＦ－κＢの活性化の後に起こる。ＭＲＰは、直接的に、あるいは酸素代謝物と反応することにより、酸化的バーストを阻害する。Ｓ１００Ａ９は、腹膜のＢＣＧ刺激マクロファージによって放出されるＨ２Ｏ２のレベルを低下させる。この効果は、ヒト及びマウスのＳ１００Ａ９を使用して観察できるが、Ｓ１００Ａ８では観察できない。Ｓ１００Ａ９とは異なり、Ｓ１００Ａ８は、ＯＣｌ－アニオンによって効率的に酸化され、共有結合したＳ１００Ａ８ホモ二量体の形成、及びその走化性活性の（マウスＳ１００Ａ８で実証された）喪失をもたらし得る。
代替的に、ＭＲＰはサイトゾルタンパク質であるため、好中球をそれ自体の酸化的バーストの有害効果から保護することができる。Ｓ１００Ａ９は、その侵害受容作用によって炎症性疼痛の制御に関与していることでも知られている。ＭＲＰの機能はｉｎ ｖｉｖｏでも調査されている。マウスに腹腔内注射すると、マウスＳ１００Ａ８は、４時間以内に好中球及びマクロファージの蓄積を刺激した。Ｓ１００Ａ１２の阻害により、遅延型過敏症のマウスモデルにおける急性炎症及び大腸炎における慢性炎症が低減した。全てのＭＲＰは、マウス空気嚢モデルで注射すると、炎症反応を誘導する。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、胚発生、生殖、及び組織リモデリングなどの正常な生理学的プロセス、ならびに関節炎及び転移などの疾患プロセスにおける細胞外マトリックスの分解に関与する、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質をコードする。ほとんどのＭＭＰは、細胞外プロテイナーゼによって切断されると活性化する、不活性のプロタンパク質として分泌される。この遺伝子によってコードされる酵素は、ＩＶ型及びＶ型のコラーゲンを分解する。アカゲザルでの研究は、骨髄からの造血前駆細胞のＩＬ－８誘導性動員にこの酵素が関与していることを示唆しており、マウスでの研究は、腫瘍関連組織リモデリングにおける役割を示唆している。
ＭＭＰ、特にＭＭＰ９、２、及び３は、４０年以上にわたり、がんに関係するとされている。増大する証拠は、ＥＣＭ分解における役割に加えて、がん細胞の浸潤及び転移に重要である血管新生、リンパ血管新生、及び脈管形成におけるこれらの役割を示唆している。例えば、ＭＭＰ９は、大腸癌及び膵臓癌などのいくつかのがんにおいて、その受容体に結合する隔絶されたＶＥＧＦの生物学的利用能を増加させる。ＭＭＰ９はまた、ＨＣＣの重要な増殖因子であるＴＧＦ－βのタンパク質分解的活性化を媒介する。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、がん細胞の増殖、遊走、浸潤及び転移を促進するプロテアーゼである（Ｅｇｅｂｌａｄ ａｎｄ Ｗｅｒｂ， ２００２）。ＭＡＮ１Ａ１の過剰発現は、ＭＭＰ９ ｍＲＮＡ発現レベルを上昇させ、ＭＡＮ１Ｃ１の過剰発現は、ＭＭＰ９ ｍＲＮＡ発現レベルを低下させた。ＭＭＰはあらゆる種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解できるため、ＭＭＰ９発現の減少は、細胞の遊走及び浸潤能力が阻害されていることを意味する。転移に関与することが知られている遺伝子は、ＭＭＰ９及びＣＴＴＮを含む。ＭＭＰ９は、哺乳動物において細胞外マトリックスのコラーゲンを分解する分泌型亜鉛メタロプロテアーゼの一群のメンバーである。ＭＭＰ９の発現上昇は、多くの異なるがんタイプにおいて転移に関連付けられている（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００、Ｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００２）。ＣＴＴＮは、頭頸部癌及び乳癌の扁平上皮細胞癌において高頻度で増幅されることが見出されている１１ｑ１３領域に存在する癌遺伝子であることが示されている（Ｓｃｈｕｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２、Ｓｃｈｕｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＢＭＰ２及びＥＧＦＲを含む、腫瘍形成に関与する遺伝子であり得る。ＢＭＰ２は、多くの細胞型で増殖、分化、及び他の機能を制御する、トランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、頭頸部ＳＣＣを含む多くの異なるタイプのがんにおいて、最も高頻度で増幅され変異する遺伝子のうちの１つである（Ｓａｎｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． １９９１、Ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ． １９９３、Ｇｒａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔｗｅａｒｄｙ １９９３）。転移プロセスにおける役割が明確に定義されていない、他の同定された候補遺伝子は、ＧＴＳＥ１、ＥＥＦ１Ａ１を含む。ＧＴＳＥ１は、微小管局在タンパク質である。その発現は細胞周期によって調節されており、過剰発現するとＧ２／Ｍ期の蓄積を誘導し得る（Ｍｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ． ２０００）。ＧＴＳＥ１は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質のレベル及び活性を下方制御することができ、ＤＮＡ損傷後にアポトーシスを誘導するその能力を抑制することが実証されている（Ｍｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ． ２００４）。ＥＥＦ１Ａ１遺伝子は、アミノアシル－ｔＲＮＡの８０Ｓリボソームへの結合に関与する伸長因子１のアルファサブユニットをコードする。この遺伝子の腫瘍形成への関与は明らかではない。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子はＳＡＴ１である。ＳＡＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、アセチルトランスフェラーゼファミリーに属し、ポリアミン代謝の異化経路における律速酵素である。スペルミジン及びスペルミンのアセチル化を触媒し、ポリアミンの細胞内濃度及び細胞外への輸送の調節に関与している。この遺伝子の欠損は、禿髪性棘状毛嚢性角化症（ＫＦＳＤ）に関連している。この遺伝子については、選択的スプライスによる転写物が見出されている。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子はＴＹＭＰである。ＴＹＭＰ遺伝子（旧称ＥＣＧＦ１）は、チミジンホスホリラーゼと呼ばれる酵素を作るための説明を提供する。チミジンは、（化学修飾後に）ＤＮＡの構成要素として使用されるヌクレオシドとして知られる分子である。チミジンホスホリラーゼは、チミジンを２つの小さな分子、２－デオキシリボース１－リン酸及びチミンに変換する。この化学反応は、細胞内のヌクレオシドのレベルを調節するのに役立つ、チミジンの分解における重要なステップである。チミジンホスホリラーゼは、ミトコンドリアと呼ばれる細胞構造で適切な量のチミジンを維持するにあたり、重要な役割を果たす。ミトコンドリアは、食物からのエネルギーを細胞が使用できる形態に変換する。ほとんどのＤＮＡは核内の染色体にパッケージされているが、ミトコンドリアは少量の独自のＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡまたはｍｔＤＮＡと呼ばれる）も有する。ミトコンドリアは、チミジンを含むヌクレオシドを使用して、必要に応じてｍｔＤＮＡの新しい分子を構築する。ＴＹＭＰ遺伝子の約５０種の変異が、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）を有するヒトにおいて同定されている。ＴＹＭＰ変異は、チミジンホスホリラーゼの活性を大幅に低減させるか、または消失させる。この酵素が不足すると、チミジンが体内に非常に高いレベルで蓄積することが可能になる。過剰なチミジンはｍｔＤＮＡに損傷を与え、その通常の維持及び修復を妨害すると考えられている。その結果、変異がｍｔＤＮＡに蓄積し、ｍｔＤＮＡが不安定になり得る。ミトコンドリアは、通常よりも少ないｍｔＤＮＡを有する場合もある（ｍｔＤＮＡの枯渇）。これらの遺伝的変化は、ミトコンドリアの正常な機能を損なう。ｍｔＤＮＡの異常は、ＭＮＧＩＥ疾患に特徴的な消化器系及び神経系の問題の根底にあるが、ミトコンドリアの欠損がどのように障害の特定の特徴を引き起こすのかは不明である。
いくつかの実施形態において、参照遺伝子はＳＴＫ４である。ＳＴＫ４遺伝子によってコードされるタンパク質は、ストレス誘導性マイトジェン活性化タンパク質キナーゼカスケードの上流で作用する、酵母Ｓｔｅ２０ｐキナーゼと構造的に類似した細胞質キナーゼである。コードされたタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質をリン酸化することができ、自己リン酸化を受ける。コードされたタンパク質のカスパーゼ切断断片は、ヒストンＨ２Ｂをリン酸化できることが示されている。このタンパク質によって触媒される特定のリン酸化は、アポトーシスと相関しており、このタンパク質が、このプロセスで観察されるクロマチン凝縮を誘導する可能性がある。
いくつかの実施形態において、アッセイは、次の参照遺伝子：ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＣＡＳＣ３、ＳＫＰ１、及びＨＮＲＮＰＡ１のうちの１つまたは複数；ならびに次の標的遺伝子：ＣＴＳＳ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２、ＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、ＣＸＣＲ２、ＮＣＦ２、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＳＡＴ１、ＴＹＭＰ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＳＥＬＬ、Ｓ１００Ａ９、及びＰＡＤＩ４のうちの１つまたは複数を含み得る。
回帰を使用して、患者のサンプルから生成されたデータポイントを標準に当てはめ、結果が標準の単位で表されるようにすることができる。いくつかの実施形態において、標準は、１つまたは複数の細胞株から作出されたＲＮＡからなる。いくつかの実施形態において、標準は、合成ＲＮＡからなる場合がある。標準内の各ＲＮＡの断片の数は既知であってもよく、標準化された単位は、各標的に存在するＲＮＡ分子の数であり得る。
アッセイは、異なる配列の成分もしくは類似の領域を標的とする異なる検出可能な標識を有する成分、同じ遺伝子の異なる領域を標的とする成分、または上記のＲ１ａアッセイで挙げたもの以外の遺伝子の領域を標的とする成分を含み得る。
結果は、ＶｉｏｍｉｃｓのＮＳＣＬＣ検査といったＶｉｏｍｉｃｓのがん検査の決定規則を使用して評価され得る。一方の軸が特定の標的遺伝子と第１の参照遺伝子の比であり、他方の軸が標的遺伝子と第２の参照遺伝子の比であるプロットが作出され得る。
細胞株対照を使用する場合、ＮＳＣＬＣ及び正常サンプルの結果は互いに著しく異なる。いくらかの重複が存在するにもかかわらず、ＮＳＣＬＣサンプルは、細胞株対照に当てはめたとき、がんではないサンプルよりも著しく大きい、標的遺伝子発現と参照遺伝子発現の比を一貫して示す。
細胞株対照ではなく合成ＲＮＡ標準を使用した場合、同様の結果が得られる。重複の減少は、段階希釈の数の減少（６から３）から生じた、標準の変動性の減少に起因し得る。段階希釈の各ステップはエラーを導入し得る。
結果は、第１の標的遺伝子発現の線形結合と第２の標的遺伝子発現の線形結合との間の単一の比率として解釈することもできる。決定規則は、所与の閾値を超えるスコアはがんを示し、閾値未満のスコアはがんがないことを示すと指定し得る。合成標準は、各マーカーの係数が１であり、各スコアが、スコア＝標的遺伝子／（参照遺伝子１＋参照遺伝子２）として算出されるように設計することができる。
例えば、上記のリストから選択される遺伝子の遺伝子発現値は、サンプルから判定され、典型的に得られる値の範囲にわたる合成標準のセット（例えば、段階希釈系列）から判定されたレベルと比較され得る。各遺伝子について、患者サンプルから判定された遺伝子発現レベルは、合成標準テンプレートで回帰分析を行って各遺伝子に蓄積レベル値を当てはめることにより判定された遺伝子発現レベルと比較される。回帰及び当てはめ値は、各遺伝子について個別に得られる。当てはめ値が得られたら、追加の分析（例えば、比率の計算）を行うことができる。
これらのスコアは、閾値を超えるスコアが、患者サンプルの示す肺癌リスクが高いことを示すように、閾値と比較され得る。
各標準の正しい濃度、係数、及び閾値は、がん患者とがんのない患者の両方から小さなサンプルセットでデータを収集し、次いで線形モデルを使用してこれらを分離することによって判定され得る。線形モデルは、ロジスティック回帰、もしくは線形カーネル関数を用いるサポートベクターマシンなどの統計的方法を介して生成してもよく、または線形モデルは、検査によって生成してもよい。
除外基準を満たすサンプルが結果を報告しないように、除外基準を実装してもよい。これらの除外基準は、記載された実施形態のうちの１つの前または後に行われる他の検定を含み得る。除外基準は、検定自体の結果に基づいてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、非常に少量のマーカーは、サンプルの劣化を示し、２つの参照遺伝子の発現レベル間の予想外に大きな比率は、夾雑があることを示し得る。いくつかの実施形態において、２つの参照遺伝子の比率が、遺伝子の蓄積レベルの比率の中央値と比較して１０、５、４、３、または２倍を超えて異なる場合、サンプルは除外される。
いくつかの実施形態において、この方法は、統計的距離判定を含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＯＣ曲線によってのみ判定される固定カットオフとは対照的に、統計的距離に基づいてアッセイ結果（例えば、陽性または陰性の結果）を判定する。
特異性に基づいて、結果は群（高信頼度、低信頼度など）に分けられ得る。この数は、信頼度の数値スコアを求めるために、何らかの簡単な式で変換されてもよい。
いくつかの実施形態において、この方法は、人口統計学的属性または生活様式属性（複数可）と組み合わせたＲＮＡ発現の結果に基づいて、患者に存在するがんのタイプを予測するためのモデル及び導出を含み得る。
ＲＮＡ抽出の方法
ＲＮＡ抽出の一般的な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを含め、分子生物学の標準的教本において開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎなどの商業的製造元による精製キット、バッファーセット、及びプロテアーゼを、製造元の説明書（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）に従って使用して行うことができる。例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用し、培養下の細胞から全ＲＮＡを単離することができる。多数のＲＮＡ単離キットが市販されており、本開示の技術の方法で使用することができる。
いくつかの実施形態において、全血サンプル中のＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して抽出され得る。全血などの生物学的物質から全ＲＮＡを精製するには、生物学的物質をＲＮＡ溶解／結合溶液と接触させた後、固体支持体と接触させる。ＲＮＡ溶解／結合溶液を使用して生物学的物質を溶解し、ＲＮＡを放出させてから、これを固体支持体に加える。さらに、ＲＮＡ溶解／結合溶液は、ＲＮａｓｅなどの有害な酵素の悪影響を防止する。ＲＮＡ溶解／結合溶液は、培養された細胞もしくはペレット状の白血球を溶解するために、または標準的な９６ウェルプレートなどの培養プレートに接着もしくは収集した細胞を溶解するために、首尾よく使用され得る。生物学的物質が組織塊または小さな粒子で構成されている場合、ＲＮＡ溶解／結合溶液は、その効果的な溶解能力のために、そのような組織塊を粉砕してスラリーにするよう効果的に使用され得る。ＲＮＡ溶解／結合溶液の体積は、細胞数または組織サイズに応じてスケールアップまたはダウンしてもよい。生物学的物質が溶解されたら、ライセートを固体支持体に直接加えてもよいし、前清浄化（ｐｒｅ－ｃｌｅａｒ）用の膜に通して大きな粒子をライセートから除去してもよい。適切な製品の例は、Ｇｅｎｔｒａ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ＲＮＡ Ｐｒｅ－Ｃｌｅａｒ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）である。
代替的に、ＲＮＡ溶解／結合溶液を固体支持体に直接加え、これによってステップを省略し、方法をさらに単純化してもよい。この後者の方法では、ＲＮＡ溶解／結合溶液を固体支持体に適用し、次いで固体支持体上で乾燥させた後、処理された固体支持体と生物学的物質を接触させてもよい。例えば、一実施形態において、Ｓｐｉｎ－Ｘ（登録商標）バスケット（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎ．Ｙ．）内に配置した固体支持体に、好適な体積のＲＮＡ溶解／結合溶液を直接加え、さらにこれを２ｍｌのスピンチューブ内に配置する。固体支持体を少なくとも１２時間４０～８０℃の温度で乾燥するまで加熱し、その後、余剰の未結合ＲＮＡ溶解／結合溶液があれば除去し、次いで乾燥下で保存する。ＲＮＡ溶解／結合溶液で前処理された固体支持体に生物学的物質を直接加え、これが好適に溶解され、核酸が放出されて固体支持体に結合するまで、少なくとも１分間、例えば少なくとも５分間インキュベートしてもよい。
生物学的物質が細胞物質またはウイルス物質を含む場合、ＲＮＡ溶解／結合溶液との直接接触、またはＲＮＡ溶解／結合溶液で前処理された固体支持体との接触は、細胞及び核膜、またはウイルスコートを可溶化及び／または破裂させ、これにより核酸ならびにタンパク質、リン脂質などといった他の夾雑物質が放出される。放出された核酸は、ＲＮＡ複合体化リチウム塩の存在下で固体支持体に選択的に結合する。任意選択の還元剤を用いると、ＲＮａｓｅを多く含む組織において必要であり得るＲＮａｓｅ活性の低減に役立つ。
このインキュベーション期間の後、生物学的物質の残りは、遠心分離、ピペッティング、圧力、真空などの好適な手段により、または核酸が固体支持体に結合したままであるようにこれらの手段をＲＮＡ洗浄液と組み合わせて使用することにより、場合により除去される。タンパク質、リン脂質などを含む、核酸以外の生物学的物質の残りは、遠心分離によってまず除去され得る。これを行うことにより、ライセート中の未結合の夾雑物が固体支持体から分離される。複数の洗浄ステップにより、固体支持体から実質的に全ての夾雑物が除去され、固体支持体に優先的に結合したＲＮＡが残る。
その後、当業者に知られている適切な量のＲＮＡ溶出液を使用して、結合したＲＮＡを溶出することができる。次いで、固体支持体を遠心分離するか、または圧力もしくは真空にかけて、ＲＮＡを固体支持体から遊離させることができ、次いで好適な容器に収集することができる。
いくつかの実施形態において、この方法は、ｃｆＲＮＡを患者のサンプルから抽出し、抽出されたｃｆＲＮＡをアッセイすることで開始してもよい。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００８） “Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５：９４－１０４を参照のこと。いくつかの実施形態において、データの信頼性が保証されるよう、ｃｆＲＮＡを血漿または他のＲＮＡ源から単離するために、一貫性のある反復可能な方法が使用される。ｃｆＲＮＡを血液から得るためには、以下に挙げるプロトコールが使用され得るが、他の方法も想定される。
ｃｆＲＮＡ分子は、例えばＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環核酸キットを使用して、血漿または他のサンプルから精製することができる。このキットのプロトコールは、参照により全体として本明細書に組み込まれる文書「ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第２版、２０１１年１月に記載されている。このプロトコールは、１ｍＬの血漿から循環中の全核酸を精製する方法の一実施形態を提供する。簡単に説明すると、溶解試薬及びプロテアーゼを不活性キャリアＲＮＡと共に加える。全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）をカラムに結合させ、カラムを複数回洗浄し、次いでカラムから溶出させる。
例えば、プロトコールは、次のようにステップを実行することによって行われ得る。１００μｌ、２００μｌ、または３００μｌのＱＩＡＧＥＮ（登録商標）プロテイナーゼＫを、５０ｍｌの遠心チューブにピペットで入れる。１ｍｌ、２ｍｌ、または３ｍｌの血清または血漿を５０ｍｌチューブに加える。０．８ｍｌ、１．６ｍｌ、または２．４ｍｌのバッファーＡＣＬ（１．０μｇのキャリアＲＮＡを含む）を加える。キャップを閉じ、３０秒間パルスボルテックスして混合し、視認できるボルテックスがチューブに生じることを確認する。効率的な溶解を確実にするために、サンプルとバッファーＡＣＬを十分に混合して、均質溶液を得る。この時点で手順を中断してはならない。
溶解インキュベーションを開始するために、６０℃で３０分間インキュベートする。チューブを実験台に戻し、１．８ｍｌ、３．６ｍｌ、または５．４ｍｌのバッファーＡＣＢをチューブ内のライセートに加える。キャップを閉じ、１５～３０秒間パルスボルテックスして十分に混合する。チューブ内のライセート－バッファーＡＣＢ混合物を氷上で５分間インキュベートする。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＭｉｎｉカラムをＱＩＡｖａｃ（登録商標）２４ ＰｌｕｓのＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒに挿入する。２０ｍｌのチューブエクステンダーを開いたＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに挿入する。サンプルの漏出を防ぐために、チューブエクステンダーがＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムにしっかりと挿入されていることを確認する。
採取チューブを下記のドライスピン用に取っておく。ライセート－バッファーＡＣＢ混合物をＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムのチューブエクステンダーに適用する。真空ポンプのスイッチを入れる。全てのライセートがカラムに完全に吸引されたら、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。チューブエクステンダーを注意深く取り外して廃棄する。大量のサンプルライセート（３ｍｌのサンプルから開始する場合は約１１ｍｌ）は、真空力によってＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ膜を通過するのに最長１０分間を必要とし得ることに留意されたい。真空圧を素早く簡便に解放するには、真空調節器（ＱＩＡｖａｃ（登録商標）Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの一部）を使用すべきである。相互汚染を避けるために、近傍のＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムの上方にチューブエクステンダーを動かさないよう注意すること。
６００μｌのバッファーＡＣＷ１をＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに適用する。カラムの蓋を開いたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。バッファーＡＣＷ１の全てがＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに吸引された後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。７５０μｌのバッファーＡＣＷ２をＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに適用する。カラムの蓋を開いたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。バッファーＡＣＷ２の全てがＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに吸引された後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。７５０μｌのエタノール（９６～１００％）をＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに適用する。カラムの蓋を開いたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。エタノールの全てがスピンカラムに吸引されたら、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムの蓋を閉じる。真空マニホールドから取り外し、ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒを廃棄する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムを清潔な２ｍｌの採取チューブに入れ、フルスピード（２０，０００×ｇ；１４，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムを新しい２ｍｌの採取チューブに入れる。蓋を開け、アセンブリを５６℃で１０分間インキュベートして、膜を完全に乾燥させる。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムを清潔な１．５ｍｌの溶出チューブ（付属）に入れ、ステップ１４の２ｍｌ採取チューブを廃棄する。２０～１５０μｌのバッファーＡＶＥをＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ膜の中央に注意深く適用する。蓋を閉め、室温で３分間インキュベートする。溶出バッファーＡＶＥが室温（１５～２５℃）に平衡化されていることを確認する。少量（＜５０μｌ）で溶出を行う場合、結合したＤＮＡが完全に溶出するように、溶出バッファーを膜の中央に分注する必要がある。溶出体積はフレキシブルであり、下流用途の要件に従って適合することができる。回収される溶出液体積は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムに適用された溶出体積よりも最大５μｌ少なくなる。マイクロ遠心機においてフルスピード（２０，０００×ｇ；１４，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離して核酸を溶出させる。上記の例のＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １／２０１１は、当業者の知識を代表するものであり、限定的ではなく例示的なものである。本明細書では、上記方法の変形またはｃｆＲＮＡ精製の異なる手法を含む代替的な実施形態が想定され、本明細書で開示される方法及び組成物は、いずれかの特定のｃｆＲＮＡ精製方法に限定されるものではない。例示的なＲＮＡ方法については、下記の実施例１でさらに説明する。
ｉ． 遺伝子発現レベルを検出するシーケンシングベースの方法
いくつかの実施形態において、ＲＮＡレベルは、シーケンシング技術を使用してアッセイされ得る。シーケンシング技術の例は、パイロシーケンシング、例えば、「４５４」法（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４３７：３７６－３８０、Ｒｏｎａｇｈｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２：８４－８９）、「Ｓｏｌｅｘａ」もしくはＩｌｌｕｍｉｎａタイプのシーケンシング（Ｆｅｄｕｒｃｏ ｅｔ ａｌ．， （２００６）， ＢＴＡ， ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌａｓｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｃｏｌｏｎｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４， ｅ２２、Ｔｕｒｃａｔｔｉ ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ｅ２５）、ＳＯＬｉＤシーケンシング技術（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｏｎｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９， １７２８－１７３２、ＭｃＫｅｒｎａｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ， （２００６） Ｒｅａｇｅｎｔｓ， ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、米国特許出願第２００８０００３５７１号）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ技術（Ｈａｒｒｉｓ， Ｔ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０， １０６－１０９）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｎｏｎ－ｏｐｔｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ４７５， ３４８－３５２）、ＳＭＲＴシーケンシング技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＧｒｉｄＩＯＮナノポアベースのシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｔｈｅ－ｇｒｉｄｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ／ｔｈｅ－ｇｒｉｄｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ）など、１つまたは複数の技術を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ａｎｄ Ｊｉ，“Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（１０）：１１３５－１１４５ （２００８）、または当業者に利用可能な他の技術で説明されているような、任意の数のいわゆる「次世代」ＤＮＡシーケンシング法が使用され得る。ＤＮＡ配列の判定のための他の方法も適用可能であり、本明細書で開示される実施形態は、特定の遺伝子座における塩基同一性を判定するいずれかの特定の方法に限定されてあらゆる他の方法を除外するものではない。
いくつかの実施形態において、クローン増幅された分子及び単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にする次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技法が使用される。ＮＧＳの非限定的な例は、可逆的色素ターミネーターを使用する合成によるシーケンシング、及びライゲーションによるシーケンシングを含む。
いくつかの実施形態では、検出される少なくとも１つのＲＮＡ分子、少なくとも１つの第１のアダプター、少なくとも１つの第２のアダプター、及び二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼを含むライゲーション反応組成物が形成される。第１のアダプターは、３’末端に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが一緒にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含む。第２のアダプターは、５’リン酸基を含む第３のオリゴヌクレオチドと、第３のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドが一緒にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４のオリゴヌクレオチドとを含む。第１のアダプター及び第２のアダプターは、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼによってライゲーション反応組成物中のＲＮＡ分子にライゲーションされて、ライゲーション産物を形成する。第１のアダプター及び第２のアダプターは、それらの構造に起因して方向性のある様式でＲＮＡ分子とアニーリングし、各アダプターは、それがアニーリングされるＲＮＡ分子に、連続的にではなく同時にまたはほぼ同時にライゲーションされる（例えば、第２のアダプター及びＲＮＡ分子がリガーゼと組み合わされ、第２のアダプターがＲＮＡ分子の３’末端にライゲーションされると、その後、第１のアダプターがライゲーション後のＲＮＡ分子－第２のアダプターと組み合わされ、次いで第１のアダプターがＲＮＡ分子－第２のアダプターの５’末端にライゲーションされ、第２のアダプターのＲＮＡ分子へのライゲーションと、第１のアダプターのＲＮＡ分子へのライゲーションとの間には、介在する精製ステップがある。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５： １８８－２００， ２００１、Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． Ｓｕｐｐ． ３８： Ｓ２－Ｓ７， ２００６を参照のこと）。成分がライゲーション反応組成物に加えられる順序は限定的ではなく、成分は任意の順序で加えられ得ることが理解されるべきである。また、成分を加えるプロセス中に、リガーゼの存在下でアダプターを対応するＲＮＡ分子とライゲーションしてから、反応組成物の成分の全てを加えてもよいこと、例えば、限定ではないが、リガーゼの存在下で第２のアダプターを対応するＲＮＡ分子とライゲーションしてから、第１のアダプターを加えてもよいこと、そして、一方のアダプターがＲＮＡ分子にライゲーションされる時と、他方のアダプターがＲＮＡ分子にライゲーションされる時との間に精製手順がない限り、このような反応は本教示の意図される範囲内であることが理解されるべきである。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれることもある）をライゲーション産物と合わせて反応混合物を形成し、これを逆転写産物に好適な条件下でインキュベートする。逆転写産物を、リボヌクレアーゼ、典型的にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）と合わせると、リボヌクレオシドの少なくとも一部が逆転写産物から消化されて、増幅テンプレートが形成される。
次に、増幅テンプレートを、少なくとも１つのフォワードプライマー、少なくとも１つのリバースプライマー、及びＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれることもある）と合わせて、増幅反応組成物を形成する。増幅産物の生成を可能にするのに好適な条件下で増幅反応組成物をサーモサイクルにかける。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも１つの種が検出される。いくつかの実施形態において、レポータープローブ及び／または核酸色素が、サンプル中のＲＮＡ種の少なくとも１つの存在を間接的に検出するために使用される。特定の実施形態において、増幅反応組成物は、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーなどだがこれらに限定されないレポータープローブ、あるいは例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎまたは他の核酸結合色素もしくは核酸挿入色素だがこれに限定されない核酸色素をさらに含む。本教示の特定の実施形態では、検出は、定量的ＰＣＲを含むがこれに限定されない、リアルタイムまたはエンドポイント検出技法を含む。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列が判定され、これにより、対応するＲＮＡ分子を同定することができる。いくつかの実施形態において、ライブラリー特異的ヌクレオチド配列を含む増幅産物のライブラリーが、出発物質中のＲＮＡ分子から生成され、ここで、増幅産物種のうちの少なくともいくつかは、バーコード配列もしくはハイブリダイゼーションタグ、または一般的なマーカーもしくはアフィニティータグを含むがこれらに限定されない、例えばライブラリー特異的ヌクレオチド配列だがこれに限定されない、ライブラリー特異的識別子を共通して有する。いくつかの実施形態では、２つ以上のライブラリーが組み合わされて分析され、次いで、結果がライブラリー特異的識別子に基づいてデコンボリューションされる。
いくつかの実施形態において、１つのポリメラーゼ、すなわち、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含むＤＮＡポリメラーゼのみが、逆転写反応組成物に用いられ、追加のポリメラーゼは使用されない。他の方法の実施形態では、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの両方が逆転写反応組成物に加えられ、追加のポリメラーゼは増幅反応組成物に加えられない。
いくつかの実施形態において、サンプル中のＲＮＡ分子を検出する方法は、ライゲーション反応組成物を形成するように、少なくとも１つの第１のアダプター、少なくとも１つの第２のアダプター、及び二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドとサンプルを合わせることであって、少なくとも１つの第１のアダプター及び少なくとも１つの第２のアダプターは、サンプルのＲＮＡ分子にライゲーションされて、同じライゲーション反応組成物においてライゲーション産物を形成する、合わせることと、ライゲーション産物のＲＮＡ分子またはその代用物を検出することとを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第１のアダプターは、１０～６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ３’末端に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが二重鎖になるとき、１～８ヌクレオチドの一本鎖５’部分をさらに含む、第２のオリゴヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２のアダプターは、１０～６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ５’リン酸基を含む第３のオリゴヌクレオチドと、第３のオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドであって、第３のオリゴヌクレオチド及び第４のオリゴヌクレオチドが二重鎖になるとき、１～８ヌクレオチドの一本鎖３’部分をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、一本鎖部分は、独立して、縮重ヌクレオチド配列、またはＲＮＡ分子の一部分に相補的である配列を有する。いくつかの実施形態において、第１及び第３のオリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有する。ライゲーション反応組成物において、検出されるＲＮＡ分子は、少なくとも１つの第１のアダプターの一本鎖部分及び少なくとも１つの第２のアダプターの一本鎖部分とハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子またはその代用物を検出することは、ライゲーション産物を、ｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼ、またはｉｉｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることと；ライゲーション産物を逆転写して逆転写産物を形成することと；リボヌクレアーゼＨを用いて逆転写産物からリボヌクレオシドのうちの少なくともいくつかを消化して増幅テンプレートを形成することと；増幅反応組成物を形成するように、増幅テンプレートを、少なくとも１つのフォワードプライマー、少なくとも１つのリバースプライマー、及びライゲーション産物がｉ）のように合わされる場合はＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることと；増幅反応組成物をサイクルにかけて少なくとも１つの増幅産物を形成し、増幅産物の少なくとも一部の配列を判定し、これによってＲＮＡ分子を検出することとを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡライブラリーを生成する方法は、ライゲーション反応組成物を形成するように、複数の異なるＲＮＡ分子を、複数の第１のアダプター種、複数の第２のアダプター種、及び二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼと合わせることであって、少なくとも１つの第１のアダプターは、３’末端に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが一緒にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含み、少なくとも１つの第２のアダプターは、５’リン酸基を含む第３のオリゴヌクレオチドと、第３のオリゴヌクレオチド及び第４のオリゴヌクレオチドが一緒にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４のオリゴヌクレオチドとを含む、合わせることと、複数の異なるライゲーション産物種を形成するように、少なくとも１つの第１のアダプター及び少なくとも１つの第２のアダプターをＲＮＡ分子にライゲーションすることであって、第１のアダプター及び第２のアダプターは、同じライゲーション反応組成物においてＲＮＡ分子にライゲーションされる、ライゲーションすることとを含む。この方法は、複数のライゲーション産物種をＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることと、複数のライゲーション産物種のうちの少なくともいくつかを逆転写して、複数の逆転写産物種を形成することと、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を用いて複数の逆転写産物のうちの少なくともいくつかからリボヌクレオシドのうちの少なくともいくつかを消化して複数の増幅テンプレート種を形成することと、複数の増幅テンプレート種を、少なくとも１つのフォワードプライマー、少なくとも１つのリバースプライマー、及びＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせて、増幅反応組成物を形成することと、増幅反応組成物をサイクルにかけて、複数の増幅産物種を含むライブラリーを形成することであって、増幅産物種のうちの少なくともいくつかは、ライブラリー内の他の増幅産物種のうちの少なくともいくつかと共通する識別配列を含む、形成することとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列が判定され、これにより、目的のＲＮＡ分子が検出される。「シーケンシング」という用語は、本明細書では広義に使用され、伸長産物またはベクターインサートの少なくとも一部を含むがこれらに限定されない、ＲＮＡの少なくとも一部における少なくともいくつかの連続するヌクレオチドの順序を同定することを可能にする、当技術分野で知られる任意の技法を指す。シーケンシング技法のいくつかの非限定的な例は、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシターミネーター法ならびにＭａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの化学的切断法を含み、これらの方法の変形、すなわち、例えばビーズアレイなどのマイクロアレイまたはビーズへの増幅産物のハイブリダイゼーションだがこれに限定されないハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３－６５， １９９８を参照のこと）、及び制限マッピングを含む。いくつかのシーケンシング方法は、キャピラリー電気泳動及びゲル電気泳動を含むがこれらに限定されない電気泳動、質量分析、ならびに単分子検出を含む。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、直接シーケンシング、デュプレックスシーケンシング、サイクルシーケンシング、単一塩基伸長シーケンシング（ＳＢＥ）、固相シーケンシング、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００－Ａｖａｎｔ、３７３０、または３７３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、もしくはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ２０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、または質量分析計だがこれらに限定されない計器を使用して、シーケンシング産物を検出することを含む。特定の実施形態において、シーケンシングは、エマルジョンＰＣＲ（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（７）：５４５－５０， ２００６を参照のこと）を含む。特定の実施形態において、シーケンシングは、例えば超並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）だがこれに限定されないハイスループットシーケンシング技法を含む。ＭＰＳＳの説明は、とりわけ、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３１：２８５－３１１， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｒｅｉｎａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， １：９５－１０４， ２００２、Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１００７－１４， ２００５に見出すことができる。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、ｄＮＴＰのジデオキシリボヌクレオチドバージョンを含むｄＮＴＰを、増幅産物に組み込むことを含む。
核酸分子の少なくとも一部分の配列を判定するのに有用であるさらなる例示的な技法は、エマルジョンベースのＰＣＲとそれに続く任意の好適な超並列シーケンシングまたは他のハイスループット技法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列を判定して対応するＲＮＡ分子を検出することは、増幅産物を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、例えば、「Ｒｅａｇｅｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｆｏｒ Ｂｅａｄ－Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題するＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ０６／０８４１３２号、及び「Ｒｅａｇｅｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｅａｄ－Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する同第ＷＯ０７／１２１４８９号に記載されているように、ＳＯＬｉＤ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施される。いくつかの実施形態において、増幅産物を定量化することは、リアルタイムもしくはエンドポイント定量的ＰＣＲ、またはその両方を含む。いくつかの実施形態において、増幅産物を定量化することは、ｍＲＮＡ発現プロファイルまたはｍｉＲＮＡ発現プロファイルといった、検出されるＲＮＡ分子の発現プロファイルを生成することを含む。特定の実施形態において、増幅産物を定量化することは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓだがこれらに限定されない１つまたは複数の５’－ヌクレアーゼアッセイを含み、これらは、低密度アレイを含むがこれに限定されないマイクロフルイディクスデバイスを含んでもよい。当技術分野で知られる任意の好適な発現プロファイリング技法を、本開示の方法の様々な実施形態で用いることができる。
当業者には、用いられるシーケンシング方法が典型的には本発明の方法の限定ではないことが理解されよう。むしろ、検出しようとする対応する増幅産物またはＲＮＡの少なくとも一部、または増幅産物に由来するベクターインサートの少なくとも一部の、少なくともいくつかの連続したヌクレオチドの順序を提供する任意のシーケンシング技法は、典型的に本発明の方法に使用することができる。シーケンシング技法の説明は、とりわけ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、特に第５章、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｉｕｚｄａｋ， Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＭＣＣ Ｐｒｅｓｓ， ２００３、特に第７章、及びＲａｐｌｅｙに見出すことができる。いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマー及び／またはｄＮＴＰは、例えばＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（登録商標）試薬（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）だがこれに限定されない、エキソヌクレアーゼＩ及びシュリンプアルカリホスファターゼによる消化を含むがこれに限定されない酵素分解により、シーケンシングステップの前に除去される。いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマー、ｄＮＴＰ、及び／またはｄｄＮＴＰは、ゲルもしくはカラム精製、沈降、濾過、ビーズ、磁気分離、またはハイブリダイゼーションベースのプルアウトにより、必要に応じて除去される（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｕｐｌｅｘ（商標）３８４ Ｗｅｌｌ Ｆ／Ｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４３０８０８２を参照のこと）。
当業者には、特定の実施形態において、用いられるシーケンシング／再シーケンシング技法のリード長が、効果的に検出され得るＲＮＡ分子のサイズの要因であり得ることが理解されよう（例えば、Ｋｌｉｎｇ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２１（１２）：１４２５－２７を参照のこと）。いくつかの実施形態において、第１のサンプルにおけるＲＮＡ分子から生成された増幅産物は、第１の識別配列（本明細書では「バーコード」と呼ばれることもある）または他のマーカーで標識され、第２のサンプルにおけるＲＮＡ分子から生成された増幅産物は、第２の識別配列または第２のマーカーで標識され、第１の識別配列を含む増幅産物及び第２の識別配列を含む増幅産物は、対応するサンプル中の対応するＲＮＡ分子の配列を判定する前にプールされる。特定の実施形態において、該当するライブラリーに特異的な識別子配列を各々が含む３つ以上の異なるＲＮＡライブラリーが組み合わされる。いくつかの実施形態において、第１のアダプター、第２のアダプター、フォワードプライマー、リバースプライマー、またはこれらの組み合わせは、識別配列または識別配列の相補体を含む。
いくつかの実施形態において、シーケンシングは、後述のように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、ならびに４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）の合成によるシーケンシングプラットフォーム、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームといった、市販されている技術を使用することを含む。Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの合成によるシーケンシングを使用して行われる単分子シーケンシングに加えて、他の単分子シーケンシング技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴ（登録商標）技術、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（登録商標）技術、及び例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発されたナノポアシーケンシングを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）複数の第１のプライマー中の２つ以上の第１のプライマーの３’領域と、ＲＮＡサンプル中の２つ以上のＲＮＡ分子との間に複合体が形成され、第１のプライマーの３’領域がランダムヌクレオチド配列及び第１のヌクレオチド配列タグを含む条件下で、複数の第１のプライマーをＲＮＡサンプルにハイブリダイズさせること；（ｂ）複合体の複数の第１のプライマーを逆転写によって伸長させ、これによって２つ以上のＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成すること；（ｃ）第２のヌクレオチド配列タグを含む複数の二本鎖ポリヌクレオチド分子を、２つ以上のｃＤＮＡ分子に、（ｉ）複数の二本鎖ポリヌクレオチド分子中の二本鎖ポリヌクレオチド分子の３’オーバーハングと、ｃＤＮＡ分子の３’領域との間に複合体が形成され、３’オーバーハングが第２のランダムヌクレオチド配列を含み、かつ（ｉｉ）複数の二本鎖ポリヌクレオチド分子中の二本鎖ポリヌクレオチド分子の相補的な第２の鎖の５’末端がｃＤＮＡ分子の３’末端に隣接する条件下で、ハイブリダイズさせること；（ｄ）二本鎖ポリヌクレオチド分子の相補的な第２の鎖の５’末端を２つ以上のｃＤＮＡ分子の３’末端に結合させ、これによって二本鎖ポリヌクレオチド分子の未結合の鎖を生成すること；（ｅ）二本鎖ポリヌクレオチド分子の未結合の鎖を除去し、これによって第１及び第２のヌクレオチド配列タグを含む複数の一本鎖ｃＤＮＡ分子を形成すること、ならびに（ｆ）複数の一本鎖ｃＤＮＡ分子を二本鎖ｃＤＮＡ分子に変換し、これによってＲＮＡサンプル中のＲＮＡ分子の特定の鎖を表すｃＤＮＡライブラリーを作出することにより、ＲＮＡサンプル中のＲＮＡ分子の特定の鎖を表す相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを作出することを含む。
他の実施形態では、この方法は、（ａ）複数の第１のプライマー中の２つ以上の第１のプライマーの３’領域と、ＲＮＡサンプル中の２つ以上のＲＮＡ分子との間に複合体が形成され、一本鎖プライマーの３’領域がランダムヌクレオチド配列及び第１のヌクレオチド配列タグを含む条件下で、複数の第１のプライマーをＲＮＡサンプルにハイブリダイズさせること；（ｂ）複合体の第１のプライマーを逆転写によって伸長させ、これによって２つ以上のＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成すること；（ｃ）ある条件下で二本鎖ポリヌクレオチド分子をｃＤＮＡ分子に結合させることであって、（ｃ）二本鎖ポリヌクレオチド分子の５’末端がｃＤＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子が二本鎖ポリヌクレオチド分子の３’末端に結合せず、二本鎖ＤＮＡ分子が第２のヌクレオチド配列タグを含む条件下で、二本鎖ポリヌクレオチド分子をｃＤＮＡ分子に結合させること；（ｄ）前記ＲＮＡ分子を除去すること；ならびに（ｅ）相補的な第２の鎖ＤＮＡ分子を前記ｃＤＮＡ分子から合成し、これによってＲＮＡサンプル中のＲＮＡ分子の特定の鎖を表すｃＤＮＡライブラリーを形成することにより、ＲＮＡサンプル中のＲＮＡ分子の特定の鎖を表すｃＤＮＡライブラリーを作出することを含む。
いくつかの実施形態において、プライマーは、非ランダム配列、例えばポリＴまたはポリＡ配列を使用してポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよく、非ランダム配列は、この実施形態のいくつかの形態では、標的とハイブリダイズするランダムまたは非ランダムの非ポリ－Ｔまたは非ポリ－Ｔ配列で終わる場合がある。別の例として、プライマーは、エクソン配列と実質的に相補的または実質的に同じのいずれかに対応する配列を含み得る。複数のポリヌクレオチドが同時に標的とされる場合、プライマーは、複数のポリヌクレオチドを標的とするものと同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、超並列シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａの合成によるシーケンシング及び可逆的ターミネーターに基づくシーケンシング化学（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ６：５３－５９ ［２００９］に記載の通り）を使用する。いくつかの実施形態において、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシング技術は、オリゴヌクレオチドアンカーが結合している平面的で光学的に透明な表面にＲＮＡ転写物の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が結合することに依存する。テンプレートｃＤＮＡを末端修復して、５’－リン酸化平滑末端を生成し、Ｋｌｅｎｏｗ断片のポリメラーゼ活性を使用して、平滑なリン酸化ＤＮＡ断片の３’末端に単一のＡ塩基を付加する。この付加により、ライゲーション効率を増加させる単一のＴ塩基のオーバーハングを３’末端に有する、オリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションするためのＤＮＡ断片が調製される。アダプターオリゴヌクレオチドは、フローセルアンカーに相補的である。限界希釈条件下で、アダプター修飾された一本鎖テンプレートＤＮＡがフローセルに加えられ、アンカーへのハイブリダイゼーションによって固定化される。結合したＤＮＡ断片を伸長させ、ブリッジ増幅すると、同じテンプレートの約１，０００コピーを各々が含む億単位のクラスターを有する超高密度シーケンシングフローセルが作出される。一実施形態において、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクラスター増幅に供する前に、ＰＣＲを使用して増幅する。
いくつかの実施形態において、除去可能な蛍光色素を備えた可逆的ターミネーターを用いる合成によるロバストな４色ＤＮＡシーケンシング技術を使用して、テンプレートをシーケンシングする。高感度蛍光検出は、レーザー励起及び全内反射光学を使用して達成される。約２０～４０ｂｐ、例えば、３６ｂｐの短い配列リードが、リピートマスクされた参照ゲノムに対してアラインされ、参照ゲノムに対する短い配列リードのユニークマッピングが、特別に開発されたデータ分析パイプラインソフトウェアを使用して同定される。リピートマスクされていない参照ゲノムを使用することもできる。リピートマスクされた参照ゲノムまたはリピートマスクされていない参照ゲノムのいずれが使用されるかにかかわらず、参照ゲノムにユニークにマッピングされるリードのみが計数される。第１のリードの完了後、テンプレートをｉｎ ｓｉｔｕで再生して、断片の反対端から第２のリードを可能にすることができる。よって、ＤＮＡ断片のシングルエンドシーケンシングを使用してもペアエンドシーケンシングを使用してもよい。サンプル中に存在するＤＮＡ断片の部分的なシーケンシングを行い、所定の長さ、例えば３６ｂｐのリードを含む配列タグを、既知の参照ゲノムにマッピングし、計数する。一実施形態において、ｃＤＮＡ分子のクローン増幅されたコピーの一端をシーケンシングし、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（ＥＬＡＮＤ）ソフトウェアを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒのバイオインフォマティクスアラインメント分析によって処理する。
ｉｉ． ＲＮＡ発現レベルを検出するＰＣＲベースの方法
ＲＮＡ抽出法によって生成されたサンプルは、高純度で、ＰＣＲ阻害剤を含まない場合があり、例えば、様々なタイプのがんのアッセイとしてＲＮＡ相対発現をアッセイするために、いくつかの実施形態で使用されるｑＰＣＲに好適であり得る。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、アンプリコンを生成するためにＰＣＲまたはｑＰＣＲを行うことを含む。ＰＣＲ及びｑＰＣＲのプロトコールは、本明細書以下で例示されており、標的遺伝子及び参照遺伝子の検出及び／または同定のために本明細書に記載される組成物を使用する使用に直接適用または適合させることができる。
いくつかの実施形態は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）を含む方法を提供する。ｑＰＣＲは、定量的測定を行い、時間及び夾雑を低減させるという利点ももたらし得る。本明細書で使用される場合、「定量的ＰＣＲ」（「ｑＰＣＲ」またはより具体的には「リアルタイムｑＰＣＲ」）とは、反応産物のサンプリングを繰り返す必要なしに、発生中のＰＣＲ増幅の進行を直接モニタリングすることを指す。ｑＰＣＲでは、反応産物は、それらが生成されるときにシグナル伝達機構（例えば蛍光）を介してモニタリングされ得、シグナルがバックグラウンドレベルを超えて上昇した後、しかし反応がプラトーに達する前に追跡される。蛍光の検出可能または「閾値」レベルを達成するのに必要なサイクルの数（本明細書ではサイクル閾値または「ＣＴ」と呼ばれる）は、ＰＣＲプロセスの開始時の増幅可能な標的の濃度に正比例し、リアルタイムでサンプル中の標的核酸の量の測度を提供するシグナル強度の測定を可能にする。
ＰＣＲ及びｑＰＣＲ反応の準備をするには、反応混合物は、最小限の、テンプレート核酸（例えば、後述する陰性対照の場合を除き、検査サンプルに存在する）ならびにオリゴヌクレオチドプライマー及び／またはプローブを、好適なバッファー、塩など、及び適切な濃度の核酸ポリメラーゼと組み合わせて含む。本明細書で使用される場合、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。一般に、この酵素は、標的配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終結するまでテンプレートに沿って５’－３’方向に進む。適切な濃度は、本明細書に記載される方法において、この反応を触媒するものを含む。本明細書で開示される方法において有用な公知のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰＴＡＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＬＥＮＴＡＱ １（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．）、ＨＯＴＧＯＬＤＳＴＡＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＫＡＰＡＴＡＱ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｓ）、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）などを含む。
上記の成分に加えて、本発明の方法の反応混合物は、プライマー、プローブ、及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
通常、反応混合物は、４つの天然に発生するヌクレオシド塩基に対応する４つの異なるタイプのｄＮＴＰ、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰをさらに含む。いくつかの実施形態において、各ｄＮＴＰは、典型的には、約１０～５０００μＭ、通常は約２０～１０００μＭ、約１００～８００μＭ、または約３００～６００μＭの範囲の量で存在する。
反応混合物は、一価イオン源、二価カチオン源、及び緩衝剤を含む水性緩衝媒体をさらに含むことができる。塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの任意の簡便な一価イオン源を使用することができる。二価カチオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛などであり得、ここで、カチオンは、典型的にはマグネシウムである。塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどを含む、任意の簡便なマグネシウムカチオン源を用いることができる。バッファー中に存在するマグネシウムの量は、０．５～１０ｍＭの範囲であり得、約１～約６ｍＭ、または約３～約５ｍＭの範囲とすることができる。バッファー中に存在し得る代表的な緩衝剤または塩は、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどを含み、緩衝剤の量は、典型的には約５～１５０ｍＭ、通常は約１０～１００ｍＭ、より一般的には約２０～５０ｍＭの範囲であり、特定の好ましい実施形態において、緩衝剤は、約６．０～９．５の範囲、例えば、約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、または９．５のｐＨをもたらすのに十分な量で存在する。緩衝媒体中に存在し得る他の薬剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤が含まれる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡなどを含むことができる。さらに、いくつかの実施形態において、反応物は、特に試薬が長期間保存され得るマスターミックスとして提供される場合、トレハロースなどの凍結防止剤を含み得る。
反応混合物を調製する際、様々な構成成分を任意の都合のよい順序で合わせることができる。例えば、バッファーをプライマー、ポリメラーゼ、次いでテンプレート核酸と合わせてもよく、または様々な構成成分の全てを同時に合わせて反応混合物を生成してもよい。
代替的に、例えば、Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ ＰＣＲミックス（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）もしくはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ＆＃８４８２；Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、またはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む、市販の混合済み試薬を、製造元の説明書に従って、または反応条件を改善するために改変して（例えば、必要に応じて、バッファー濃度、カチオン濃度、またはｄＮＴＰ濃度の改変）、本明細書で開示される方法において利用してもよい。
反応混合物は、プライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件」）、例えば、テンプレート鎖をテンプレートとして使用したプライマー分子の末端へのヌクレオチドの付加により、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長を可能にする条件に供され得る。多くの実施形態において、プライマー伸長反応条件は、増幅条件であり、この条件は、複数の反応サイクルを含み、各反応サイクルは、（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップ、及び（３）重合ステップを含む。後述するように、いくつかの実施形態において、増幅プロトコールは、アニーリングに特化した特定の時間を含まず、代わりに、変性及び伸長に特化した特定の時間のみを含む。反応サイクルの数は、行われる適用形態に応じて異なるが、通常は少なくとも１５、より一般的には少なくとも２０であり、最高６０またはそれ以上であってもよく、異なるサイクルの数は、典型的には約２０～４０の範囲である。約２５を超える、通常は約３０を超えるサイクルが行われる方法の場合、酵素的プライマー伸長に好適な条件が維持されるように、反応混合物に追加のポリメラーゼを導入することが便利または望ましい場合がある。
変性ステップは、反応混合物を高温に加熱し、反応混合物中に存在するあらゆる二本鎖またはハイブリダイズした核酸が解離するのに十分な時間にわたり、混合物を高温に維持することを含む。変性の場合、反応混合物の温度を、通常、約８５～１００℃、通常は約９０～９８℃、より一般的には約９３～９６℃の範囲の温度に上昇させ、この温度で約３～１２０秒の範囲、通常は約３秒からの時間にわたって維持する。
変性に続いて、反応混合物は、テンプレートとしてハイブリダイズされる核酸を使用してプライマーが５’から３’の方向に伸長される様式で、混合物中に存在する（存在する場合）テンプレート核酸へのプライマーアニーリング、及びプライマー末端へのヌクレオチドの重合に十分な条件、例えば、プライマー伸長産物の酵素による生成に十分な条件に供され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング及び伸長プロセスは、同じステップで起こる。これらの条件を達成するために下げられる反応混合物の温度は、通常、最適な効率及び特異性をもたらすように選択され、一般的には約５０～８５℃、通常は約５５～７０℃、より一般的には約６０～６８℃の範囲である。いくつかの実施形態において、アニーリング条件は、約１５秒～３０分、通常は約２０秒～５分、もしくは約３０秒～１分の範囲、または約３０秒の時間にわたって維持され得る。
このステップは、場合により、アニーリングステップ及び伸長ステップの各々を１つ含むことができ、各ステップで温度及び時間の長さが変更及び最適化される。２ステップのアニーリング及び伸長の場合、アニーリングステップは上記のように進めることができる。テンプレート核酸へのプライマーのアニーリングに続いて、反応混合物はさらに、上記のようにプライマー末端にヌクレオチドを重合させるのに十分な条件に供される。重合条件を達成するためには、反応混合物の温度を、典型的に、約６５～７５℃、通常は約６７～７３℃の範囲の温度に上昇させるか、またはこの温度で維持し、約１５秒～２０分、通常は約３０秒～５分の範囲の時間にわたって維持する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、別個のアニーリング及び伸長ステップを含まない。むしろ、これらの方法は、変性及び伸長ステップを含み、特にアニーリングに特化したステップを含まない。
変性、アニーリング、及び伸長の上記のサイクルは、典型的にサーマルサイクラーとして知られている自動化されたデバイスを使用して行われ得る。用いることのできるサーマルサイクラーは、本明細書の他の箇所、ならびに米国特許第５，６１２，４７３号、同第５，６０２，７５６号、同第５，５３８，８７１号、及び同第５，４７５，６１０号に記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される方法は、非ＰＣＲベースの用途において、標的核酸配列を検出するために使用することもでき、この標的は、固体支持体上に固定化され得る。核酸配列を固体支持体上に固定化する方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）において説明されており、また、製造元により提供されているプロトコール、例えば、膜についてはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ａｍｐ；Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁気ビーズについてはＤｙｎａｌ、培養プレートについてはＣｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、ビーズアレイプラットフォームについてはＬｕｍｉｎｅｘ及びＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、本明細書で提供される実施形態に従って有用な他の支持体についてはＣＰＧ，Ｉｎｃによって説明されている。
同様の増幅または検出／数量化結果をもたらす、様々な試薬の正確な量、及びＰＣＲまたは他の好適な増幅手順のための条件（例えば、バッファー条件、サイクリング時間など）の変更は、均等物とみなされる。一実施形態において、対象のｑＰＣＲ検出は、サンプル中の標的核酸の５０コピー未満（好ましくは２５コピー未満、より好ましくは１５コピー未満、さらにより好ましくは１０コピー未満、例えば、５、４、３、２、または１コピー）を検出する感度を有する。
いくつかの実施形態において、この方法は、テンプレートＲＮＡのＰＣＲ増幅を含み得る。ＤＮａｓｅ処理を行ってＲＮＡサンプルからＤＮＡ夾雑を除去してもよい。標的ＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換してもよく、このステップは、ＰＣＲ反応で使用したものと同じプライマーのうちの１つまたは複数を使用してもよい。標的ｃＤＮＡは、例えば、血漿由来のｃＤＮＡまたは他のｃＤＮＡを増幅するための一貫性のある反復可能な方法によって増幅してもよい。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ中の１つまたは複数の標的は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）化学を介して増幅及び数量化され得る。このプロトコールは、ＲＮＡ量を検出するための唯一の好適なプロトコールではない場合がある。しかしながら、プロトコールの変化は最終的な結果に大きな影響を与え得るので、ｃＤＮＡ合成及び増幅には一貫性のあるプロトコールを使用することが重要であり得る。
いくつかの実施形態において、Ｑｉａｇｅｎアッセイ＃ＱＦ００１１９６０２が、製造元のプロトコールに従って提供されるプライマー／プローブを使用したｑＰＣＲに使用され得る。ＡｇｉｌｅｎｔのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡをｑＰＣＲの標準として使用してもよい。
ＲＮＡ標準は、複数のランで結果を標準化するために使用され得る。この標準は、異なる希釈度でランすることができる。いくつかの実施形態において、合成標準が使用され得る。例えば、１つまたは複数のマーカーの正常範囲及びカットオフを検査してもよく、合成標準を得て直接使用してもよく、またはマーカーの予測されるレベルなどの予測されるレベルと同様のレベルになるように希釈するもしくは合わせてもよい。いくつかの実施形態において、合成標準は、患者サンプル中の予測されるレベル、またはこのレベルの１桁以内（例えば１０倍高いまたは１０倍低い）レベルで存在する。いくつかの実施形態において、合成標準は、患者サンプルについて予測されたレベル、またはこのレベルの５倍以内の差の（５倍高いまたは５倍低い）レベルで存在する。いくつかの実施形態において、合成標準は、患者サンプルについて予測されたレベル、またはこのレベルの２倍以内の差の（２倍高いまたは２倍低い）レベルで存在する。
合成標準中の各合成ＲＮＡの適切なレベルを判定するには、多くの方法が使用され得る。一実施形態において、これらを代表するいくつかのサンプルをランして結果（例えば、標準に対するＣｔ値または当てはめ値）を記録してもよい。次いで、各合成ＲＮＡを同じアッセイでランしてもよく、サンプルと同じスケール（例えば、標準に対するＣｔスコアまたは当てはめ値）で結果を測定してもよい。検査により、どの標準を使用すべきかを判定することができる。例えば、５０個のサンプルをランしてもよく、所与の遺伝子について３３～３８の範囲のＣｔスコアが得られる。１μＬ当たり１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２コピーの標準は、２４、２８、３２、３６、４０、または４４のＣｔスコアをもたらし得る。よって、アッセイ準備中、１０５標準を使用し、１０４及び１０３への希釈を行うことを決定できる。この戦略を使用すると、将来のサンプルをカバーするために、元の標準及び２つの希釈のみが必要である。同様の方法を使用して、同じマルチプレックスにおける他の標準の適切な濃度を選択することができる。この方法を使用すると、アッセイしようとする各転写物に異なる濃度を使用することができるので、マルチプレックス内の異なる遺伝子間に大きな不一致がある場合でも、単一の標準を使用することができる。本明細書で開示される方法を使用することにより、標準的なテンプレートでの増幅反応の回数を減らして、広範囲の蓄積レベルの転写物をアッセイすることができる。
例えば、遺伝子Ａが１００～１０，０００コピー／μｌの範囲にあり、遺伝子Ｂが１，０００，０００～１００，０００，０００コピーの範囲にあると予想される場合、１０，０００コピーの遺伝子Ａと１００，０００，０００コピーの遺伝子Ｂとの混合された合成標準を作出することができ、これにより、サンプルについて予想される全範囲をカバーするのに、１０倍希釈系列で３つの標準のみが必要になる。このような合成標準を使用すると、いくつかの実施形態では、遺伝子ａと遺伝子Ｂの両方の予想範囲をカバーする標準曲線を生成するためにｑＰＣＲ反応プレートでランする必要のある標準または対照サンプルの数が劇的に低減する。この方法はまた、段階希釈中の配合によるピペッティングによって導入される小さなエラーのリスクを最小限に抑える。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）は、バイオマーカーのＲＮＡレベル、例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡレベルを判定するために使用され得る。ＲＴ－ＰＣＲを使用すると、異なるサンプル集団における、正常組織及び腫瘍組織における、薬物処置の有無にかかわらない、バイオマーカーのこのようなＲＮＡレベルを比較すること、遺伝子発現のパターンの特性決定を行うこと、密接に関連するＲＮＡを区別すること、ならびにＲＮＡ構造を分析することができる。
典型的に、第１のステップは、サンプルからＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを単離することである。出発物質は、ヒトサンプル、例えば、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、及び対応する正常組織または細胞株からそれぞれ単離された、全ＲＮＡであり得る。よって、ＲＮＡを、サンプル、例えば、腫瘍細胞または腫瘍細胞株から単離し、健康なドナー由来のプールＤＮＡと比較してもよい。ｍＲＮＡ源が原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡを抽出することができる。
ＲＮＡがｍＲＮＡを含むか、ｍｉＲＮＡを含むか、または他のタイプのＲＮＡを含むかにかかわらず、ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングは、ＲＮＡテンプレートを逆転写してｃＤＮＡにし、続いてＰＣＲ反応で増幅させることを含み得る。一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）を含むが、これらに限定されない。逆転写ステップは、典型的に、状況及び発現プロファイリングの目的に応じて、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、ステムループプライマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を製造元の説明に従って使用して、逆転写することができる。得られたｃＤＮＡは、次いで、後のＰＣＲ反応でテンプレートとして使用することができる。
いくつかの実施形態において、ＰＣＲステップは、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’－５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠いているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは典型的に、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’－ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、均等な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用してよい。ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成するためには、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するよう設計されている。このプローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能であり、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。レーザーにより誘導されたレポーター色素からの発光は、２つの色素がプローブ上にあり、それらが互いの近くに位置する場合、クエンチ色素によってクエンチされる。増幅反応中、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存性様式でプローブを切断する。結果として得られるプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルには、第２のフルオロフォアのクエンチ効果がない。合成される新しい分子毎にレポーター色素の１分子が遊離し、クエンチされていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎を提供する。
いくつかの実施形態において、ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販の機器を使用して行うことができる。一実施形態において、５’ヌクレアーゼの手順は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスで実行される。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラ、及びコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラーで９６ウェルフォーマットのサンプルを増幅する。増幅中、レーザーにより誘導された蛍光シグナルが、９６ウェル全てで光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。このシステムは、計器を動作させデータを分析するためのソフトウェアを含む。ＴａｑＭａｎデータはまず、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表される。蛍光値は、全てのサイクルで記録され、増幅反応中のその時点までに増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
いくつかの実施形態において、エラー及びサンプル間変動の影響を最小限に抑えるために、内部標準を使用したＲＴ－ＰＣＲが行われる。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現され、実験的処理の影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ－アクチンのｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、リアルタイム定量的ＰＣＲは、二重標識されたＦＲＥＴ蛍光発生プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）を使用して、ＰＣＲ産物の蓄積を測定することができる。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部競合物質が正規化に使用される定量的競合ＰＣＲと、サンプルに含まれる正規化遺伝子またはＲＴ－ＰＣＲのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方に適合する。例えば、Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６－９９４を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ＰＣＲフラップアッセイを使用してサンプル中のＲＮＡを測定することができる。実施例１において詳細に説明するように、ＱｕＡＲＴＳ及びＬＱＡＳ／ＴＥＬＱＡＳフラップアッセイ技術は、ポリメラーゼベースの標的ＤＮＡ増幅プロセスを、侵襲的切断ベースのシグナル増幅プロセスと組み合わせたものである。本明細書で後述するのは、サンプルからのＲＮＡの定量化のために、逆転写と、これらのフラップアッセイ技術を組み合わせるアッセイである。
ｉｉｉ． 遺伝子発現レベルを検出する代替的方法
いくつかの実施形態において、ＲＮＡレベルは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ｎＣｏｕｎｔｅｒ、または同様のものを介してアッセイされ得る。例えば、差次的発現研究で一般的に使用されるアレイの１つのクラスには、マイクロアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイが含まる。これらのアレイでは、基質上で直接合成され、相補的ハイブリダイゼーションの原理に基づいて複雑なＲＮＡまたはメッセージ集団を精査するために使用される多数のプローブが利用される。典型的に、これらのマイクロアレイは、目的の遺伝子またはヌクレオチド配列の選択された領域にわたる比較的短い長さ（２０量体～２５量体）の１６～２０セットのオリゴヌクレオチドプローブペアを提供する。オリゴヌクレオチドアレイで使用されるプローブペアは、同じＲＮＡまたはメッセージ鎖にハイブリダイズするよう設計されたパーフェクトマッチプローブ及びミスマッチプローブも含む。パーフェクトマッチプローブは、目的のメッセージに完全に相補的である既知の配列を含み、ミスマッチプローブは、パーフェクトマッチプローブと異なる少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むことを除いては、その配列に関してパーフェクトマッチプローブに類似している。発現の分析中、多くのメッセージの発現レベルを同時に検証し定量化するために、サンプルヌクレオチド集団からのメッセージのハイブリダイゼーション効率が、パーフェクトマッチ及びミスマッチプローブに対して評価される。いくつかの実施形態では、遺伝子アレイ全体がマイクロアレイに印刷される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子のうちの少なくとも１つと、参照遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む遺伝子のサブセットが、マイクロアレイに含まれる。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供されるｎＣｏｕｎｔｅｒなどのデバイスを使用して、分析を容易にすることができる。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムは、完全に自動化された準備ステーション、デジタルアナライザー、ＣｏｄｅＳｅｔ（分子バーコード）、ならびに分析を行うために必要な試薬及び消耗品の全てを備える統合システムである。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムでの分析は、１つの単純なワークフローにおける、溶液中ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後の処理、デジタルデータの取得、及び正規化からなる。いくつかの実施形態では、プロセスは自動化されている。いくつかの実施形態では、カスタムまたは事前設計されたバーコードプローブセットが、分析の一部として、包括的なシステム対照セットと事前に混合され得る。
いくつかの実施形態は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用して遺伝子発現レベルを検出する。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、固体支持体、典型的にはスライドガラスに細胞を固定する。いくつかの実施形態において、細胞を熱またはアルカリで変性させてもよい。次いで、細胞をハイブリダイゼーション溶液と適度な温度で接触させて、標識された特定のプローブのアニーリングを可能にする。プローブは、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識されていることが好ましい。
いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、高度の配列類似性を示す配列の部分のみに結合する蛍光プローブを使用する。ＦＩＳＨは、細胞内の特定のポリヌクレオチド配列を検出し局在化するために、いくつかの実施形態で使用される細胞遺伝学的技法である。例えば、ＦＩＳＨを使用して染色体上のＤＮＡ配列を検出することができる。ＦＩＳＨを使用して、組織サンプル内の特定のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを検出し局在化することもできる。ＦＩＳＨでは、高度の配列類似性を示す特定のヌクレオチド配列に結合する蛍光プローブを示す。蛍光顕微鏡を使用して、蛍光プローブが結合しているかどうか、そしてどこに結合しているかを調べることができる。ＦＩＳＨは、特定のヌクレオチド配列、例えば転座、融合、切断、重複、及び他の染色体異常の検出に加えて、細胞及び組織内の特定の遺伝子コピー数及び／または遺伝子発現の時空間的パターンを定義するのに役立つ。
いくつかの実施形態において、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの動態を用いて、サンプルからの異なるＤＮＡもしくはＲＮＡ配列のコピー数を比較するか、または、１つのサンプルにおける異なるＤＮＡもしくはＲＮＡ配列のコピー数を、別のサンプル中の実質的に同一の配列のコピー数と比較する。ＣＧＨの多くの有用な適用形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、対象の細胞または細胞集団から単離される。比較は定性的であっても定量的であってもよい。コピー数情報は、参照ゲノム上の異なる位置間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の比較から生じる。ＣＧＨの方法、技法、及び用途は、米国特許第６，３３５，１６７号及び米国出願第６０／８０４，８１８号に記載されており、これらの関連する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ． 定量的タンパク質分析
いくつかの実施形態において、遺伝子発現のレベルは、タンパク質発現レベルを検出することによって判定される。タンパク質ベースの検出技法は、免疫親和性アッセイを含む。抗体は、溶液サンプルから特定のタンパク質を免疫沈降させるため、または例えばポリアクリルアミドゲルによって分離されたタンパク質をイムノブロットするために使用され得る。免疫細胞化学的方法は、組織または細胞における特定のタンパク質多型を検出する際にも使用され得る。
他の実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射測定アッセイ（ＩＲＭＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）、ならびにモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む、代替的な抗体ベースの技法を使用することもできる。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号を参照のこと（これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、免疫組織化学を使用して、タンパク質レベルを検出する。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、組織の細胞中の局在抗原（例えばタンパク質）が抗体を組織内の抗原に特異的に結合させるプロセスである。抗原結合性抗体は、例えば可視化を介して検出が可能になるタグにコンジュゲートまたは融合させることができる。いくつかの実施形態において、タグは、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼといった、発色反応を触媒することができる酵素である。酵素は、抗体に融合させるか、または例えばビオチン－アビジン系を使用して非共有結合させることができる。代替的に、抗体は、フルオレセイン、ローダミン、ＤｙＬｉｇｈｔ ＦｌｕｏｒまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどのフルオロフォアでタグ付けしてもよい。抗原結合性抗体は、直接タグ付けしてもよく、またはタグを有する検出抗体にそれ自体を認識させてもよい。ＩＨＣを使用すると、１つまたは複数のタンパク質を検出できる。遺伝子産物の発現は、対照レベルと比較したその染色強度に関連し得る。
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーまたは質量分析を使用して、タンパク質レベルを検出することができる。ＨＰＬＣ－顕微鏡タンデム質量分析技法では、タンパク質分解消化をタンパク質に行い、結果として生じるペプチド混合物を逆相クロマトグラフィー分離によって分離する。次いでタンデム質量分析を行い、そこから収集されたデータを分析する。Ｇａｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７２：７５７－７６３ （２０００）を参照のこと。
本明細書で開示される方法の実施ならびに組成物及びキットでの使用に必要な遺伝子発現レベルデータを得るためのいくつかの方法及びデバイス、ならびに単一のデータ蓄積方法またはデバイスは、限定とみなされてはならない。
ＩＩ． メチル化マーカー分析
いくつかの実施形態では、マーカーは１００塩基以下の領域であり、マーカーは５００塩基以下の領域であり、マーカーは１０００塩基以下の領域であり、マーカーは５０００塩基以下の領域である、または、いくつかの実施形態では、マーカーは１塩基である。いくつかの実施形態において、マーカーは、高ＣｐＧ密度のプロモーター中にある。
この技術は、サンプルのタイプによって限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルは、便サンプル、組織サンプル、痰、血液サンプル（例えば、血漿、血清、全血）、排泄物、または尿サンプルである。
さらに、この技術は、メチル化状態を判定するために使用される方法において限定されない。いくつかの実施形態において、アッセイは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕捉を使用することを含む。いくつかの実施形態において、アッセイは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、この技術は、メチル化状態を判定するため、超並列シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、例えば、合成によるシーケンシング、リアルタイム（例えば、単分子）シーケンシング、ビーズエマルジョンシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどを使用する。
この技術は、可変メチル化領域（ＤＭＲ）を検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から選択されるアノテーションを有する染色体領域；またはＺＮＦ７８１、ＢＡＲＸ１、及びＥＭＸ１からなる群；ＳＨＯＸ２、ＳＯＢＰ、ＺＮＦ７８１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＳＵＣＬＧ２、及びＳＫＩからなる群；ＳＬＣ１２Ａ８、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＰＡＲＰ１５、ＯＰＬＡＨ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＨＯＸＢ２、及びＥＭＸ１からなる群；ＳＨＯＸ２、ＳＯＢＰ、ＺＮＦ７８１、ＢＴＡＣＴ、ＣＹＰ２６Ｃ１、及びＤＬＸ４からなる群；ＳＨＯＸ２、ＳＯＢＰ、ＺＮＦ７８１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＳＵＣＬＧ２、及びＳＫＩからなる群；ＺＮＦ７８１、ＢＡＲＸ１、及びＥＭＸ１と、ＳＯＢＰ及び／またはＨＯＸＡ９からなる群；ＢＡＲＸ１、ＦＬＪ４５９８３、ＳＯＢＰ、ＨＯＰＸ、ＩＦＦＯ１、及びＺＮＦ７８１からなる群；ならびにＢＡＲＸ１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１からなる群を定義するマーカーのサブセットのいずれかから選択されるマーカーに相補的な配列を含む。
キットの実施形態、例えば、バイサルファイト試薬と、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含み、がん（例えば、肺癌）を有しない対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸とを備えるキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されるように、バイサルファイト試薬及びオリゴヌクレオチドを備える。いくつかの実施形態において、キットは、バイサルファイト試薬と、かかる染色体領域の配列を含み、肺癌を有する対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸とを備える。
この技術は、組成物（例えば反応混合物）の実施形態に関連する。いくつかの実施形態では、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸と、バイサルファイト試薬とを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸と、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸と、メチル化特異的制限酵素とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸と、ポリメラーゼとを含む組成物を提供する。
対象から得られたサンプル中の新生物（例えば、肺癌）をスクリーニングするための、さらなる関連する方法の実施形態、例えば、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域内の塩基を含むサンプル中のマーカーのメチル化状態を判定することと；対象サンプルにおけるマーカーのメチル化状態を、肺癌を有しない対象由来の正常対照サンプルにおけるマーカーのメチル化状態と比較することと；対象サンプル及び正常対照サンプルにおけるメチル化状態の差の信頼区間及び／またはｐ値を判定することとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００１である。方法のいくつかの実施形態は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸を、バイサルファイト試薬と反応させて、バイサルファイト反応後の核酸を生成するステップと；バイサルファイト反応後の核酸をシーケンシングして、バイサルファイト反応後の核酸のヌクレオチド配列を用意するステップと；バイサルファイト反応後の核酸のヌクレオチド配列を、肺癌を有しない対象由来の染色体領域を含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定するステップと；差が存在する場合、新生物を有するものとして対象を同定するステップとを提供する。
この技術により、対象から得られたサンプル中の肺癌をスクリーニングするためのシステムが提供される。システムの例示的な実施形態は、例えば、対象から得られたサンプル中の肺癌をスクリーニングするためのシステムであって、サンプルのメチル化状態を判定するよう構成された分析構成要素と、サンプルのメチル化状態を、データベースに記録された対照サンプルまたは参照サンプルのメチル化状態と比較するよう構成されたソフトウェア構成要素と、がん関連メチル化状態をユーザに警告するよう構成されたアラート構成要素とを備えるシステムを含む。いくつかの実施形態において、アラートは、複数のアッセイ（例えば、複数のマーカー、例えば、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域のメチル化状態を判定すること）の結果を受信し、複数の結果に基づいて報告する値または結果を算出する、ソフトウェア構成要素によって判定される。いくつかの実施形態は、ユーザ（例えば、医師、看護師、臨床医など）に報告する値もしくは結果及び／またはアラートを算出するのに使用するための、本明細書で提供される、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する各染色体領域と関連する重み付きパラメータのデータベースを提供する。いくつかの実施形態では、複数のアッセイからの全ての結果が報告され、いくつかの実施形態では、対象の肺癌リスクを示す、複数のアッセイからの１つまたは複数の結果の複合に基づくスコア、値、または結果を提供するために、１つまたは複数の結果が使用される。
システムのいくつかの実施形態では、サンプルは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、システムは、核酸を単離するための構成要素、サンプルを採取するための構成要素、例えば便サンプルを採取するための構成要素をさらに備える。いくつかの実施形態において、システムは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、肺癌を有しない対象由来の核酸配列を含む。核酸、例えば、各核酸が、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む配列を有する核酸のセットも提供される。
関連するシステムの実施形態は、記載したような核酸のセット、及び核酸のセットに関連する核酸配列のデータベースを含む。いくつかの実施形態は、バイサルファイト試薬をさらに含む。そして、いくつかの実施形態は、核酸シーケンサーをさらに含む。
特定の実施形態において、ヒト対象から得られたサンプルの特性決定を行う方法であって、ａ）ヒト対象からサンプルを得ることと；ｂ）サンプル中の１つまたは複数のマーカーのメチル化状態をアッセイすることであって、マーカーが、次のマーカーの群：ＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から、好ましくは上記に列挙したマーカーのサブセットのいずれかから選択されるアノテーションを有する染色体領域内の塩基を含む、アッセイすることと；ｃ）アッセイされたマーカーのメチル化状態を、新生物を有しない対象でアッセイされたマーカーのメチル化状態と比較することとを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、この技術は、生物学的サンプル中の本明細書で同定されたマーカーのうちの１つまたは複数の存在及びメチル化状態を評価することに関連する。これらのマーカーは、本明細書で説明するように、１つまたは複数の可変メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。この技術の実施形態では、メチル化状態が評価される。したがって、本明細書で提供される技術は、遺伝子のメチル化状態を測定する方法において限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、メチル化状態はゲノム走査法によって測定される。例えば、１つの方法は、制限ランドマークゲノム走査（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４： ７４２１－７４２７）を含み、別の例は、ＭＳＡＰ－ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ５９４－５９９）を含む。いくつかの実施形態において、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化特異的制限酵素、特にメチル化感受性酵素によるゲノムＤＮＡの消化の後、目的の領域のサザン分析を行うこと（消化サザン法）によってモニタリングされる。いくつかの実施形態において、メチル化パターンの変化の分析は、１つまたは複数のメチル化特異的制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化と、分析される領域のメチル化ステータスを示す切断または非切断の領域の分析とを含むプロセスを含む。いくつかの実施形態において、処理されたＤＮＡの分析は、ＰＣＲ増幅を含み、増幅結果は、ＤＮＡが制限酵素によって切断されたか否かを示す。いくつかの実施形態において、生成された増幅産物の存在、非存在、量、サイズ、及び配列のうちの１つまたは複数を評価して、目的のＤＮＡのメチル化ステータスを分析する。例えば、Ｍｅｌｎｉｋｏｖ， ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３３（１０）：ｅ９３、Ｈｕａ， ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ９１（１）：４５５－６０、及びＳｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８： ６８７を参照のこと。さらに、メチル化分析の出発点としてＤＮＡのバイサルファイト処理を利用する他の技法が報告されている。これらは、バイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物のメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ９８２１－９８２６）及び制限酵素消化（Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ （１９９６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ５０５８－５０５９、及びＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２５３２－２５３４）を含む。遺伝子変異の検出（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： １１４３－１１４７）及びアレル特異的発現の数量化（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ （１９９５） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９： ３０９７－３１０８、及びＳｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １： １６０－１６３）のためのＰＣＲ技法が開発されている。このような技法は、ＰＣＲで生成されたテンプレートにアニーリングし、アッセイされる単一ヌクレオチドのすぐ５’側で終結する、内部プライマーを使用する。米国特許第７，０３７，６５０号に記載されている「定量的Ｍｓ－ＳＮｕＰＥアッセイ」を使用する方法が、いくつかの実施形態で使用される。
いくつかの実施形態において、マーカーのメチル化状態をアッセイするための設計は、アッセイ技術によって精査されるマーカーの標的領域における個々のＣｐＧ遺伝子座でのバックグラウンドメチル化を分析することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、疾患、例えばがんと診断された対象から単離されたサンプルにおける、マーカーＤＮＡの多数の個々のコピー（例えば、１０，０００超、好ましくは１００，０００超の個々のコピー）を検査して、メチル化の頻度を判定し、これらのデータを、疾患のない対象から単離されたサンプルにおけるマーカーＤＮＡの同様に多数の個々のコピーと比較する。より高いシグナル対ノイズ、例えば、高い検出可能メチル化及び／または低減したバックグラウンドメチル化を有するＣｐＧ遺伝子座が、アッセイ設計における使用のために選択され得るように、サンプルにおけるマーカーＤＮＡ中の個々のＣｐＧ遺伝子座における疾患関連メチル化及びバックグラウンドメチル化の頻度を比較することができる。例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，６３７，７９２号及び同第１０，５１９，５１０号を参照のこと。いくつかの実施形態では、アッセイ結果に基づいてマーカーを「メチル化」または「非メチル化」と分類するには、ＣｐＧ遺伝子座の全てが事前に判定されたメチル化ステータスを有する必要がある（例えば、全てがメチル化されている必要がある、またはメチル化されているものがあり得ない）ように、シグナル対ノイズの高いＣｐＧ遺伝子座の一群（例えば、マーカー領域内の２、３、４、５、またはそれ以上の個々のＣｐＧ遺伝子座）が、アッセイにより同時に精査される。
メチル化状態を評価する際、メチル化状態は、特定の部位で（例えば、単一ヌクレオチドで、特定の領域または遺伝子座で、より長い目的の配列で、例えば、ＤＮＡの最長約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐまたはそれ以上の部分配列で）メチル化されているＤＮＡの個々の鎖の、その特定の部位を含むサンプル中のＤＮＡの全集団と比した割合またはパーセンテージとして表されることが多い。従来、非メチル化核酸の量は、キャリブレータを使用したＰＣＲによって判定される。次いで、既知量のＤＮＡがバイサルファイト処理され、結果として生じるメチル化特異的配列が、リアルタイムＰＣＲまたは他の指数関数的増幅、例えば、ＱｕＡＲＴＳアッセイ（例えば、米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号、ならびに米国特許出願第１５／８４１，００６号によって提供されている）のいずれかを使用して判定される。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、外部標準を使用することによって、メチル化されていない標的の標準曲線を生成することを含む。この標準曲線は、少なくとも２点から構成され、メチル化されていないＤＮＡについてのリアルタイムＣｔ値を既知の定量的標準に関連させる。次いで、メチル化された標的についての第２の標準曲線が、少なくとも２点及び外部標準から構築される。この第２の標準曲線は、メチル化されたＤＮＡのＣｔを、既知の定量的標準に関連させる。次に、メチル化された集団及びメチル化されていない集団について、検査サンプルのＣｔ値が判定され、最初の２つのステップによって生成された標準曲線から、ＤＮＡのゲノム当量が算出される。目的の部位におけるメチル化のパーセンテージは、集団内のＤＮＡの総量と比したメチル化ＤＮＡの量から算出され、例えば、（メチル化ＤＮＡの数）／（メチル化ＤＮＡの数＋非メチル化ＤＮＡの数）×１００である。
また本明細書では、これらの方法を実践するための組成物及びキットが提供される。例えば、いくつかの実施形態において、１つまたは複数のマーカーに特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）が、単独で、またはセット（例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマーペアのセット）で提供される。検出アッセイを行うための追加の試薬（例えば、ＱｕＡＲＴＳ、ＰＣＲ、シーケンシング、バイサルファイト、または他のアッセイを行うための酵素、バッファー、陽性対照及び陰性対照）も提供され得る。いくつかの実施形態において、方法を行うために必要な、十分な、または有用な１つまたは複数の試薬を含むキットが提供される。また、試薬を含む反応混合物も提供される。さらに、反応混合物を完成させるように互い及び／または検査サンプルに加えられ得る複数の試薬を含むマスターミックス試薬セットが提供される。
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡを単離する方法は、当技術分野で知られている。特に、いくつかの実施形態は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／４７０，２５１号（「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」）に記載されている核酸の単離を含む。
ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む任意の手段によって単離され得る。簡潔に述べると、目的のＤＮＡが細胞膜で被包されている場合、生物学的サンプルは一般に、酵素的、化学的、または機械的な手段によって破壊及び溶解される。次いで、例えばプロテイナーゼＫで消化することにより、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の夾雑物が取り除かれ得る。次いで、ゲノムＤＮＡが溶液から回収される。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む、多様な方法によって実施され得る。方法の選択は、時間、費用、及び必要とされるＤＮＡ量を含む、いくつかの要因に影響される。新生物性物質または前新生物性物質を含む全ての臨床的サンプルタイプ、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、便、結腸流出物、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞、及びこれらの組み合わせが、本発明の方法における使用に好適である。
この技術は、サンプルを調製し、検査のための核酸を用意するために使用される方法において限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、例えば、米国特許出願第６１／４８５３８６号に詳述されているような直接遺伝子捕捉を使用して、または関連する方法によって、便サンプルから、または血液から、または血漿サンプルから単離される。
この技術は、肺癌に関連し得る、または肺癌の非存在を確定するために検査され得る、任意のサンプルの分析に関連する。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルは、患者から得られる組織及び／または生物学的流体を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、分泌物を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、痰、血液、血清、血漿、胃分泌物、肺組織サンプル、肺細胞、または便から回収された肺ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。このようなサンプルは、当業者には明らかであるような、当技術分野で知られる任意の数の手段によって得ることができる。
Ａ． 肺癌を検出するためのメチル化アッセイ
候補メチル化ＤＮＡマーカーが、選択された肺癌症例及び肺対照組織の偏りのない全メチロームシーケンシングによって同定された。上位マーカー候補は、２５５名の独立した患者でさらに評価され、そのうち１１９名が対照であり、そのうち３７名は良性結節からのものであり、１３６の症例は全ての肺癌サブタイプを含むものであった。患者組織サンプルから抽出されたＤＮＡをバイサルファイト処理し、次いで候補マーカー及び正規化遺伝子としてのβ－アクチン（ＡＣＴＢ）をＱｕＡＲＴＳ増幅（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ増幅）によってアッセイした。ＱｕＡＲＴＳアッセイ化学は、メチル化マーカー選択及びスクリーニングのための高度な識別をもたらす。
個々のマーカー候補の受信者動作特性分析では、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．５１２～０．９４１の範囲であった。１００％の特異性において、８つのメチル化マーカー（ＳＬＣ１２Ａ８、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＰＡＲＰ１５、ＯＰＬＡＨ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＭＡＸ．１２．５２６、ＨＯＸＢ２、及びＥＭＸ１）の複合パネルは、肺癌の全てのサブタイプで９８．５％の感度をもたらした。さらに、８マーカーのパネルを使用した場合、良性肺結節は偽陽性をもたらさなかった。
Ｂ． メチル化検出アッセイ及びキット
本明細書に記載されるマーカーは、多様なメチル化検出アッセイで利用される。５－メチルシトシンの存在について核酸を分析するために最も頻繁に使用される方法は、Ｆｒｏｍｍｅｒらによって説明された、ＤＮＡ中の５－メチルシトシンの検出のためのバイサルファイト法（あらゆる目的で参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １８２７－３１）またはその変形に基づいている。５－メチルシトシンをマッピングするバイサルファイト法は、シトシンは亜硫酸水素イオン（バイサルファイトとしても知られている）と反応するが、５－メチルシトシンは反応しないという観察に基づいている。この反応は通常、次のステップに従って行われる：まず、シトシンが亜硫酸水素塩と反応してスルホン化シトシンを形成する。次に、スルホン化反応中間体の自発的脱アミノ化が、スルホン化ウラシルをもたらす。最後に、スルホン化ウラシルがアルカリ性条件下で脱スルホン化されてウラシルを形成する。ウラシルがアデニンと塩基対を形成する（したがってチミンのように挙動する）のに対し、５－メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成する（したがってシトシンのように挙動する）ため、検出が可能である。これにより、例えば、バイサルファイトゲノムシーケンシング（Ｇｒｉｇｇ Ｇ， ＆ Ｃｌａｒｋ Ｓ， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ （１９９４） １６： ４３１－３６、Ｇｒｉｇｇ Ｇ， ＤＮＡ Ｓｅｑ． （１９９６） ６： １８９－９８）、例えば米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているようなメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によって、または、配列特異的プローブ切断を含むアッセイ、例えば、ＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６： Ａ１９９、ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号を参照のこと）を使用して、メチル化シトシンを非メチル化シトシンから識別することが可能になる。
いくつかの従来技術は、分析しようとするＤＮＡをアガロースマトリックスに封入し、これにより、ＤＮＡの拡散及び復元を防ぐこと（バイサルファイトは一本鎖ＤＮＡとしか反応しない）、ならびに沈殿ステップ及び精製ステップを高速透析に置き換えることを含む方法に関連している（Ｏｌｅｋ Ａ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） “Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ５０６４－６）。したがって、個々の細胞のメチル化ステータスを分析することが可能であり、この方法の有用性及び感度が例示される。５－メチルシトシンを検出する従来の方法の概説は、Ｒｅｉｎ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６： ２２５５によって提供されている。
バイサルファイト技法は、典型的に、バイサルファイト処理に続いて既知の核酸の短い特定の断片を増幅し、次いでこの産物をシーケンシング（Ｏｌｅｋ ＆ Ｗａｌｔｅｒ （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １７： ２７５－６）またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２５２９－３１、ＷＯ９５／００６６９、米国特許第６，２５１，５９４号）のいずれかによってアッセイして、個々のシトシン位置を分析することを含む。いくつかの方法は酵素消化を使用する（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２５３２－４）。ハイブリダイゼーションによる検出も当技術分野において説明されている（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化検出のためのバイサルファイト技法の使用が説明されている（Ｇｒｉｇｇ ＆ Ｃｌａｒｋ （１９９４） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６： ４３１－６、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ６： ３８７－９５、Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ６９５、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｅ １５７： ２６１－４、ＷＯ９７４６７０５、ＷＯ９５１５３７３）。
本発明の技術によるバイサルファイト処理と併せて、様々なメチル化アッセイ手順を使用することができる。これらのアッセイは、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態の判定を可能にする。このようなアッセイは、数ある技法の中でもとりわけ、バイサルファイト処理済み核酸のシーケンシング、ＰＣＲ（配列特異的増幅のため）、サザンブロット分析、及びメチル化特異的制限酵素、例えば、メチル化感受性またはメチル化依存性酵素の使用を含む。
例えば、バイサルファイト処理を使用することにより、メチル化パターン及び５－メチルシトシンの分布の分析のためにゲノムシーケンシングが簡略化されている（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １８２７－１８３１）。さらに、バイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ５０５８－５０５９によって説明されているように、またはＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２５３２－２５３４）として知られる方法で具体化されているように、メチル化状態の評価に利用される。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析は、少量のゲノムＤＮＡの特定の遺伝子座でＤＮＡメチル化レベルを判定するのに有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５３２－２５３４， １９９７）。簡潔に述べると、制限酵素消化を使用して、重亜硫酸ナトリウム処理済みＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化依存性配列の差異を明らかにする。メチル化依存性配列の差異を、まず、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１， １９９２）によって説明されている手順に従い、標準的なバイサルファイト処理によってゲノムＤＮＡに導入する。次いで、目的のＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して、バイサルファイト変換ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、その後、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的な標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のＤＮＡサンプル中のメチル化レベルは、広範囲のＤＮＡメチル化レベルの全域で直線的に定量的な様式で、消化されたＰＣＲ産物及び未消化のＰＣＲ産物の相対的な量によって表される。さらに、この技法は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織サンプルから得られたＤＮＡに高信頼度で適用され得る。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；制限酵素及び適切なバッファー；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドプローブのためのキナーゼ標識キット；ならびに標識されたヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換試薬は、ＤＮＡ変性バッファー；スルホン化バッファー；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化バッファー；及びＤＮＡ回収成分を含み得る。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光標識リアルタイムＰＣＲ技法）（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２－２３０６， １９９９）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９－２５３１， １９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６， １９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０７－１２， １９９９）などのアッセイが、単独で、またはこれらの方法のうちの１つまたは複数と組み合わせて使用される。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ技法は、バイサルファイト処理済みＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づいてメチル化の差異を評価する定量的な方法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的ブロッキングプローブ（「ブロッカー」）は、核酸サンプルのメチル化特異的な選択的増幅を可能にする。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせたものである。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイは、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用してもよい。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、またはバイサルファイト処理済みＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ブロッキングオリゴヌクレオチド；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得るが、これらに限定されない。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、メチル化特異的制限酵素の使用に関係なく、ＣｐＧアイランド内の実質的に全てのＣｐＧ部位群のメチル化ステータスの評価を可能にする（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６， １９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）。簡潔に述べると、非メチル化シトシンをウラシルに変換するがメチル化シトシンは変換しない重亜硫酸ナトリウムによってＤＮＡを修飾し、その後、この産物を、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーと非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅させる。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化アレルに対する感度を示し、パラフィン包埋サンプルから抽出されたＤＮＡに行うことができる。ＭＳＰ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するメチル化型及び非メチル化型のＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ならびに特定のプローブを含み得るが、これらに限定されない。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップ後にさらなる操作を必要としない、蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２３０２－２３０６， １９９９）。簡潔に述べると、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、標準的な手順に従い、重亜硫酸ナトリウム反応において、メチル化依存性配列の差異の混合されたプールに変換される、ゲノムＤＮＡの混合サンプルにより始まる（バイサルファイトプロセスは、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、「偏りのある」反応において、例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマーを用いて、蛍光ベースのＰＣＲが行われる。配列の識別は、増幅プロセスのレベルと蛍光検出プロセスのレベルの両方で行われる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、配列の識別がプローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンの定量的検査として使用される。定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下でメチル化特異的増幅がもたらされる。プライマーとプローブのいずれもが、いかなるＣｐＧジヌクレオチドにも重ならない反応によって、インプットＤＮＡ量に対して偏りのない対照がもたらされる。代替的に、ゲノムメチル化の定性的検査は、既知のメチル化部位をカバーしない対照オリゴヌクレオチド（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光ベースのバージョン）、または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかを用い、偏りのあるＰＣＲプールをプローブすることによって達成される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、任意の好適なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブなど）を用いて使用される。例えば、いくつかの用途では、二本鎖ゲノムＤＮＡが、重亜硫酸ナトリウムで処理され、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する、例えば、ＭＳＰプライマー及び／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチドならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる、２セットのＰＣＲ反応のうちの１つに供される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、ＧＣ含有量の比較的多い領域に特異的であるように設計されており、そのため、ＰＣＲサイクル中にフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に完全にハイブリダイズしたままにすることが可能である。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新たな鎖を酵素的に合成するに従い、最終的にはアニーリングされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。次いで、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエンドヌクレアーゼ活性が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化することにより、このプローブが変位し、蛍光レポーター分子が放出され、そのもはやクエンチされていないシグナルが、リアルタイム蛍光検出システムを使用して定量的に検出される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得るが、これらに限定されない。
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、配列の識別がプローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンの代替的な定量的検査である。この定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下で偏りのない増幅がもたらされる。プライマーとプローブのいずれもが、いかなるＣｐＧジヌクレオチドにも重ならない反応によって、インプットＤＮＡ量に対して偏りのない対照がもたらされる。代替的に、ゲノムメチル化の定性的検査は、既知のメチル化部位をカバーしない対照オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光ベースのバージョン）、または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかを用い、偏りのあるＰＣＲプールをプローブすることによって達成される。
ＱＭ（商標）プロセスは、増幅プロセスにおいて、任意の好適なプローブ、例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブを用いて使用され得る。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡが、重亜硫酸ナトリウムで処理され、偏りのないプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに供される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、ＧＣ含有量の比較的多い領域に特異的であるように設計されており、そのため、ＰＣＲサイクル中にフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融出する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に完全にハイブリダイズしたままにすることが可能である。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新たな鎖を酵素的に合成するに従い、最終的にはアニーリングされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。次いで、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエンドヌクレアーゼ活性が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化することにより、このプローブが変位し、蛍光レポーター分子が放出され、そのもはやクエンチされていないシグナルが、リアルタイム蛍光検出システムを使用して定量的に検出される。ＱＭ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＱＭ（商標）ベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得るが、これらに限定されない。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）技法は、ＤＮＡのバイサルファイト処理に続いて単一ヌクレオチドプライマー伸長を行うことに基づいて特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の差異を評価する定量的な方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２５２９－２５３１， １９９７）。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させて、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、５－メチルシトシンは未変化のままにする。次いで、バイサルファイト変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して、所望の標的配列の増幅を行い、結果として生じる産物を単離し、目的のＣｐＧ部位でのメチル化の分析のためのテンプレートとして使用する。少量のＤＮＡ（例えば、顕微解剖された病変切片）を分析することができ、これにより、ＣｐＧ部位のメチル化ステータスを判定するための制限酵素の利用が避けられる。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）ベースのキットに見出され得るようなもの）は、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理済みＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性対照プライマー；特定の遺伝子座に対するＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー；反応バッファー（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ反応のため）；ならびに標識されたヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換試薬は、ＤＮＡ変性バッファー；スルホン化バッファー；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化バッファー；及びＤＮＡ回収成分を含み得る。
ＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、核酸をバイサルファイト処理して全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換することから始まり、その後、制限酵素消化（例えば、ＭｓｐＩなどのＣＧ配列を含む部位を認識する酵素による）を行い、アダプターリガンドにカップリングした後に断片の完全なシーケンシングを行う。制限酵素の選択により、ＣｐＧが密な領域について断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされ得る余剰の配列の数が低減する。したがって、ＲＲＢＳは、シーケンシングのための制限断片のサブセットを選択することにより（例えば、分取ゲル電気泳動を使用したサイズ選択により）、核酸サンプルの複雑性を低減させる。全ゲノムのバイサルファイトシーケンシングとは対照的に、制限酵素消化によって生成される全ての断片が、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドについてのＤＮＡメチル化情報を含む。したがって、ＲＲＢＳは、プロモーター、ＣｐＧアイランド、及びこれらの領域内に高頻度の制限酵素切断部位を含む他のゲノム特徴についてサンプルを濃縮させ、よって、１つまたは複数のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するためのアッセイを提供する。
ＲＲＢＳの典型的なプロトコールは、核酸サンプルをＭｓｐＩなどの制限酵素で消化するステップ、オーバーハングの充填及びＡテーリングのステップ、アダプターをライゲーションするステップ、バイサルファイト変換のステップ、ならびにＰＣＲのステップを含む。例えば、ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７： １３３－６、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３： ５８６８－７７を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ＱｕＡＲＴＳ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）アッセイを使用して、メチル化状態を評価する。３つの反応は、各ＱｕＡＲＴＳアッセイにおいて連続して起こり、一次反応における増幅（反応１）及び標的プローブ切断（反応２）、ならびに二次反応におけるＦＲＥＴ切断及び蛍光シグナル生成（反応３）を含む。標的核酸が特異的プライマーで増幅されると、フラップ配列を含む特異的検出プローブがアンプリコンに緩く結合する。標的結合部位に特異的な侵襲性オリゴヌクレオチドが存在すると、５’ヌクレアーゼ、例えば、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼが、検出プローブとフラップ配列との間を切断することにより、フラップ配列を遊離させる。フラップ配列は、対応するＦＲＥＴカセットの非ヘアピン部分に相補的である。したがって、フラップ配列は、ＦＲＥＴカセット上の侵襲性オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットのフルオロフォアとクエンチャーとの間の切断をもたらし、これが蛍光シグナルを生成する。この切断反応は、標的１つ当たり複数のプローブを切断し、したがってフラップ１つ当たり複数のフルオロフォアを放出し、指数関数的なシグナル増幅をもたらすことができる。ＱｕＡＲＴＳは、異なる色素を含むＦＲＥＴカセットを使用することにより、単一の反応ウェルで複数の標的を検出することができる。例えば、各々があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６： Ａ１９９）、ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、バイサルファイト処理済みＤＮＡは、数量化の前に精製される。これは、当技術分野で知られている、限外濾過などだがこれに限定されない任意の手段によって、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）製）の手段によって行うことができる。精製は、改変された製造元のプロトコール（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照のこと）に従って実施される。いくつかの実施形態において、バイサルファイト処理済みＤＮＡを、固体支持体、例えば、磁気ビーズに結合させ、ＤＮＡが支持体に結合している間に脱スルホン化及び洗浄を行う。このような実施形態の例は、例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１１６３７５及び米国特許第９，３１５，８５３号、及び米国特許出願第６３／０５８，１７９号において提供されている。特定の好ましい実施形態において、支持体に結合したＤＮＡは、支持体上での脱スルホン化及び洗浄の直後に、メチル化アッセイの準備ができている。いくつかの実施形態において、脱スルホン化ＤＮＡは、アッセイ前に支持体から溶出される。
いくつかの実施形態において、処理済みのＤＮＡの断片は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドのセット（例えば、図５を参照のこと）及び増幅酵素を使用して増幅される。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を、１つの同一の反応容器内で同時に実施することができる。典型的に、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施される。
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡを単離する方法は、当技術分野で知られている。特に、いくつかの実施形態は、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０００，１４６号、同第９，１６３，２７８号、及び同第１０，７０４，０８１号に記載されているように、核酸の単離を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるマーカーは、便サンプルで行われるＱＵＡＲＴＳアッセイに利用される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡサンプルを生成する方法、特に、高度に精製され存在量の低い核酸を少量（例えば、１００未満、６０マイクロリットル未満）含み、ＤＮＡサンプルを検査するために使用されるアッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＩＮＶＡＤＥＲ、ＱｕＡＲＴＳアッセイなど）を阻害する物質を実質的に及び／または事実上含まない、ＤＮＡサンプルを生成する方法が提供される。このようなＤＮＡサンプルは、患者から採取されたサンプル中に存在する遺伝子、遺伝子バリアント（例えば、アレル）、もしくは遺伝子修飾（例えば、メチル化）の存在を定性的に検出する、またはそれらの活性、発現、もしくは量を定量的に測定する、診断アッセイに利用される。例えば、いくつかのがんは、特定の変異体アレルまたは特定のメチル化状態の存在と相関しており、したがって、そのような変異体アレルまたはメチル化状態の検出及び／または数量化は、がんの診断及び治療において予測的価値を有する。
サンプル中には、多くの価値ある遺伝子マーカーがごく少量しか存在せず、このようなマーカーを生成する事象の多くは稀である。それ故、ＰＣＲなどの高感度の検出方法でさえ、存在量の低い標的を、アッセイの検出閾値を満たすまたはそれに取って代わるのに十分に提供するには、大量のＤＮＡを必要とする。さらに、少量の阻害性物質が存在するだけでも、このような少量の標的を検出することを目的とするこれらのアッセイの正確度及び精度が損なわれる。したがって、本明細書では、このようなＤＮＡサンプルを生成するための体積及び濃度の必要条件の管理を行う方法が提供される。
いくつかの実施形態において、サンプルは、血液、血清、血漿、または唾液を含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。このようなサンプルは、当業者には明らかであるような、当技術分野で知られる任意の数の手段によって得ることができる。セルフリーまたは実質的にセルフリーのサンプルは、遠心分離及び濾過を含むがこれらに限定されない、当業者に知られる様々な技法にサンプルを供することによって得ることができる。サンプルを得るために侵襲的技法を使用しないことが一般的に好ましいが、それでも、組織ホモジネート、組織切片、及び生検検体などのサンプルを得ることが好ましい場合がある。この技術は、サンプルを調製し、検査のための核酸を用意するために使用される方法において限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、例えば、米国特許第８，８０８，９９０号及び同第９，１６９，５１１号、ならびにＷＯ２０１２／１５５０７２に詳述されているような直接遺伝子捕捉を使用して、または関連する方法によって、便サンプルから、または血液から、または血漿サンプルから単離される。
マーカーの分析は、１つの検査サンプル中で、さらなるマーカーと別々に実施することも、同時に実施することもできる。例えば、いくつかのマーカーを１つの検査に組み合わせて、複数のサンプルを効率的に処理し、ことによっては診断及び／または予後の正確度を高めることができる。さらに、当業者には、同じ対象由来の複数のサンプルを（例えば、連続した時点で）検査することの価値が認識されよう。このような連続的なサンプルの検査は、マーカーのメチル化状態の経時的な変化の同定を可能にし得る。メチル化状態の変化だけでなく、メチル化状態の変化がないことも、病状に関する有用な情報を提供することができ、これは、事象の発生からのおよその時間、救済可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性の同定、ならびに将来の事象のリスクを含む対象の転帰の同定を含むが、これらに限定されない。
バイオマーカーの分析は、多様な物理的フォーマットにおいて実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を使用して、多数の検査サンプルの処理を容易にすることができる。代替的に、単一のサンプルフォーマットを発展させて、例えば、救急輸送または緊急治療室の状況における適時の早急処置及び診断を容易にすることができる。
この技術の実施形態は、キットの形態で提供されることが想定される。キットは、本明細書に記載される組成物、デバイス、装置などの実施形態と、キットの使用説明書とを備える。このような説明書は、サンプルから分析物を調製するための、例えば、サンプルを採取し、サンプルから核酸を調製するための、適切な方法を説明するものである。キットの個々の構成要素は、適切な容器及びパッケージ（例えば、バイアル、箱、ブリスターパック、アンプル、瓶、ボトル、チューブなど）にパッケージ化され、構成要素は、キットの保管、搬送、及び／またはユーザによる使用の便宜上、適切な容器（例えば、１つまたは複数の箱）に一緒にパッケージ化される。液体成分（例えばバッファー）は、ユーザにより再構成されるために凍結乾燥された形態で提供されてもよい。キットは、キットの性能を評価、検証、及び／または保証するための対照または基準を含んでもよい。例えば、サンプル中に存在する核酸の量をアッセイするためのキットは、比較用に同じ核酸または別の核酸を既知濃度で含む対照を含み得、いくつかの実施形態では、対照核酸に特異的な検出試薬（例えばプライマー）を含み得る。キットは、臨床現場での使用に適切であり、いくつかの実施形態では、ユーザの家庭での使用に適切である。キットの構成要素は、いくつかの実施形態では、サンプルから核酸溶液を調製するためのシステムの機能を提供する。いくつかの実施形態において、システムの特定の構成要素は、ユーザによって提供される。
ＩＩＩ． 適用
いくつかの実施形態において、診断アッセイは、個体における疾患または状態の存在を同定する。いくつかの実施形態において、疾患は、がん（例えば、肺癌）である。
いくつかの実施形態において、異常なメチル化が肺癌に関連しているマーカー（例えば、表１に挙げたマーカーから選択される１つまたは複数のマーカー、あるいは、好ましくはＥＭＸ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のうちの１つまたは複数）が使用される。いくつかの実施形態において、アッセイは、参照遺伝子（例えば、β－アクチン、ＺＤＨＨＣ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６。例えば、各々があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，４６５，２４８号、及びＷＯ２０１８／０１７７４０を参照のこと）の検出をさらに含む。
いくつかの実施形態において、異常な発現が肺癌に関連しているマーカー（好ましくは、表３に挙げた１つまたは複数のマーカー：Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１）が使用され、サンプル中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質のうちの１つまたは複数の測定によって検出される。いくつかの実施形態において、アッセイは、参照遺伝子（例えば、表３に示されるようなもの）の検出をさらに含む。
いくつかの実施形態において、この技術は、患者（例えば、肺癌患者、初期ステージの肺癌患者、または肺癌を発症し得る患者）の治療に応用され、この方法は、本明細書で提供される１つまたは複数のマーカーのメチル化状態を判定することと、メチル化状態を判定した結果に基づいて患者に治療を投与することとを含む。治療は、医薬化合物の投与、ワクチン、手術の実施、患者のイメージング、別の検査の実施であり得る。好ましくは、前記使用は、臨床的スクリーニングの方法、予後評価の方法、療法の結果をモニタリングする方法、特定の治療的処置に応答する可能性が最も高い患者を同定する方法、患者または対象をイメージングする方法、ならびに薬物スクリーニング及び開発の方法におけるものである。
いくつかの実施形態において、この技術は、対象の肺癌を診断するための方法において応用される。本明細書で使用される「診断する」及び「診断」という用語は、対象が所与の疾患もしくは状態に罹患しているか否か、または将来的に所与の疾患もしくは状態を発症し得るか否かを、当業者が推定し、さらには判定することを可能にする方法を指す。当業者は、多くの場合、例えばバイオマーカーのような、そのメチル化状態が状態の存在、重篤度、または非存在を示す１つまたは複数の診断指標に基づいて、診断を行う。
診断に加えて、臨床的ながんの予後は、がんの悪性度及び腫瘍再発の尤度を判定して、最も効果的な療法を計画することに関する。より正確に予後が判断できる場合、またはさらには、がんを発症する潜在的リスクが評価できる場合、適切な療法を選択することができ、いくつかの事例においては患者にそれほど過酷ではない療法を選択することができる。がんバイオマーカーの評価（例えば、メチル化状態の判定）は、良好な予後及び／または低いがん発症リスクを有し、治療を必要としない、または限られた治療しか必要としない対象を、がん発症またはがん再発の可能性がより高く、より集中的な治療が有効であり得る対象と分けるために有用である。
したがって、本明細書で使用される場合、「診断を行う」または「診断する」は、本明細書で開示される診断バイオマーカーの測定に基づいて、臨床転帰の予測（医学的処置の有無にかかわらない）、適切な治療の選択（または治療が有効であるかどうか）、または現在の治療のモニタリング及び潜在的な治療の変更を行い得る、がん発症リスクの判定または予後の判定を行うことをさらに含む。
さらに、この技術のいくつかの実施形態では、診断及び／または予後を容易にするために、経時的なバイオマーカーの複数の判定を行うことができる。バイオマーカーの時間的変化は、臨床転帰を予測する、肺癌の進行をモニタリングする、及び／またはがんを対象とした適切な療法の有効性をモニタリングするために使用され得る。例えば、そのような実施形態では、効果的な療法の過程において、生物学的サンプル中の本明細書で開示される１つまたは複数のバイオマーカー（及び、モニタリングする場合、ことによっては１つまたは複数の追加のバイオマーカー（複数可））のメチル化状態の変化を経時的に見ることが期待され得る。
この技術はさらに、対象のがんの予防または治療を開始または継続するかどうかを判定する方法に応用される。いくつかの実施形態において、この方法は、ある期間にわたり対象から一連の生物学的サンプルを用意することと；一連の生物学的サンプルを分析して、生物学的サンプルの各々における本明細書で開示される少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態を判定することと；生物学的サンプルの各々におけるバイオマーカーのうちの１つまたは複数のメチル化状態の測定可能な変化を比較することとを含む。ある期間にわたるバイオマーカーのメチル化状態における変化は、がん発症リスクを予測し、臨床転帰を予測し、がんの予防または療法を開始または継続するかどうか、及び現在の療法が効果的にがんを治療しているかどうかを判定するために使用され得る。例えば、治療の開始前に第１の時点を選択することができ、治療の開始後のある時点で第２の時点を選択することができる。異なる時点で採取されたサンプルの各々においてメチル化状態を測定し、定性的及び／または定量的な差異を記録することができる。異なるサンプルにおけるバイオマーカーレベルのメチル化状態の変化は、肺の発症リスク、予後、対象における治療有効性の判定、及び／またはがんの進行と相関し得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法及び組成物は、疾患を初期ステージで、例えば、疾患の症状が現れる前に、治療または診断するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明の方法及び組成物は、臨床ステージで疾患を治療または診断するためのものである。
上記のように、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の診断バイオマーカーまたは予後バイオマーカーの複数の判定を行うことができ、マーカーの時間的変化を使用して、診断または予後を判定することができる。例えば、診断マーカーを初回に、そして再度２回目に判定してもよい。このような実施形態において、初回から２回目へのマーカーの増加は、がんの特定のタイプもしくは重篤度、または所与の予後を診断するものであり得る。同様に、初回から２回目へのマーカーの減少は、がんの特定のタイプもしくは重篤度、または所与の予後を示すものであり得る。さらに、１つまたは複数のマーカーの変化の程度は、がんの重篤度及び将来の有害事象に関連し得る。特定の実施形態では、同じバイオマーカーの比較測定を複数の時点で行うことができ、また、所与のバイオマーカーを１つの時点で測定し、第２のバイオマーカーを第２の時点で測定することもでき、これらのマーカーの比較が診断情報を提供し得ることが、当業者には理解されよう。
本明細書で使用される場合、「予後を判定する」という語句は、対象における状態の過程または転帰を当業者が予測することを可能にする方法を指す。「予後」という用語は、状態の過程もしくは転帰を１００％の正確度で予測できることを指すものではなく、またはさらには、所与の過程もしくは転帰が発生する可能性が高いか低いかをバイオマーカーのメチル化状態に基づいて予測可能であることを指すものでもない。むしろ、当業者には理解されるであろうが、「予後」という用語は、特定の過程または転帰が発生する確率の増加、すなわち、所与の状態を呈する対象において過程または転帰が発生する可能性が、その状態を呈していない個体と比較すると高いことを指す。例えば、その状態を呈していない個体では、所与の転帰（例えば、肺癌の罹患）の確率が非常に低い場合がある。
いくつかの実施形態では、統計分析により、予後指標を有害転帰への素因と関連付ける。例えば、いくつかの実施形態において、がんを有しない患者から得られた正常対照サンプルのものと異なるメチル化状態は、統計的有意性のレベルによって判定されるように、ある対象ががんに罹患する可能性が、対照サンプルのメチル化状態により類似するレベルを有する対象よりも高いことを示し得る。さらに、メチル化状態のベースライン（例えば「正常」）レベルからの変化は、対象の予後を反映するものであり得、メチル化状態の変化の程度は、有害事象の重篤度に関連し得る。統計的有意性は、２つ以上の集団を比較して信頼区間及び／またはｐ値を判定することによって判定されることが多い。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＤｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３を参照のこと。本発明の主題の例示的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、及び９９．９９％であり、例示的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。
他の実施形態では、本明細書で開示される予後バイオマーカーまたは診断バイオマーカーのメチル化状態の閾値変化度を確立することができ、生物学的サンプル中のバイオマーカーのメチル化状態の変化度は、メチル化状態の閾値変化度と単純比較される。本明細書で提供されるバイオマーカーについてのメチル化状態における好ましい閾値変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、及び約１５０％である。さらに他の実施形態において、「ノモグラム」を確立することができ、これにより、予後または診断の指標（バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ）のメチル化状態が、所与の転帰に対する関連素因に直接関連付けられる。当業者は、集団の平均ではなく個々のサンプル測定値が参照されるので、この測定における不確実性はマーカー濃度の不確実性と同じであるとの理解のもとに、このようなノモグラムを使用して２つの数値を関連付けることに精通している。
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルから得られる結果が、対照サンプルから得られる結果と比較され得るように、対照サンプルは、生物学的サンプルと同時に分析される。さらに、標準曲線を用意してもよく、これを用いて生物学的サンプルに関するアッセイ結果が比較され得ることが想定される。このような標準曲線は、バイオマーカーのメチル化状態を、アッセイ単位の関数として、例えば、蛍光標識が使用される場合は蛍光シグナル強度の関数として提示する。複数のドナーから採取されたサンプルを使用する場合、標準曲線は、正常組織における１つまたは複数のバイオマーカーの対照メチル化状態について、また、肺癌を有するドナーから採取された組織における１つまたは複数のバイオマーカーの「リスクあり」レベルについても提供され得る。
マーカーの分析は、１つの検査サンプル中で、さらなるマーカーと別々に実施することも、同時に実施することもできる。例えば、いくつかのマーカーを１つの検査に組み合わせて、複数のサンプルを効率的に処理し、ことによっては診断及び／または予後の正確度を高めることができる。さらに、当業者には、同じ対象由来の複数のサンプルを（例えば、連続した時点で）検査することの価値が認識されよう。このような連続的なサンプルの検査は、マーカーのメチル化状態の経時的な変化の同定を可能にし得る。メチル化状態の変化だけでなく、メチル化状態の変化がないことも、病状に関する有用な情報を提供することができ、これは、事象の発生からのおよその時間、救済可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性の同定、ならびに将来の事象のリスクを含む対象の転帰の同定を含むが、これらに限定されない。
バイオマーカーの分析は、多様な物理的フォーマットにおいて実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を使用して、多数の検査サンプルの処理を容易にすることができる。代替的に、単一のサンプルフォーマットを発展させて、例えば、救急輸送または緊急治療室の状況における適時の早急処置及び診断を容易にすることができる。
いくつかの実施形態では、対照メチル化状態と比較して、サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な差異があれば、対象は肺癌を有すると診断される。逆に、生物学的サンプル中のメチル化状態の変化が同定されなければ、対象は、肺癌を有しない、がんのリスクがない、またはがんのリスクが低いものと同定され得る。これに関して、肺癌またはそのリスクを有する対象は、がんまたはそのリスクが低いまたは実質的にない対象から区別され得る。肺癌を発症するリスクを有する対象は、より集中的及び／または定期的なスクリーニングスケジュール下におくことができる。その一方、リスクが低いか実質的にない対象は、これらの対象において肺癌のリスクが現れたことが、将来のスクリーニング、例えば、本発明の技術に従って行われるスクリーニングによって示されるようなときまで、スクリーニング手続きを受けることを避けることができる。
上述したように、本発明の技術の方法の実施形態に応じて、１つまたは複数のバイオマーカーのメチル化状態における変化の検出は、定性的判定であってもよく、定量的判定であってもよい。したがって、肺癌を有するまたは肺癌の発症リスクがあるものとして対象を診断するステップは、特定の閾値の測定が行われ、例えば、生物学的サンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーのメチル化状態が、所定の対照メチル化状態と異なることを示す。この方法のいくつかの実施形態において、対照メチル化状態は、バイオマーカーのいずれかの検出可能なメチル化状態である。対照サンプルが生物学的サンプルと同時に検査される方法の他の実施形態において、所定のメチル化状態は、対照サンプル中のメチル化状態である。この方法の他の実施形態において、所定のメチル化状態は、標準曲線に基づく、及び／または標準曲線によって同定される。この方法の他の実施形態において、所定のメチル化状態は、特異的な状態、または状態の範囲である。したがって、所定のメチル化状態は、当業者には明らかであろう許容可能な限度内で、実践されている方法の実施形態及び所望の特異性などに部分的に基づいて選択され得る。
いくつかの実施形態において、肺癌を有するか、または有する疑いのある対象由来のサンプルが、１つまたは複数のメチル化マーカー、及び、異なるタイプの肺癌、例えば非小細胞癌（腺癌、大細胞癌、扁平上皮細胞癌）と小細胞癌とを区別するデータを提供する好適なアッセイ方法を使用してスクリーニングされる。例えば、腺癌及び小細胞癌では高度にメチル化されている（正常バフィーコート中のその遺伝子座における平均メチル化と比較した平均メチル化として示されている）が、大細胞または扁平上皮細胞癌では高度にメチル化されていないマーカー参照番号ＡＣ２７（図２；ＰＬＥＣ）；他の全てのサンプルタイプよりも腺癌で高度にメチル化されているマーカー参照番号ＡＣ２３（図１；ＩＴＰＲＩＰＬ１）；他の全てのサンプルタイプよりも大細胞癌で高度にメチル化されているマーカー参照番号ＬＣ２（図２；ＤＯＣＫ２））；他の全てのサンプルタイプよりも小細胞癌で高度にメチル化されているマーカー参照番号ＳＣ２２１（図３；ＳＴ８ＳＩＡ４）；ならびに他の全てのサンプルタイプよりも扁平上皮細胞癌で高度にメチル化されているマーカー参照番号ＳＱ３６（図４、ＤＯＫ１）を参照のこと。
本明細書に記載されるように選択されるメチル化マーカーは、対象由来のサンプルの分析が肺新生物の存在を明らかにし、また、肺癌のタイプ、例えば、小細胞癌と非小細胞癌を区別するのに十分な情報を提供するように、単独で、または組み合わせて（例えば、パネルで）使用され得る。好ましい実施形態において、マーカーまたはマーカーの組み合わせは、腺癌、大細胞癌、及び扁平上皮細胞癌を区別するために、及び／または未確定もしくは病理混合型の癌腫の特性決定を行うために十分なデータをさらに提供する。他の実施形態では、メチル化マーカーまたはそれらの組み合わせは、存在する肺癌のタイプにかかわらず、データを区別することなく、陽性結果（例えば、肺新生物の存在を示す結果）を提供するように選択される。
近年、転移性腫瘍細胞を表す循環上皮細胞が、多くのがん患者の血液中で検出され得ることが明らかになっている。希少細胞の分子プロファイリングは、生物学的研究及び臨床的研究において重要である。用途は、疾患の予後及び個別化された治療のための、がん患者の末梢血中の循環上皮細胞（ＣＥｐＣ）の特性決定と多岐にわたる（例えば、Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：７８１－７９１、Ｈａｙｅｓ ＤＦ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：４２１８－４２２４、Ｂｕｄｄ ＧＴ， ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６４０３－６４０９、Ｍｏｒｅｎｏ ＪＧ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｕｒｏｌｏｇｙ ６５：７１３－７１８、Ｐａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｎａｔ Ｒｅｖ ８：３２９－３４０、及びＣｏｈｅｎ ＳＪ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：３２１３－３２２１を参照のこと）。したがって、本開示の実施形態は、血漿または全血中のメチル化マーカーの存在を同定することによって、対象における転移癌の存在を存在するための組成物及び方法を提供する。
また、本明細書には、マルチプレックス逆転写及び前増幅に続いて、ＬＱＡＳ ＰＣＲ－フラップアッセイを含むアッセイが記載される（逆転写及び前増幅と組み合わせたＬＱＡＳアッセイは、ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳアッセイ（「Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｌｏｎｇ ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｓｉｇｎａｌ」の略）と呼ばれる）。ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳアッセイでは、標的ＲＮＡ、例えば、サンプル由来の全ＲＮＡを、例えば、２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、１．５ＵのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、及びオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、１２種の標的に対して、等モル量（例えば、各プライマー２００ｎＭ）または異なる標的ＲＮＡの増幅効率を調整するように変更した量の、１２種のプライマーペア／２４種のプライマー）を含む、ＲＴ－前増幅反応物で処理し、逆転写に適度な温度（例えば、４２℃）でインキュベートし、その後、限定された数のサーマルサイクル（例えば、９５℃、６３℃、７０℃の１０サイクル）により、含まれているプライマーペアに対応する標的配列の前増幅を行う。サーマルサイクリングの後、ＲＴ－前増幅反応物のアリコート（例えば、１０μＬ）を、後述するようにＬＱＡＳ ＰＣＲ－フラップアッセイで使用する。ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ及びＲＴ－ＬＱＡＳアッセイにおける検出に好適なＲＮＡは、いずれかの特定のタイプのＲＮＡ標的に限定されない。例えば、組織、細胞由来のあらゆる様式のＲＮＡ、または血液由来の循環セルフリーＲＮＡ、例えばタンパク質コーディングメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び他の非コードＲＮＡ分子（ｎｃＲＮＡ）（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、ＳＵ Ｕｍｕ， ｅｔ ａｌ． “Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ，” ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５（２）：２４２－２５０ （２０１８）を参照のこと）が、本明細書で後述するＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ法及びＲＴ－ＬＱＡＳ法を使用してアッセイされ得る。
好ましい実施形態において、これらの方法は、標準的なＰＣＲバッファーと比較して比較的高いＭｇ＋＋及び低いＫＣｌ（例えば、６～１０ｍＭ、好ましくは７．５ｍＭのＭｇ＋＋、及び０．０～０．８ｍＭのＫＣｌ）を有するＰＣＲ－フラップアッセイバッファーを含む反応混合物中で行われる。典型的なＰＣＲバッファーは、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８、及び５０ｍＭ ＫＣｌであり、ＰＣＲ－フラップアッセイバッファーは、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．３ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．８ｍＭ ＫＣｌ、０．１μｇ／μＬ ＢＳＡ、０．０００１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、及び０．０００１％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０を含む。驚くべきことに、本明細書で後述するＲＴ－ＬＱＡＳ法及びＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ法では、ＲＴ－ＬＱＡＳフラップアッセイの逆転写及びＴＥＬＱＡＳ法のＲＴ－前増幅を含む全ての増幅ステップが、同じＰＣＲ－フラップアッセイバッファー中で行われる。マルチプレックス前増幅を使用する場合、同じプライマーペアを前増幅標的濃縮及び定量的ＰＣＲ－フラップアッセイに使用することができ、すなわち、プライマーはネステッドプライマーである必要がない。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，７０４，０８１号を参照のこと。
［実施例］
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されているが、限定するものではない。理解を容易にするべく、技術提案の解釈を助けるために特定の実施形態が提供される。すなわち、これらの実施形態は、例示のみを目的とし、断じて本発明の範囲を限定するものではない。特に明記しない限り、実施形態は具体的な条件を示すものではなく、従来の条件または製造元の推奨条件に従っている。
実施例１
ＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離、タンパク質単離の方法。
以下に、分析前のＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離、及びタンパク質サンプル調製の例示的な方法を示す。
血液からのＲＮＡ単離
血液サンプルを、後のＲＮＡ検出に好適な採血チューブ（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｔｕｂｅ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に採取する。サンプルは直ちにアッセイしても、将来の分析まで凍結してもよい。ＲＮＡは、標準的な方法、例えば、Ｑｉａｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ ｂｌｏｏｄ ＲＮＡキット（製品番号：７６２６３５）により、製造元の説明に従って、サンプルから抽出される。ＲＴ－ＬＱＡＳで検査する前に、ＲＮＡサンプルを希釈してもよい（例えば、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中で１：５０）。
細胞及び血漿からのＤＮＡ単離
細胞株の場合、例えば、「Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ ｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ」（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、細胞馴化培地からゲノムＤＮＡを単離することができる。キットのプロトコールに従い、血漿の代わりに１ｍＬの細胞馴化培地（ＣＣＭ）を使用し、キットの手順に従って処理する。溶出体積は１００μＬであり、そのうち７０μＬを一般的にバイサルファイト変換に使用する。
４ｍＬの血漿サンプルからＤＮＡを単離するための例示的な手順は次の通りである：
● ４ｍＬの血漿サンプルに、３００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合する。
● １μｇ／μＬの魚ＤＮＡ ３μＬを血漿－プロテイナーゼＫ混合物に加える。
● ２ｍＬの血漿溶解バッファーを血漿に加える。
血漿溶解バッファーは次の通りである：
－ ４．３Ｍチオシアン酸グアニジン
－ １０％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、分岐）
（５．３ｇのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０と４５ｍＬの４．８Ｍチオシアン酸グアニジンを合わせたもの）
● 混合物を５５℃で１時間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
● 以下を加えて混合する：
○ ３ｍＬの血漿溶解バッファー
○ ２ｍＬの１００％イソプロパノール
○ ２００μＬの磁性シリカ結合ビーズ（ビーズ１６μｇ／μＬ）
（場合により、溶解バッファーとイソプロパノールを、各添加後に混合する、及び／または場合により、混合物に加える前に予備混合する）
● ３０℃で３０分間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
● チューブ（複数可）を磁石に付け、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。
● 結合ビーズを含む容器に７５０μＬのＧｕＨＣｌ－ＥｔＯＨを加えて混合する。
ＧｕＨＣｌ－ＥｔＯＨ洗浄バッファーは次の通りである：
－ ３Ｍ ＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）
－ ５７％ ＥｔＯＨ（エチルアルコール）
● ４００ｒｐｍで１分間振盪する。
● サンプルをディープウェルプレートまたは２ｍＬマイクロ遠心チューブに移す。
● チューブを磁石に付け、ビーズを１０分間収集させる。上清を吸引して廃棄する。
● １０００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭトリスＨＣｌ、８０％ ＥｔＯＨ）をビーズに加え、３０℃で３分間振盪しながらインキュベートする。
● チューブを磁石に付け、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。
● ５００μＬの洗浄バッファーをビーズに加え、３０℃で３分間振盪しながらインキュベートする。
● チューブを磁石に付け、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。
● ２５０μＬの洗浄バッファーを加え、３０℃で３分間振盪しながらインキュベートする。
● チューブを磁石に付け、ビーズを収集させる。残りのバッファーを吸引して廃棄する。
● ２５０μＬの洗浄バッファーを加え、３０℃で３分間振盪しながらインキュベートする。
● チューブを磁石に付け、ビーズを収集させる。残りのバッファーを吸引して廃棄する。
● ビーズを７０℃で１５分間振盪しながら乾燥させる。
● １２５μＬの溶出バッファー（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）をビーズに加え、６５℃で２５分間振盪しながらインキュベートする。
● チューブを磁石に付け、ビーズを１０分間収集させる。
● ＤＮＡを含む上清を吸引し、新しい容器またはチューブに移す。
バイサルファイト変換
Ｉ． 亜硫酸水素アンモニウムを使用したＤＮＡのスルホン化
１． 各チューブで、６４μＬのＤＮＡ、７μＬの１Ｎ ＮａＯＨ、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．２５ｍｇ／ｍＬの魚ＤＮＡを含む９μＬのキャリア溶液を合わせる。
２． ４２℃で２０分間インキュベートする。
３． １２０μＬの４５％亜硫酸水素アンモニウムを加え、６６°で７５分間インキュベートする。
４． ４℃で１０分間インキュベートする。
ＩＩ． 磁気ビーズを使用した脱スルホン化
材料
● 磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＭａｇｎｅＳｉｌ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＡＳ１０５０、１６μｇ／μＬ）。
● 結合バッファー：６．５～７Ｍ塩酸グアニジン。
● 変換後洗浄バッファー：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む８０％エタノール。
● 脱スルホン化バッファー：７０％イソプロピルアルコール、０．１Ｎ ＮａＯＨを脱スルホン化バッファーに選択した。
サンプルは、基本的に後述するような温度及び混合速度でサンプルを混合またはインキュベートするための任意の適切なデバイスまたは技術を使用して混合する。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）がサンプルの混合またはインキュベーションのために使用され得る。例示的な脱スルホン化は次の通りである：
１． ボトルを１分間ボルテックスすることにより、ビーズストックを十分に混合する。
２． ５０μＬのビーズを２．０ｍＬチューブ（例えばＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にアリコートする。
３． ７５０μＬの結合バッファーをビーズに加える。
４． ステップＩのスルホン化ＤＮＡ １５０μＬを加える。
５． 混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で３０分間）。
６． チューブをマグネットスタンドに置き、５分間放置する。チューブをスタンドに置いた状態で、上清を除去し、廃棄する。
７． １，０００μＬの洗浄バッファーを加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で３分間）。
８． チューブをマグネットスタンドに置き、５分間放置する。チューブをスタンドに置いた状態で、上清を除去し、廃棄する。
９． ２５０μＬの洗浄バッファーを加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で３分間）。
１０． チューブを磁気ラックに置く；１分後に上清を除去し、廃棄する。
１１． ２００μＬの脱スルホン化バッファーを加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で５分間）。
１２． チューブを磁気ラックに置く；１分後に上清を除去し、廃棄する。
１３． ２５０μＬの洗浄バッファーを加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で３分間）。
１４． チューブを磁気ラックに置く；１分後に上清を除去し、廃棄する。
１５． ２５０μＬの洗浄バッファーをチューブに加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭ、３０℃で３分間）。
１６． チューブを磁気ラックに置く；１分後に上清を除去し、廃棄する。
１７． 蓋を開けた状態で全てのチューブを３０℃で１５分間インキュベートする。
１８． 磁気ラックからチューブを取り出し、７０μＬの溶出バッファーをビーズに直接加える。
１９． ビーズを溶出バッファーと共にインキュベートする（例えば、１０００ＲＰＭ、４０℃で４５分間）。
２０． チューブを磁気ラックに約１分間置く；上清を取り除いて取っておく。
次いで、変換されたＤＮＡを、後述のように、検出アッセイ、例えば、前増幅及び／またはフラップエンドヌクレアーゼアッセイで使用する。
核酸のバイサルファイト処理のさらなる実施形態については、米国特許第１０，７０４，０８１号及び２０２０年７月２９日に出願された米国特許出願第６３／０５８，１７９号を参照されたい。これらは各々、あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれ、本明細書に記載される技術で適用され得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ及びＤＮＡは、対象由来の異なる血液サンプルから単離される。例えば、ＲＮＡの最適な保存及び／または単離のために構成された第１の採取チューブと、ＤＮＡの最適な保存及び単離のために構成された第２の採取チューブとに、血液を採取してもよく、この様式で採取された血液の一部から、ＲＮＡ及びＤＮＡを抽出してもよい。他の実施形態において、ＲＮＡ及びＤＮＡはいずれも、例えば、ＤＮＡとＲＮＡの両方の最適な保存及び単離のために構成された採取チューブ（例えば、セルフリーＤＮＡとセルフリーＲＮＡの両方の保存及び単離のための、ＮＯＲＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．のｃｆ－ＤＮＡ／ｃｆ－ＲＮＡ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｔｕｂｅｓ（カタログ番号６３９５０））を使用して、単一の採血サンプルから抽出される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ及びＤＮＡは、例えば、ＲＴ－ＬＱＡＳ／ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ反応において一緒にアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ及びＤＮＡは、上述のように、別々に単離され、及び／または別々に、例えばバイサルファイトで処理され、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは一緒に処理され、例えば、両方がバイサルファイト処理及び後の精製中に存在し、アッセイ反応物に一緒に加えられる。
フラップエンドヌクレアーゼアッセイ
ＱｕＡＲＴＳ及びＬＱＡＳ／ＴＥＬＱＡＳフラップアッセイ技術は、ポリメラーゼベースの標的ＤＮＡ増幅プロセスを、侵襲的切断ベースのシグナル増幅プロセスと組み合わせたものである。ＱｕＡＲＴＳ技術は、例えば、米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号に記載されており、より長い標的特異的領域を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用するフラップアッセイ（Ｌｏｎｇ ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｓｉｇｎａｌ、「ＬＱＡＳ」）は、米国特許第１０，６４８，０２５号に記載されており、これらは各々、あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるＱｕＡＲＴＳアッセイでは、フラップオリゴヌクレオチドは、１２塩基の標的特異的領域を有し、一方ＬＱＡＳアッセイは、少なくとも１３塩基の標的特異的領域を有するフラップオリゴヌクレオチドを使用し、増幅のために異なるサーマルサイクリング手順を使用する。ＱｕＡＲＴＳ及びＬＱＡＳ反応により生成される蛍光シグナルは、リアルタイムＰＣＲと同様の様式でモニタリングされ、サンプル中の標的核酸の量の定量化が可能である。
例示的なＱｕＡＲＴＳ反応は、典型的に、およそ２００～６００ｎｍｏｌ／Ｌ（例えば、５００ｎｍｏｌ／Ｌ）の各プライマー及び検出プローブ、およそ１００ｎｍｏｌ／Ｌの侵襲性オリゴヌクレオチド、およそ６００～７００ｎｍｏｌ／Ｌの各ＦＲＥＴカセット（ＦＡＭ、例えば、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．により商業的に供給されているもの；ＨＥＸ、例えば、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商業的に供給されているもの；及びＱｕａｓａｒ ６７０、例えば、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商業的に供給されており、「ブラックホール」クエンチャー、例えば、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、またはＢＨＱ－３を含むもの）、６．６７５ｎｇ／μＬのＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）２．０、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）、３０μＬ反応体積中１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの３－（ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、７．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、及び２５０μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む。例示的なＱｕＡＲＴＳサイクリング条件は、下記の表に示す通りである。いくつかの用途において、数量化サイクル（Ｃｑ）の分析により、サンプル中の標的ＤＮＡ鎖の初期数（例えば、コピー数）の測度がもたらされる。
Figure 2022546504000002
例示的なＬＱＡＳ反応物は、典型的に、およそ２００～６００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマー、およそ１００ｎｍｏｌ／Ｌの侵襲性オリゴヌクレオチド、およそ５００ｎｍｏｌ／Ｌの各フラップオリゴヌクレオチドプローブ及びＦＲＥＴカセットを含む。ＬＱＡＳ反応物は、例えば、次のサーモサイクリング条件に供され得る：
Figure 2022546504000003
ＱｕＡＲＴＳ及びＬＱＡＳアッセイのためのマルチプレックス標的前増幅
バイサルファイト変換ＤＮＡのマルチプレックス標的前増幅
インプットサンプルからバイサルファイト処理済みＤＮＡのほとんどまたは全てを前増幅するために、単一の大容量マルチプレックス増幅反応において、大量の処理済みＤＮＡを使用することができる。例えば、ＤＮＡは、上述のように、例えばＭａｘｗｅｌｌ Ｐｒｏｍｅｇａ血液キット＃ＡＳ１４００を使用して、細胞株（例えば、ＤＦＣＩ０３２細胞株（腺癌）；Ｈ１７５５細胞株（神経内分泌）から抽出される。このＤＮＡを、例えば、上述のようにバイサルファイト変換する。
前増幅は、例えば、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、０．３ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．８ｍＭのＫＣｌ、０．１μｇ／μＬのＢＳＡ、０．０００１％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０００１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、１２種の標的に対して、等モル量（例えば、各プライマー２００～５００ｎＭを含むがこれに限定されない範囲）、または異なる標的領域の増幅効率のバランスを取るように調整された個々のプライマー濃度の、１２種のプライマーペア／２４種のプライマー）、０．０２５単位／μＬのＨｏｔＳｔａｒｔ ＧｏＴａｑ濃縮物、及び２０～５０体積％のバイサルファイト処理済み標的ＤＮＡ（例えば、５０μＬの反応混合物中に１０μＬの標的ＤＮＡ、または１２５μＬの反応混合物中に５０μＬの標的ＤＮＡ）を含む反応混合物中で行う。サーマルサイクリング時間及び温度は、反応物及び増幅容器の容量に適切となるよう選択する。例えば、反応物は、次のようなサイクルにかけられ得る：
Figure 2022546504000004
サーマルサイクリング後、前増幅反応物のアリコート（例えば、１０μＬ）を、魚ＤＮＡありまたはなしで、１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで５００μＬに希釈する。希釈した前増幅ＤＮＡのアリコート（例えば、１０μＬ）を、例えば上述のようなＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップアッセイで使用する。２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，０９７号、２０１６年１０月２６日に出願された出願第１５／３３５，０９６号、及び２０１６年１０月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／５８８７５も参照のこと。これらは各々、あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる。
前増幅とＬＱＡＳを組み合わせたアッセイは、ＴＥＬＱＡＳアッセイ（「Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｌｏｎｇ ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｓｉｇｎａｌ」の略）と呼ばれる。
前増幅されたサンプルを使用し、ＱｕＡＲＴＳ及びＴＥＬＱＡＳ反応を次のように準備する：
Figure 2022546504000005
上記のように、ＱｕＡＲＴＳアッセイのフラップオリゴヌクレオチドは、１２塩基の標的特異的領域を有し、一方ＬＱＡＳアッセイは、少なくとも１３塩基の標的特異的領域を有するフラップオリゴヌクレオチドを使用し、異なるサーマルサイクリング条件に供される。
ＱｕＡＲＴＳ反応物は、次のサーモサイクリング条件に供される：
Figure 2022546504000006
ＴＥＬＱＡＳ反応物は、次のサーモサイクリング条件に供される：
Figure 2022546504000007
ＲＮＡ検出のためのＬＱＡＳ／ＴＥＬＱＡＳ（「ＲＴ－ＬＱＡＳ」または「ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ」）
例示的なＲＴ－ＬＱＡＳ反応物は、２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、２１９ｎｇのＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）２．０、１．５ＵのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー、各５００ｎＭのプローブ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ならびに２５０μＭの各ｎＮＴＰを含む。例示的なプロトコールは次の通りである：
１． 要求される必要なオリゴヌクレオチドミックスを－２０℃の冷凍庫から取り出し、解凍する。
２． 対照を－８０℃から室温で短時間解凍し、次いで氷上に置く。
３． サンプルプレートを－８０℃から室温で短時間解凍し、次いで氷上に置く。
４． 適切なサイズのチューブでオリゴ混合物のマスターミックスを調製する。
５． ＭＭＬＶ－ＲＴをＨ２Ｏで１：２０に希釈する
Figure 2022546504000008
６． プレートレイアウトに従って、マトリックスピペットまたは８チャネルＰ２０ピペットを使用し、２０μＬのマスターミックスを９６ウェルＲＴ－ＬＱＡＳプレートにピペッティングして入れる。
７． １０μＬのサンプル、対照、キャリブレータをロードする（プレートレイアウトに従う）。
８． プレートを密封し、手短に遠心分離する。
９． 以下の反応条件でプレートをランする
反応は、典型的に、リアルタイムで（例えば、連続的に、またはいくつかもしくは全てのサイクルで同じ時点で）蛍光データを収集するよう構成されたサーマルサイクラーでランする。例えば、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０計器またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＤＸ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ計器が、次の条件下で使用され得る：
Figure 2022546504000009
いくつかの実施形態において、ＲＴ－ＬＱＡＳアッセイは、上述のように、マルチプレックス逆転写ステップと、前増幅ステップ、例えば、サンプル中で２、５、１０、１２、またはそれ以上の標的（すなわち１つの標的よりも多くの任意の数の標的）を前増幅させるステップとを含み得、「ＲＴ－ＴＥＬＱＡＳ」と呼ばれ得る。好ましい実施形態において、ＲＴ－前増幅は、例えば、２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、１．５ＵのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、及びオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、１２種の標的に対して、等モル量（例えば、各プライマー２００ｎＭ）、または異なる標的の増幅効率のバランスを取るよう調整された個々のプライマー濃度の、１２種のプライマーペア／２４種のプライマー）を含む反応混合物中で行う。サーマルサイクリング時間及び温度は、反応物及び増幅容器の容量に適切となるよう選択する。例えば、反応物は、次のようなサイクルにかけられ得る：
Figure 2022546504000010
サーマルサイクリング後、ＲＴ－前増幅反応物のアリコート（例えば、１０μＬ）を、魚ＤＮＡありまたはなしで、１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで５００μＬに希釈する。希釈した前増幅ＤＮＡのアリコート（例えば、１０μＬ）を、上述のようなＬＱＡＳ／ＴＥＬＱＡＳ ＰＣＲ－フラップアッセイで使用する。いくつかの実施形態において、ＬＱＡＳ／ＴＥＬＱＡＳ ＰＣＲフラップアッセイは、追加量の同じプライマーペアを使用して行われる。
実施例２
メチル化マーカーの選択及び検査
マーカー選択プロセス：
ＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データを、１６の腺癌肺癌組織、１１の大細胞肺癌組織、１４の小細胞肺癌組織、２４の扁平上皮細胞肺癌組織、及び１８の非癌肺組織から取得し、２６名の健康な患者からバフィーコートサンプルのＲＲＢＳ結果も取得した。
バイサルファイト変換型のヒトゲノム配列とのアラインメントの後、各ＣｐＧアイランドにおける平均メチル化を各サンプルタイプ（すなわち、組織またはバフィーコート）について計算し、次の基準に基づいてマーカー領域を選択した：
● 領域は５０塩基対以上になるように選択した。
● ＱｕＡＲＴＳフラップアッセイの設計では、ａ）プローブ領域、ｂ）フォワードプライマー結合領域、及びｃ）リバースプライマー結合領域の各々の下に最低１つのメチル化ＣｐＧがあるように領域を選択した。フォワードプライマー及びリバースプライマーについては、メチル化ＣｐＧがプライマーの３’末端に近いが、３’末端ヌクレオチドにはないことが好ましい。例示的なフラップエンドヌクレアーゼアッセイオリゴヌクレオチドを図５に示す。
● 目的の領域内のいずれかのＣｐＧにおけるバフィーコートのメチル化は、＞０．５％以下であることが好ましい。
● 目的の領域内のがん組織のメチル化は、＞１０％であることが好ましい。
● 組織分析のために設計されたアッセイでは、目的の領域内の正常組織のメチル化は、好ましくは＜０．５％である。
異なる肺癌組織型のＲＲＢＳデータを図２～５に示す。上記の基準に基づいて、下記の表に示したマーカーを選択し、図５に示すように、これらについてＱｕＡＲＴＳフラップアッセイを設計した。
Figure 2022546504000011
Figure 2022546504000012
Figure 2022546504000013
選択されたマーカーのバフィーコートとの交差反応性の分析。
１）バフィーコートのスクリーニング
健康な患者の血液１０ｍＬから得られたバフィーコートから抽出したＤＮＡで、上記リストのマーカーをスクリーニングした。ＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）を使用して抽出し、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して変換した。バイサルファイト変換β－アクチンＤＮＡ（「ＢＴＡＣＴ」）とのバイプレックス反応を使用し、標的ゲノムＤＮＡのおよそ４０，０００の鎖を使用し、上述のようなＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイを使用してサンプルを検査して、交差反応性を検査した。すると、３つのマーカーのアッセイが有意な交差反応性を示した：
Figure 2022546504000014
２）組織のスクリーニング
２６４の組織サンプルを、下記の表２に示すように、様々な商業的供給源及び非商業的供給源（Ａｓｕｒａｇｅｎ、ＢｉｏＳｅｒｖｅ、ＣｏｎｖｅｒｓａｎｔＢｉｏ、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｍ Ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、及びＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ）から得た。
Figure 2022546504000015
病理学者が組織切片を検査し、組織学的に明確な病変に丸をつけて顕微解剖を指示した。全核酸の抽出は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステムを使用して行った。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドをこすり、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（＃ＡＳ１４５０）を使用し、製造元の手順を使用し、ただしＲＮａｓｅ処理ステップを省略して、ＤＮＡを抽出した。同じ手順をＦＦＰＥカールにも使用した。凍結パンチ生検サンプルの場合、ＲＳＣ ＤＮＡ ＦＦＰＥキットの溶解バッファーとＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡキット（＃ＡＳ１４００）を使用した、改変された手順を利用し、ＲＮａｓｅステップを省略した。サンプルを１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で溶出し、１０ｕＬを使用して６つのマルチプレックスＰＣＲ反応を準備した。
以下のマルチプレックスＰＣＲプライマーミックスを１０倍濃度（１０倍＝各プライマー２μＭ）で作った：
● マルチプレックスＰＣＲ反応物１は、次の各マーカーからなるものであった：ＢＡＲＸ１、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＰＡＲＰ１５、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１４５１０５６４６－１４５１０５６５３、ＳＴ８ＳＩＡ１＿２２、ＺＤＨＨＣ１、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＳＫＩ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＲＡＳＳＦ１、ＦＥＲＭＴ３、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ反応物２は、次の各マーカーからなるものであった：ＺＮＦ６７１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６－２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＯＢＰ、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ反応物３は、次の各マーカーからなるものであった：ＭＡＸ．ｃｈｒ１０．２２６２４４３０－２２６２４５４４、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１４５１０５６４６－１４５１０５６５３、ＭＡＸ．ｃｈｒ１０．２２５４１８９１－２２５４１９４６、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０８７５２２３－５０８７５２４１、ＰＴＧＤＲ＿９、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＤＯＣＫ２、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ反応物４は、次の各マーカーからなるものであった：ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．１６３９４４８９－１６３９４５７５、ＨＯＸＢ２、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．３７２８８４２６－３７２８８４８０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６５２２６８－５２６５２３６２、ＦＬＪ４５９８３、ＨＯＸＡ９、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ反応物５は、次の各マーカーからなるものであった：ＥＭＸ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＯＰＬＡＨ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ７８１、ＤＬＸ４、ＰＴＧＤＲ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ｃｈｒ１７＿７３７、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ反応物６は、次の各マーカーからなるものであった：ＴＢＸ１５、ＭＡＴＫ、ＳＨＯＸ２、ＢＣＡＴ１、ＳＵＣＬＧ２、ＢＩＮ２、ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＳＨＲＯＯＭ１、Ｓ１ＰＲ４、ＮＦＩＸ、及びＢＴＡＣＴ。
各マルチプレックスＰＣＲ反応は、０．２μＭの反応バッファー、０．２μＭの各プライマー、０．０５μＭのＨｏｔｓｔａｒｔ Ｇｏ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）の最終濃度となるように準備し、４０μＬのマスターミックスを１０μＬのＤＮＡテンプレートと合わせて５０μＬの最終反応体積となるようにした。
マルチプレックスＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５°で５分間のプレインキュベーションステージと、９５°で３０秒間、６４°で３０秒間、７２°で３０秒間の１０サイクルの増幅と、４°で冷却し、さらなる処理まで保持するステージとを伴った。マルチプレックスＰＣＲが完了したら、ＰＣＲ産物を、２０ｎｇ／μＬの魚ＤＮＡ（例えば、水中またはバッファー中、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２１２，３９２号を参照のこと）の希釈剤を使用して１：１０に希釈し、１０μＬの希釈した増幅サンプルを各ＱｕＡＲＴＳアッセイ反応に使用した。
各ＱｕＡＲＴＳアッセイは、２つのメチル化マーカー及び参照遺伝子としてのＢＴＡＣＴからなるトリプレックス形式で構成した。
● マルチプレックスＰＣＲ産物１からは、次の７つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＢＡＲＸ１、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＢＴＡＣＴ；（２）ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＢＴＡＣＴ；（３）ＰＡＲＰ１５、ＭＡＸｃｈｒ８１４５１０５６４６－１４５１０５６５３、ＢＴＡＣＴ；（４）ＳＴ８ＳＩＡ１＿２２、ＺＤＨＨＣ１、ＢＴＡＣＴ；（５）ＢＩＮ２＿Ｚ、ＳＫＩ、ＢＴＡＣＴ；（６）ＤＮＭＴ３Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＴＡＣＴ；（７）ＲＡＳＳＦ１、ＦＥＲＭＴ３、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ産物２からは、次の５つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＺＮＦ６７１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＴＡＣＴ；（２）ＮＫＸ６－２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＴＡＣＴ；（３）ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＢＴＡＣＴ；（４）ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１１１０、ＡＧＲＮ、ＢＴＡＣＴ；（５）ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＯＢＰ、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ産物３からは、次の５つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＭＡＸｃｈｒ１０２２６２４４３０－２２６２４５４４、ＺＭＩＺ１、ＢＴＡＣＴ；（２）ＭＡＸｃｈｒ８１４５１０５６４６－１４５１０５６５３、ＭＡＸｃｈｒ１０２２５４１８９１－２２５４１９４６、ＢＴＡＣＴ；（３）ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＢＴＡＣＴ；（４）ＭＡＸｃｈｒ１６５０８７５２２３－５０８７５２４１、ＰＴＧＤＲ＿９、ＢＴＡＣＴ；（５）ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＤＯＣＫ２、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ産物４からは、次の５つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＭＡＸｃｈｒ１９１６３９４４８９－１６３９４５７５、ＨＯＸＢ２、ＢＴＡＣＴ；（２）ＺＮＦ１３２、ＭＡＸｃｈｒ１９３７２８８４２６－３７２８８４８０、ＢＴＡＣＴ；（３）ＭＡＸｃｈｒ１２５２６５２２６８－５２６５２３６２、ＦＬＪ４５９８３、ＢＴＡＣＴ；（４）ＨＯＸＡ９、ＴＲＨ、ＢＴＡＣＴ；（５）ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ産物５からは、次の５つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＥＭＸ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＢＴＡＣＴ；（２）ＯＰＬＡＨ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＢＴＡＣＴ；（３）ＺＮＦ７８１、ＤＬＸ４、ＢＴＡＣＴ；（４）ＰＴＧＤＲ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＢＴＡＣＴ；（５）ＧＲＩＮ２Ｄ、ｃｈｒ１７＿７３７、及びＢＴＡＣＴ。
● マルチプレックスＰＣＲ産物６からは、次の５つのトリプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイをランした：（１）ＴＢＸ１５、ＭＡＴＫ、ＢＴＡＣＴ；（２）ＳＨＯＸ２、ＢＣＡＴ１、ＢＴＡＣＴ；（３）ＳＵＣＬＧ２、ＢＩＮ２、ＢＴＡＣＴ；（４）ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＳＨＲＯＯＭ１、ＢＴＡＣＴ；（５）Ｓ１ＰＲ４、ＮＦＩＸ、及びＢＴＡＣＴ。
３）データ分析：
組織データの分析では、正常組織で＜０．５％メチル化及びがん組織で＞１０％メチル化のＲＲＢＳ基準に基づいて選択されたマーカーを含めた。これにより、さらに分析するための５１種のマーカーが得られた。
マーカーの感度を判定するために、以下を行った：
１．各マーカーのメチル化％は、その特定のマーカーで得られた鎖の値をＡＣＴＢ（β－アクチン）の鎖の値で割ることによって計算した。
２．各マーカーの最大メチル化％は、正常組織で測定した。これが１００％の特異性として定義される。
３．各マーカーのがん組織陽性は、そのマーカーの正常組織の最大メチル化％よりも多かったがん組織の数として判定した。
５１種のマーカーの感度を以下に示す。
Figure 2022546504000016
Figure 2022546504000017
マーカーの組み合わせを使用して特異性及び感度を増加させることができる。例えば、８つのマーカーＳＬＣ１２Ａ８、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＰＡＲＰ１５、ＯＰＬＡＨ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＨＯＸＢ２、及びＥＭＸ１の組み合わせは、検査したがん組織の全てで、１００％の特異性で、９８．５％の感度（１３４／１３６のがん）をもたらした。
いくつかの実施形態において、マーカーは、例えば、特定のがんタイプまたはタイプの組み合わせに対して感度及び特異性を示すマーカーの使用による、特定のタイプの肺癌組織、例えば、腺癌、大細胞癌、扁平上皮細胞癌、または小細胞癌と関連する、高感度かつ特異的な検出のために選択される。
組織でアッセイされたメチル化ＤＮＡマーカーのこのパネルは、正常な肺組織及び良性結節では陰性のままでありながら、全てのタイプの肺癌のきわめて高度な識別を達成する。このマーカーパネルのアッセイは、血液または体液ベースの検査にも適用することができ、例えば、肺癌スクリーニング及び悪性結節と良性結節の識別に応用される。
実施例３
血漿サンプルでの３０マーカーセットの検査
実施例２のマーカーのリストから、３０種のマーカーを、２９５名の対象（肺癌６４名、正常対照２３１名）由来の血漿サンプルにおけるＤＮＡの検査で使用するために選択した。ＤＮＡを各対象の２ｍＬの血漿から抽出し、実施例１に記載したようにバイサルファイトで処理した。バイサルファイト変換ＤＮＡのアリコートを、実施例１に記載したように、２つのマルチプレックスＱｕＡＲＴＳアッセイで使用した。分析のために選択したマーカーは次の通りである：
１． ＢＡＲＸ１
２． ＢＣＬ２Ｌ１１
３． ＢＩＮ２＿Ｚ
４． ＣＹＰ２６Ｃ１
５． ＤＬＸ４
６． ＤＭＲＴＡ２
７． ＤＮＭＴ３Ａ
８． ＥＭＸ１
９． ＦＥＲＭＴ３
１０． ＦＬＪ４５９８３
１１． ＨＯＸＡ９
１２． ＫＬＨＤＣ７Ｂ
１３． ＭＡＸ．ｃｈｒ１０．２２６２４４３０－２２６２４５４４
１４． ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６５２２６８－５２６５２３６２
１５． ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４１７３２３６－１２４１７３３７０
１６． ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１４５１０５６４６－１４５１０５６５３
１７． ＮＦＩＸ
１８． ＯＰＬＡＨ
１９． ＰＡＲＰ１５
２０． ＰＲＫＣＢ＿２８
２１． Ｓ１ＰＲ４
２２． ＳＨＯＸ２
２３． ＳＫＩ
２４． ＳＬＣ１２Ａ８
２５． ＳＯＢＰ
２６． ＳＰ９
２７． ＳＵＣＬＧ２
２８． ＴＢＸ１５
２９． ＺＤＨＨＣ１
３０． ＺＮＦ７８１
これらのマーカーの、標的配列、バイサルファイト変換後の標的配列、及びアッセイオリゴヌクレオチドは、図５に示す通りであった。各変換標的に使用したプライマー及びフラップオリゴヌクレオチド（プローブ）は、次の通りであった：
Figure 2022546504000018
Figure 2022546504000019
Figure 2022546504000020
Figure 2022546504000021
Figure 2022546504000022
Figure 2022546504000023
Figure 2022546504000024
Figure 2022546504000025
Figure 2022546504000026
Figure 2022546504000027
＊Ｂ３ＧＡＬＴ６マーカーは、がんメチル化マーカーと参照標的の両方として使用される。参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１９日に出願された米国特許出願第６２／３６４，０８２号を参照のこと。
†ゼブラフィッシュの参照ＤＮＡについては、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１９日に出願された米国特許出願第６２／３６４，０４９号を参照のこと。
上述のように血漿から調製されたＤＮＡを、実施例１に記載したように、２つのマルチプレックス前増幅反応で増幅した。マルチプレックス前増幅反応は、次のマーカーの組み合わせを増幅する試薬を含んだ。
Figure 2022546504000028
前増幅の後、前増幅混合物のアリコートを１０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで１：１０に希釈し、次いで、実施例１に記載したようにトリプレックスＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップアッセイでアッセイした。第１群のトリプレックス反応は、マルチプレックスミックス１からの前増幅材料を使用し、第２群の反応は、マルチプレックスミックス２からの前増幅材料を使用した。トリプレックスの組み合わせは次の通りであった：
第１群：
ＺＦ＿ＲＡＳＳＦ１－Ｂ３ＧＡＬＴ６－ＢＴＡＣＴ（ＺＢＡトリプレックス）
ＢＡＲＸ１－ＳＬＣ１２Ａ８－ＢＴＡＣＴ（ＢＳＡ２トリプレックス）
ＰＡＲＰ１５－ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４－ＢＴＡＣＴ（ＰＭＡトリプレックス）
ＳＨＯＸ２－ＺＤＨＨＣ１－ＢＴＡＣＴ（ＳＺＡ２トリプレックス）
ＢＩＮ２＿Ｚ－ＳＫＩ－ＢＴＡＣＴ（ＢＳＡトリプレックス）
ＤＮＭＴ３Ａ－ＢＣＬ２Ｌ１１－ＢＴＡＣＴ（ＤＢＡトリプレックス）
ＴＢＸ１５－ＦＥＲＭＴ３－ＢＴＡＣＴ（ＴＦＡトリプレックス）
ＰＲＫＣＢ＿２８－ＳＯＢＰ－ＢＴＡＣＴ（ＰＳＡ２トリプレックス）
第２群：
ＺＦ＿ＲＡＳＳＦ１－Ｂ３ＧＡＬＴ６－ＢＴＡＣＴ（ＺＢＡトリプレックス）
ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１４５－ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６－ＢＴＡＣＴ（ＭＭＡ２トリプレックス）
ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６－ＦＬＪ４５９８３－ＢＴＡＣＴ（ＭＦＡトリプレックス）
ＨＯＸＡ９－ＥＭＸ１－ＢＴＡＣＴ（ＨＥＡトリプレックス）
ＳＰ９－ＤＭＲＴＡ２－ＢＴＡＣＴ（ＳＤＡトリプレックス）
ＯＰＬＡＨ－ＣＹＰ２６Ｃ１－ＢＴＡＣＴ（ＯＣＡトリプレックス）
ＺＮＦ７８１－ＤＬＸ４－ＢＴＡＣＴ（ＺＤＡトリプレックス）
ＳＵＣＬＧ２－ＫＬＨＤＣ７Ｂ－ＢＴＡＣＴ（ＳＫＡトリプレックス）
Ｓ１ＰＲ４－ＮＦＩＸ－ＢＴＡＣＴ（ＳＮＡトリプレックス）
各トリプレックスの頭字語は、各遺伝子名の最初の文字を使用する（例えば、ＨＯＸＡ９－ＥＭＸ１－ＢＴＡＣＴの組み合わせ＝「ＨＥＡ」）。ある頭字語が、マーカーの異なる組み合わせについて、または別の実験から繰り返される場合、その頭字語を有する第２の群は２の数字を含む。上記に挙げたトリプレックスの各メンバーのＦＲＥＴカセットで使用される色素レポーターは、それぞれＦＡＭ－ＨＥＸ－Ｑｕａｓａｒ６７０である。
標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用して、定量的反応を較正した。各キャリブレータプラスミドについて、魚ＤＮＡ希釈剤（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中２０ｎｇ／ｍＬの魚ＤＮＡ）中で１μｌ当たり１０～１０６コピーの標的鎖を有する１０倍キャリブレータ希釈ストックの系列を調製した。トリプレックス反応には、トリプレックスの標的の各々を含むプラスミドを有する混合ストックを使用した。１μＬ当たり１×１０５コピーで各プラスミドを有する混合物を調製し、これを使用して１：１０希釈系列を作った。未知のサンプル中の鎖は、Ｃｐ対Ｌｏｇ（プラスミドの鎖）をプロットすることにより生成された標準曲線を使用して逆算した。
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用し、各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。これを、９５％包含区間の上限によってソートして下記の表に示す。
Figure 2022546504000029
これらのマーカーは、がん患者のサンプルを正常対象のサンプルから区別するうえで非常に良好に機能した（上記ＲＯＣの表を参照のこと）。マーカーを組み合わせて使用すると感度が改善した。例えば、データのロジスティックフィット、ならびにＳＨＯＸ２、ＳＯＢＰ、ＺＮＦ７８１、ＢＴＡＣＴ、ＣＹＰ２６Ｃ１、及びＤＬＸ４のマーカーを使用した６マーカーフィットを使用すると、ＲＯＣ曲線分析は、０．９７３の曲線下面積（ＡＵＣ）を与えた。この６マーカーフィットを使用すると、９２．２％の感度が９３％の特異性で得られる。ＳＨＯＸ２、ＳＯＢＰ、ＺＮＦ７８１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＳＵＣＬＧ２、及びＳＫＩを使用した場合、ＡＵＣが０．９７９８２のＲＯＣ曲線が与えられた。
実施例４
第２の独立試験群のアーカイブ血漿を盲検法で検査した。各群の肺癌症例及び対照（明らかに健康な喫煙者）は、年齢及び性別（２３症例、８０対照）でバランスを取った。実施例１に記載したように、マルチプレックスＰＣＲに続いてＱｕＡＲＴＳ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ増幅）アッセイを使用し、血漿から抽出されたＤＮＡ上のメチル化ＤＮＡマーカーのバイサルファイト後の数量化を行った。この実験では、実施例３の上位の各メチル化マーカーを検査して、肺癌検出に最適なマーカーパネルを同定した（２ｍｌ／患者）。
結果：１３種の高性能メチル化ＤＮＡマーカーを検査した（ＣＹＰ２６Ｃ１、ＳＯＢＰ、ＳＵＣＬＧ２、ＳＨＯＸ２、ＺＤＨＨＣ１、ＮＦＩＸ、ＦＬＪ４５９８３、ＨＯＸＡ９、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＺＮＦ７８１、ＳＰ９、ＢＡＲＸ１、及びＥＭＸ１）。データは、ロジスティック回帰フィット及び回帰二分木手法の２つの方法を使用して分析した。ロジスティックフィットモデルは、０．９６のＡＵＣならびに９１％の全体的感度及び９０％の特異性を有する４マーカーパネル（ＺＮＦ７８１、ＢＡＲＸ１、ＥＭＸ１、及びＳＯＢＰ）を同定した。回帰二分木手法を使用したデータの分析は、０．９６のＡＵＣならびに９６％の全体的感度及び９４％の特異性を有する４つのマーカー（ＺＮＦ７８１、ＢＡＲＸ１、ＥＭＸ１、及びＨＯＸＡ９）を同定した。いずれの手法でも、Ｂ３ＧＡＬＴ６を総ＤＮＡインプットの標準化マーカーとして使用した。血漿中でアッセイされたメチル化ＤＮＡマーカーのこれらのパネルは、全てのタイプの肺癌に対して高い感度及び特異性を達成した。
実施例５
肺癌の区別
上述の方法を使用すると、特定のタイプの肺癌に関連するメチル化の検出において高い性能を呈するメチル化マーカーが選択される。
肺癌を有する疑いのある対象について、サンプル、例えば、血漿サンプルが採取され、ＤＮＡがサンプルから単離され、例えば、実施例１に記載したようなバイサルファイト試薬で処理される。変換されたＤＮＡは、実施例１に記載したように、マルチプレックスＰＣＲに続いて、異なるメチル化マーカーまたはメチル化マーカーの組み合わせに対して同定可能な異なるシグナルを提供するよう構成されたＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイを使用して分析され、これにより、対象における１つまたは複数の異なるタイプの肺癌（例えば、腺癌、大細胞癌、扁平上皮細胞癌、及び／または小細胞癌）の存在を特異的に同定するよう構成されたデータセットが提供される。好ましい実施形態では、肺癌の存在を示すアッセイ結果の存在または非存在を示し、存在する場合は、１つまたは複数の同定されたタイプの肺癌の存在をさらに示す、レポートが生成される。いくつかの実施形態において、対象由来のサンプルが、ある期間または治療の過程にわたって採取され、アッセイ結果が、がんの病状の変化をモニタリングするために比較される。
異なるタイプの肺癌に対する感度を示すマーカー及びマーカーパネルは、例えば、存在するがんのタイプ（複数可）の分類、病理混合型の同定、及び／または経時的ながんの進行及び／または治療への応答のモニタリングに利用される。
実施例６
実施例１に記載したように、マルチプレックスＰＣＲに続いてＱｕＡＲＴＳ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ増幅）アッセイを使用し、血漿から抽出されたＤＮＡ上のメチル化ＤＮＡマーカーのバイサルファイト後の数量化を行った。これらのマーカーの、標的配列、バイサルファイト変換後の標的配列、及びアッセイオリゴヌクレオチドは、図５に示す通りであった。各変換標的に使用したプライマー及びフラップオリゴヌクレオチド（プローブ）は、次の通りであった：
Figure 2022546504000030
Figure 2022546504000031
Figure 2022546504000032
Figure 2022546504000033
上述のように血漿から調製されたＤＮＡを、実施例１に記載したように、マルチプレックス前増幅反応で増幅した。前増幅の後、前増幅混合物のアリコートを１０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで１：１０に希釈し、次いで、実施例１に記載したようにトリプレックスＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップアッセイでアッセイした。トリプレックスの組み合わせは次の通りであった：
Figure 2022546504000034
標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用して、定量的反応を較正した。各キャリブレータプラスミドについて、魚ＤＮＡ希釈剤（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中２０ｎｇ／ｍＬの魚ＤＮＡ）中で１μｌ当たり１０～１０６コピーの標的鎖を有する１０倍キャリブレータ希釈ストックの系列を調製した。トリプレックス反応には、トリプレックスの標的の各々を含むプラスミドを有する混合ストックを使用した。１μＬ当たり１×１０５コピーで各プラスミドを有する混合物を調製し、これを使用して１：１０希釈系列を作った。未知のサンプル中の鎖は、Ｃｐ対Ｌｏｇ（プラスミドの鎖）をプロットすることにより生成された標準曲線を使用して逆算した。
Ｂ３ＧＡＬＴ６鎖に対するメチル化％を使用した受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用し、各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。これを下記の表に示す。
Figure 2022546504000035
ＢＡＲＸ１、ＦＬＪ４５９８３、ＳＯＢＰ、ＨＯＰＸ、ＩＦＦＯ１、及びＺＮＦ７８１のマーカーを使用した６マーカーロジスティックフィットを使用すると、ＲＯＣ曲線分析は、０．８５８８１の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。マーカーを組み合わせて使用すると、単一のマーカーと比較して感度が改善した。
実施例７
肺癌検出感度を改善する、ｍＲＮＡ及びメチル化マーカーの組み合わせ
ＦＰＲ１ ｍＲＮＡ（ホルミルペプチド受容体１）の発現レベルは、血液中で検出可能な肺癌マーカーであることが以前に示されている（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， （２０１８） １４２：２３５５－２３６２）。いくつかの実施形態において、上述のメチル化マーカーアッセイは、１つまたは複数の発現マーカーの測定と組み合わせて使用される。例示的な複合アッセイは、１つのサンプルまたは同じ対象由来の複数のサンプルにおける、ＦＰＲ１ ｍＲＮＡレベルの測定及びメチル化マーカーＤＮＡ（複数可）の検出（例えば、実施例１～６に記載の通り）を含む。
ＦＰＲ１配列（ＮＭ＿００１１９３３０６．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）、転写物バリアント１のｍＲＮＡは、配列番号４３７に示されている。前掲のＭｏｒｒｉｓらによって説明されているように、血液サンプルを、後のＲＮＡ検出に好適な採血チューブ（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｔｕｂｅ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に採取する。サンプルは直ちにアッセイしても、将来の分析まで凍結してもよい。ＲＮＡは、標準的な方法、例えば、Ｑｉａｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ ｂｌｏｏｄ ＲＮＡキットにより、サンプルから抽出される。ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡマーカーのレベルは、サンプル中に存在する特定のＲＮＡの測定に好適なアッセイ、例えば、ＲＴ－ＰＣＲを使用して判定される。いくつかの実施形態において、逆転写ステップを含むＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイ反応が使用される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／５８７，８０６号を参照のこと。好ましい実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲまたはＲＴ－ＱｕＡＲＴＳアッセイのためのアッセイプローブ及び／またはプライマーは、アッセイが対応するゲノム遺伝子座を検出するのではなくｍＲＮＡ標的を特異的に検出するように、エクソンジャンクション（複数可）にまたがるように設計される。
例示的なＲＴ－ＱｕＡＲＴＳ反応物は、２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、２１９ｎｇのＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）２．０、１．５ＵのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー、各５００ｎＭのプローブ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ならびに２５０μＭの各ｄＮＴＰを含む。反応は、典型的に、リアルタイムで（例えば、連続的に、またはいくつかもしくは全てのサイクルで同じ時点で）蛍光データを収集するよう構成されたサーマルサイクラーでランする。例えば、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０システムが、次の条件下で使用され得る：４２℃で３０分間（ＲＴ反応）、９５℃で３分間、９５℃で２０秒間、６３℃で３０秒間、７０℃で３０秒間の１０サイクル、続いて９５℃で２０秒間、５３℃で１分間、７０℃で３０秒間の３５サイクル、及び４０℃で３０秒間保持。
いくつかの実施形態において、ＲＴ－ＱｕＡＲＴＳアッセイは、実施例１で上述したように、マルチプレックス前増幅、例えば、サンプル中の２、５、１０、１２、またはそれ以上の標的（すなわち１つの標的よりも多くの任意の数の標的）を前増幅させるステップを含み得る。好ましい実施形態において、ＲＴ－前増幅は、例えば、２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、１．５ＵのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、及びオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、１２種の標的に対して、等モル量（例えば、各プライマー２００ｎＭ）、または異なる標的の増幅効率のバランスを取るよう調整された個々のプライマー濃度の、１２種のプライマーペア／２４種のプライマー）を含む反応混合物中で行う。サーマルサイクリング時間及び温度は、反応物及び増幅容器の容量に適切となるよう選択する。例えば、反応物は、次のようなサイクルにかけられ得る：
Figure 2022546504000036
サーマルサイクリング後、前増幅反応物のアリコート（例えば、１０μＬ）を、魚ＤＮＡありまたはなしで、１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで５００μＬに希釈する。希釈した前増幅ＤＮＡのアリコート（例えば、１０μＬ）を、上述のようなＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップアッセイで使用する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的、例えば、メチル化ＤＮＡマーカー遺伝子、変異マーカー遺伝子、及び／またはＲＮＡマーカーに対応する遺伝子などが、例えば、上記の実施例１で説明したように、ＱｕＡＲＴＳアッセイ反応において逆転写されたｃＤＮＡと共に増幅及び検出され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ及びｃＤＮＡは、単一チューブ反応において、すなわち、試薬の混合と出力データの収集との間のいかなる時点でも反応容器を開ける必要なしに、同時増幅及び検出される。他の実施形態では、同じサンプル由来または異なるサンプル由来のマーカーＤＮＡは、バイサルファイト変換ステップありまたはなしで、別々に単離され得、ＲＴ－ＱｕＡＲＴＳアッセイにおいてサンプルＲＮＡと組み合わされ得る。さらに他の実施形態において、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡサンプルは、上述のように前増幅され得る。
Ｍｏｒｒｉｓでは、ハウスキーピング遺伝子（ＨＮＲＮＰＡ１）に対するＦＰＲ１ ｍＲＮＡ比のＲＯＣ曲線分析により、８９％の特異性で６８％の感度がもたらされ、メチル化マーカーＢＡＲＸ１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１を使用したＲＯＣ曲線分析では、９２．３％の特異性で７７．２％の感度がもたらされる。これらのアッセイを一緒に使用すると、８２％の特異性で９２．７％の理論感度がもたらされる。
この分析は、１つまたは複数のメチル化マーカーの検出と合わせた、ＦＰＲ１ ｍＲＮＡのレベルの複合アッセイにより、いずれかの方法単独と比較して改善された感度を有するアッセイがもたらされることを示す。異なるクラスのマーカーを組み合わせるがん検出アッセイは、初期ステージと後期ステージとの間の生物学的差異ならびにがんの異なる生物学的応答または原因を検出することができるという利点を有する。当業者には明らかであろうが、ＦＰＲ１以外に、またはＦＰＲ１に加えて、ＬｕｎＸ ｍＲＮＡ（Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２６：８９－９４）などのｍＲＮＡ標的を含む、他のＲＮＡ標的をメチル化マーカーと組み合わせて、感度を向上させることができる。
実施例８
肺癌検出感度を改善する、ｍＲＮＡマーカー及びＤＮＡマーカーの組み合わせのＲＴ－ＬＱＡＳアッセイ
ＲＮＡについては、ＲＮＡアッセイのためのＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、及びＤＮＡアッセイのためのＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＰＰＴ血漿調製チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採取し、製造元の説明に従ってサンプルを保存した。ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＩＤ：７６２６３５）を製造元の説明に従って使用し、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ計器でＲＮＡサンプルを抽出した。ＲＴ－ＬＱＡＳでの検査の前に、ＲＮＡサンプルを１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで１：５０に希釈した。ＤＮＡは実施例１に記載したように抽出した。サンプルは次の通りであった：
ＲＮＡ試験：
肺癌を有する対象由来の１５５サンプル
健康な正常対象由来の３１７サンプル
ＤＮＡ試験：
肺癌を有する対象由来の１０２サンプル
健康な正常対象由来の１４２サンプル
プライマー及びプローブは、下記の表３に示すように、８つのｍＲＮＡと３つの参照遺伝子の組み合わせを検出するように設計した。
Figure 2022546504000037
Figure 2022546504000038
上記に挙げた標的核酸のプライマー及びフラップオリゴヌクレオチドプローブを図６に示す。ＲＴ－ＬＱＡＳアッセイは、上記の実施例１で説明したように行った。分析では、次のように算出した％ＲＮＡレベルを使用した：
● ＲＴ－ＬＱＡＳ及びキャリブレータ用の合成ＲＮＡ標的を使用してｍＲＮＡレベルの鎖の値を算出する；
● ３つの参照遺伝子（ＣＡＳＣ３、ＳＫＰ１、ＳＴＫ４）の鎖レベルを平均する；
● 測定されたマーカーのｍＲＮＡ鎖を３つの参照遺伝子の鎖の平均で割る；
● ％ＲＮＡのＲＯＣ分析を行う
これらのＲＮＡマーカーを個別に使用し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用して分析したＬＱＡＳアッセイの性能、各ＲＮＡマーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。これを下記にまとめる：
Figure 2022546504000039
肺癌を有する対象由来の１０２サンプル及び健康な正常対象由来の１４２サンプルを使用し、ＲＮＡとメチル化ＤＮＡの両方の分析を行った。高性能のｍＲＮＡマーカーペアＰＡＤＩ４及びＳＥＬＬを使用すると、組み合わせたＲＮＡマーカーのロジスティックフィットは、曲線下面積が０．８５６２６であり、９０％の特異性で６３．７％の感度を示した。高性能のＤＮＡメチル化マーカーペアＨＯＸＡ９及びＩＦＦＯ１を使用すると、組み合わせたＤＮＡメチル化アッセイのロジスティックフィットは、曲線下面積が０．０９１６７７であり、９０％の特異性で７８．４％の感度を示した。これらのｍＲＮＡマーカー及びＤＮＡメチル化マーカーの結果の組み合わせは、０．９５０７０の曲線下面積をもたらし、９０％の特異性で９０．２％の感度を示した。
実施例９
肺癌検出感度を改善する、タンパク質（例えば、自己抗体）及びメチル化マーカーの組み合わせ
肺腫瘍及び他の固形腫瘍における腫瘍関連抗原は、自己抗体の形態で液性免疫応答を誘発する場合があり、これらの抗体は、疾患過程の非常に早い段階、例えば、症状の発現前に存在することが観察されている（あらゆる目的で参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｍａｎ ＣＪ， Ｍｕｒｒａｙ Ａ， ＭｃＥｌｖｅｅｎ ＪＥ， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｏｒａｘ ２００８；６３：２２８－２３３を参照のこと）。しかしながら、肺癌を検出するための自己抗体の検出感度は比較的低い。例えば、腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１（受入番号Ｐ７８３５８、配列番号４４２として示される配列；ＣＴＡＧ１Ｂとしても知られている）に対する自己抗体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ；Ｃｈａｐｍａｎ、前掲）の良好なマーカーであることが文献で示されているが、単独で有用であるほど十分な感度はない。１つまたは複数の腫瘍関連自己抗体の検出を、１つまたは複数のメチル化マーカーの検出と組み合わせると、より感度の高いアッセイがもたらされる。
血液サンプルを採取し、前掲のＣｈａｐｍａｎによって説明されているように、標準的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ検出を使用して、自己抗体を検出する。サンプルから単離されたＤＮＡ中のメチル化及び／または変異マーカーの検出は、上記の実施例１で説明したように行う。
ＮＹ－ＥＳＯ－１自己抗体のみの検出は、９５％の特異性で４０％の感度をもたらす（Ｔｕｒｅｃｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３６（１）：６４ （２００６）。上述のように、ＢＡＲＸ１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１マーカーの組み合わせのメチル化をアッセイすると、９２．３％の特異性で７７．２％の感度がもたらされる。この自己抗体マーカーの分析を、メチル化マーカーのこの組み合わせのアッセイと組み合わせると、８７．７％の特異性で、８６．３％の複合理論感度がもたらされる。
この分析は、自己抗体のレベルと１つまたは複数のメチル化マーカーの分析との複合アッセイにより、いずれかの方法単独と比較して改善された感度を有するアッセイが得られることを示す。異なるクラスのマーカーを組み合わせるがん検出アッセイは、初期ステージと後期ステージとの間の生物学的差異ならびにがんの異なる生物学的応答または原因を検出することができるという利点を有する。
実施例１０
肺癌検出感度を改善する、ｍＲＮＡ、メチル化マーカー（複数可）、及びタンパク質（例えば、自己抗体）の組み合わせ
対象における肺癌及び他のがんの検出を向上させるために、対象由来の１つサンプルまたは複数のサンプル中の、１つまたは複数のＲＮＡ、マーカーＤＮＡ、及び自己抗体の組み合わせの分析を行うことができる。サンプル調製ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質検出の方法は、上述の通りである。
実施例７で記述したように、Ｍｏｒｒｉｓらによって報告されているハウスキーピング遺伝子（ＨＮＲＮＰＡ１）に対するＦＰＲ１ ｍＲＮＡ比の分析では、８９％の特異性で６８％の感度がもたらされ（Ｍｏｒｒｉｓ、前掲）、Ｃｈａｐｍａｎにより報告されているＮＹ－ＥＳＯ－１自己抗体のみの検出では、９５％の特異性で４０％の感度がもたらされ、ＢＡＲＸ１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１マーカーの組み合わせのメチル化をアッセイすると、９２．３％の特異性で７７．２％の感度がもたらされた。ｍＲＮＡ、自己抗体マーカーの分析、及びメチル化マーカーのこの組み合わせのアッセイを組み合わせると、７７．９％の特異性で９５．６％の複合理論感度がもたらされ、このことは、ｍＲＮＡのレベル及び自己抗体のレベルと１つまたは複数のメチル化マーカーの分析との複合アッセイにより、これらの方法のいずれか１つ単独と比較して改善した感度を有するアッセイがもたらされることを示している。
上述のようなアッセイは、１つまたは複数の抗原を検出するアッセイの追加によってさらに向上し得る。当業者であれば、抗原の検出を、ＲＮＡ（複数可）、メチル化マーカー遺伝子（複数可）、及び／または自己抗体（複数可）のいずれかの検出に、個々にまたは任意の組み合わせで追加してもよく、これにより全体的感度がさらに向上することを理解するであろう。
実施例１１
異なるステージのがんを有する対象由来のサンプルにおけるＲＮＡ発現
ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及びステージＩＶの非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）を有することが分かっている患者から血液サンプルを採取した。比較のために、非喫煙者とタバコ喫煙者の両方で、既知の肺癌がないヒト（「無がん」と推定される個体）からも血液サンプルを採取した。既知の肺癌がないヒトでも、実際には別の未検出のがんを有し得る可能性がいくらかあった。これらの患者の存在は、この検査の偽陽性率の過大評価につながる（「健康な個体」からの「偽陽性」は、実際には、これらの個体におけるがんの存在を表し得るため）。血液サンプルをＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｔｕｂｅに採取し、サンプルの劣化を最小限に抑えるよう、室温または氷上で検査施設に搬送した。サンプルが検査施設で受領された後、各血液サンプルから白血球ＲＮＡがＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔで抽出された。
ＲＮＡが抽出された後、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔプロトコールを使用して、各血液サンプルのＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製した。次に、各血液サンプルのｃＤＮＡライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０ Ｓｙｓｔｅｍでシーケンシングして、全トランスクリプトームをプロファイリングし、各遺伝子のＲＮＡ発現レベルを得た。以下の結果が得られた。
図７～１０を参照すると、白血球ＲＮＡの全トランスクリプトーム分析から、健康な個体と肺癌患者との間で有意な遺伝子発現の変化を示した標的遺伝子が同定された。遺伝子発現の変化は、おそらく、患者の腫瘍に対する免疫細胞の免疫応答を反映するものであった。これらの結果は、少なくとも本開示の標的遺伝子のＲＮＡ発現レベルを測定することで、ヒトにおける肺癌の存在を予測できることを示した。
図７のパネルＣに示されるように、各データ点は、個体の血液サンプルにおける標的遺伝子ＦＰＲ１（ｙ軸）のＲＮＡ発現レベルを表すものであった。ｘ軸は、健康な非喫煙者、健康なタバコ喫煙者、及びステージＩ～ＩＶのＮＳＣＬＣ患者に個体を群分けしたものである。健康な個体と比較して、ステージＩ～ＩＩＩのＮＳＣＬＣは、ＦＰＲ１遺伝子発現レベルの有意な増加を伴った。さらに、ＦＰＲ１遺伝子発現は、正常なタバコ喫煙者ではわずかに増加していた。
図７のパネルＡ及びＢには、訓練セットとして割り当てられたデータの部分と、検証セットとして割り当てられたデータの部分との受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示した。選択された各ＲＮＡ発現閾値レベル（パネルＣのｙ値の切片）において、真陽性率及び偽陽性率を算出した。特定の状態を有するものとして正しく同定されたＮＳＣＬＣ患者のパーセンテージが真陽性率（感度）を定義し、ＮＳＣＬＣを有しないものとして正しく同定された健康なヒトのパーセンテージが特異性を定義した。偽陽性率は（１－特異性）として定義された。ランダムな推測では、ＲＯＣ曲線は対角線になり、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．５になる。検証セットのＡＵＣは０．８２であり、これにより、ＦＰＲ１遺伝子発現がＮＳＣＬＣリスクを予測することが実証された。
同様に、図８のパネルＣにおいて、各データ点は、個体の白血球サンプルにおける標的遺伝子Ｓ１００Ａ１２（ｙ軸）のＲＮＡ発現レベルを表すものであった。ｘ軸は、健康な非喫煙者、健康なタバコ喫煙者、及びステージＩ～ＩＶのＮＳＣＬＣ患者に個体を群分けしたものである。健康な個体と比較して、ステージＩ～ＩＩＩのＮＳＣＬＣは、Ｓ１００Ａ１２遺伝子発現レベルの有意な増加を伴った。図８のパネルＡ及びＢには、訓練セットとして割り当てられたデータの部分と、検証セットとして割り当てられたデータの部分とのＲＯＣ曲線を示した。検証セットのＡＵＣは０．９３であり、これにより、Ｓ１００Ａ１２遺伝子発現がＮＳＣＬＣリスクを予測し、ＦＰＲ１を標的遺伝子として使用するよりも著しく良好であったことが実証された。
図９のパネルＣにおいて、各データ点は、個体の白血球サンプルにおける標的遺伝子ＭＭＰ９（ｙ軸）のＲＮＡ発現レベルを表すものであった。ｘ軸は、健康な非喫煙者、健康なタバコ喫煙者、及びステージＩ～ＩＶのＮＳＣＬＣ患者に個体を群分けしたものである。健康な個体と比較して、ステージＩ～ＩＩＩのＮＳＣＬＣは、ＭＭＰ９遺伝子発現レベルの有意な増加を伴った。さらに、ＭＭＰ９遺伝子発現は、タバコ喫煙者ではわずかに増加していた。図９のパネルＡ及びＢには、訓練セットとして割り当てられたデータの部分と、検証セットとして割り当てられたデータの部分とのＲＯＣ曲線を示した。検証セットのＡＵＣは０．９３であり、これにより、ＭＭＰ９遺伝子発現がＮＳＣＬＣリスクを予測し、また、ＦＰＲ１を標的遺伝子として使用するよりも著しく良好であったことが実証された。
図１０のパネルＣにおいて、各データ点は、個体の白血球サンプルにおける標的遺伝子ＳＡＴ１（ｙ軸）のＲＮＡ発現レベルを表すものであった。ｘ軸は、健康な非喫煙者、健康なタバコ喫煙者、及びステージＩ～ＩＶのＮＳＣＬＣ患者に個体を群分けしたものである。健康な個体と比較して、ステージＩ～ＩＩＩのＮＳＣＬＣは、ＳＡＴ１遺伝子発現レベルの有意な増加を伴った。図１０のパネルＡ及びＢには、訓練セットとして割り当てられたデータの部分と、検証セットとして割り当てられたデータの部分とのＲＯＣ曲線を示した。検証セットのＡＵＣは０．７９であり、これにより、ＳＡＴ１遺伝子発現がＮＳＣＬＣリスクを予測したことが実証された。
これらの実験結果は、本開示の標的遺伝子のＲＮＡ発現レベルを検出することで、ヒトにおける肺癌の存在を予測できたことを示した。
実施例１２
ＲＮＡ発現レベルと参照遺伝子からの発現との比較
図１１～１３は、標的遺伝子のＲＮＡ発現レベルを参照遺伝子と比較することで、ヒトにおける肺癌の存在のより良好な予測が可能になり得ることを示す。
図１１のパネルＡに示すように、各データ点は、１）健康である、２）良性肺腫瘍を有する、または３）肺癌と診断された個体から採取された白血球サンプルを表す。ｘ軸（ＦＰＲ１ ＦＰＫＭ）は、裸のＦＰＲ１発現レベルの断片の１００万当たりのキロベース当たりの正規化を表す。ｙ軸（ＦＰＲ１比）は、ＦＰＲ１発現レベルの参照遺伝子ＳＴＫ４発現レベルに対する比を表す。図１１のパネルＢに示すように、ＦＰＲ１比についてＲＯＣ分析を行ったところ、ＡＵＣは０．８９であることが分かり、これは、ＦＰＲ１発現のみを使用した場合の予測力を改善した（図７）。
図１２のパネルＡに示すように、各データ点は、１）健康である、２）良性肺腫瘍を有する、または３）肺癌と診断された個体由来の白血球サンプルを表す。ｘ軸（１ ＦＰＫＭ）は、裸のＳ１００Ａ１２発現レベルの断片の１００万当たりのキロベース当たりの正規化を表す。ｙ軸（Ｓ１００Ａ１２比）は、Ｓ１００Ａ１２発現レベルの参照遺伝子ＳＴＫ４発現レベルに対する比を表すものであった。図１２のパネルＢに示すように、Ｓ１００Ａ１２比についてＲＯＣ分析を行ったところ、ＡＵＣは０．９４であり、これは、Ｓ１００Ａ１２発現のみを使用した場合の予測力を改善した（図８）。
図１３のパネルＡに示すように、各データ点は、健康である、良性肺腫瘍を有する、または肺癌を有する個体由来の白血球サンプルを表す。ｘ軸（ＭＭＰ９ ＦＰＫＭ）は、裸のＭＭＰ９発現レベルの断片の１００万当たりのキロベース当たりの正規化を表す。ｙ軸（ＭＭＰ９比）は、ＭＭＰ９発現レベルの参照遺伝子ＳＴＫ４発現レベルに対する比を表すものであった。図１３のパネルＢに示すように、ＭＭＰ９比についてＲＯＣ分析を行ったところ、ＡＵＣは０．９４であり、これは、ＭＭＰ９発現のみを使用した場合の予測力を改善した（図９）。
これらの実験結果は、本開示の参照遺伝子と標的遺伝子のＲＮＡ発現レベルを比較することで、ヒトにおける肺癌の存在の予測が向上したことを示した。
実施例１３
マーカー遺伝子の組み合わせからのＲＮＡ発現レベル
図１４～１６は、２つの標的遺伝子のＲＮＡ発現レベルを一緒に使用することで、ヒトにおける肺癌の存在を予測できたことを示す。
図１４では、実施例１２からの２つの最も予測的な標的遺伝子、例えば、Ｓ１００Ａ１２及びＭＭＰ９のデータを使用して、二項分類器（破線で表される）を学習した。Ｓ１００Ａ１２はＹ軸上にあり、ＭＭＰ９はＸ軸上にある。示されているデータは、ＦＰＫＭ正規化されている。各データ点は、１）健康な非喫煙者、２）健康なタバコ喫煙者、３）ステージＩのＮＳＣＬＣを有する、４）ステージＩＩのＮＳＣＬＣを有する、５）ステージＩＩＩのＮＳＣＬＣを有する、または６）ステージＩＶのＮＳＣＬＣを有する個体由来の血液サンプルを表す。分類器は、ステージＩのＮＳＣＬＣに対して０．８７の感度、ステージＩ～ＩＩＩのＮＳＣＬＣに対して０．８８の感度、及び０．９の特異性を有していた。これは、Ｓ１００Ａ１２及びＭＭＰ９の遺伝子発現データを組み合わせることで、肺癌リスクの良好な予測力がもたらされたことを実証する。
代替的に、図１５は、Ｓ１００Ａ１２及びＳＡＴ１の遺伝子発現データを使用し、図１６は、Ｓ１００Ａ１２及びＴＹＭＰの遺伝子発現データを使用した。各データ点は、１）健康である、２）良性肺腫瘍を有する、または３）肺癌と診断された個体由来の血液サンプルを表す。図１５は、群間の距離を最大化するよう選択された遺伝子を示す。これにより、データに対する検出エラー及び分析前の変数の影響が最小限に抑えられる。図１６は、Ｓ１００Ａ１２に直交するマーカーを見出そうと試みるものである。ＴＹＭＰは、良性結節をがんと区別するのに非常に良好であり、つまり、ＣＴスキャンにおいて発見される結節の良好な反射検査の一部として使用され得ることが見出された。
特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本出願において引用される全ての文献及び同様の資料は、参照により全体としてあらゆる目的のために明示的に組み込まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本明細書に記載される様々な実施形態が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。組み込まれた参考文献における用語の定義が、本発明の教示において提供される定義と異なると考えられる場合、本発明の教示において提供される定義が優先するものとする。
本発明の特定の実施形態を説明してきたが、これらの実施形態は、単なる例として提示したものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。実際、本明細書に記載される新規の方法及びシステムは、他の多様な形態で具体化することができる。さらに、記載された組成物、方法、システム、及び本技術の使用の様々な改変、省略、置換、及び変形は、記載された技術の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかになるであろう。本技術を特定の例示的な実施形態との関連で説明してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されてはならないことを理解されたい。実際、薬理学、生化学、医学、または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための態様の記述に対する様々な改変は、以下の特許請求の範囲に含まれるよう意図される。添付のクレーム及びそれらの均等物は、本開示の範囲及び精神に入るような形態または改変をカバーすることを意図している。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ定義される。
本開示の範囲は、本明細書中の本セクションまたは他の箇所における好ましい実施形態の特定の開示によって限定されることを意図せず、本明細書中の本セクションもしくは他の箇所において提示される、または将来提示されるクレームによって定義され得る。特許請求の範囲中の文言は、特許請求の範囲で用いられる文言に基づいて広く解釈されるべきであり、本明細書または本出願の出願手続き中に説明される例に限定されない。これらの例は、非排他的であると解釈されるべきである。
特定の態様、実施形態、または例に関連して説明された特徴、材料、特性、または群は、適合性がない場合を除き、本明細書中の本セクションまたは他の箇所に記載された任意の他の態様、実施形態、または例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（あらゆる添付のクレーム、要約及び図面を含む）で開示された特徴の全て、及び／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、かかる特徴及び／またはステップの少なくともいくつかが相互排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。保護対象は、いずれかの前述の実施形態の詳細に制限されない。保護対象は、本明細書（あらゆる添付のクレーム、要約及び図面を含む）において開示された特徴のうちのあらゆる新規の１つもしくはあらゆる新規の組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスのステップのうちのあらゆる新規の１つもしくはあらゆる新規の組み合わせに及ぶ。
さらに、別個の実施態様の文脈で本開示に記載される特定の特徴は、単一の実施態様で組み合わせて実現してもよい。逆に、単一の実施態様の文脈で記載される様々な特徴を、複数の実施態様で別々に、または任意の好適な部分的組み合わせで実現することもできる。さらに、複数の特徴は特定の組み合わせにおいて作用すると上述されている場合があるが、特許請求される組み合わせにおける１つまたは複数の特徴は、場合によっては、その組み合わせから切り離してもよく、この組み合わせは、部分的組み合わせまたは部分的組み合わせの変形として特許請求され得る。
さらに、工程が特定の順序で図面に示されるまたは明細書に記載される場合があるが、望ましい結果を達成するために、このような工程が、示された特定の順序または連続した順序で行われる必要もなければ、全ての工程が行われる必要もない。図示または説明されていない他の工程を、例示的な方法及びプロセスに組み込んでもよい。例えば、１つまたは複数の追加の工程を、記載された任意の工程の前に、後に、それと同時に、またはそれらの間に行ってもよい。さらに、他の実施態様では、工程を再整理したり並べ替えたりしてもよい。当業者には、いくつかの実施形態において、例示及び／または開示されるプロセスで行われる実際のステップが、図に示されたものと異なり得ることが理解されよう。実施形態に応じて、上述の特定のステップを削除することができ、他のステップを追加することができる。さらに、上記で開示された特定の実施形態の特徴及び属性を、異なるかたちで組み合わせて、追加の実施形態を形成してもよく、それらは全て、本開示の範囲内に入る。また、上述の実施態様における様々なシステム構成要素の分離は、全ての実施態様においてそのような分離を必要とするものとして理解されるべきではなく、記載された構成要素及びシステムが、概して、単一の製品に一緒に統合され得ること、または複数の製品にパッケージ化され得ることが理解されるべきである。例えば、エネルギー貯蔵システムを形成するために、本明細書に記載されるエネルギー貯蔵システムの構成要素のいずれかを、別々に提供することも、または一緒に統合する（例えば、一緒にパッケージ化する、または一緒に取り付ける）こともできる。
本開示の目的のために、特定の態様、利点、及び新規の特徴が本明細書に記載されている。必ずしも、そのような利点の全てが、いずれかの特定の実施形態に従って達成され得るとは限らない。よって、例えば、本明細書で教示または示唆され得る他の利点を必ずしも達成するとは限らないが、本明細書で教示される１つの利点または一群の利点を達成する様式で、本開示が具体化または実施され得ることが、当業者には認識されるであろう。

Claims (64)

  1. 対象からサンプリングされた血液中の１つまたは複数の遺伝子発現産物の量を測定する方法であって、
    ａ）対象からサンプリングされた血液から、
    ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現の産物である、少なくとも１つの遺伝子発現マーカー、ならびに
    ｉｉ）少なくとも１つの参照マーカー
    を抽出することと、
    ｂ）ａ）で抽出された前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量及び少なくとも１つの参照マーカーの量を測定することと、
    ｃ）前記少なくとも１つの参照マーカーの前記量に対するパーセンテージとしての、前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの前記量の値を算出することであって、前記値は、前記対象からサンプリングされた前記血液中の前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を示す前記算出することと
    を含む前記方法。
  2. 前記抽出することは、全血、白血球を含む血液製剤、及び血漿を含む血液製剤から選択されるサンプルからマーカーを抽出することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、タンパク質またはＲＮＡを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記対象からサンプリングされた前記血液から抽出されるＲＮＡは、循環セルフリーＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記対象からサンプリングされた前記血液から抽出されるＲＮＡは、免疫細胞によって発現されたＲＮＡを含む、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記対象からサンプリングされた前記血液から抽出されるＲＮＡは、ｍＲＮＡを含む、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、２、３、４、５、６、７、８、または９つの遺伝子発現マーカーからなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの参照マーカーは、ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの参照マーカーはＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つの参照マーカーは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及びＵ６ ｓｎＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を測定することは、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、質量ベースの分離、及び標的捕捉、定量的パイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）検出、ならびにタンパク質免疫沈降のうちの１つまたは複数を使用することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記測定は、マルチプレックス増幅を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法であって、
    ｄ）前記対象からサンプリングされた血液から、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡ及び少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡを抽出することと、
    ｅ）少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することであって、前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む前記測定することと、
    ｆ）少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡの量を測定することと、
    ｇ）前記参照マーカーＤＮＡの前記量に対するパーセンテージとしての、前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの前記量の値を算出することであって、前記値は、対象からサンプリングされた前記血液中の前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す前記算出することと
    をさらに含む前記方法。
  14. 前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のメチル化マーカーＤＮＡからなる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記対象からサンプリングされた前記血液から抽出されるＤＮＡは、循環セルフリーＤＮＡを含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの参照マーカーＤＮＡは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＢＡＲＸ１、ＦＬＪ４５９８３、ＨＯＰＸ、ＺＮＦ７８１、ＦＡＭ５９Ｂ、ＨＯＸＡ９、ＳＯＢＰ、及びＩＦＦＯ１のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、ＦＰＲ１、ＰＡＤＩ４、及びＳＥＬＬから選択されるマーカー遺伝子の発現の産物を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記メチル化マーカーＤＮＡは、ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式で前記ＤＮＡを選択的に修飾する試薬で処理される、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記バイサルファイト試薬は、重亜硫酸アンモニウムを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することは、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉のうちの１つまたは複数を使用することを含む、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記測定は、マルチプレックス増幅を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及びバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つまたは複数の方法を使用することを含む、請求項１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 対象からサンプリングされた血液の特性決定を行う方法であって、
    ｉ）対象からサンプリングされた血液を処理して抽出ＤＮＡ及び抽出ＲＮＡを生成することと、
    ｉｉ）前記抽出ＲＮＡ中の２つ以上のマーカーＲＮＡの量を測定することであって、前記マーカーＲＮＡは、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１ ＲＮＡから選択される前記測定することと、
    ｉｉｉ）前記抽出ＲＮＡ中の少なくとも１つの参照ＲＮＡの量を測定することであって、前記参照ＲＮＡは、ＣＡＳＣ３Ａ、ＳＫＰ１、及びＳＴＫ４から選択される前記測定することと、
    ｉｖ）前記少なくとも１つの参照ＲＮＡの前記量に対するパーセンテージとしての、前記２つ以上のマーカーＲＮＡの各々の前記量の値を算出することであって、各マーカーＲＮＡの前記値は、前記対象からサンプリングされた前記血液中の前記マーカーＲＮＡの前記量を示す前記算出することと、
    ｖ）前記抽出ＤＮＡをバイサルファイト試薬で処理して、バイサルファイト処理済みＤＮＡを生成することと、
    ｖｉ）前記バイサルファイト処理済みＤＮＡ中の２つ以上のメチル化マーカーＤＮＡの量を測定することであって、前記メチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９遺伝子から選択される前記測定することと、
    ｖｉｉ）前記バイサルファイト処理済みＤＮＡ中の少なくとも１つの参照ＤＮＡの量を測定することであって、前記少なくとも１つの参照ＤＮＡは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される前記測定することと、
    ｖｉｉｉ）前記バイサルファイト処理済みＤＮＡ中で測定された参照ＤＮＡの前記量に対するパーセンテージとしての、前記２つ以上のメチル化マーカーＤＮＡの各々の前記量の値を算出することであって、各メチル化マーカーＤＮＡの前記値は、前記対象からサンプリングされた前記血液中の前記メチル化マーカーＤＮＡの前記量を示す前記算出することと
    を含む前記方法。
  26. 単一の採血デバイスで採取された血液からＤＮＡ及びＲＮＡが単離される、請求項１３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記対象は、肺新生物を有するか、または有する疑いがある、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記対象からサンプリングされた前記血液中の前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量は、前記対象の肺癌リスクを示す、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記対象からサンプリングされた前記血液中の前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量は、前記対象の肺癌リスクを示す、請求項１３～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. ａ）対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの遺伝子発現マーカーの量を測定するための試薬セットであって、前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現から生成される前記試薬セット、
    ｂ）前記対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定するための試薬セット
    を備えるキット。
  31. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカー及び前記少なくとも１つの参照マーカーを血液から抽出するための試薬セットをさらに備える、請求項３０に記載のキット。
  32. 前記少なくとも１つの遺伝子発現マーカーは、ＲＮＡ及びタンパク質のうちの１つまたは複数を含み、前記少なくとも１つの参照マーカーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質のうちの１つまたは複数を含む、請求項３０または３１に記載のキット。
  33. 請求項３０～３２のいずれか１項に記載のキットであって、
    ｉ）少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択される遺伝子発現マーカーに関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖に特異的にハイブリダイズする前記少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド、
    ｉｉ）少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、参照マーカーに特異的にハイブリダイズし、前記参照マーカーは参照核酸である前記少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド
    を備える前記キット。
  34. 遺伝子発現マーカーに関連するヌクレオチド配列を含む前記核酸鎖は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または増幅ＤＮＡから選択される、請求項３３に記載のキット。
  35. 前記参照核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項３３または３４に記載のキット。
  36. 前記参照マーカーは、ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質を含む、請求項３０～３５のいずれか１項に記載のキット。
  37. 請求項３３～３６のいずれか１項に記載のキットであって、
    ｃ）前記対象からサンプリングされた血液中の少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定するための試薬セットであって、前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のうちの少なくとも１つに関連するヌクレオチド配列を含む前記試薬セット
    をさらに備える前記キット。
  38. 少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を測定するための前記試薬セットは、
    ｉｉｉ）少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９のメチル化メーカー遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含む核酸鎖に特異的にハイブリダイズする前記少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチド
    を含む、請求項３７に記載のキット。
  39. 請求項３８に記載のキットであって、少なくとも１つの第４のオリゴヌクレオチドをさらに備え、前記少なくとも１つの第４のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、参照マーカーＤＮＡ、好ましくは、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される参照マーカーＤＮＡに特異的にハイブリダイズする前記キット。
  40. メチル化メーカー遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含む前記核酸鎖及び前記参照マーカーＤＮＡのうちの少なくとも１つは、バイサルファイト処理済みＤＮＡを含む、請求項３８または３９に記載のキット。
  41. ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式で前記ＤＮＡを選択的に修飾する試薬をさらに備える、請求項３８～４０のいずれか１項に記載のキット。
  42. ＤＮＡのメチル化ステータスに特異的な様式で前記ＤＮＡを選択的に修飾する前記試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素を含む、請求項４１に記載のキット。
  43. 前記バイサルファイト試薬は、重亜硫酸アンモニウムを含む、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記少なくとも１つの第１、第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、捕捉オリゴヌクレオチド、核酸プライマーペア、核酸プローブ、及び侵襲性オリゴヌクレオチドから選択される、請求項３３～４３のいずれか１項に記載のキット。
  45. 前記捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合している、請求項４４に記載のキット。
  46. 前記固体支持体は磁気ビーズである、請求項４５に記載のキット。
  47. 請求項３３～４６のいずれか１項に記載のキットであって、
    ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択されるマーカー遺伝子の発現の遺伝子発現マーカー産物から第１の増幅ＤＮＡを生成するための第１のプライマーペアと、
    ｉｉ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第１のプローブと、
    ｉｉｉ）第２の増幅ＤＮＡを生成するための第２のプライマーペアと、
    ｉｖ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第２のプローブと、
    ｖ）逆転写酵素と、
    ｖｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
    を備える前記キット。
  48. 前記第２の増幅ＤＮＡは、メチル化マーカー遺伝子または参照マーカー核酸から生成される、請求項４７に記載のキット。
  49. 前記第１のプローブは、前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む、請求項４７または４８に記載のキット。
  50. 前記第２のプローブは、前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第２のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のキット。
  51. 請求項４９または５０に記載のキットであって、
    ｖｉｉ）前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット、
    ｖｉｉｉ）前記第２のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット
    のうちの１つまたは複数をさらに備える前記キット。
  52. フラップエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼをさらに備える、請求項４９～５１のいずれか１項に記載のキット。
  53. ｉ）Ｓ１００Ａ９、ＳＥＬＬ、ＰＡＤＩ４、ＡＰＯＢＥ３ＣＡ、Ｓ１００Ａ１２、ＭＭＰ９、ＦＰＲ１、ＴＹＭＰ、及びＳＡＴ１から選択される遺伝子の発現の遺伝子発現マーカー産物から、第１の増幅ＤＮＡを生成するための第１のプライマーペアと、
    ｉｉ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第１のプローブと、
    ｉｉｉ）第２の増幅ＤＮＡを生成するための第２のプライマーペアと、
    ｉｖ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含む第２のプローブと、
    ｖ）逆転写酵素と、
    ｖｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
    を含む組成物。
  54. 対象からサンプリングされた血液から抽出された核酸をさらに含む、請求項５３に記載の組成物であって、前記対象は、好ましくは、肺新生物を有するか、または有する疑いがある前記組成物。
  55. 前記核酸は、
    － 細胞ＲＮＡ、
    － 循環セルフリーＲＮＡ、
    － 細胞ＤＮＡ、
    － 循環セルフリーＤＮＡ
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記第２のプライマーペアは、メチル化マーカー遺伝子または参照マーカー核酸から、第２の増幅ＤＮＡを生成する、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記第２のプライマーペアは、
    － ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂ、ＳＴＫ４、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＣＡＳＣ３、及びＳＫＰ１から選択される遺伝子から発現されたＲＮＡ、
    － Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及びＵ６ ｓｎＲＮＡから選択されるＲＮＡ、
    － Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択されるＤＮＡ
    から選択される参照核酸から、第２の増幅ＤＮＡを生成する、請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記第２のプライマーペアは、ＥＭＸ１、ＧＲＩＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ６７１、ＩＦＦＯ１、ＨＯＰＸ、ＢＡＲＸ１、ＨＯＸＡ９、ＬＯＣ１００１２９７２６、ＳＰＯＣＫ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４、ＲＡＳＳＦ１、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＮＫＸ６＿２、ＦＡＭ５９Ｂ、ＤＩＤＯ１、ＭＡＸ＿Ｃｈｒ１．１１０、ＡＧＲＮ、ＳＯＢＰ、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２６、ＺＭＩＺ１、ＭＡＸ＿ｃｈｒ８．１４５、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１０．２２５、ＰＲＤＭ１４、ＡＮＧＰＴ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１６．５０、ＰＴＧＤＲ＿９、ＤＯＣＫ２、ＭＡＸ＿ｃｈｒ１９．１６３、ＺＮＦ１３２、ＭＡＸ ｃｈｒ１９．３７２、ＴＲＨ、ＳＰ９、ＤＭＲＴＡ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＴＫ、ＢＣＡＴ１、ＰＲＫＣＢ＿２８、ＳＴ８ＳＩＡ＿２２、ＦＬＪ４５９８３、ＤＬＸ４、ＳＨＯＸ２、ＨＯＸＢ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．５２６、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＯＰＬＡＨ、ＰＡＲＰ１５、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＬＣ１２Ａ８、ＢＨＬＨＥ２３、ＣＡＰＮ２、ＦＧＦ１４、ＦＬＪ３４２０８、ＢＩＮ２＿Ｚ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＦＥＲＭＴ３、ＮＦＩＸ、Ｓ１ＰＲ４、ＳＫＩ、ＳＵＣＬＧ２、ＴＢＸ１５、及びＺＮＦ３２９から選択されるメチル化マーカー遺伝子から、第２の増幅ＤＮＡを生成する、請求項５６に記載の組成物。
  59. 前記第１のプローブ及び／または前記第２のプローブは、フルオロフォアを含む検出部分を含む、請求項５３～５８のいずれか１項に記載の組成物。
  60. 前記第１のプローブは、前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む、及び／または前記第２のプローブは、前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第２のフラップ配列を有するフラップ部分をさらに含む、請求項５３～５８のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 請求項６０に記載の組成物であって、
    ｖｉｉ）前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット、
    ｖｉｉｉ）前記第２のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセット
    のうちの１つまたは複数をさらに含む前記組成物。
  62. フラップエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５３～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. ６～１０ｍＭのＭｇ＋＋を含むバッファーをさらに含む、請求項５３～６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 請求項５３～６３のいずれか１項に記載の組成物を含む反応混合物。
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