JP2022526415A - 血漿中の膵管腺癌の検出 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されるのは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）スクリーニングのための技術であり、限定するものではないが、特に、ＰＤＡＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途である。
Description
本明細書で提供されるのは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）スクリーニングのための技術であり、限定するものではないが、特に、ＰＤＡＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途である。
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、最も悪性度の高い固形悪性腫瘍の１つである。発生率は非常に低いにもかかわらず、主に絶望的な診断のために、依然として、膵管腺癌は現代世界におけるがん関連死の４番目の主要な原因である（Ｇａｒｒｉｄｏ－Ｌａｇｕｎａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１５；１２：３１９－３３４を参照されたい）。過去数十年で、様々な固形がんのスクリーニング及び療法の大幅な改善が実現され、患者の治癒の可能性が著しく増大した。それでもなお、膵癌研究の進歩にもかかわらず、発生率に対する死亡率の比は、過去数十年にわたり大幅に変更されていない。５年生存率は依然としてわずか５～７％程度であり、１年生存は症例の２０％未満で達成される（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１１；３７８：６０７－６２０を参照されたい）。この厳しい予後は主に、早期診断のための可視的かつ特徴的な症状及び信頼性の高いバイオマーカーの欠如、ならびに治療への応答不良につながる悪性度の高い転移拡散に起因する（Ｍａｉｔｒａ Ａ．，Ｈｒｕｂａｎ Ｒ．Ｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．２００８；３：１５７－１８８を参照されたい）。
ＰＤＡＣ及びＰＤＡＣの様々なサブタイプを検出するための改善された方法が必要とされている。
本発明は、これらの要求に対応する。
メチル化ＤＮＡは、大部分の腫瘍タイプの組織におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。多くの場合、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、遺伝子発現のエピジェネティック制御として、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位でＤＮＡにメチル基を付加する。生物学的に興味深い機序において、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的なメチル化事象は、発現をサイレンシングし、それにより発がんの一因となると考えられている。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現よりも、より化学的及び生物学的に安定した診断ツールである可能性がある（Ｌａｉｒｄ（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１：１９１－２０３）。さらに、散発性結腸癌などの他のがんでは、メチル化マーカーは、優れた特異性を提供し、個別のＤＮＡ突然変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高い（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １６：２６８６－９６）。
ＣｐＧアイランドの分析により、動物モデル及びヒト細胞株に適用される場合の重要な知見がもたらされた。例えば、Ｚｈａｎｇ及び同僚らは、同じＣｐＧアイランドの異なる部分からのアンプリコンが、異なるレベルのメチル化を有する可能性があることを見出した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ５：ｅ１０００４３８）。さらに、メチル化レベルは、高度にメチル化された配列と非メチル化配列との間で二峰性に分布し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性のバイナリースイッチ様パターンをさらに裏付けた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ５：ｅ１０００４３８）。ｉｎ ｖｉｖｏのマウス組織及びｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞株の分析により、高ＣｐＧ密度のプロモーター（ＨＣＰ、３００塩基対領域内で７％超のＣｐＧ配列を有すると定義される）の約０．３％のみがメチル化されたのに対して、低ＣｐＧ密度の領域（ＬＣＰ、３００塩基対領域内で５％未満のＣｐＧ配列を有すると定義される）は、動的組織特異的パターンにおいて高頻度でメチル化される傾向があることが実証された（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５４：７６６－７０）。ＨＣＰには、遍在性ハウスキーピング遺伝子及び高度に調節された発生遺伝子のためのプロモーターが含まれる。５０％超でメチル化されたＨＣＰ部位の中に、Ｗｎｔ２、ＮＤＲＧ２、ＳＦＲＰ２、及びＢＭＰ３などのいくつかの確立されたマーカーが存在した（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５４：７６６－７０）。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるシトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位でのＤＮＡのエピジェネティックメチル化は、大部分の腫瘍タイプの組織におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。生物学的に興味深い機序において、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的なメチル化事象は、発現をサイレンシングし、発がんの一因となると考えられている。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現よりも、より化学的及び生物学的に安定した診断ツールである可能性がある。さらに、散発性結腸癌などの他のがんでは、異常メチル化マーカーは、個別のＤＮＡ突然変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高く、優れた特異性を提供する。
新規メチル化マーカーを探索するためのいくつかの方法が利用可能である。ＣｐＧメチル化のマイクロアレイベースの照合は、合理的で高スループットなアプローチであるが、この方策は、既知の目的の領域、主に確立された腫瘍抑制プロモーターに偏っている。ＤＮＡメチル化のゲノムワイド解析の代替方法が、この１０年間に開発されてきた。３つの基本的なアプローチが存在する。１つ目は、特定のメチル化部位を認識する制限酵素によるＤＮＡの消化を用い、続いて定量化ステップ（メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）など）においてＤＮＡを増幅するために使用される酵素認識部位またはプライマーに限定されたメチル化データを提供する、いくつかの可能な分析技術を用いる。第２のアプローチは、メチル－シトシンまたは他のメチル化特異的結合ドメインを対象とする抗体を使用してゲノムＤＮＡのメチル化画分を濃縮し、続いてマイクロアレイ分析またはシーケンシングを行って、断片を参照ゲノムにマッピングする。このアプローチは、断片内の全てのメチル化部位の単一ヌクレオチド分解能を提供しない。第３のアプローチは、全ての非メチル化チロシンをウラシルに変換するためのＤＮＡのバイサルファイト処理から始まり、続いて制限酵素消化を行い、アダプターリガンドへの結合後に全ての断片の完全シーケンシングを行う。制限酵素の選択により、ＣｐＧ高密度領域の断片を濃縮することができ、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列の数が低減される。
ＲＲＢＳは、中程度～高いリードカバレッジで、全てのＣｐＧアイランドの８０～９０％及び大部分の腫瘍抑制プロモーターの、単一ヌクレオチド分解能でのＣｐＧメチル化状況データをもたらす。がん症例対照研究では、これらのリードの分析により、可変メチル化領域（ＤＭＲ）が同定される。膵癌標本のこれまでのＲＲＢＳ分析により、何百ものＤＭＲが明らかとなったが、その多くは発がんとは全く関連せず、その多くはアノテーションされなかった。独立した組織試料セットに対するさらなる検証試験により、性能の点で１００％の感度及び特異性であったマーカーＣｐＧが確認された。
本明細書で提供されるのは、ＰＤＡＣスクリーニングのための技術であり、限定するものではないが、特に、ＰＤＡＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途である。
実際、実施例Ｉに記載されるように、本発明に関する実施形態を同定する過程中に行われた実験により、組織試料及び血漿試料内でＰＤＡＣを非腫瘍性対照ＤＮＡと識別するための可変メチル化領域（ＤＭＲ）の新規セットが同定された。
そのような実験により、ａ）血漿試料内でＰＤＡＣと非腫瘍性対照とを区別する（表３、実施例Ｉを参照されたい）、及びｂ）ＰＤＡＣ組織と良性膵組織とを区別する（表４、実施例１を参照されたい）、１３個のＤＮＡメチル化マーカー（ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１）が列挙され記載されている。
そのような実験により、血液試料（例えば、血漿試料、全血試料、白血球試料、血清試料）中でＰＤＡＣを検出するための以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが同定された：
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３、実施例１を参照されたい）。
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３、実施例１を参照されたい）。
そのような実験により、ＰＤＡＣ組織と良性膵組織とを区別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが同定された：
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表４、実施例１を参照されたい）。
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表４、実施例１を参照されたい）。
本明細書に記載されるように、本技術は、ＰＤＡＣ全体を高度に識別する、多数のメチル化ＤＮＡマーカー及びそのサブセット（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または１３個のマーカーのセット）を提供する。実験は、選択フィルターを候補マーカーに適用し、ＰＤＡＣのスクリーニングまたは診断を目的とした高い特異性を提供するために、高いシグナル対ノイズ比及び低いバックグラウンドレベルをもたらすマーカーを同定した。
いくつかの実施形態では、本技術は、生体試料（例えば、膵組織試料、血液試料）中の本明細書で同定されるマーカーのうちの１つ以上の存在及びメチル化状態を評価することに関する。これらのマーカーは、本明細書において考察される、例えば、表１に示される通りの１箇所以上の可変メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。メチル化状態は、本技術の実施形態において評価される。したがって、本明細書で提供される技術は、遺伝子のメチル化状態が測定される方法において制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、メチル化状態は、ゲノムスキャニング法によって測定される。例えば、１つの方法は、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１－７４２７）を含み、別の例は、メチル化感受性任意プライムＰＣＲ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５９４－５９９）を含む。いくつかの実施形態では、特定のＣｐＧ部位でのメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化と、それに続く目的領域のサザン分析（消化－サザン法）によってモニタリングされる。いくつかの実施形態では、メチル化パターンの変化を分析することは、ＰＣＲ増幅前のメチル化感受性制限酵素またはメチル化依存性制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化を含む、ＰＣＲベースのプロセスを含む（Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７）。さらに、メチル化分析の出発点としてＤＮＡのバイサルファイト処理を利用する他の技術が報告されている。これらとしては、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６）ならびにバイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化（Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９、及びＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）が挙げられる。ＰＣＲ技術は、遺伝子突然変異の検出（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４３－１１４７）、ならびに対立遺伝子特異的発現の定量化（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０９７－３１０８、及びＳｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：１６０－１６３）のために開発されてきた。そのような技術は、ＰＣＲにより生成された鋳型にアニーリングしアッセイされる単一ヌクレオチドの５’で直ちに終結する、内部プライマーを使用する。米国特許第７，０３７，６５０号に記載されている「定量的Ｍｓ－ＳＮｕＰＥアッセイ」を使用する方法が、いくつかの実施形態で使用される。
メチル化状態を評価する際、メチル化状態は、多くの場合、特定の部位で（例えば、単一ヌクレオチドにおいて、特定の領域または遺伝子座において、比較的長い目的配列において、例えば、ＤＮＡの最大約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐの部分配列またはそれを上回って）、その特定の部位を含む試料中のＤＮＡの全集団と比較してメチル化される、個々のＤＮＡ鎖の割合またはパーセンテージとして表される。従来、非メチル化核酸の量は、較正物質を使用するＰＣＲによって判定される。次いで、既知のＤＮＡ量がバイサルファイト処理され、得られたメチル化特異的配列が、リアルタイムＰＣＲまたは他の指数関数的増幅、例えば、ＱｕＡＲＴＳアッセイ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３６１，７２０号、ならびに米国特許出願公開第２０１２／０１２２０８８号及び同第２０１２／０１２２１０６号により提供されるもの）のいずれかを使用して判定される。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、外部標準物質を使用することにより非メチル化標的の標準曲線を生成することを含む。標準曲線は、少なくとも２点から構成され、既知の定量標準物質に対する非メチル化ＤＮＡのリアルタイムＣｔ値に関する。次いで、メチル化標的の第２の標準曲線が、少なくとも２点及び外部標準物質から構成される。この第２の標準曲線は、既知の定量標準物質に対するメチル化ＤＮＡのＣｔに関する。次に、試験試料のＣｔ値が、メチル化集団及び非メチル化集団について判定され、ＤＮＡのゲノム当量が、最初の２つのステップによって生成された標準曲線から算出される。目的部位におけるメチル化のパーセンテージは、集団中のＤＮＡの総量に対するメチル化ＤＮＡ量、例えば、（メチル化ＤＮＡ数）／（メチル化ＤＮＡ数＋非メチル化ＤＮＡ数）×１００から算出される。
本明細書では、方法を実施するための組成物及びキットもまた提供される。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のマーカーに特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）が、単独で、またはセット（例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマー対のセット）で提供される。検出アッセイを行うためのさらなる試薬（例えば、ＱｕＡＲＴＳ、ＰＣＲ、シーケンシング、バイサルファイト、または他のアッセイを実施するための酵素、緩衝液、陽性及び陰性対照）もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）を含有する。いくつかの実施形態では、方法を実施するのに必要な、十分な、または有用な１つ以上の試薬を含有するキットが提供される。試薬を含有する反応混合物もまた提供される。さらに提供されるのは、互いに、及び／または試験試料に添加して反応混合物を完成させることができる複数の試薬を含有する、マスターミックス試薬セットである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載される方法によって提供される一連の算術演算または論理演算を実施するように設計されたプログラム可能な機械に関連する。例えば、本技術のいくつかの実施形態は、コンピュータソフトウェア及び／またはコンピュータハードウェアに関連する（例えば、これらに実装される）。一態様では、本技術は、メモリの形態、算術演算及び論理演算を実施するための要素、ならびにデータを読み取り、操作し、保存するための一連の命令（例えば、本明細書で提供される方法）を実行するための処理要素（例えば、マイクロプロセッサ）を含むコンピュータに関する。いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサは、全て本明細書に記載の通りの、（例えば、１箇所以上のＤＭＲ、例えば、表１に示される通りのＤＭＲ１～１３の）メチル化状態の判定；（例えば、１箇所以上のＤＭＲ、例えば、表１に示される通りのＤＭＲ１～１３の）メチル化状態の比較；標準曲線の生成；Ｃｔ値の判定；（例えば、１箇所以上のＤＭＲ、例えば、表１に示される通りのＤＭＲ１～１３の）メチル化の割合、頻度、またはパーセンテージの算出；ＣｐＧアイランドの同定；アッセイまたはマーカーの特異性及び／または感度の判定；ＲＯＣ曲線及び関連するＡＵＣの算出；配列分析；のためのシステムの一部であるか、あるいは当該技術分野において公知である。
いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサまたはコンピュータは、がんの部位を予測するためのアルゴリズムにおいて、メチル化状態のデータを使用する。
いくつかの実施形態では、ソフトウェアまたはハードウェアコンポーネントは、複数のアッセイの結果を受信し、複数のアッセイの結果に基づいてがんリスクを示す単一の値の結果を判定しユーザーに報告する（例えば複数のＤＭＲ（例えば、表１に示される通りのもの）のメチル化状態を判定する）。関連実施形態は、例えば、複数のマーカー（例えば、表１に示される通りの複数のＤＭＲなど）のメチル化状態を判定する、複数のアッセイからの結果の数学的組み合わせ（例えば、加重組み合わせ、線形組み合わせ）に基づいてリスク因子を算出する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲのメチル化状態は、次元を規定し、かつ多次元空間における値を有する可能性があり、複数のＤＭＲのメチル化状態によって規定される座標は、例えば、ユーザーに報告するための、例えばがんリスクに関連する結果である。
いくつかの実施形態は、記憶媒体及びメモリコンポーネントを含む。メモリコンポーネント（例えば、揮発性及び／または不揮発性メモリ）は、命令（例えば、本明細書で提供されるプロセスの実施形態）及び／またはデータ（例えば、メチル化測定値、配列、及びそれらと関連する統計的記述などのワークピース）の保存に使用される。いくつかの実施形態は、ＣＰＵ、グラフィックスカード、及びユーザーインターフェース（例えば、ディスプレイなどの出力デバイス及びキーボードなどの入力デバイスを含む）のうちの１つ以上をさらに含むシステムに関する。
本技術と関連するプログラム可能な機械は、従来の現存技術及び開発中またはまだ開発されていない技術（例えば、量子コンピュータ、化学コンピュータ、ＤＮＡコンピュータ、光コンピュータ、スピントロニクスに基づくコンピュータなど）を含む。
いくつかの実施形態では、本技術は、データを伝送するための有線（例えば、金属ケーブル、光ファイバー）または無線伝送媒体を含む。例えば、いくつかの実施形態は、ネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、アドホックネットワーク、インターネットなど）によるデータ伝送に関する。いくつかの実施形態では、プログラム可能な機械は、ピアなどのネットワーク上に存在し、いくつかの実施形態では、プログラム可能な機械は、クライアント／サーバ関係を有する。
いくつかの実施形態では、データは、ハードディスク、フラッシュメモリ、光学媒体、フロッピーディスクなどのコンピュータ可読記憶媒体に保存される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術は、共に動作して本明細書に記載の方法を実施する、複数のプログラム可能なデバイスに関連する。例えば、いくつかの実施形態では、複数のコンピュータ（例えば、ネットワークによって接続される）は、例えば、イーサネット、光ファイバーなどの従来のネットワークインターフェースによって、または無線ネットワーク技術によって、ネットワーク（プライベート、パブリック、またはインターネット）に接続される完全なコンピュータ（オンボードＣＰＵ、記憶装置、電源、ネットワークインターフェースなどを備える）に依存するクラスタコンピューティングまたはグリッドコンピューティングまたは何らかの他の分散コンピュータアーキテクチャの実装において、並行して動作し、データを収集して処理することができる。
例えば、いくつかの実施形態は、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータを提供する。実施形態は、プロセッサに連結されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。プロセッサは、メモリに保存されているコンピュータ実行可能プログラム命令を実行する。そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、ＡＳＩＣ、状態機械、または他のプロセッサを含み得、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＩｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＳｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩｌｌｉｎｏｉｓのＭｏｔｏｒｏｌａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのプロセッサなどの多数のコンピュータプロセッサのいずれかであり得る。そのようなプロセッサは、媒体、例えば、コンピュータ可読媒体を含むか、または媒体と通信することができ、この媒体は、プロセッサによって実行される場合、プロセッサに本明細書に記載のステップを実施させる命令を保存する。
コンピュータ可読媒体の実施形態としては、プロセッサにコンピュータ可読命令を与えることができる電子的、光学的、磁気的、または他の記憶デバイスまたは伝送デバイスが挙げられるが、これらに限定されない。好適な媒体の他の例としては、フロッピーディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、構成済みプロセッサ、全ての光学媒体、全ての磁気テープもしくは他の磁気媒体、またはコンピュータプロセッサが命令を読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられるが、これらに限定されない。また、コンピュータ可読媒体の様々な他の形態は、コンピュータに命令を伝送するか、または伝達することができ、有線及び無線の両方のルーター、プライベートもしくはパブリックネットワーク、または他の伝送デバイスもしくはチャネルを含む。命令は、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、及びＪａｖａＳｃｒｉｐｔを含む、任意の好適なコンピュータプログラミング言語からのコードを含み得る。
コンピュータは、いくつかの実施形態ではネットワークに接続されている。コンピュータはまた、いくつかの外部または内部デバイス、例えば、マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、または他の入力もしくは出力デバイスなども含み得る。コンピュータの例は、パーソナルコンピュータ、デジタルアシスタント、パーソナルデジタルアシスタント、携帯電話（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｎｅ）、携帯電話（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ）、スマートフォン、ポケットベル、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネットアプライアンス、及び他のプロセッサベースのデバイスである。概して、本明細書で提供される技術の態様に関連するコンピュータは、本明細書で提供される技術を含む１つ以上のプログラムをサポートすることができる任意のオペレーティングシステム、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ、ＵＮＩＸ、Ｍａｃ ＯＳ Ｘなどで動作する、任意のタイプのプロセッサベースのプラットフォームであってよい。いくつかの実施形態は、他のアプリケーションプログラム（例えば、アプリケーション）を実行するパーソナルコンピュータを含む。アプリケーションはメモリに格納することができ、これらとしては、例えば、ワードプロセッシングアプリケーション、スプレッドシートアプリケーション、電子メールアプリケーション、インスタントメッセンジャーアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザアプリケーション、カレンダー／オーガナイザーアプリケーション、及びクライアントデバイスによって実行可能な任意の他のアプリケーションを挙げることができる。
本技術に関連するものとして本明細書に記載されるそのような全てのコンポーネント、コンピュータ、及びシステムは、論理的または仮想的であり得る。
したがって、本明細書で提供されるのは、対象から得られた試料中のＰＤＡＣについてスクリーニングする方法に関する技術であり、本方法は、対象から得られた試料（例えば、膵組織）（例えば、血液試料）中のマーカーのメチル化状態をアッセイすること、ならびにマーカーのメチル化状態が、ＰＤＡＣを有しない対象においてアッセイされたマーカーのメチル化状態と異なる場合にＰＤＡＣを有すると対象を同定することを含み、ここで、マーカーは、表１に示される通りの可変メチル化領域（ＤＭＲ）１～１３からなる群から選択されるＤＭＲ中に塩基を含む。
対象から得られた試料が血液試料（例えば、血漿試料、全血試料、白血球試料、血清試料）であり、以下のマーカーのうちの１つ以上のメチル化状態が、ＰＤＡＣを有しない対象においてアッセイされた１つ以上のマーカーのメチル化状態と異なるいくつかの実施形態では、対象がＰＤＡＣを有することを示す：ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３、実施例１を参照されたい）。
対象から得られた試料が膵組織であり、以下のマーカーのうちの１つ以上のメチル化状態が、ＰＤＡＣを有しない対象においてアッセイされた１つ以上のマーカーのメチル化状態と異なるいくつかの実施形態では、対象がＰＤＡＣを有することを示す：ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表４、実施例１を参照されたい）。
本技術はさらに、血液試料及び／または組織試料からＰＤＡＣを同定及び識別することに関連する。いくつかの実施形態は、複数のマーカーをアッセイすることを含む（例えば、２～１３個、３～１３個、４～１３個、５～１３個、６～１３個、７～１３個、８～１３個、９～１３個、１０～１３個、１１～１３個、１２～１３個をアッセイすることを含む）（例えば、１３個以下のマーカーをアッセイすることを含む；１３個またはそれより少ないマーカーをアッセイすることを含む）（例えば、１２個以下のマーカー、１１個以下のマーカー、１０個以下のマーカー、９つ以下のマーカー、８つ以下のマーカー、７つ以下のマーカー、６つ以下のマーカー、５つ以下のマーカー、４つ以下のマーカー、３つ以下のマーカー、２つ以下のマーカーをアッセイすることを含む）方法を提供する。
本技術は、評価されるメチル化状態に限定されない。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態を評価することは、１塩基のメチル化状態を判定することを含む。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態をアッセイすることは、複数の塩基におけるメチル化の程度を判定することを含む。さらに、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較したマーカーのメチル化の増加を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較したマーカーのメチル化の低下を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較したマーカーのメチル化の異なるパターンを含む。
さらに、いくつかの実施形態では、マーカーは１００以下の塩基の領域であり、マーカーは５００以下の塩基の領域であり、マーカーは１０００以下の塩基の領域であり、マーカーは５０００以下の塩基の領域であり、またはいくつかの実施形態では、マーカーは１塩基である。いくつかの実施形態では、マーカーは、高ＣｐＧ密度プロモーター中に存在する。
本技術は、試料のタイプによって限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料（例えば、膵組織試料）、血液試料（例えば、血漿、白血球、血清、全血）、排泄物、または尿試料である。
さらに、本技術は、メチル化状態を判定するために使用される方法に限定されない。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕捉を使用することを含む。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、本技術は、超並列シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、例えば、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、リアルタイム（例えば、単一分子）シーケンシング、ビーズエマルジョンシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどを使用して、メチル化状態を判定する。
本技術は、ＤＭＲを検出するための試薬を提供し、例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１～１３によって示される配列（表１を参照されたい）を含むオリゴヌクレオチドのセットが提供される。いくつかの実施形態では、ＤＭＲ中に塩基を有する染色体領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＭＲのメチル化状態に対する感度が高いオリゴヌクレオチドが提供される。
本技術は、ＰＤＡＣを同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３及び／または表４、実施例１を参照されたい）であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
キットの実施形態、例えば、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）と、（表１の）ＤＭＲ１～１３からなる群から選択されるＤＭＲの配列を含み、かつＰＤＡＣを有しない対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸とを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、バイサルファイト試薬及び本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）と、（表１の）ＤＭＲ１～１３からなる群から選択されるＤＭＲの配列を含み、かつＰＤＡＣを有する対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸とを含む。いくつかのキットの実施形態は、対象から試料（例えば、糞便試料、膵組織試料、血液試料）を得るための試料コレクター、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）、ならびに本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。
本技術は、組成物（例えば、反応混合物）の実施形態に関する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲを含む核酸ならびにメチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸と本明細書に記載のオリゴヌクレオチドとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸とメチル化感受性制限酵素とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸とポリメラーゼとを含む組成物を提供する。
追加の関連方法の実施形態は、対象から得られた試料（例えば、膵組織試料、血液試料、糞便試料）中のＰＤＡＣについてスクリーニングするために提供され、例えば、本方法は、（表１の）ＤＭＲ１～１３のうちの１箇所以上であるＤＭＲ中に塩基を含む試料中のマーカーのメチル化状態を判定すること、対象試料のマーカーのメチル化状態を、ＰＤＡＣを有しない対象からの正常対照試料のマーカーのメチル化状態と比較すること、ならびに対象試料及び正常対照試料のメチル化状態における差の信頼区間及び／またはｐ値を判定することを含む。いくつかの実施形態では、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００１である。方法のいくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸を、メチル化特異的な形で核酸を修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）と反応させて、例えば、メチル化特異的な形で修飾された核酸を生成するステップ、メチル化特異的な形で修飾された核酸をシーケンシングし、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を得るステップ、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を、ＰＤＡＣを有しない対象からのＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定するステップ、ならびに差が存在する場合、対象がＰＤＡＣを有すると同定するステップを提供する。
対象から得られた試料中のＰＤＡＣについてスクリーニングするためのシステムが、本技術によって提供される。システムの例示的な実施形態は、例えば、対象から得られた試料（例えば、膵組織試料、血漿試料、糞便試料）中のＰＤＡＣについてスクリーニングするためのシステムを含み、このシステムは、試料のメチル化状態を判定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態をデータベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及びＰＤＡＣ関連メチル化状態をユーザーに警告するように構成されている警告コンポーネントを含む。警告は、いくつかの実施形態では、複数のアッセイ（例えば、複数のマーカー、例えば、ＤＭＲ（例えば、表１に示される通りのもの）のメチル化状態を判定する）からの結果を受信し、値または結果を算出して複数の結果に基づいて報告するソフトウェアコンポーネントによって判定される。いくつかの実施形態は、値もしくは結果の算出及び／またはユーザー（例えば、医師、看護師、臨床医など）に報告する警告に使用するための、本明細書で提供される各ＤＭＲと関連する重み付けパラメータのデータベースを提供する。いくつかの実施形態では、複数のアッセイからの結果全てが報告され、いくつかの実施形態では、１つ以上の結果が、対象におけるがんリスクを示す複数のアッセイからの１つ以上の結果を複合したものに基づいて、スコア、値、または結果を提供するために使用される。
システムのいくつかの実施形態では、試料は、ＤＭＲを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、システムは、核酸を単離するためのコンポーネント、試料を収集するためのコンポーネント、例えば、糞便試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、ＤＭＲを含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、ＰＤＡＣを有しない対象からの核酸配列を含む。さらに提供されるのは、核酸、例えば、核酸のセットであり、各核酸はＤＭＲを含む配列を有する。核酸のセットのいくつかの実施形態では、各核酸は、ＰＤＡＣを有しない対象からの配列を有する。関連システムの実施形態は、記載されるような核酸のセット及び核酸のセットに関連する核酸配列のデータベースを含む。いくつかの実施形態は、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）をさらに含む。また、いくつかの実施形態は、核酸シーケンサーをさらに含む。
特定の実施形態では、ヒト患者からの試料（例えば、膵組織試料、血液試料、糞便試料）を特徴付けるための方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、そのような実施形態は、ヒト患者の試料からＤＮＡを得ること、表１の可変メチル化領域（ＤＭＲ）１～１３からなる群から選択されるＤＭＲ中に塩基を含むＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすること、ならびに１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのアッセイされたメチル化状態を、ＰＤＡＣを有しないヒト患者の１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベル参照と比較することを含む。
そのような方法は、ヒト患者に由来する特定のタイプの試料に限定されない。いくつかの実施形態では、試料は、膵組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血液試料（例えば、白血球試料、血漿試料、全血試料、血清試料）、または尿試料である。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、複数のＤＮＡメチル化マーカーをアッセイすることを含む（例えば、２～１３個、３～１３個、４～１３個、５～１３個、６～１３個、７～１３個、８～１３個、９～１３個、１０～１３個、１１～１３個、１２～１３個をアッセイすることを含む）（例えば、１３個以下のマーカーをアッセイすることを含む；１３個またはそれより少ないマーカーをアッセイすることを含む）（例えば、１２個以下のマーカー、１１個以下のマーカー、１０個以下のマーカー、９つ以下のマーカー、８つ以下のマーカー、７つ以下のマーカー、６つ以下のマーカー、５つ以下のマーカー、４つ以下のマーカー、３つ以下のマーカー、２つ以下のマーカーをアッセイすることを含む）。いくつかの実施形態では、そのような方法は、試料中の１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすることを含み、１塩基のメチル化状態を判定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、試料中の１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすることを含み、複数の塩基におけるメチル化の程度を判定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、フォワード鎖のメチル化状態をアッセイすること、またはリバース鎖のメチル化状態をアッセイすることを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、１００以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、５００以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、１０００以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、５０００以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、１塩基である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化マーカーは、高ＣｐＧ密度プロモーター中に存在する。
いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕捉を使用することを含む。
いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、メチル化特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３（表１）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表１、実施例１を参照されたい）からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、ＤＮＡメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、２つのＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を判定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、表１の行に示されるＤＮＡメチル化マーカー対のメチル化状態を判定することを含む。
特定の実施形態では、本技術は、ヒト患者から得られた試料（例えば、膵組織試料、白血球試料、血漿試料、全血試料、血清試料、糞便試料）を特徴付けるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、表１のＤＭＲ１～１３からなる群から選択されるＤＭＲ中に塩基を含む試料におけるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を判定すること、患者試料のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を、ＰＤＡＣを有しないヒト対象からの正常対照試料のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態と比較すること、ならびにヒト患者及び正常対照試料のメチル化状態における差の信頼区間及び／またはｐ値を判定することを含む。いくつかの実施形態では、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００１である。
特定の実施形態では、本技術は、ヒト対象から得られた試料（例えば、膵組織試料、白血球試料、血漿試料、全血試料、血清試料、糞便試料）を特徴付けるための方法を提供し、本方法は、ＤＭＲを含む核酸を、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）と反応させてメチル化特異的な形で修飾された核酸を生成すること、メチル化特異的な形で修飾された核酸をシーケンシングし、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を得ること、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を、ＰＤＡＣを有しない対象からのＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定することを含む。
特定の実施形態では、本技術は、ヒト対象から得られた試料（例えば、膵組織試料、血漿試料、糞便試料）を特徴付けるためのシステムを提供し、このシステムは、試料のメチル化状態を判定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態を、データベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及びメチル化状態の組み合わせに基づいて単一値を判定し、ＰＤＡＣ関連メチル化状態をユーザーに警告するように構成されている警告コンポーネントを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＭＲを含む核酸を含む。
いくつかの実施形態では、そのようなシステムは、核酸を単離するためのコンポーネントをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのようなシステムは、試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血液試料（例えば、血漿試料、白血球試料、全血試料、血清試料）、または尿試料である。
いくつかの実施形態では、データベースは、ＤＭＲを含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、ＰＤＡＣを有しない対象からの核酸配列を含む。
さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて、関連分野の当業者には明らかとなる。
定義
本技術の理解を促進するために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
本技術の理解を促進するために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、以下の用語は、文脈により別途明確に指示されない限り、本明細書に明示的に関連する意味を持つ。「一実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を指す場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、「別の実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、異なる実施形態を指す場合もあるが、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らない。したがって、以下に記載の通りに、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。
さらに、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、包括的「または」演算子であり、文脈により別途明確に指示されない限り、「及び／または」という用語と同等である。「に基づく」という用語は、文脈により別途明確に指示されない限り、排他的なものではなく、記載されていない追加の因子に基づくことを可能にする。さらに、本明細書全体にわたって、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味には、複数の言及物が含まれる。「中に（ｉｎ）」の意味には、「中に（ｉｎ）」及び「上に（ｏｎ）」が含まれる。
「から本質的になる」という移行句は、本出願の特許請求の範囲において使用する場合、Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ ＵＳＰＱ ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）に述べられているように、特許請求の範囲を、特許請求された発明の特定の物質またはステップ「及び基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼすことのないもの」に限定する。例えば、列挙された要素「から本質的になる」組成物は、列挙されていない混入物を、存在はするものの、純粋な組成物、すなわち列挙された成分「からなる」組成物と比較した場合に列挙された組成物の機能を変化させないようなレベルで含有する場合がある。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、一般に任意のリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指し、非修飾または修飾ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。「核酸」には、一本鎖及び二本鎖核酸が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語はまた、１つ以上の修飾塩基を含有する、前述の通りのＤＮＡも含む。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡは、「核酸」である。「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸のそのような化学的、酵素的、または代謝的修飾形態に加えて、ウイルスならびに細胞（例えば、単純型及び複合型細胞を含む）に特徴的なＤＮＡの化学的形態を包含する。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上、好ましくは３つを超える、及び通常は１０個を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する分子を指す。正確なサイズは、多くの因子に依存することになり、そして次に、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む任意の手法で生成することができる。ＤＮＡの典型的なデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニンである。ＲＮＡの典型的なリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、及びグアニンである。
本明細書で使用される場合、核酸の「遺伝子座」または「領域」という用語は、核酸の小領域、例えば、染色体上の遺伝子、単一ヌクレオチド、ＣｐＧアイランドなどを指す。
「相補的な」及び「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連付けられるヌクレオチド（例えば、１つのヌクレオチド）またはポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’に相補的である。相補性は、核酸の塩基の数個のみが塩基対合則に従い適合する、「部分的」であってもよい。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度をもたらす。これは、増幅反応において、及び核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
「遺伝子」という用語は、ＲＮＡの、またはポリペプチドもしくはその前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能的ポリペプチドは、完全長コード配列によって、またはポリペプチドの所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、コード配列の任意の部分によって、コードされ得る。「部分」という用語は、遺伝子に関して使用される場合、その遺伝子の断片を指す。断片は、数個のヌクレオチドから、遺伝子全体の配列から１つのヌクレオチドを除いたサイズの範囲であり得る。したがって、「遺伝子の少なくとも一部分を含むヌクレオチド」は、遺伝子の断片または遺伝子全体を含み得る。
「遺伝子」という用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、５’末端及び３’末端の両方で、例えば、いずれかの末端上で約１ｋｂの距離でコード領域に隣接して位置する配列を含み、これにより、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（例えば、コード配列、調節配列、構造配列及び他の配列を含む）の長さに対応する。コード領域の５’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または５’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。一部の生物（例えば、真核生物）では、遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される、非コード配列によって分断されるコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有し得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシングにより除去」され、そのため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中には存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチド中でアミノ酸の配列または順序を規定するように翻訳中に機能する。
イントロンの含有に加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端及び３’末端の両方に位置する配列を含み得る。これらの配列は、「隣接」配列または「隣接」領域と称される（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するかまたはそれに影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサーなどの調節配列を含有し得る。３’隣接領域は、転写終結、転写後切断、及びポリアデニル化を指示する配列を含有し得る。
「野生型」という用語は、遺伝子に関して言及する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。「野生型」という用語は、遺伝子産物に関して言及する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。「天然に存在する」という用語は、対象物に使用される場合、対象物が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離することができ、かつ実験室で人の手により意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。野生型遺伝子は、多くの場合、集団中で最も高頻度で観察されるその遺伝子または対立遺伝子であり、そのため、遺伝子の「正常」または「野生型」形態と任意に称される。対照的に、「修飾された」または「突然変異体」という用語は、遺伝子または遺伝子産物に関して言及する場合、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／または機能特性に修飾（例えば、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物をそれぞれ指す。天然に存在する突然変異体は単離することができ、これらは、それらが野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実によって同定されることに留意する。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の多様性を指し、多様性としては、バリアント及び突然変異体、多型遺伝子座、ならびに一塩基多型遺伝子座、フレームシフト、及びスプライス突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。対立遺伝子は、集団中に天然に存在する場合もあれば、または集団における任意の特定個体の生涯の間に生じる場合がある。
したがって、「バリアント」及び「突然変異体」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、別の（通常は関連する）ヌクレオチド酸配列とは１つ以上のヌクレオチドで異なる核酸配列を指す。「多様性」は、２つの異なるヌクレオチド配列間の差であり、通常、一方の配列は参照配列である。
「増幅」は、鋳型特異性に関与する核酸複製の特殊な事例である。これは、非特異的鋳型複製（例えば、鋳型依存的であるが、特定の鋳型には依存しない複製）とは対照的である。鋳型特異性は、本明細書では、複製の忠実度（例えば、適切なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性の点でしばしば説明される。標的配列は、それらが他の核酸からの選別が求められるという意味において「標的」である。増幅技術は、主にこの選別のために設計されている。
核酸との関連における「増幅すること」または「増幅」という用語は、通常は少量のポリヌクレオチド（例えば、単一ポリヌクレオチド分子）から開始するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部分の複数コピーの生成を指し、増幅産物またはアンプリコンは、概して検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的及び酵素的プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えば、米国特許第５，４９４，８１０号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）中の、標的または鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成が、増幅の形態である。増幅のさらなるタイプとしては、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、アセンブリＰＣＲ（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，６６２，５９４号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，３３８，６７１号を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、配列間特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：８１８６を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ライゲーション媒介ＰＣＲ（例えば、Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１８５４－１８５８（１９９７）、米国特許第５，５０８，１６９号を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ ９３（１３）９８２１－９８２６を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１２）：ｅ５７を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（２３）１１１４１－１１１５６、Ｂａｌｌａｂｉｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８４（６）５７１－５７３、Ｈａｙｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：８０を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（１５）７３５１－７３６７を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３－４１７、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６－１０３０を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、逆転写ＰＣＲ（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２５：１６９－１９３を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、ならびにタッチダウンＰＣＲ（例えば、Ｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（１４）４００８、Ｒｏｕｘ，Ｋ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（５）８１２－８１４、Ｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０（３）４７８－４８５を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド増幅はまた、デジタルＰＣＲを使用して行うことができる（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９－２００４，（１９９７）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６；９２３６－４１，（１９９９）、国際特許公開第ＷＯ０５０２３０９１Ａ２号、米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニングまたは精製することなく、ゲノムまたは他のＤＮＡもしくはＲＮＡの混合物中で標的配列のセグメント濃度を増加させるための方法を記載しているＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号の方法を指す。標的配列を増幅させるためのこのプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱サイクルを正確な順序で行うことからなる。２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれらの各々の鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングさせる。アニーリング後、プライマーを、新たな相補鎖の対を形成するようにポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長のステップを何度も反復して（すなわち、変性、アニーリング及び伸長が１回の「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）、高濃度の、所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対的な位置によって判定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスの反復の側面から、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と称される。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中で（濃度に関して）優勢配列となることから、それらは「ＰＣＲ増幅された」と称され、それらは「ＰＣＲ産物」または「アンプリコン」である。当業者は、「ＰＣＲ」という用語が、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、単一プライマー及び任意プライムＰＣＲなどを使用する、当初説明された方法の多くの変形を包含すると理解するであろう。
鋳型特異性は、大半の増幅技術において酵素の選択により実現される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、核酸の不均質混合物中で核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑ－ベータレプリカーゼの場合、ＭＤＶ－１ ＲＮＡは、レプリカーゼの特異的鋳型である（Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：３０３８［１９７２］）。他の核酸が、この増幅酵素によって複製されることはない。同様に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自体のプロモーターに対してストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２２８：２２７［１９７０］）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、酵素は、ライゲーション結合部においてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの基質と鋳型との間にミスマッチがある場合、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをライゲーションすることはない（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０）。最後に、耐熱性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）は、高温で機能するそれらの能力によって、プライマーが結合しそれによりプライマーによって規定される配列に対して高度な特異性を示すことが見出され、高温によって、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションには有利であるが非標的配列とはハイブリダイズしない、熱力学的条件がもたらされる（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
本明細書で使用される場合、「核酸検出アッセイ」という用語は、目的の核酸のヌクレオチド組成を判定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイとしては、ＤＮＡシーケンシング法、プローブハイブリダイゼーション法、構造特異的切断アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）、ならびに例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，０９０，５４３号、及び同第６，８７２，８１６号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、ならびに米国特許第９，０９６，８９３号に記載されているものであり、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）；酵素ミスマッチ切断法（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、同第５，９５８，６９２号、同第５，８５１，７７０号）；前述のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；分枝ハイブリダイゼーション法（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，７１０，２６４号、同第５，１２４，２４６号、及び同第５，６２４，８０２号）；ローリングサークル複製（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号及び同第６，２３５，５０２号）；ＮＡＳＢＡ（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４０９，８１８号）；分子ビーコン技術（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１５０，０９７号）；Ｅセンサー技術（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、同第６，２２１，５８３号、同第６，０１３，１７０号、及び同第６，０６３，５７３号）；サイクリングプローブ技術（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４０３，７１１号、同第５，０１１，７６９号、及び同第５，６６０，９８８号）；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅法（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２１，００１号、同第６，１１０，６７７号、同第５，９１４，２３０号、同第５，８８２，８６７号、及び同第５，７９２，６１４号）；リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎａｙ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１８９－９３（１９９１））；ならびにサンドイッチハイブリダイゼーション法（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８８，６０９号）が挙げられるが、これらに限定されない。
「増幅可能な核酸」という用語は、任意の増幅方法によって増幅することができる核酸を指す。「増幅可能な核酸」は、通常「試料鋳型」を含むことが企図される。
「試料鋳型」という用語は、「標的」（以下に定義される）の存在について分析される試料に由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料中に存在する場合もあれば、存在しない場合もある試料鋳型以外の核酸に関して使用される。バックグラウンド鋳型は、ほとんどの場合偶発的なものである。バックグラウンド鋳型は、キャリーオーバーの結果であり得るか、またはそれは、試料から精製除去されることが求められる核酸混入物の存在によるものであり得る。例えば、検出対象以外の生物からの核酸が、試験試料中にバックグラウンドとして存在する可能性がある。
「プライマー」という用語は、例えば、制限消化物からの核酸断片として天然に生じるか、または合成により生成されるかを問わないオリゴヌクレオチドを指し、これは、核酸鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（例えば、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下に、かつ好適な温度及びｐＨに）置かれる場合、合成の開始点として機能することができる。プライマーは、増幅の効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、まずその鎖を分離するために処理され、その後伸長産物の調製に使用される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマー供給源、及び方法の使用をはじめとする、多数の因子に依存することになる。
「プローブ」という用語は、精製された制限消化物のように天然に生じるか、または合成により、組換えにより、もしくはＰＣＲ増幅により生成されるかを問わないオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指し、これは目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である（例えば、「捕捉プローブ」）。本発明で使用されるいずれのプローブも、いくつかの実施形態において、任意の「レポーター分子」で標識することができ、その結果、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素ベースの組織化学アッセイ）、蛍光、放射性、ならびに発光システムを含むがこれらに限定されない任意の検出システムで検出可能であることが企図される。これは、本発明がいずれかの特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。
「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、プローブ結合、増幅、単離、捕捉などによって他の核酸から選別されることが求められる核酸を指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーによって結合された核酸の領域を指し、一方、標的ＤＮＡが増幅されないアッセイに使用される場合、例えば、侵入切断アッセイのいくつかの実施形態では、標的は、プローブ及び侵入オリゴヌクレオチド（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）が結合して侵入切断構造を形成する部位を含み、これにより、標的核酸の存在を検出することができる。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。
本明細書で使用される場合、「メチル化」は、シトシンのＣ５位もしくはＮ４位でのシトシンメチル化、アデニンのＮ６位、または他のタイプの核酸メチル化を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ＤＮＡは、典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ増幅法が増幅鋳型のメチル化パターンを保持しないため、通常メチル化されない。ただし、「非メチル化ＤＮＡ」または「メチル化ＤＮＡ」はまた、元の鋳型がメチル化されていなかった増幅ＤＮＡ、または元の鋳型がメチル化されていた増幅ＤＮＡもそれぞれ指し得る。
したがって、本明細書で使用される場合、「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上のメチル部分の存在を指し、メチル部分は、認識されている典型的なヌクレオチド塩基中には存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含有しないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、チミンはＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるため、本明細書の目的において、ＤＮＡ中に存在する場合にチミンはメチル化ヌクレオチドであるとは見なされない。
本明細書で使用される場合、「メチル化核酸分子」は、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを含有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、核酸分子の「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状況」は、核酸分子中の１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の存在または欠如を指す。例えば、メチル化シトシンを含有する核酸分子は、メチル化されていると見なされる（例えば、核酸分子のメチル化状態は、メチル化されている）。メチル化ヌクレオチドを一切含有しない核酸分子は、メチル化されていないと見なされる。
特定の核酸配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）のメチル化状態は、配列中の全塩基のメチル化状態を示し得るか、または配列内における塩基のサブセットの（例えば、１つ以上のシトシンの）メチル化状態を示し得るか、またはメチル化が生じる配列内の正確な位置情報を提供しながら、もしくは提供せずに、配列内の局所的メチル化密度に関する情報を示し得る。
核酸分子中のヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子における特定の遺伝子座のメチル化ヌクレオチドの存在または欠如を指す。例えば、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンである場合に、メチル化されている。同様に、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（かつ５－メチルシトシンではない）場合には、メチル化されていない。
メチル化状況は、任意選択的に「メチル化値」（例えば、メチル化頻度、割合、比、パーセントなどを表す）によって表すかまたは示すことができる。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素を用いた制限消化後に存在するインタクトな核酸量を定量することによって、またはバイサルファイト反応後の増幅プロファイルを比較することによって、またはバイサルファイト処理及び未処理核酸の配列を比較することによって生成することができる。したがって、値、例えば、メチル化値は、メチル化状況を表し、これにより、これらを遺伝子座の複数のコピーにわたりメチル化状況の定量的指標として使用することができる。これは、試料中の配列のメチル化状況を閾値または参照値と比較することが望ましい場合の、特定の用途である。
本明細書で使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない事例の数と比較した、分子または遺伝子座がメチル化されている事例の数を指す。
したがって、メチル化状態は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化の状態を表す。さらに、メチル化状態は、メチル化に関連する特定のゲノム遺伝子座における核酸セグメントの特徴を指す。そのような特徴としては、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されるか否か、メチル化Ｃ残基（複数可）の位置、核酸の任意の特定領域全体にわたるメチル化Ｃの頻度またはパーセンテージ、及び例えば、対立遺伝子の起源の差に起因するメチル化の対立遺伝子差が挙げられるが、これらに限定されない。「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状況」という用語はまた、生体試料中の核酸の任意の特定領域全体にわたるメチル化Ｃまたは非メチル化Ｃの相対濃度、絶対濃度、またはパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合、それは「高メチル化」または「メチル化の増加」を有すると称される場合があり、一方、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合、それは「低メチル化」または「メチル化の低下」を有すると称される場合がある。同様に、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域からの、または異なる個体からなどの）と比較してメチル化されている場合、その配列は、他の核酸配列と比較して高メチル化またはメチル化の増加を有すると見なされる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域からの、または異なる個体からなどの）と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他の核酸配列と比較して低メチル化またはメチル化の低下を有すると見なされる。さらに、本明細書で使用される場合、「メチル化パターン」という用語は、核酸のある領域にわたるメチル化及び非メチル化ヌクレオチドの集合部位を指す。２つの核酸は、メチル化及び非メチル化ヌクレオチドの数が領域全体にわたって同じまたは類似しているがメチル化及び非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合、同じまたは類似したメチル化頻度またはメチル化パーセントを有し得るが、異なるメチル化パターンを有し得る。配列は、それらがメチル化の程度（例えば、一方が他方と比較してメチル化の増加または低下を有する）、頻度、またはパターンが異なる場合、「可変メチル化」であると、または「メチル化の差」を有すると、または「異なるメチル化状態」を有すると称される。「可変メチル化」という用語は、がん陰性試料中の核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した場合の、がん陽性試料中の核酸メチル化のレベルまたはパターンの差を指す。それはまた、手術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンの差を指す場合もある。可変メチル化及びＤＮＡメチル化の特定のレベルまたはパターンは、例えば、正確なカットオフまたは予測特性が定められた後は、予後及び予測バイオマーカーである。
メチル化状態頻度を使用して、個体集団または単一個体に由来する試料を記述することができる。例えば、５０％のメチル化状態頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、５０％の事例においてメチル化されており、５０％の事例においてメチル化されていない。そのような頻度は、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が、個体集団または核酸集合体中でメチル化される程度について記述するために使用することができる。したがって、核酸分子の第１集団またはプール中のメチル化が、核酸分子の第２集団またはプール中のメチル化とは異なる場合、第１集団またはプールのメチル化状態頻度は、第２集団またはプールのメチル化状態頻度とは異なることになる。そのような頻度はまた、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が単一個体中でメチル化される程度を記述するために使用することができる。例えば、そのような頻度を使用して、組織試料からの細胞群がヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化されている程度、またはメチル化されていない程度を記述することができる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド遺伝子座」は、核酸分子中のヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座は、核酸分子中のメチル化ヌクレオチドの位置を指す。
通常、ヒトＤＮＡのメチル化は、シトシンがグアニンの５’に位置している、隣接するグアニン及びシトシンを含むジヌクレオチド配列（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも称される）上で生じる。ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンの多くはヒトゲノム中でメチル化されているが、いくつかは、ＣｐＧアイランドとして知られる特定のＣｐＧジヌクレオチドリッチゲノム領域中でメチル化されないままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：５０３－５１４を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧアイランド」は、全ゲノムＤＮＡと比較して増加した数のＣｐＧジヌクレオチドを含有するゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、少なくとも１００、２００、またはそれを超える塩基対長であり得、この場合、領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５０％であり、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は０．６であり、場合によっては、ＣｐＧアイランドは、少なくとも５００塩基対長であり得、この場合、領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５５％であり、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は０．６５である。予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１－２８１で提供される方法に従って算出することができる。例えば、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って算出することができ、式中、Ｒは、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比であり、Ａは、分析された配列中のＣｐＧジヌクレオチド数であり、Ｂは、分析された配列中のヌクレオチドの総数であり、Ｃは、分析された配列中のＣヌクレオチドの総数であり、Ｄは、分析された配列中のＧヌクレオチドの総数である。メチル化状態は通常、ＣｐＧアイランド中で、例えば、プロモーター領域で判定される。しかしながら、ＣｐＡ及びＣｐＴなど、ヒトゲノム中の他の配列が、ＤＮＡメチル化の傾向にあることが理解されるであろう（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５２３７－５２４２、Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０４：３４０－３５１、Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２８２７－２８４２、Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４３５３－４３６７、Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４５：８８８－８９４を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「メチル化特異的試薬」は、核酸分子のメチル化状態に応じて核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬を指すか、またはメチル化特異的試薬は、核酸分子のメチル化状態を反映する形で核酸分子のヌクレオチド配列を変化させ得る化合物もしくは組成物もしくは他の薬剤を指す。核酸分子をそのような試薬で処理する方法は、核酸分子を試薬と接触させ、必要に応じて追加のステップに連結させて、ヌクレオチド配列の所望の変化を達成することを含み得る。そのような方法は、非メチル化ヌクレオチド（例えば、各非メチル化シトシン）が、異なるヌクレオチドへと修飾される形で適用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのような試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化してデオキシウラシル残基を生成することができる。そのような試薬の例としては、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
メチル化特異的試薬による核酸ヌクレオチド配列の変化はまた、各メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドへと修飾される核酸分子をもたらし得る。
「メチル化アッセイ」という用語は、核酸配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を判定するための任意のアッセイを指す。
「ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ」（メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応）という用語は、ＣＧリッチプライマーを使用してゲノムを全スキャンし、ＣｐＧジヌクレオチドを含有する可能性が最も高い領域に集中することを可能にする、当該技術分野において認識されている技術を指し、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４－５９９によって記載されている。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」という用語は、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６によって記載されている、当該技術分野において認識されている蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ技術を指す。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」という用語は、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または増幅プライマーによってカバーされるメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーとも称される）が、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にするアッセイを指す。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされている。
「Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）という用語は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１によって記載されている当該技術分野において認識されているアッセイを指す。
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）という用語は、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６によって、及び米国特許第５，７８６，１４６号によって記載されている当該技術分野において認識されているメチル化アッセイを指す。
「ＣＯＢＲＡ」（複合バイサルファイト制限分析）という用語は、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４によって記載されている当該技術分野において認識されているメチル化アッセイを指す。
「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）という用語は、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２によって、及びＷＯ００／２６４０１Ａ１に記載されているメチル化アッセイを指す。
本明細書で使用される場合、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子に通常存在する４つのヌクレオチド（ＤＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡ、ＲＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１つのヌクレオチドを指し、通常存在するヌクレオチドのメチル化誘導体を含み得（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、メチル化Ｃ及び非メチル化Ｃの両方が、選択されたヌクレオチドの意味に含まれる）、一方、メチル化された選択されたヌクレオチドは、メチル化された通常存在するヌクレオチドを特に指し、メチル化されていない選択されたヌクレオチドは、メチル化されていない通常存在するヌクレオチドを特に指す。
「メチル化特異的制限酵素」という用語は、制限酵素であって、その認識部位のメチル化状態に依存する核酸を選択的に消化する制限酵素を指す。認識部位がメチル化されていないかまたはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素（メチル化感受性酵素）の場合、認識部位が一方または両方の鎖上でメチル化されている場合、切断は行われない（または著しく低下した効率で行われる）。認識部位がメチル化されている場合に限り特異的に切断する制限酵素（メチル化依存性酵素）の場合、認識部位がメチル化されていない場合、切断は行われない（または著しく低下した効率で行われることになる）。好ましくはメチル化特異的制限酵素であり、その認識配列は、ＣＧジヌクレオチド（例えば、ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧなどの認識配列）を含有する。いくつかの実施形態にさらに好ましいのは、このジヌクレオチド中のシトシンが炭素原子Ｃ５でメチル化される場合には切断しない制限酵素である。
本明細書で使用される場合、「異なるヌクレオチド」は、選択されたヌクレオチドとは化学的に異なるヌクレオチドを指し、通常、その結果、異なるヌクレオチドが、選択されたヌクレオチドとは異なるワトソン－クリック塩基対合特性を有するため、選択されたヌクレオチドに相補的な通常存在するヌクレオチドは、異なるヌクレオチドに相補的な通常存在するヌクレオチドと同じではない。例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、ＵまたはＴは異なるヌクレオチドであり得、これはＣのＧに対する相補性及びＵまたはＴのＡに対する相補性によって例示される。本明細書で使用される場合、選択されたヌクレオチドに相補的な、または異なるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で、４つの通常存在するヌクレオチドのうちの３つとの相補的ヌクレオチドの塩基対合よりも高い親和性で、選択されたヌクレオチドまたは異なるヌクレオチドと塩基対合するヌクレオチドを指す。相補性の一例は、ＤＮＡ（例えば、Ａ－Ｔ及びＣ－Ｇ）ならびにＲＮＡ（例えば、Ａ－Ｕ及びＣ－Ｇ）のワトソン－クリック塩基対合である。したがって、例えば、Ｇは、高ストリンジェンシー条件下で、ＧがＧ、Ａ、またはＴと塩基対合するよりも高い親和性でＣと塩基対合し、このため、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、Ｇは、選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー（または共に使用されるマーカーのセット）の「感度」は、腫瘍性試料と非腫瘍性試料とを区別する閾値を超えるＤＮＡメチル化値を報告する試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陽性は、閾値を超えるＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連する範囲）を報告する組織学的に確認された新生物形成として定義され、偽陰性は、閾値未満のＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連しない範囲）を報告する組織学的に確認された新生物形成として定義される。したがって、感度の値は、既知の罹患試料から得られた所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が、疾患関連測定値の範囲内にあるであろう確率を反映する。本明細書で定義される場合、算出された感度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有する対象に適用される場合、その臨床状態の存在を検出する確率の推定を表す。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー（または共に使用されるマーカーのセット）の「特異性」は、腫瘍性試料と非腫瘍性試料とを区別する閾値未満のＤＮＡメチル化値を報告する非腫瘍性試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陰性は、閾値未満のＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連しない範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義され、偽陽性は、閾値を超えるＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連する範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義される。したがって、特異性の値は、既知の非腫瘍性試料から得られた所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が、非疾患関連測定値の範囲内にあるであろう確率を反映する。本明細書で定義される場合、算出された特異性値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有しない患者に適用される場合、その臨床状態の欠如を検出する確率の推定を表す。
「ＡＵＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、「曲線下面積」の略称である。特に、ＡＵＣは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線は、診断試験の考えられる様々なカットポイントの、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。ＲＯＣ曲線は、選択されたカットポイントに応じた感度と特異性との間のトレードオフを示す（感度のあらゆる上昇は、特異性の低下を伴うことになる）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断試験の精度の尺度である（面積が大きいほどより良好であり、１が最適であり、ランダム試験は対角線上に位置するＲＯＣ曲線を有し、面積は０．５である。参照：Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．（１９７５）Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ＲＯＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
「新生物」という用語は、本明細書で使用される場合、組織のあらゆる新規の異常増殖を指す。したがって、新生物は、前悪性新生物または悪性新生物であり得る。
「新生物特異的マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、新生物の存在を示すために使用され得る任意の生体物質または要素を指す。生体物質の例としては、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜及びミトコンドリア）、ならびに全細胞が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、マーカーは、特定の核酸領域（例えば、遺伝子、遺伝子内領域、特定の遺伝子座など）である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」、「マーカー遺伝子座」などと称される場合がある。
本明細書で使用される場合、「腺腫」という用語は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの増殖は良性であるが、経時的にそれらは進行して悪性となるおそれがある。
「前がん性」または「前腫瘍性」という用語及びそれらの等価物は、悪性転換を経ている任意の細胞増殖性障害を指す。
新生物、腺腫、がんなどの「部位」は、新生物、腺腫、がんなどが位置している対象の身体中の組織、器官、細胞タイプ、解剖学的領域、身体部位などである。
本明細書で使用される場合、「診断」試験の適用には、対象の疾患状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の検出または同定、対象が所与の疾患または状態に罹患する可能性を判定すること、疾患または状態を有する対象が療法に応答する可能性を判定すること、疾患または状態を有する対象の予後（またはその進行もしくは後退の可能性）を判定すること、及び疾患または状態を有する対象に対する治療の効果を判定することが含まれる。例えば、診断は、新生物に罹患している対象の存在もしくは可能性、またはそのような対象が化合物（例えば、医薬、例えば、薬物）もしくは他の治療に好都合に応答する可能性を検出するために使用され得る。
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」のように核酸に関して使用される場合、その天然源中で通常付随する少なくとも１つの混入核酸から同定され分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然に見出されるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出される。単離されていない核酸の例としては、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出される所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）、ＲＮＡ配列、例えば、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などが挙げられる。しかしながら、特定のタンパク質をコードする単離された核酸としては、例として、そのタンパク質を通常発現する細胞中のそのような核酸が挙げられ、この場合、核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するか、またはさもなければ、天然に見出されるものとは異なる核酸配列に隣接している。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、このオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはコード鎖を最低限含む（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。単離された核酸は、その天然の、または通常の環境からの単離後、他の核酸または分子に組み合わされ得る。例えば、単離された核酸は、宿主細胞中に存在する場合があり、それは例えば、異種発現のためにそこに配置されている。
「精製された」という用語は、核酸またはアミノ酸配列のいずれかの分子であって、それらの自然環境から除去されたか、単離されたか、または分離された分子を指す。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列であり得る。「実質的に精製された」分子は、それらが自然に付随している他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、より好ましくは少なくとも９０％含まない。本明細書で使用される場合、「精製された」または「精製するための」という用語はまた、試料からの混入物の除去も指す。混入タンパク質の除去により、試料中の目的のポリペプチドまたは核酸のパーセントが上昇する。別の例では、組換えポリペプチドが、植物、細菌、酵母、または哺乳動物宿主細胞中で発現され、このポリペプチドが、宿主細胞タンパク質の除去により精製され、それにより組換えポリペプチドのパーセントが試料中で上昇する。
所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド「を含む組成物」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含有する任意の組成物を広く指す。組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、及び他の成分（例えば、デンハルト液、粉乳、サケ精子ＤＮＡなど）を含有する水溶液を含み得る。
「試料」という用語は、その最も広義に使用される。ある意味では、試料は、動物細胞または組織を指し得る。別の意味では、試料は、任意の供給源から得られた標本または培養物、ならびに生体試料及び環境試料を指す。生体試料は、植物または動物（ヒトを含む）から得ることができ、流体、固体、組織、及び気体を包含する。環境試料には、表面物質、土壌、水、及び工業試料などの環境物質が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料のタイプを限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「遠隔試料」は、いくつかの文脈で使用される場合、試料の細胞、組織、または器官の供給源ではない部位から間接的に収集される試料に関する。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、本技術によって提供される様々な試験に供される生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。より一層好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに診断方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び動物対象の両方を含む。したがって、獣医学的な治療的使用が本明細書で提供される。したがって、本技術により、ヒトなどの哺乳動物、加えてアムールトラなどの絶滅の危機に瀕しているために重要である哺乳動物、ヒトによる消費のために農場で飼育されている動物などの経済的に重要である哺乳動物、及び／またはペットとして、もしくは動物園で飼育されている動物などのヒトにとって社会的に重要である動物などの診断が可能となる。そのような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物；ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ、及びイノシシを含むブタ（ｓｗｉｎｅ）；ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなどの反芻動物及び／または有蹄動物；鰭脚類；ならびにウマが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）などを含むがこれらに限定されない家畜の診断及び治療もまた、提供される。本明細書で開示される主題は、対象の肺癌を診断するためのシステムをさらに含む。このシステムは、例えば、生体試料が収集されている対象における肺癌リスクについてスクリーニングするために、または肺癌を診断するために使用され得る、市販のキットとして提供され得る。本技術に従って提供される例示的なシステムは、本明細書に記載のマーカーのメチル化状態を評価することを含む。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイとの関連において、そのような送達システムは、ある位置から別の位置への反応試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）及び／または支持物質（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための書面による説明書など）の保管、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットには、関連する反応試薬及び／または支持物質を含有する１つ以上の封入容器（例えば、箱）が含まれる。本明細書で使用される場合、「細分化キット」という用語は、２つ以上の別個の容器を含み、その各々がキットの全構成要素の小部分を含有する、送達システムを指す。この容器は、一緒にまたは別々に目的のレシピエントに送達されてもよい。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含有し得、一方で第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含有する。「細分化キット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法のセクション５２０（ｅ）の下で規制される分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含することを意図するが、これに限定されない。実際、２つ以上の別個の容器を含み、その各々がキットの全構成要素の小部分を含有する任意の送達システムが、「細分化キット」という用語に含まれる。対照的に、「複合キット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一容器中に（例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱中に）含有する送達システムを指す。「キット」という用語は、細分化キット及び複合キットの両方を含む。
本明細書で使用される場合、「情報」という用語は、事実またはデータの任意の集合を指す。インターネットを含むがこれに限定されないコンピュータシステム（複数可）を使用して保存または処理される情報に関して、この用語は、任意の形式（例えば、アナログ、デジタル、光学など）で保存される任意のデータを指す。本明細書で使用される場合、「対象に関連する情報」という用語は、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、核酸配列、遺伝子、メチル化パーセンテージ、対立遺伝子頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型に関連する表現型などを含むがこれらに限定されない、ゲノムに関する情報を指す。「対立遺伝子頻度情報」は、対立遺伝子識別情報、対立遺伝子の存在と対象（例えば、ヒト対象）の特徴との間の統計的相関、個体または集団における対立遺伝子の存在または欠如、１つ以上の特定の特徴を有する個体中に存在する対立遺伝子のパーセンテージ尤度などを含むがこれらに限定されない、対立遺伝子頻度に関する事実またはデータを指す。
詳細な説明
様々な実施形態のこの詳細な説明において、説明のために、多数の具体的な詳細が、開示される実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者は、これらの様々な実施形態が、これらの具体的な詳細の有無にかかわらず実施され得ることを理解するであろう。他の場合では、構造及び機構は、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、方法が提示かつ実施される特定の順序は例示的なものであると容易に理解することができ、また、順序は変更することができるが、依然として本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内であることが企図される。
様々な実施形態のこの詳細な説明において、説明のために、多数の具体的な詳細が、開示される実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者は、これらの様々な実施形態が、これらの具体的な詳細の有無にかかわらず実施され得ることを理解するであろう。他の場合では、構造及び機構は、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、方法が提示かつ実施される特定の順序は例示的なものであると容易に理解することができ、また、順序は変更することができるが、依然として本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内であることが企図される。
本明細書で提供されるのは、ＰＤＡＣスクリーニングのための技術であり、限定するものではないが、特に、ＰＤＡＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途である。本技術が本明細書に記載される場合、使用されるセクションの見出しは構成目的のみのものであり、いかなる意味においても主題を限定すると解釈されるべきではない。
実際、実施例１に記載されるように、本発明に関する実施形態を同定する過程中に行われた実験により、ＰＤＡＣを非腫瘍性対照ＤＮＡと識別するための１３箇所の可変メチル化領域（ＤＭＲ）が同定された。
そのような実験により、ａ）血漿試料内でＰＤＡＣと非腫瘍性対照とを区別する（表３、実施例Ｉを参照されたい）、及びｂ）ＰＤＡＣ組織と良性膵組織とを区別する（表４、実施例１を参照されたい）、１３個のＤＮＡメチル化マーカー（ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１）が列挙され記載されている。
そのような実験により、血液試料（例えば、血漿試料、全血試料、白血球試料、血清試料）中でＰＤＡＣを検出するための以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが同定された：
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３、実施例１を参照されたい）。
・ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表３、実施例１を参照されたい）。
そのような実験により、ＰＤＡＣ組織と良性膵組織とを区別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが同定された：
ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表４、実施例１を参照されたい）。
ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１（表４、実施例１を参照されたい）。
本明細書における開示は、ある特定の例示された実施形態を指すが、これらの実施形態は例として提示されているものであり、限定のためではないと理解されるべきである。
特定の態様では、本技術は、ＰＤＡＣなどのがんを同定、判定、及び／または分類するための組成物及び方法を提供する。本方法は、対象から単離された生体試料（例えば、糞便試料、膵組織試料、血漿試料）中の少なくとも１つのメチル化マーカーのメチル化状況を判定することを含み、マーカーのメチル化状態の変化は、ＰＤＡＣの存在、クラス、または部位を示している。特定の実施形態は、ＰＤＡＣの診断（例えば、スクリーニング）に使用される可変メチル化領域（ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１～１３、表１を参照されたい）を含むマーカーに関する。
本明細書で提供され、表１に示されるＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１～１３）を含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のメチル化分析が分析される実施形態に加えて、本技術はまた、がん、特にＰＤＡＣの検出に有用なＤＭＲを含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基を含むマーカーのパネルも提供する。
本技術のいくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のＣｐＧメチル化状況の分析に基づく。
いくつかの実施形態では、本技術は、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）を１つ以上のメチル化アッセイと組み合わせて使用して、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～１３、表１を参照されたい）を含む少なくとも１つのマーカー内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況を判定することを可能にする。ゲノムＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化または非メチル化され得る（あるいは、それぞれ上方メチル化（ｕｐ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）及び下方メチル化（ｄｏｗｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）として知られている）。しかしながら、本発明の方法は、遠隔試料（例えば、血液、器官排出物、または糞便）のバックグラウンド内の、不均質な性質の生体試料、例えば、低濃度の腫瘍細胞、またはそれらからの生体物質の分析に適する。したがって、そのような試料内のＣｐＧ位置のメチル化状況を分析する場合、特定のＣｐＧ位置におけるメチル化のレベル（例えば、パーセント、割合、比、比率、または程度）を判定するための定量アッセイを使用することができる。
本技術によれば、ＤＭＲを含むマーカー中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況の判定は、ＰＤＡＣなどのがんの診断及び特徴付けの両方に有用である。
マーカーの組み合わせ
いくつかの実施形態では、本技術は、表１のＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ番号１～１３）を含むマーカーの組み合わせのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態では、複数のマーカーのメチル化状態を評価することによって、対象における新生物（例えば、ＰＤＡＣ）を同定するためのスクリーニングまたは診断の特異性及び／または感度が向上する。
いくつかの実施形態では、本技術は、表１のＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ番号１～１３）を含むマーカーの組み合わせのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態では、複数のマーカーのメチル化状態を評価することによって、対象における新生物（例えば、ＰＤＡＣ）を同定するためのスクリーニングまたは診断の特異性及び／または感度が向上する。
様々ながんは、例えば、予測の特異性及び感度に関する統計的技術によって同定されるように、マーカーの様々な組み合わせによって予測される。本技術は、いくつかのがんに関する予測組み合わせ及び検証された予測組み合わせを同定するための方法を提供する。
メチル化状態をアッセイするための方法
特定の実施形態では、５－メチルシトシンの存在について核酸を分析する方法は、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬によるＤＮＡの処理を含む。そのような試薬の例としては、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、５－メチルシトシンの存在について核酸を分析する方法は、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬によるＤＮＡの処理を含む。そのような試薬の例としては、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
５－メチルシトシンの存在について核酸を分析するために頻繁に使用される方法は、ＤＮＡ中の５ーメチルシトシンの検出（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－３１、その全体があらゆる目的のために参照より本明細書に明示的に組み込まれる）またはそれらの多様性の検出に関する、Ｆｒｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．によって記載されているバイサルファイト法に基づく。５－メチルシトシンをマッピングするバイサルファイト法は、シトシンが亜硫酸水素イオン（バイサルファイトとしても知られる）と反応する（ただし５－メチルシトシンは反応しない）という知見に基づく。反応は通常、以下のステップに従って実施される：最初に、シトシンが亜硫酸水素塩と反応し、スルホン化シトシンを形成する。次に、スルホン化反応中間体の自発的脱アミノ化が、スルホン化ウラシルを生じさせる。最後に、スルホン化ウラシルが、アルカリ条件下で脱スルホン化され、ウラシルを形成する。ウラシルがアデニンと塩基対合する（このため、チミンのように挙動する）のに対して、５－メチルシトシンはグアニンと塩基対合する（したがって、シトシンのように挙動する）ことから、検出が可能である。これにより、例えば、バイサルファイトゲノムシーケンシング（Ｇｒｉｇｇ Ｇ，＆ Ｃｌａｒｋ Ｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９４）１６：４３１－３６、Ｇｒｉｇｇ Ｇ，ＤＮＡ Ｓｅｑ．（１９９６）６：１８９－９８）、例えば、米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によって、または配列特異的プローブ切断を含むアッセイ、例えば、ＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９、ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号を参照されたい）を使用することによって、メチル化シトシンと非メチル化シトシンとの識別が可能となる。
いくつかの従来技術は、分析対象のＤＮＡをアガロースマトリックスに封入し、それによりＤＮＡの拡散及び復元を防止し（バイサルファイトは一本鎖ＤＮＡのみと反応する）、高速透析により沈殿及び精製ステップを代替することを含む方法に関する（Ｏｌｅｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４－６）。したがって、メチル化状況について個々の細胞を分析し、方法の有用性及び感度を示すことが可能である。５－メチルシトシンを検出するための従来の方法の概要は、Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２５５により提供されている。
バイサルファイト技術は通常、バイサルファイト処理後に既知の核酸の短い特定の断片を増幅し、次いでシーケンシング（Ｏｌｅｋ ＆ Ｗａｌｔｅｒ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２７５－６）またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－３１、ＷＯ９５／００６６９、米国特許第６，２５１，５９４号）のいずれかによって産物をアッセイし、個々のシトシン位置を分析することを含む。いくつかの方法は、酵素消化を使用する（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－４）。ハイブリダイゼーションによる検出もまた、当該技術分野において記載されている（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化検出のためのバイサルファイト技術の使用が記載されている（Ｇｒｉｇｇ ＆ Ｃｌａｒｋ（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６：４３１－６、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．６：３８７－９５、Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：６９５、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５７：２６１－４、ＷＯ９７４６７０５、ＷＯ９５１５３７３）。
様々なメチル化アッセイ手順を、本技術によるバイサルファイト処理と併用することができる。これらのアッセイにより、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態を判定することができる。そのようなアッセイは、他の技術の中でも、バイサルファイト処理核酸のシーケンシング、ＰＣＲ（配列特異的増幅に関して）、サザンブロット分析、及びメチル化特異的制限酵素、例えば、メチル化感受性酵素またはメチル化依存性酵素の使用を含む。
例えば、ゲノムシーケンシングは、バイサルファイト処理を使用することによって、メチル化パターン及び５－メチルシトシン分布の分析用に簡略化されている（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１）。さらに、バイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９により記載されているような、またはＣＯＢＲＡ（複合バイサルファイト制限分析）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）として知られる方法で具体化されているような、メチル化状態の評価に使用される。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析は、少量のゲノムＤＮＡで特定の遺伝子座におけるＤＮＡメチル化レベルを判定するのに有用な、定量メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４，１９９７）。簡潔に述べると、制限酵素消化は、ナトリウムバイサルファイト処理ＤＮＡのＰＣＲ産物中のメチル化依存性配列差を明らかにするために使用される。メチル化依存性配列差は、まず、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１，１９９２）により記載されている手順に従って、標準的なバイサルファイト処理によりゲノムＤＮＡ中に導入される。次いで、バイサルファイト変換ＤＮＡのＰＣＲ増幅を、目的のＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して実施し、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的標識ハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のＤＮＡ試料中のメチル化レベルは、ＤＮＡメチル化レベルの広範囲にわたる直線的な定量手法で、消化されたＰＣＲ産物及び未消化のＰＣＲ産物の相対量によって表される。さらに、この技術は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織試料から得られたＤＮＡに確実に適用され得る。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切な緩衝液、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ用のキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液、スルホン化緩衝液、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）、脱スルホン化緩衝液、及びＤＮＡ回収成分を挙げることができる。
アッセイ、例えば、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光ベースリアルタイムＰＣＲ技術）（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２，１９９９）が、単独でまたはこれらの方法のうち１つ以上と組み合わせて使用される。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ技術は、バイサルファイト処理ＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づいてメチル化の差を評価する定量法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または増幅プライマーによってカバーされるメチル化特異的ブロッキングプローブ（「ブロッカー」）は、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされている。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用することができる。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、またはバイサルファイト処理ＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位の実質的に任意の群のメチル化状況を評価することができる（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）。簡潔に述べると、ＤＮＡがナトリウムバイサルファイトによって修飾され、非メチル化シトシンがウラシルに変換され（ただし、メチル化シトシンは変換されない）、続いて産物が、非メチル化ＤＮＡと比べてメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅される。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィン包埋試料から抽出されたＤＮＡで実施することができる。ＭＳＰ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するメチル化及び非メチル化ＰＣＲプライマー、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびに特異的プローブを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップ後にさらなる操作を必要としない、蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用する高スループット定量メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）。簡潔に述べると、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、標準的な手順によって、ナトリウムバイサルファイト反応中にメチル化依存性配列差の混合プールに変換されるゲノムＤＮＡの混合試料から始まる（バイサルファイトプロセスは、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、蛍光ベースのＰＣＲは、例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドにオーバーラップするＰＣＲプライマーを用いて「偏った」反応で実施される。配列の識別は、増幅プロセスのレベル及び蛍光検出プロセスのレベルの両方で行われる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンの定量試験として使用され、配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる。定量版では、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位にオーバーラップする蛍光プローブの存在下でメチル化特異的増幅がもたらされる。インプットＤＮＡ量に偏りのない対照は、プライマーもプローブも一切のＣｐＧジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。あるいは、ゲノムメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位をカバーしない対照オリゴヌクレオチド（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技術の蛍光ベース版）または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて、偏ったＰＣＲプールをプロービングすることによって行われる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、任意の適切なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブなど）とともに使用される。例えば、いくつかの用途では、二本鎖ゲノムＤＮＡは、ナトリウムバイサルファイトで処理され、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用した、例えば、ＭＳＰプライマー及び／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチドならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたＰＣＲ反応の２セットのうちの１セットに供される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、ＰＣＲサイクルにおいてこのプローブがフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解するように、比較的高いＧＣ含量領域に特異的となるように設計されている。このことにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中、十分にハイブリダイズし続けることができる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規鎖を酵素的に合成するため、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに最終的に達することになる。次いで、リアルタイム蛍光検出システムを使用して蛍光レポーター分子の現在クエンチされていないシグナルを定量的に検出するために、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化して蛍光レポーター分子を放出することによりこのプローブを取り除く。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＱＭ（商標）（定量メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンの代替定量試験であり、配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる。この定量版では、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位にオーバーラップする蛍光プローブの存在下で偏りのない増幅がもたらされる。インプットＤＮＡ量に偏りのない対照は、プライマーもプローブも一切のＣｐＧジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。あるいは、ゲノムメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位をカバーしない対照オリゴヌクレオチド（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技術の蛍光ベース版）または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて、偏ったＰＣＲプールをプロービングすることによって行われる。
ＱＭ（商標）プロセスは、増幅プロセスにおいて任意の好適なプローブ、例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブとともに使用され得る。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡは、ナトリウムバイサルファイトで処理され、偏りのないプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに供される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、ＰＣＲサイクルにおいてこのプローブがフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解するように、比較的高いＧＣ含量領域に特異的となるように設計されている。このことにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中、十分にハイブリダイズし続けることができる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規鎖を酵素的に合成するため、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに最終的に達することになる。次いで、リアルタイム蛍光検出システムを使用して蛍光レポーター分子の現在クエンチされていないシグナルを定量的に検出するために、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化して蛍光レポーター分子を放出することによりこのプローブを取り除く。ＱＭ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＱＭ（商標）ベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）技術は、ＤＮＡのバイサルファイト処理、その後の単一ヌクレオチドプライマー伸長に基づき、特定のＣｐＧ部位においてメチル化の差を評価するための定量法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）。簡潔に述べると、５－メチルシトシンを変化させないまま、ゲノムＤＮＡをナトリウムバイサルファイトと反応させて非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次いで、所望の標的配列の増幅が、バイサルファイト変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して実施され、得られた産物は単離され、目的のＣｐＧ部位におけるメチル化分析用の鋳型として使用される。少量のＤＮＡを分析することができ（例えば、顕微解剖病理切片）、これによりＣｐＧ部位でメチル化状況を判定するための制限酵素の利用が回避される。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）ベースのキットに見られ得るもの）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー、最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、特定の遺伝子座に対するＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、反応緩衝液（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ反応に関する）、ならびに標識ヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、バイサルファイト変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液、スルホン化緩衝液、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）、脱スルホン化緩衝液、及びＤＮＡ回収成分を挙げることができる。
簡約表示（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）バイサルファイトシーケンシング（ＲＲＢＳ）は、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換するための核酸のバイサルファイト処理から始まり、続いて制限酵素消化（例えば、ＭｓｐＩなどのＣＧ配列を含む部位を認識する酵素による）を行い、アダプターリガンドへの結合後に断片の完全シーケンシングを行う。制限酵素の選択により、ＣｐＧ高密度領域の断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列の数が低減される。したがって、ＲＲＢＳは、シーケンシングのための制限断片サブセットを選択することにより（例えば、調製用ゲル電気泳動を使用したサイズ選択により）、核酸試料の複雑性を低減させる。全ゲノムバイサルファイトシーケンシングとは対照的に、制限酵素消化によって生成される全ての断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのＤＮＡメチル化情報を含有する。したがって、ＲＲＢＳは、プロモーター、ＣｐＧアイランド、及びこれらの領域において高頻度の制限酵素切断部位を有する他のゲノム形質の試料を濃縮し、これにより１つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するためのアッセイを提供する。
ＲＲＢＳの典型的なプロトコルは、ＭｓｐＩなどの制限酵素を用いて核酸試料を消化するステップ、オーバーハングを充填するステップ、及びＡテーリングステップ、アダプターをライゲーションするステップ、バイサルファイト変換ステップ、ならびにＰＣＲステップを含む。例えば、ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１３３－６、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：５８６８－７７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）アッセイは、メチル化状態を評価するために使用される。各ＱｕＡＲＴＳアッセイでは３つの反応が連続して生じ、一次反応には増幅（反応１）及び標的プローブ切断（反応２）が、二次反応にはＦＲＥＴ切断及び蛍光シグナル生成（反応３）が含まれる。標的核酸が特定のプライマーで増幅される場合、フラップ配列を有する特定の検出プローブが、アンプリコンに緩く結合する。標的結合部位における特定の侵入オリゴヌクレオチドの存在により、５’ヌクレアーゼ、例えば、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼが検出プローブとフラップ配列との間を切断することによって、フラップ配列が放出される。フラップ配列は、対応するＦＲＥＴカセットの非ヘアピン部分に相補的である。したがって、フラップ配列は、ＦＲＥＴカセット上で侵入オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットフルオロフォアとクエンチャーとの間に切断をもたらし、蛍光シグナルを生成する。切断反応は、標的ごとに複数のプローブを切断することができ、それによりフラップごとに複数のフルオロフォアを放出して指数関数的なシグナル増幅をもたらす。ＱｕＡＲＴＳは、異なる色素を有するＦＲＥＴカセットを使用することにより、単一反応ウェル中で複数の標的を検出することができる。例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９、ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号中を参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
「バイサルファイト試薬」という用語は、バイサルファイト、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む試薬を指し、本明細書で開示されるように、メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを区別するのに有用である。該処理の方法は、当該技術分野において公知である（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５及びＷＯ２０１３／１１６３７５、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、バイサルファイト処理は、変性溶媒、限定されないが、例えばｎ－アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）存在下で、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、変性溶媒は、１％～３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態では、バイサルファイト反応は、スカベンジャー、限定されないが、例えばクロマン誘導体、例えば、６－ヒドロキシ－２，５，７，８，－テトラメチルクロマン２－カルボン酸またはトリヒドロキシ安息香酸及びそれらの誘導体、例えば、没食子酸などの存在下で実施される（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照されたく、これはその全体が参照により組み込まれる）。特定の好ましい実施形態では、バイサルファイト反応は、例えば、ＷＯ２０１３／１１６３７５に記載されているような亜硫酸水素アンモニウムによる処理を含む。
いくつかの実施形態では、処理されたＤＮＡの断片は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドのセット（例えば、表１０、表１９及び表２０を参照されたい）ならびに増幅酵素を使用して増幅される。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、１つの同じ反応容器中で同時に実施され得る。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施される。アンプリコンは、通常１００～２０００塩基対長である。
本方法の別の実施形態では、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～１３、表１）を含むマーカー内の、またはその近傍のＣｐＧ位置のメチル化状況は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して検出することができる。この技術（ＭＳＰ）は、Ｈｅｒｍａｎの米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。バイサルファイト処理ＤＮＡの増幅のためのメチル化状況特異的プライマーの使用により、メチル化核酸と非メチル化核酸との区別が可能になる。ＭＳＰプライマー対は、バイサルファイト処理ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含有する。したがって、該プライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧ中のＣ位の位置に「Ｔ」を含有する。
増幅によって得られた断片は、直接または間接的に検出可能な標識を保持し得る。いくつかの実施形態では、標識は、質量分析計で検出され得る典型的な質量を有する蛍光標識、放射性核種、または脱離可能な分子断片である。該標識が質量標識である場合、いくつかの実施形態は、標識アンプリコンが単一の正または負の正味電荷を有することにより、質量分析計における良好な検出性を可能にする。検出は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して、実施し可視化することができる。
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡを単離するための方法は、当該技術分野において公知である。特に、いくつかの実施形態は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／４７０，２５１号（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”）に記載されている核酸の単離を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマーカーは、糞便試料で実施されるＱＵＡＲＴＳアッセイに使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料を生成するための方法、特に、高度に精製された低存在量の核酸を少量（例えば、１００マイクロリットル未満、６０マイクロリットル未満）含み、ＤＮＡ試料を試験するために使用されるアッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＩＮＶＡＤＥＲ、ＱｕＡＲＴＳアッセイなど）を阻害する物質を実質的に及び／または効果的に含まないＤＮＡ試料を生成するための方法が、提供される。そのようなＤＮＡ試料は、患者から採取した試料中に存在する遺伝子、遺伝子バリアント（例えば、対立遺伝子）、または遺伝子修飾（例えば、メチル化）の存在を定性的に検出するか、またはその活性、発現、もしくは量を定量的に測定する診断アッセイに使用される。例えば、一部のがんは、特定の突然変異対立遺伝子または特定のメチル化状態の存在と相関しており、したがって、そのような突然変異対立遺伝子またはメチル化状態の検出及び／または定量は、がんの診断及び治療において予測的価値を有する。
多くの有益な遺伝子マーカーは、試料中に極めて少量で存在し、そのようなマーカーを生成する事象の多くは稀なものである。結果として、ＰＣＲなどの高感度の検出方法でさえ、アッセイの検出閾値を満たすか、またはそれを無効にするように低存在量の標的を十分に提供するには、多量のＤＮＡを必要とする。さらに、少量であっても阻害物質の存在は、そのような少量の標的の検出を目的としたこれらのアッセイの正確度及び精度を損なう。したがって、本明細書で提供されるのは、そのようなＤＮＡ試料を生成するための、体積及び濃度の必要な管理を提供する方法である。
いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、白血球、血漿、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。そのような試料は、当業者には明らかとなるものなどの当該技術分野において公知の、任意数の手段によって得ることができる。無細胞または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及び濾過を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々な技術に試料を供することによって得ることができる。侵襲的技術を使用せずに試料を得ることが一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織切片、及び生検標本などの試料を得ることが依然として好ましい場合もある。本技術は、試料を調製するため、及び試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、直接的遺伝子捕捉、例えば、米国特許第８，８０８，９９０号及び同第９，１６９，５１１号に、ならびにＷＯ２０１２／１５５０７２に詳述されているものを使用して、または関連する方法によって糞便試料から、または血液から、または血漿試料から単離される。
マーカーの分析は、１つの試験試料内で追加のマーカーと別個にまたは同時に実施され得る。例えば、いくつかのマーカーは、複数の試料を効率的に処理するために、かつ診断及び／または予後のより高い精度を提供する可能性のために、１つの試験に組み合わされ得る。さらに、当業者は、同じ対象からの複数の試料を（例えば、連続的な時点で）試験する価値を認識するであろう。一連の試料のそのような試験により、マーカーのメチル化状態の経時的な変化を同定することが可能になる。メチル化状態の変化に加えて、メチル化状態の変化の欠如は、事象開始からのおおよその時間の同定、回復可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性、ならびに将来の事象のリスクを含む対象の転帰の同定を含むがこれらに限定されない、疾患状態に関する有用な情報を提供し得る。
バイオマーカーの分析は、様々な物理的形式で実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用され得る。あるいは、単一の試料形式は、適時に、例えば、外来搬送または緊急救命室の現場において即時の治療及び診断を容易にするために開発され得る。
本技術の実施形態は、キットの形態で提供されることが企図される。キットは、本明細書に記載の組成物、デバイス、装置など、及びキットの使用に関する説明書の実施形態を含む。そのような説明書は、試料から分析物を調製するための適切な方法、例えば、試料を収集し、その試料から核酸を調製するための方法について記載する。キットの個々の構成要素は、適切な容器及びパッケージング（例えば、バイアル、箱、ブリスターパック、アンプル、瓶、ボトル、チューブなど）に包装され、構成要素は、簡便な保存、輸送、及び／またはキットのユーザーによる使用のために適切な容器（例えば、箱（複数可））中に一緒に包装される。液体構成要素（例えば、緩衝液）は、ユーザーによって再構成される凍結乾燥形態で提供されてもよいことが理解される。キットは、キットの性能を評価、検証、及び／または保証するための対照または参照を含んでよい。例えば、試料中に存在する核酸の量をアッセイするためのキットは、既知濃度の同じまたは別の核酸を比較のために含む対照を含んでよく、いくつかの実施形態では、対照核酸に特異的な検出試薬（例えば、プライマー）を含んでよい。キットは、臨床現場での使用に、及びいくつかの実施形態では、ユーザーの自宅での使用に適している。キットの構成要素は、いくつかの実施形態では、試料から核酸溶液を調製するためのシステムの機能を提供する。いくつかの実施形態では、システムの特定の構成要素は、ユーザーによって提供される。
方法
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）対象から得られた核酸（例えば、血液試料（例えば、血漿試料、全血試料、白血球試料、血清試料）から単離された、例えば、ゲノムＤＮＡ）を、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも１つのマーカー内の、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
２）ＰＤＡＣを検出する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で得られる）ステップ、を含む方法が提供される。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）対象から得られた核酸（例えば、血液試料（例えば、血漿試料、全血試料、白血球試料、血清試料）から単離された、例えば、ゲノムＤＮＡ）を、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも１つのマーカー内の、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
２）ＰＤＡＣを検出する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で得られる）ステップ、を含む方法が提供される。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）対象から得られた核酸（例えば、膵組織から単離された、例えば、ゲノムＤＮＡ）を、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも１つのマーカー内の、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
２）ＰＤＡＣを検出する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で得られる）ステップ、を含む方法が提供される。
１）対象から得られた核酸（例えば、膵組織から単離された、例えば、ゲノムＤＮＡ）を、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも１つのマーカー内の、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
２）ＰＤＡＣを検出する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で得られる）ステップ、を含む方法が提供される。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）生体試料中のゲノムＤＮＡをメチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬（例えば、ここで試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素である）で処理することを通じて、ヒト個体の生体試料における１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを測定するステップであって、１つ以上の遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１のうちの１つから選択される、測定するステップ；
２）選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、処理したゲノムＤＮＡを増幅するステップ；ならびに
３）ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉によって、１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを判定するステップ、を含む方法が提供される。
１）生体試料中のゲノムＤＮＡをメチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬（例えば、ここで試薬は、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素である）で処理することを通じて、ヒト個体の生体試料における１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを測定するステップであって、１つ以上の遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１のうちの１つから選択される、測定するステップ；
２）選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、処理したゲノムＤＮＡを増幅するステップ；ならびに
３）ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉によって、１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを判定するステップ、を含む方法が提供される。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）試料からのＤＮＡ中の少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定するステップであって、１つ以上の遺伝子がＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される、測定するステップ；
２）ＤＮＡ中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定するステップ；ならびに
３）ＤＮＡ中で測定された少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量の値を、ＤＮＡ中で測定された参照マーカー遺伝子の量のパーセンテージとして算出するステップであって、この値が、試料中で測定された少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す、算出するステップ、を含む方法が提供される。
１）試料からのＤＮＡ中の少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定するステップであって、１つ以上の遺伝子がＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される、測定するステップ；
２）ＤＮＡ中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定するステップ；ならびに
３）ＤＮＡ中で測定された少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量の値を、ＤＮＡ中で測定された参照マーカー遺伝子の量のパーセンテージとして算出するステップであって、この値が、試料中で測定された少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す、算出するステップ、を含む方法が提供される。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップ：
１）生体試料中のゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬であるバイサルファイト（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）で処理することを通じて、ヒト個体の生体試料における１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定するステップ；
２）選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、修飾したゲノムＤＮＡを増幅するステップ；ならびに
３）メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、またはバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲによって、ＣｐＧ部位のメチル化レベルを判定するステップ、を含み、
ここで、１つ以上の遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される、方法が提供される。
１）生体試料中のゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬であるバイサルファイト（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬）で処理することを通じて、ヒト個体の生体試料における１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定するステップ；
２）選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、修飾したゲノムＤＮＡを増幅するステップ；ならびに
３）メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、またはバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲによって、ＣｐＧ部位のメチル化レベルを判定するステップ、を含み、
ここで、１つ以上の遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される、方法が提供される。
好ましくは、そのような方法の感度は、約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、または約８０％～約８５％である。好ましくは、特異性は、約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、または約８０％～約８５％である。
ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、任意の手段によって単離することができる。簡潔に述べると、目的のＤＮＡが細胞膜によって被包されている場合、生体試料を酵素的、化学的または機械的手段によって破壊し溶解しなければならない。次いで、例えば、プロテイナーゼＫで消化することにより、タンパク質及び他の混入物をＤＮＡ溶液から除去することができる。次いで、ゲノムＤＮＡを溶液から回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む、様々な方法によって実施することができる。方法の選択は、時間、費用、及びＤＮＡの必要量を含む、いくつかの要因に影響される。腫瘍性物質または前腫瘍性物質を含む全ての臨床試料タイプ、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、乳房組織、膵組織、白血球、結腸排出物、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞、及びこれらの組み合わせが、本方法における使用に好適である。
本技術は、試料を調製するため、及び試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、直接的遺伝子捕捉、例えば、米国特許出願第６１／４８５３８６号に詳述されているものを使用して、または関連方法によって糞便試料から、または血液から、または血漿試料から単離される。
次いで、ゲノムＤＮＡ試料を、ＤＭＲ（例えば、表１に示される通りの、例えば、ＤＭＲ１～１３）を含む少なくとも１つのマーカー内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する、少なくとも１つの試薬、または一連の試薬で処理する。
いくつかの実施形態では、試薬は、５’位でメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換する。しかしながら、いくつかの実施形態では、試薬は、メチル化感受性制限酵素であり得る。
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ試料を、５’位でメチル化されていないシトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換されるような形で処理する。いくつかの実施形態では、この処理は、バイサルファイト（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）、続いてアルカリ加水分解で実施される。
次いで、処理した核酸を分析し、標的遺伝子配列（ＤＭＲ、例えば、表１に示される通りのＤＭＲ１～１３から選択される少なくとも１箇所のＤＭＲを含むマーカーからの少なくとも１つの遺伝子、ゲノム配列、またはヌクレオチド）のメチル化状態を判定する。分析の方法は、本明細書に示されるもの、例えば、本明細書に記載のＱｕＡＲＴＳ及びＭＳＰを含む、当該技術分野において公知のものから選択することができる。
異常なメチル化、より具体的には、ＤＭＲ（例えば、表１に示される通りのＤＭＲ１～１３）を含むマーカーの高メチル化は、ＰＤＡＣに関連している。
本技術は、ＰＤＡＣに関連するあらゆる試料の分析に関する。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、患者から得られた組織及び／または体液を含む。いくつかの実施形態では、試料は、分泌物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、胃分泌物、膵液、胃腸生検試料、乳房生検からの顕微解剖細胞、及び／または糞便から回収した細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、膵組織を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。試料には、子宮内膜、乳房、肝臓、胆管、膵臓、胃、結腸、直腸、食道、小腸、虫垂、十二指腸、ポリープ、胆嚢、肛門、及び／または腹膜からの細胞、分泌物、または組織が含まれ得る。いくつかの実施形態では、試料は、細胞液、腹水、尿、糞便、膵液、内視鏡検査中に得られた液体、血液、粘液、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料である。いくつかの実施形態では、試料は、膵組織試料である。
そのような試料は、当業者には明らかとなるものなどの当該技術分野において公知の、任意数の手段によって得ることができる。例えば、尿及び糞便試料は、容易に入手可能であるが、血液、腹水、血清、または膵液試料は、例えば、ニードル及びシリンジを使用することによって非経口的に得ることができる。無細胞または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及び濾過を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々な技術に試料を供することによって得ることができる。侵襲的技術を使用せずに試料を得ることが一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織切片、及び生検標本などの試料を得ることが依然として好ましい場合もある。
いくつかの実施形態では、本技術は、患者（例えば、ＰＤＡＣを有する患者）を治療する方法に関し、本方法は、本明細書で提供される１箇所以上のＤＭＲのメチル化状態を判定すること、及びメチル化状態を判定する結果に基づいて患者に治療を施すことを含む。治療は、医薬化合物の投与、ワクチンの投与、外科手術の実施、患者のイメージング、別の試験の実施であり得る。好ましくは、該使用は、臨床スクリーニングの方法、予後評価の方法、療法の結果をモニタリングする方法、特定の治療的処置に応答する可能性が最も高い患者を同定する方法、患者または対象をイメージングする方法、ならびに薬物のスクリーニング及び開発のための方法におけるものである。
本技術のいくつかの実施形態では、対象のＰＤＡＣを診断するための方法が提供される。「診断する」及び「診断」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が所与の疾患もしくは状態に罹患しているか否か、または将来的に所与の疾患もしくは状態を発症する可能性があるか否かを、当業者が推定し、さらに判定することができる方法を指す。当業者は多くの場合、１つ以上の診断指標、例えば、バイオマーカー（例えば、本明細書で開示されるＤＭＲ）などに基づいて診断を行い、そのメチル化状態は、状態の存在、重症度、または欠如を示している。
診断に加えて、臨床的ながん予後は、がんの攻撃性及び腫瘍再発の可能性を判定し、最も効果的な療法を計画することに関する。より正確な予後を行うことができるか、またはさらにはがんを発症する潜在的リスクを評価することができる場合、適切な療法、及び場合によっては、患者にとって比較的苛酷ではない療法を選択することができる。がんバイオマーカーの評価（例えば、メチル化状態を判定すること）は、良好な予後を有し、及び／またはがんを発症するリスクが低く、療法を必要としないかまたは限定的な療法を必要とする対象と、がんを発症するかまたはがんを再発する可能性がより高く、より強力な治療から恩恵を受ける可能性がある対象とを分けるのに有用である。
したがって、「診断を行う」または「診断する」は、本明細書で使用される場合、がんを発症するリスクを判定すること、または予後を判定することをさらに含み、これは、本明細書に開示される診断バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）の尺度に基づいて、臨床転帰（医学的治療の有無にかかわらず）を予測すること、適切な治療（もしくは治療が効果的であるかどうか）を選択すること、または現在の治療をモニタリングし、場合により治療を変更することを可能にし得る。さらに、本明細書に開示される主題のいくつかの実施形態では、診断及び／または予後を容易にするために、経時的なバイオマーカーの複数の判定を行うことができる。バイオマーカーの時間的変化を使用して、臨床転帰を予測し、ＰＤＡＣの進行をモニタリングし、及び／またはがんを対象とする適切な療法の有効性をモニタリングすることができる。そのような実施形態では、例えば、効果的な療法の過程において経時的に、生体試料中の本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）（及びモニタリングされる場合、場合により１つ以上の追加のバイオマーカー（複数可））のメチル化状態の変化を確認することが予期され得る。
本明細書で開示される主題は、いくつかの実施形態では、対象のがんの予防または治療を開始または継続するか否かを判定するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ある期間にわたって対象から一連の生体試料を得ること、一連の生体試料を分析し、生体試料の各々において本明細書に開示される少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態を判定すること、及び生体試料の各々においてバイオマーカーのうちの１つ以上のメチル化状態における任意の測定可能な変化を比較することを含む。ある期間にわたるバイオマーカーのメチル化状態におけるいずれの変化も、がんを発症するリスクを予測するため、臨床転帰を予測するため、がんの予防または療法を開始または継続するか否か、及び現在の療法ががんを効果的に治療しているか否かを判定するために使用することができる。例えば、第１の時点は、治療の開始前に選択することができ、第２の時点は、治療開始後のある時点で選択することができる。メチル化状態は、異なる時点で採取された試料の各々で測定することができ、定性的及び／または定量的な差を記録する。異なる試料からのバイオマーカーレベルのメチル化状態における変化は、対象におけるＰＤＡＣリスク、予後、治療有効性の判定、及び／またはがんの進行と相関し得る。
好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、早期での、例えば、疾患の症状が現れる前の疾患の治療または診断のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、臨床ステージでの疾患の治療または診断のためのものである。
既に述べたように、いくつかの実施形態では、１つ以上の診断バイオマーカーまたは予後バイオマーカーの複数の判定を行うことができ、マーカーの時間的変化を使用して、診断または予後を判定することができる。例えば、診断マーカーは、初回に判定することができ、２回目に再度判定することができる。そのような実施形態では、初回から２回目でのマーカーの増加は、がんの特定のタイプもしくは重症度、または所与の予後を診断し得る。同様に、初回から２回目でのマーカーの減少は、がんの特定のタイプもしくは重症度、または所与の予後を示し得る。さらに、１つ以上のマーカーの変化の程度は、がんの重症度及び将来の有害事象に関連し得る。当業者は、特定の実施形態では、同じバイオマーカーの比較測定が複数の時点で行われ得るが、所与のバイオマーカーをある時点で、及び第２のバイオマーカーを第２の時点で測定することもでき、これらのマーカーの比較により診断情報がもたらされ得ることを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「予後を判定する」という語句は、当業者が対象の状態の経過または転帰を予測することができる方法を指す。「予後」という用語は、１００％の精度で状態の経過または転帰を予測する能力、またはさらには所与の経過または転帰が、バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態に基づいて生じる可能性が予想通りに高い、もしくは低いことを予測する能力を指すわけではない。その代わりに、当業者は、「予後」という用語が、ある特定の経過または転帰が生じる確率の上昇、すなわち、経過または転帰が、所与の状態を呈する対象において、その状態を呈さない個体と比較した場合に生じる可能性がより高いことを指すと理解するであろう。例えば、状態を呈さない（例えば、１箇所以上のＤＭＲの正常なメチル化状態を有する）個体では、所与の転帰（例えば、ＰＤＡＣに罹患すること）の可能性が極めて低い場合がある。
いくつかの実施形態では、統計分析は、予後指標を有害転帰に対する素因と関連付ける。例えば、いくつかの実施形態では、がんを有しない患者から得られた正常対照試料におけるものとは異なるメチル化状態は、統計的有意性のレベルによって判定した場合、対象が、対照試料におけるメチル化状態により類似したレベルを有する対象よりも、がんに罹患する可能性が高いことを示し得る。さらに、ベースライン（例えば、「正常」）レベルからのメチル化状態の変化は、対象の予後を反映し得、メチル化状態における変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合に２つ以上の集団を比較して、信頼区間及び／またはｐ値を判定することによって判定される。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照されたい。本主題の例示的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％及び９９．９９％であり、一方、例示的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。
他の実施形態では、本明細書に開示される予後または診断バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態における変化の閾値の程度を確立することができ、生体試料中のバイオマーカーのメチル化状態における変化の程度は、メチル化状態における変化の閾値の程度と単に比較される。本明細書で提供されるバイオマーカーのメチル化状態における好ましい閾値の変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、及び約１５０％である。さらに他の実施形態では、「ノモグラム」を確立することができ、これにより予後または診断指標（バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ）のメチル化状態が、所与の転帰に対して関連付けられる素因に直接関連する。集団平均値ではなく個々の試料測定値が参照されるため、当業者は、そのようなノモグラムを使用して、この測定値の不確実性がマーカー濃度の不確実性と同じであることを理解した上で、２つの数値を関連付けることに精通している。
いくつかの実施形態では、対照試料は生体試料と同時に分析され、それにより、生体試料から得られた結果を対照試料から得られた結果と比較することができる。さらに、標準曲線を提供することができ、標準曲線と生体試料のアッセイ結果を比較することができることが企図される。そのような標準曲線は、アッセイ単位に応じたバイオマーカーのメチル化状態、例えば、蛍光標識が使用される場合、蛍光シグナル強度を提示する。複数のドナーから採取した試料を使用して、正常組織における１つ以上のバイオマーカーの対照メチル化状態について、及び異形成を有するドナーから、またはＰＤＡＣを有するドナーから採取した組織における１つ以上のバイオマーカーの「リスクがある」レベルについて、標準曲線を得ることができる。本方法の特定の実施形態では、対象は、対象から得られた生体試料において、本明細書で提供される１箇所以上のＤＭＲの異常なメチル化状態が同定されると、異形成を有すると同定される。本方法の他の実施形態では、対象から得られた生体試料におけるそのようなバイオマーカーのうちの１つ以上の異常なメチル化状態の検出により、対象はがんを有すると同定される。
マーカーの分析は、１つの試験試料内で追加のマーカーと別個にまたは同時に実施され得る。例えば、いくつかのマーカーは、複数の試料を効率的に処理するために、かつ診断及び／または予後のより高い精度を提供する可能性のために、１つの試験に組み合わされ得る。さらに、当業者は、同じ対象からの複数の試料を（例えば、連続的な時点で）試験する価値を認識するであろう。一連の試料のそのような試験により、マーカーのメチル化状態の経時的な変化を同定することが可能になる。メチル化状態の変化に加えて、メチル化状態の変化の欠如は、事象開始からのおおよその時間の同定、回復可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性、ならびに将来の事象のリスクを含む対象の転帰の同定を含むがこれらに限定されない、疾患状態に関する有用な情報を提供し得る。
バイオマーカーの分析は、様々な物理的形式で実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用され得る。あるいは、単一の試料形式は、適時に、例えば、外来搬送または緊急救命室の現場において即時の治療及び診断を容易にするために開発され得る。
いくつかの実施形態では、対象は、対照メチル化状態と比較した場合、試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な差が存在する場合にＰＤＡＣを有すると診断される。逆に、生体試料中のメチル化状態に変化がないと同定される場合、対象は、ＰＤＡＣを有していないか、がんのリスクがないか、またはがんのリスクが低いと同定され得る。これに関して、がんまたはそのリスクを有する対象は、がんまたはそのリスクが低い対象からそれらを実質的に有しない対象までとは区別され得る。ＰＤＡＣを発症するリスクを有するそれらの対象は、内視鏡サーベイランスを含む、より集中的及び／または定期的なスクリーニングスケジュールに置かれ得る。他方、リスクが低い対象から実質的にリスクを有しない対象は、将来のスクリーニング、例えば、本技術に従って行われるスクリーニングによりＰＤＡＣのリスクがそれらの対象に現れたことが示されるまで、ＰＤＡＣに関する追加試験（例えば、侵襲的手順）に供されるのを回避することができる。
前述の通り、本技術の方法の実施形態に応じて、１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態における変化を検出することは、定性的判定であり得るか、またはそれは定量的判定であり得る。したがって、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣを発症するリスクがあると対象を診断するステップは、ある特定の閾値測定が行われること、例えば、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態が、所定の対照メチル化状態とは異なることを示す。本方法のいくつかの実施形態では、対照メチル化状態は、バイオマーカーの任意の検出可能なメチル化状態である。対照試料が生体試料と同時に試験される方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、対照試料におけるメチル化状態である。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、標準曲線に基づいて、及び／または標準曲線によって同定される。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、特異的な状態または状態の範囲である。したがって、所定のメチル化状態は、当業者には明らかとなる許容可能な限度内で、実施される方法の実施形態及び所望の特異性などに一部基づいて選択され得る。
さらに診断方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び動物対象の両方を含む。したがって、獣医学的な治療的使用が本明細書で提供される。したがって、本技術により、ヒトなどの哺乳動物、加えてアムールトラなどの絶滅の危機に瀕しているために重要である哺乳動物、ヒトによる消費のために農場で飼育されている動物などの経済的に重要である哺乳動物、及び／またはペットとして、もしくは動物園で飼育されている動物などのヒトにとって社会的に重要である動物などの診断が可能となる。そのような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物；ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ、及びイノシシを含むブタ（ｓｗｉｎｅ）；ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなどの反芻動物及び／または有蹄動物；ならびにウマが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）などを含むがこれらに限定されない家畜の診断及び治療もまた、提供される。
本明細書で開示される主題は、対象のＰＤＡＣを診断するためのシステムをさらに含む。このシステムは、例えば、生体試料が収集されている対象におけるＰＤＡＣのリスクについてスクリーニングするために、またはＰＤＡＣを診断するために使用され得る、市販のキットとして提供され得る。本技術に従って提供される例示的なシステムは、表１に示される通りのＤＭＲのメチル化状態を評価することを含む。
実施例Ｉ．
本実施例では、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を検出するための血漿マーカーの同定について説明する。
本実施例では、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を検出するための血漿マーカーの同定について説明する。
１３個のメチル化ＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）を、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を検出するための血漿マーカーの同定に利用した（表１を参照されたい）。
表１に示す１３個のＭＤＭは、次世代バイサルファイトシーケンシングを使用した早期膵癌組織実験から生じた（Ｋｉｓｉｅｌ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５ Ｏｃｔ １；２１（１９）：４４７３－８１を参照されたい）。簡潔に述べると、これらのデータのリマイニングから、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、誤検出、症例と対照間の相対メチル化率及び絶対メチル化率の差、ＤＭＲ内のＣｐＧ密度、ならびに（症例における）隣接残基の均一な連続的共メチル化の存在、を含む選択基準の組み合わせに基づいて、数百の可変メチル化領域（ＤＭＲ）を同定した。独立した組織試料のより大きなセットに対して感度及び特異性の高い標的化化学作用（定量的メチル化特異的ＰＣＲなど）を使用したその後の検証により、マーカーのさらなる改良が可能となった。そのような選択により、２０～３０個の潜在的なＭＤＭが得られ、その大部分は、ゲノムブラウザトラックから決定した推定または既知の調節領域にマッピングされた。遺伝子産物の多くは、規定の腫瘍形成経路で作用し、プロモーター結合転写因子、エンハンサー、細胞シグナル伝達メディエーター、成長因子、及びイオンチャネルタンパク質としての機能を有していた。正式な血漿試験に使用可能な極めて高性能な判別アッセイ（個別及び補完的）のサブセットを定義するために、追加の実験を行った。この目的のために、新生物形成のない対照血漿のプールで追加の試験を実施し、定常状態の循環ｃｆＤＮＡから増幅したＭＤＭを取り除いた（極めて重要なステップである）。これにより、表１に示す１３個のＭＤＭを得た。表２は、表１に列挙した１３個のＭＤＭのプライマー及びプローブの情報を示し、図１は、表１に列挙した１３個のＭＤＭに使用されるマーカー染色体領域ならびに関連するプライマー及びプローブの情報をさらに示す。
１３個のＭＤＭのこのパネルを、ＰＤＡＣと診断された患者２６名の血漿試料のセット（Ｎ＝２６；Ｓ－Ｉが４、Ｓ－ＩＩが１１、Ｓ－ＩＩＩが６、Ｓ－ＩＶが５）及び正常なＥＤＴＡ血漿試料（Ｎ＝２６）で試験した。表３は、各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）、倍率変化、ｐ値、メチル化パーセンテージを示す。１３個のマーカーパネルは、１００％の特異性で、ステージ１及びステージ４のＰＤＡＣ癌を全て検出し、ＰＤＡＣステージ２及びＰＤＡＣステージ３の癌のそれぞれについて１つを除き全て検出した。さらに、この１３個のＭＤＭのパネルを、良性組織と比較したＰＤＡＣ組織試料のセットで試験し（表４）、バフィーコートと比較したＰＤＡＣ組織試料のセットで試験した（表５）。
ＰＤＡＣを検出するための唯一の臨床的に利用可能な血液バイオマーカーは、ＣＡ１９－９である。ＣＡ１９－９は、早期のＰＤＡＣ検出には信頼性がなく、進行した疾患では正常であり得る。次に、ＣＡ１９－９を用いる場合または用いない場合の表１に示す１３個のマーカーの精度を試験して、ＰＤＡＣ症例と年齢及び性別を釣り合わせた対照患者とを識別するための実験を行った。
１３個のマーカーを用いた全てのアッセイを、標的濃縮ロングプローブ定量的増幅シグナル（ＴＥＬＱＡＳ）試験によって盲検的に実施した（Ｋｉｓｉｅｌ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１８ Ａｕｇ ３１を参照されたい）。簡潔に述べると、ＴＥＬＱＡＳオリゴ（フォワード侵入プライマー、リバースプライマー、フラッププローブ）を、各１３箇所のＤＭＲ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）内のＣｐＧモチーフに対して設計した。マーカーならびにＢ３ＧＡＬＴ６（参照遺伝子）及びＲＡＳＳＦ１（ゼブラフィッシュプロセシング対照）の１２サイクルのマルチプレックス増幅を実施した。次いで、産物をＴＥ緩衝液で１０倍に希釈した。１０μＬの希釈アンプリコンをトリプレックス形式（ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｑｕａｓａｒ ６７０）で使用し、２つのマーカーに加えてＢ３ＧＡＬＴ６参照遺伝子を増幅して定量化した。ＴＥＬＱＡＳ反応を、ＡＢＩ ７５００ＤＸ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）で実施した。
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）分析装置でＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ｍａｐ Ｋｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＣＡ１９－９を血漿試料から定量化した。簡潔に述べると、キットに含まれている血清マトリックスを希釈剤として使用して、血漿試料を１：６に希釈した。免疫アッセイでは、ＣＡ１９－９抗体固定化磁気ビーズのみを使用した。キット試薬に付属のプロトコルを使用してアッセイを完了した。各試料の定量結果を、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）ソフトウェアを使用して蛍光強度シグナル中央値から生成した。
３４０個の血漿試料（ＰＤＡＣ症例１７０個、対照１７０個）から、実験ではまず、１２０例の進行期のＰＤＡＣ症例（ステージ３が６０例、ステージ４が６０例）及び１２０例の健常対照において定量的ＭＤＭ及びＣＡ１９－９レベルを使用して、９７．５％の特異性でランダムフォレスト（ｒＦｏｒｅｓｔ）モデリングによる予測アルゴリズムをトレーニングした。次いで、ロックされたアルゴリズムを、５０例の早期ＰＤＡＣ症例（ステージ１が５例、ステージ２が４５例）及び５０例の対照の独立した盲検試験のセットに適用した。続いて、３４０名の患者全員からのデータを集約し、ｒＦｏｒｅｓｔを使用して再適合させた。トレーニング及び試験のためにデータセット全体を２：１にランダムに分割することにより、ＭＤＭパネルを交差検証した。トレーニングセットからの適合させたｒＦｏｒｅｓｔモデルを使用して、試験セットの疾患状態を予測した。５００回の反復後のＡＵＣ中央値を報告した。
１３個のマーカーの曲線下面積の結果を表６に示す。初期トレーニングセットでは、ＭＤＭ－ＣＡ１９－９パネルは、９７．５％の特異性で５４／６０（９０％）のステージ３及び５９／６０（９８％）のステージ４のＰＤＡＣを検出した。これらの進行期症例から得られ、ステージ１及び２のＰＤＡＣならびに対照に適用した曲線下面積ＭＤＭカットオフ値より、ＭＤＭパネルのみで０．８４（９５％ＣＩ ０．７６～０．９２）のＡＵＣ、これに対して組み合わせたＭＤＭ－ＣＡ１９－９パネルで０．９１（０．８４～０．９７）のＡＵＣを得た（ｐ＝０．０３８）。３４０例の症例及び対照全てを合わせると、ＭＤＭ－ＣＡ１９－９パネルの交差検証した感度は、９２％（８１～１００％）の特異性で、ステージ１ＰＤＡＣで７９％、ステージ２ＰＤＡＣで８２％、ステージ３ＰＤＡＣで９４％、ステージ４ＰＤＡＣで９９％であった（図２）。交差検証したＡＵＣは、ＭＤＭパネルのみで０．９（０．８５～０．９４）であったのに対し、組み合わせたＭＤＭ－ＣＡ１９－９パネルでは０．９７（０．９４～０．９９）であった（ｐ＝＜０．０００１）（図３）。全体として、ＰＤＡＣに対する感度は、９２％の特異性で９２％（８３～９８％）であった。このような結果は、ＣＡ１９－９と組み合わせたまたは組み合わせていない表１に示す１３個のＭＤＭが、中程度から高い精度で全てのステージにわたってＰＤＡＣを検出することを示す。
各対象の１０ｃｃの血液をＫ２ＥＤＴＡバキュテナー（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）に収集した。４時間以内に、チューブを１５００×Ｇ（１０分間）で遠心分離し、血漿を除去して二度目の遠心分離を行い、２ｍＬのクライオチューブに分取し、一切断続的に解凍することなく－８０℃で保存した。自動シリカビーズ法を使用して、ｃｆＤＮＡを精製し、バイサルファイト変換した。処理異常を制御するために、非ヒトＤＮＡスパイクを使用した。全ての試料について、３．８ｍＬの血漿を、まずプロテイナーゼＫ処理に供し、続いて界面活性剤及びカオトロピック試薬で溶解した。ＤＮＡ捕捉及びＤＮＡ沈殿のために、シリカをコーティングした結合ビーズ及びイソプロピルアルコール含有溶解緩衝液を各試料に添加した。全ての試料をＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ液体ハンドリングシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ ＮＶ）で複数回洗浄し、結合ビーズを乾燥させてから、溶出緩衝液でＤＮＡ試料を溶出した。次いで、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ液体ハンドリングシステムを使用して、以前に記載されているように（Ｌｉｄｇａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１３；１１：１３１３－１３１８を参照されたい）、試料をバイサルファイト変換した。簡潔に述べると、まず、試料を水酸化ナトリウムで変性させた。脱アミノ化のために、亜硫酸水素アンモニウムを各試料に添加した。続いて、シリカをコーティングした結合ビーズに試料を結合させ、複数回洗浄してから脱スルホン化した。試料の洗浄を繰り返し、精製した試料を溶出緩衝液で溶出した。
試料ｃｆＤＮＡを、高感度マルチプレックスアッセイ形式であるＴＥＬＱＡＳ（ロングプローブ定量的増幅シグナルによる標的濃縮）を使用して試験した。（Ｋｉｓｉｅｌ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１８ Ａｕｇ ３１を参照されたい）。簡潔に述べると、ＴＥＬＱＡＳオリゴ（フォワード侵入プライマー、リバースプライマー、フラッププローブ）を、各１３箇所のＤＭＲ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）内のＣｐＧモチーフに対して設計した。マーカーならびにＢ３ＧＡＬＴ６（参照遺伝子）及びＲＡＳＳＦ１（ゼブラフィッシュプロセシング対照）の１２サイクルのマルチプレックス増幅を実施した。次いで、産物をＴＥ緩衝液で１０倍に希釈した。１０μＬの希釈アンプリコンをトリプレックス形式（ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｑｕａｓａｒ ６７０）で使用し、２つのマーカーに加えてＢ３ＧＡＬＴ６参照遺伝子を増幅して定量化した。ＴＥＬＱＡＳ反応を、ＡＢＩ ７５００ＤＸ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）で実施した。表７は、実施した９つのＬＱＡＳアッセイを示す。全てのＬＱＡＳアッセイを、既に公表されている標準的な条件で設定し実施した。
実施例ＩＩ．
表１に列挙した１３個のＭＤＭのパネルの試験を、ＰＤＡＣと診断された患者１２名で構成されたＬＢｇａｒｄ（Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）血漿試料（Ｎ＝１２；Ｓ－ＩＩが３、Ｓ－ＩＩＩが１、Ｓ－ＩＶが８）、及び２７個の正常な非ＰＤＡＣ血漿試料（Ｎ＝２７）からの収集物でさらに試験した。表８は、試料が対照からのものであるかまたはＰＤＡＣ症例からのものであるかを評価するための名義ロジスティック適合を示す。
表１に列挙した１３個のＭＤＭのパネルの試験を、ＰＤＡＣと診断された患者１２名で構成されたＬＢｇａｒｄ（Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）血漿試料（Ｎ＝１２；Ｓ－ＩＩが３、Ｓ－ＩＩＩが１、Ｓ－ＩＶが８）、及び２７個の正常な非ＰＤＡＣ血漿試料（Ｎ＝２７）からの収集物でさらに試験した。表８は、試料が対照からのものであるかまたはＰＤＡＣ症例からのものであるかを評価するための名義ロジスティック適合を示す。
ここで本発明を十分に説明してきたが、本発明の範囲またはその任意の実施形態に影響を与えることなく、条件、配合、及び他のパラメータの広範囲かつ同等の範囲内で同じものを実施できることが、当業者らには理解されるであろう。本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び出版物は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書で言及される特許文書及び科学論文のそれぞれの開示全体が、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
本明細書で言及される特許文書及び科学論文のそれぞれの開示全体が、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その趣旨またはその本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示と見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の等価の意味及び範囲内にある全ての変更が、そこに包含されることが意図される。
本発明は、その趣旨またはその本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示と見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の等価の意味及び範囲内にある全ての変更が、そこに包含されることが意図される。
Claims (69)
- 生体試料中のゲノムＤＮＡをメチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理すること；
選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、前記処理したゲノムＤＮＡを増幅すること；ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉によって、前記１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを判定すること、
を通じて、ヒト個体の前記生体試料における前記１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを測定すること、
を含む方法であって、
前記１つ以上の遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される、
前記方法。 - 前記ＤＮＡが、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理される、請求項１に記載の方法。
- 前記試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
- 前記ＤＮＡをバイサルファイト試薬で処理し、バイサルファイト処理ＤＮＡを生成する、請求項３に記載の方法。
- 前記測定することが、マルチプレックス増幅を含む、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定することが、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及びバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記試料が、血漿試料、血液試料、または組織試料（例えば、膵組織）のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットが、表２に列挙されている、請求項１に記載の方法。
- 試料を特徴付ける方法であって、
ａ）前記試料からのＤＮＡ中の少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定することであって、前記少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される１つ以上の遺伝子である、前記測定すること；
ｂ）前記ＤＮＡ中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定すること；ならびに
ｃ）前記ＤＮＡ中で測定された前記少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量の値を、前記ＤＮＡ中で測定された前記参照マーカー遺伝子の量のパーセンテージとして算出することであって、前記値が、前記試料中で測定された少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す、前記算出すること、
を含む、前記方法。 - 前記少なくとも１つの参照マーカーが、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡ及びβ－アクチンＤＮＡから選択される１つ以上の参照マーカーを含む、請求項９に記載の方法。
- 前記試料が、血漿試料、血液試料、または組織試料（例えば、膵組織）のうちの１つ以上を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、前記試料から抽出される、請求項９に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理される、請求項９に記載の方法。
- 前記試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及びバイサルファイト試薬のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記ＤＮＡをバイサルファイト試薬で処理し、バイサルファイト処理ＤＮＡを生成する、請求項１４に記載の方法。
- 修飾されたＤＮＡが、前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して増幅される、請求項１４に記載の方法。
- 前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットが、表２に列挙されている、請求項１６に記載の方法。
- メチル化マーカー遺伝子の量を測定することが、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、及び標的捕捉のうちの１つ以上を使用することを含む、請求項９に記載の方法。
- 前記測定することが、マルチプレックス増幅を含む、請求項１８に記載の方法。
- 少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量を測定することが、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及びバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項１８に記載の方法。
- 生体試料を特徴付けるための方法であって、
（ａ）前記生体試料中のゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理すること；
選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを増幅すること；ならびに
メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、またはバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲによって、ＣｐＧ部位のメチル化レベルを判定すること、
を通じて、ヒト個体の前記生体試料における、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される前記１つ以上の遺伝子の前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定すること；
（ｂ）前記メチル化レベルを、ＰＤＡＣを有しない対照試料中の対応する遺伝子のセットのメチル化レベルと比較すること；ならびに
（ｃ）前記１つ以上の遺伝子中で測定されたメチル化レベルが前記対照試料のそれぞれにおいて測定されたメチル化レベルよりも高い場合、前記個体がＰＤＡＣを有すると判定すること、
を含む、前記方法。 - 前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットが、表２に列挙されている、請求項２１に記載の方法。
- 前記生体試料が、血漿試料、血液試料、または組織試料（例えば、膵組織）である、請求項２１に記載の方法。
- 前記１つ以上の遺伝子が、表１に示されるゲノム座標によって記述される、請求項２１に記載の方法。
- 前記ＣｐＧ部位が、コード領域または調節領域に存在する、請求項２１に記載の方法。
- 前記１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することが、前記ＣｐＧ部位のメチル化スコアを判定すること及び前記ＣｐＧ部位のメチル化頻度を判定することからなる群から選択される判定を含む、請求項２１に記載の方法。
- （ａ）生体試料中のゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理すること；
選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを増幅すること；ならびに
メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトパイロシーケンシング、またはバイサルファイトゲノムシーケンシングＰＣＲによって、ＣｐＧ部位のメチル化レベルを判定すること、
を通じて、ヒト個体の前記生体試料における、ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１から選択される前記１つ以上の遺伝子の前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定すること、
を含む、方法。 - 前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットが、表２に列挙されている、請求項２７に記載の方法。
- 前記生体試料が、血漿試料、血液試料、または組織試料（例えば、膵組織）である、請求項２７に記載の方法。
- 前記１つ以上の遺伝子が、表１に示されるゲノム座標によって記述される、請求項２７に記載の方法。
- 前記１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することが、前記ＣｐＧ部位のメチル化スコアを判定すること及び前記ＣｐＧ部位のメチル化頻度を判定することからなる群から選択される判定を含む、請求項２７に記載の方法。
- 対象から得られた試料中のＰＤＡＣについてスクリーニングする方法であって、
１）ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む、ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすること、ならびに
２）前記マーカーの前記メチル化状態がＰＤＡＣを有しない対象においてアッセイされた前記マーカーのメチル化状態と異なる場合、前記対象がＰＤＡＣを有すると同定すること、
を含む、前記方法。 - 複数のマーカーをアッセイすることを含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記マーカーが、高ＣｐＧ密度プロモーター中に存在する、請求項３２に記載の方法。
- 前記試料が、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血漿試料、または尿試料である、請求項３２に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕捉を使用することを含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項３２に記載の方法。
- ヒト患者からの試料を特徴付けるための方法であって、
ａ）ヒト患者の試料からＤＮＡを得ること；
ｂ）ＡＫ０５５９５７、ＣＤ１Ｄ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＦＥＲ１Ｌ４、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９５、ＮＴＲＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＲＹＲ２、ＳＨＩＳＡ９、及びＺＮＦ７８１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む、ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすること；
ｃ）１つ以上の前記ＤＮＡメチル化マーカーのアッセイされたメチル化状態を、ＰＤＡＣを有しないヒト患者の前記１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベル参照と比較すること、
を含む、前記方法。 - 前記試料が、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血漿試料、または尿試料である、請求項３８に記載の方法。
- 複数のＤＮＡメチル化マーカーをアッセイすることを含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕捉を使用することを含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項３８に記載の方法。
- メチル化特異的オリゴヌクレオチドが、表２に列挙されている選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセット、または表２から選択されるプローブから選択される、請求項３８に記載の方法。
- ヒト対象から得られた試料を特徴付けるための方法であって、
ＤＭＲを含む核酸をバイサルファイト試薬と反応させてバイサルファイト反応した核酸を生成すること；
前記バイサルファイト反応した核酸をシーケンシングして前記バイサルファイト反応した核酸のヌクレオチド配列を得ること；
前記バイサルファイト反応した核酸のヌクレオチド配列を、ＰＤＡＣを有しない対象からの前記ＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定すること、
を含む、前記方法。 - ヒト対象から得られた試料を特徴付けるためのシステムであって、
試料のメチル化状態を判定するように構成されている分析コンポーネント、
前記試料のメチル化状態を、データベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及び
メチル化状態の組み合わせに基づいて単一値を判定し、ＰＤＡＣ関連メチル化状態をユーザーに警告するように構成されている警告コンポーネント
を含む、前記システム。 - 前記試料が、ＤＭＲを含む核酸を含む、請求項４５に記載のシステム。
- 核酸を単離するためのコンポーネントをさらに含む、請求項４５に記載のシステム。
- 試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む、請求項４５に記載のシステム。
- 前記試料が、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血漿試料、または尿試料である、請求項４５に記載のシステム。
- 前記データベースが、ＤＭＲを含む核酸配列を含む、請求項４５に記載のシステム。
- 前記データベースが、ＰＤＡＣを有しない対象の核酸配列を含む、請求項４５に記載のシステム。
- １）バイサルファイト試薬と、
２）表１のＤＭＲ１～１３からなる群から選択されるＤＭＲの配列を含み、ＰＤＡＣを有しない対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸と
を含む、キット。 - バイサルファイト試薬と、配列番号１～３９に従うオリゴヌクレオチドとを含む、キット。
- 対象から試料を得るための試料コレクターと、核酸を前記試料から単離するための試薬と、バイサルファイト試薬と、配列番号１～３９に従うオリゴヌクレオチドとを含む、キット。
- 試料が、糞便試料、組織試料、膵組織試料、血漿試料、または尿試料である、請求項５３に記載のキット。
- ＤＭＲを含む核酸と、バイサルファイト試薬とを含む、組成物。
- ＤＭＲを含む核酸と、配列番号１～３９に従うオリゴヌクレオチドとを含む、組成物。
- ＤＭＲを含む核酸と、メチル化感受性制限酵素とを含む、組成物。
- ＤＭＲを含む核酸と、ポリメラーゼとを含む、組成物。
- 対象から得られた試料中のＰＤＡＣについてスクリーニングするための方法であって、
ＤＭＲを含む核酸をバイサルファイト試薬と反応させてバイサルファイト反応した核酸を生成すること；
前記バイサルファイト反応した核酸をシーケンシングして前記バイサルファイト反応した核酸のヌクレオチド配列を得ること；
前記バイサルファイト反応した核酸のヌクレオチド配列を、ＰＤＡＣを有しない対象からの前記ＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定すること；
差が存在する場合、前記対象がＰＤＡＣを有すると同定すること、
を含む、前記方法。 - 対象から得られた試料中のＰＤＡＣについてスクリーニングするためのシステムであって、
試料のメチル化状態を判定するように構成されている分析コンポーネント、
前記試料のメチル化状態を、データベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及び
メチル化状態の組み合わせに基づいて単一値を判定し、ＰＤＡＣ関連メチル化状態をユーザーに警告するように構成されている警告コンポーネント
を含む、前記システム。 - 前記試料が、表１の可変メチル化領域（ＤＭＲ）１～１３からなる群から選択されるＤＭＲ中の塩基を含むＤＮＡメチル化マーカーを含む核酸を含む、請求項６１に記載のシステム。
- 核酸を単離するためのコンポーネントをさらに含む、請求項６１に記載のシステム。
- 試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む、請求項６１に記載のシステム。
- 糞便試料、膵組織試料、及び／または血漿試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む、請求項６１に記載のシステム。
- 前記データベースが、ＰＤＡＣを有しない対象の核酸配列を含む、請求項６１に記載のシステム。
- 前記生体試料からの炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）のレベルを測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記生体試料からの炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）のレベルを測定すること；
前記測定したＣＡ１９－９のレベルを対照生体試料からのＣＡ１９－９の参照レベルと比較すること：及び
前記１つ以上の遺伝子中で測定されたメチル化レベルが前記対照試料のそれぞれにおいて測定されたメチル化レベルよりも高く、かつＣＡ１９－９のレベルが前記対照生体試料からのＣＡ１９－９の参照レベルよりも高い場合、前記個体がＰＤＡＣを有すると判定すること、
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。 -
前記生体試料からの炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）のレベルを測定することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
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