JP2023058645A - 肝細胞癌の検出 - Google Patents

Abstract

【課題】肝細胞癌をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】対象から採取される試料中の肝細胞癌（ＨＣＣ）をスクリーニングする方法であって、ａ）対象から採取される試料におけるマーカーのメチル化状態をアッセイすること、及びｂ）前記マーカーの前記メチル化状態が、ＨＣＣを有さない対象においてアッセイされた前記マーカーのメチル化状態と異なる場合に、前記対象がＨＣＣを有していると特定することを含む前記方法であり、前記マーカーは、ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１から選択される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の塩基を含む、前記方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２日に出願された、米国仮特許出願第６２／３８３，１６５号の優先権の利益を主張する。当該仮出願は、参照することによりその全体が組み込まれる。

本明細書に提供するのは、肝細胞癌のスクリーニング用の技術であり、具体的には、限定されないが、肝細胞癌の存在を検出するための方法、組成物、及び関連する使用である。

肝細胞癌（ＨＣＣ）は、肝臓の原発性悪性腫瘍であり、主に基礎慢性肝疾患及び肝硬変の患者に発生する。起源の細胞（複数可）は、肝幹細胞であると考えられている（Ａｌｉｓｏｎ ＭＲ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２００５．１（３）：２５３－６０参照）。腫瘍は、局所的な拡大、肝内進展、及び遠隔転移を伴い進行する。

ＨＣＣは現在、世界でがんによる死亡原因の第３位であり、５００，０００人超が侵されている。ＨＣＣの発生率は、アジア及びアフリカで最も高く、そこでは、高侵淫性のＢ型肝炎及びＣ型肝炎によって、慢性肝疾患及びそれに続くＨＣＣがかなり生じやすくなる。

ＨＣＣの提示は、過去数十年にわたって大きく進化した。過去には、ＨＣＣは一般に、右上腹部痛、体重減少、及び非代償性肝疾患の兆候を伴う進行期に見つかったが、現在では、断面像の解析及び血清アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）測定を用いた既知の肝硬変患者の日常のスクリーニングの結果、かなり早いステージでの認識が増えている。

ＨＣＣの脅威は、今後何年間も拡大し続けると予想される（Ｌｌｏｖｅｔ ＪＭ，ｅｔ
ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．２００４ Ｆｅｂ．１０（２ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１１５－２０参照）。従って、これらの患者の生存率を上げるため、ＨＣＣの早期発見に対する要求が大きい。

肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界的に２番目に致命的ながんである。生存率は早期発見で向上し、正確で非侵襲的なスクリーニング手段が必要とされる。早期のＨＣＣの発症前検出のための正確で安価かつ安全なスクリーニング手段を供給する技術革新が必要不可欠である。

本発明は、この必要性に対処する。実際には、本発明は、正常な対照（肝硬変を伴う対照及び伴わない対照）からＨＣＣを区別する新規なメチル化ＤＮＡマーカーを提供する。

メチル化ＤＮＡは、ほとんどの腫瘍型の組織における潜在的なバイオマーカーの種類として研究されてきた。多くの場合、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位で、遺伝子発現のエピジェネティック制御として、ＤＮＡにメチル基を付加する。生物学的に魅力的な機序では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域での後天的なメチル化事象は、発現を抑制し、ひいては腫瘍形成に寄与すると考えられる。ＤＮＡのメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質の発現よりも化学的及び生物学的に安定な診断手段であり得る（Ｌａｉｒｄ（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ
１１：１９１－２０３）。さらに、散発性結腸癌のような他のがんでは、メチル化マーカーは、優れた特異度を与え、個々のＤＮＡ突然変異より広く情報を提供しかつ感度が高い（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １６：２６８６－９６参照）。

ＣｐＧアイランドの分析は、動物モデル及びヒト細胞株に適用した場合に重要な発見をもたらした。例えば、Ｚｈａｎｇらは、同じＣｐＧアイランドの異なる部分からのアンプリコンが、異なるメチル化のレベルを有し得ることを見出した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ５：ｅ１０００４３８）。さらに、メチル化のレベルは、高メチル化及び非メチル化配列間で二峰性に分布し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性のバイナリスイッチ様パターンをさらに裏付けた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ５：ｅ１０００４３８）。インビボでのマウス組織及びインビトロでの細胞株の分析で、動的組織特異的パターンにおいて、高ＣｐＧ密度のプロモーター（ＨＣＰ、３００塩基対の領域内に＞７％のＣｐＧ配列を有すると定義される）は約０．３％しかメチル化されない一方、低ＣｐＧ密度（３００塩基対の領域内に＜５％のＣｐＧ配列を有すると定義される）の領域は、高頻度にメチル化される傾向があることが示された（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５４：７６６－７０）。ＨＣＰは、遍在するハウスキーピング遺伝子及び高度に調節された発生遺伝子に対するプロモーターを含む。ＨＣＰ部位の中でも、＞５０％メチル化されたのは、いくつかの確立されたマーカー、例えば、Ｗｎｔ２、ＮＤＲＧ２、ＳＦＲＰ２、及びＢＭＰ３であった（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５４：７６６－７０）。

本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験は、ＨＣＣを有する対象の血漿由来のＤＮＡマーカーのメチル化状態を、対照の対象（例えば、肝硬変を有するまたは正常の対象）由来の同じＤＮＡマーカーのメチル化状態と比較した。かかる実験は、かかる対照群からＨＣＣを区別するメチル化ＤＮＡマーカーの候補を特定及び確認した。

従って、本明細書に提供するのは、ＨＣＣのスクリーニング（例えば、監視）用の技術であり、具体的には、限定されないが、ＨＣＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連する使用である。

マーカー及び／またはマーカーのパネルは、ＨＣＣ（実施例Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ参照）（ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１）を検出することができると認定された。

本明細書に記載の通り、該技術は、対象においてＨＣＣの存在を検出するための高い識別性の多くのメチル化ＤＮＡマーカー及びそれらのサブセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２マーカーのセット）を提供する。実験は、選択フィルターを候補マーカーに適用し、高シグナル対ノイズ比及び低バックグラウンドレベルを与え、高い特異度を、例えば、スクリーニングまたは診断（例えば、ＨＣＣのスクリーニングまたは診断）の目的で媒体（例えば、血漿）をアッセイする場合に与えるマーカーを識別した。

いくつかの実施形態では、該技術は、本明細書で特定された１つ以上のマーカーの存在及びメチル化状態を生体試料（例えば、血漿試料）で評価することに関する。これらのマーカーは、例えば、表１及び４に示す本明細書で論じる１つ以上の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。メチル化状態は、該技術の実施形態で評価される。従って、本明細書に提供する技術は、遺伝子のメチル化状態を測定する方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、メチル化状態はゲノムスキャニング法で測定される。例えば、１つの方法は、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１－７４２７参照）を含み、別の例は、メチル化感受性任意プライムＰＣＲ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５９４－５９９参照）を含む。いくつかの実施形態では、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化と、それに続く目的の領域のサザン解析により観察される（消化－サザン法）。いくつかの実施形態では、メチル化パターンの変化の分析は、ＰＣＲ増幅に先立つメチル化感受性制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化を含むＰＣＲに基づく方法を含む（Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７参照）。さらに、ＤＮＡのバイサルファイト処理をメチル化分析の開始点として利用する他の技術が報告されている。これらには、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６参照）及びバイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化（Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９、及びＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４参照）が含まれる。ＰＣＲ技術は、遺伝子突然変異の検出（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４３－１１４７参照）及び対立遺伝子特異的発現の定量化（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０９７－３１０８、及びＳｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：１６０－１６３）用に開発された。かかる技術は、内部プライマーを使用し、これは、ＰＣＲ生成鋳型にアニールし、アッセイする単一のヌクレオチドの５’を直接終結させる。米国特許第７，０３７，６５０号に記載の「定量的Ｍｓ－ＳＮｕＰＥアッセイ」を用いた方法をいくつかの実施形態で使用する。

メチル化状態の評価に際して、メチル化状態は、多くの場合、特定の部位（例えば、単一のヌクレオチドで、特定の領域または遺伝子座で、より長い目的の配列で、例えば、ＤＮＡの最大約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐの部分配列、またはそれ以上）でメチル化されたＤＮＡの個々の鎖の、該特定の部位を含む試料におけるＤＮＡの全集団に対する割合またはパーセンテージとして表される。伝統的に、非メチル化核酸の量は、標準物質を用いたＰＣＲにより測定される。その後、既知量のＤＮＡをバイサルファイトで処理し、得られたメチル化特異的配列は、リアルタイムＰＣＲまたは他の指数増幅、例えば、ＱｕＡＲＴＳアッセイ（例えば、米国特許第８，３６１，７２０号、第８，７１５，９３７号、及び第８，９１６，３４４号で提供されている）のいずれかを用いて測定される。

例えば、いくつかの実施形態では、方法は、外部標準を用いて非メチル化標的の標準曲線を作成することを含む。該標準曲線は、少なくとも２点から構成され、非メチル化ＤＮＡのリアルタイムＣｔ値を既知の定量標準と関連付ける。その後、メチル化標的についての第二の標準曲線を少なくとも２点及び外部標準から構成する。この第二の標準曲線は、メチル化ＤＮＡのＣｔを既知の定量標準と関連付ける。次に、試験試料のＣｔ値をメチル化及び非メチル化集団について測定し、ＤＮＡのゲノム当量を先の２つのステップで作成された標準曲線から計算する。目的の部位でのメチル化のパーセンテージを、該集団のＤＮＡの全量に対するメチル化ＤＮＡの量から計算する。例えば、（メチル化ＤＮＡ数）／（メチル化ＤＮＡ数＋非メチル化ＤＮＡ数）×１００。

本明細書に同様に提供するのは、該方法を実施するための組成物及びキットである。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のマーカーに特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）を単独で、またはセット（例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマー対のセット）で提供する。検出アッセイを実施するための追加の試薬（例えば、酵素、緩衝剤、陽性及び陰性対照でＱｕＡＲＴＳ、ＰＣＲ、配列決定、バイサルファイト、または他のアッセイを実施するためのもの）もまた提供する場合がある。いくつかの実施形態では、方法を行うために必要な、十分な、または有用な１つ以上の試薬を含むキットを提供する。該試薬を含む反応混合物もまた提供する。さらに、互いに添加され及び／または試験試料に添加して反応混合物を完成させ得る複数の試薬を含むマスターミックス試薬のセットを提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載の方法によって提供される一連の算術演算または論理演算を実行するように設計されたプログラマブル機械と関連している。例えば、該技術のいくつかの実施形態は、コンピュータソフトウェア及び／またはコンピュータハードウェアと関連している（例えば、それにより実行される）。一態様において、該技術は、メモリの形式、算術演算及び論理演算を実行するための要素、ならびにデータの読み取り、操作、及び保存のための一連の命令（例えば、本明細書に提供する方法）を実行するための処理要素（例えば、マイクロプロセッサ）を含むコンピュータに関連している。いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサは、メチル化状態（例えば１つ以上のＤＭＲ、例えば、表１及び４に示すＤＭＲ１～４００のもの）の測定、メチル化状態（例えば１つ以上のＤＭＲ、例えば、表１及び４に示すＤＭＲ１～４００のもの）の比較、標準曲線の作成、Ｃｔ値の測定、メチル化（例えば１つ以上のＤＭＲ、例えば、表１及び４に示すＤＭＲ１～４００のもの）の割合、頻度、またはパーセンテージの計算、ＣｐＧアイランドの特定、アッセイまたはマーカーの特異度及び／または感度の測定、ＲＯＣ曲線及び関連するＡＵＣの計算、配列分析のためのシステムの一部であり、すべて本明細書に記載されているか、または当技術分野で既知である。

いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサまたはコンピュータは、がんの部位を予測するためのアルゴリズムにおいてメチル化状態のデータを使用する。

いくつかの実施形態では、あるソフトウェアまたはハードウェアコンポーネントは、複数のアッセイの結果を受け取り、使用者に報告するための複数のアッセイの結果に基づくがんのリスクを示す単一の値の結果を決定する（例えば、複数のＤＭＲ、例えば、表１及び４に示すＤＭＲのメチル化状態を決定する）。関連する実施形態は、例えば、複数のマーカー（例えば、複数のＤＭＲ、例えば、表１及び４に示す）のメチル化状態を測定する複数のアッセイからの結果の数学的結合（例えば、重み付き結合、線形結合）に基づくリスクファクターを計算する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲのメチル化状態は、次元を規定し、多次元空間に値を有する場合があり、複数のＤＭＲのメチル化状態によって規定される座標は、例えば、使用者に報告するための結果である。

いくつかの実施形態は、記憶媒体及びメモリ要素を含む。メモリ要素（例えば、揮発性及び／または不揮発性メモリ）は、命令（例えば、本明細書に提供する方法の実施形態）及び／またはデータ（例えば、メチル化測定、配列、及びそれらに関連する統計的記述等のワークピース）の格納に用途を見出す。いくつかの実施形態は、ＣＰＵ、グラフィックスカード、及びユーザインタフェース（例えば、ディスプレイ等の出力デバイス及びキーボード等の入力デバイスを含む）のうちの１つ以上もまた含むシステムに関する。

該技術と関連したプログラマブル機械は、従来の現存する技術及び開発中またはまだ開発されていない技術（例えば、量子コンピュータ、化学コンピュータ、ＤＮＡコンピュータ、光コンピュータ、スピントロニクス系コンピュータ等）を含む。

いくつかの実施形態では、該技術は、データ送信用の有線（例えば、金属ケーブル、光ファイバー）または無線の伝送媒体を含む。例えば、いくつかの実施形態は、ネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、アドホックネットワーク、インターネット等）を通じたデータ送信に関する。いくつかの実施形態では、プログラマブル機械は、ピアとしてかかるネットワークに含まれ、いくつかの実施形態では、該プログラマブル機械は、クライアント／サーバー関係を有する。

いくつかの実施形態では、データは、ハードディスク、フラシュメモリ、光媒体、フロッピーディスク等のコンピュータ可読記憶媒体に格納される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する技術は、協調して作動して本明細書に記載の方法を実行する複数のプログラマブルデバイスと関連している。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、従来のネットワークインタフェース、例えば、イーサネット（登録商標）、光ファイバーによって、または無線ネットワーク技術によってネットワーク（私的、公的、またはインターネット）に接続されたクラスタコンピューティングもしくはグリッドコンピューティング、または完全なコンピュータに依存するいくつかの他の分散コンピュータアーキテクチャ（搭載ＣＰＵ、記憶装置、動力供給装置、ネットワークインタフェース等を備えた）の実行において、複数のコンピュータ（例えば、ネットワークで接続された）が並行して稼働し、データを集めて処理し得る。

例えば、いくつかの実施形態は、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータを提供する。該実施形態は、プロセッサに結合されたランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。該プロセッサは、メモリに格納されたコンピュータ実行可能プログラム命令を実行する。かかるプロセッサは、マイクロプロセッサ、ＡＳＩＣ、状態機械、または他のプロセッサを含んでよく、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びＭｏｔｏｒｏｌａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ製のプロセッサ等のいくつかのコンピュータプロセッサのいずれかでよい。かかるプロセッサは、媒体、例えば、該プロセッサが実行する場合に、該プロセッサに本明細書に記載のステップを行わせる命令を格納するコンピュータ可読媒体を具備するか、またはこれと通じていてもよい。

コンピュータ可読媒体の実施形態としては、プロセッサにコンピュータ可読命令を与えることが可能な電子、光学、磁気、もしくは他の記憶または送信デバイスが挙げられるがこれらに限定されない。他の適切な媒体の例としては、フロッピーディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、設定済みプロセッサ、すべての光媒体、すべての磁気テープもしくは他の磁気媒体、またはコンピュータプロセッサが命令を読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられるがこれらに限定されない。また、様々な他のコンピュータ可読媒体の形式が、コンピュータに命令を送信または届けてもよく、ルータ、私的もしくは公的ネットワーク、または有線及び無線両方の他の送信デバイスもしくはチャンネルが含まれる。該命令は、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ビジュアルベーシック、ジャバ、パイソン、パール、及びジャバスクリプトを含めた任意の適切なコンピュータプログラミング言語のコードを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、コンピュータはネットワークに接続される。コンピュータはまた、マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、または他の入力もしくは出力デバイスなどのいくつかの外部または内部デバイスを含み得る。コンピュータの例は、パーソナルコンピュータ、デジタル補助装置、携帯端末、携帯電話（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｎｅ）、携帯電話（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ）、スマートフォン、ポケットベル、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネット家電、及び他のプロセッサ系デバイスである。一般に、本明細書に提供する技術の態様に関するコンピュータは、本明細書に提供する技術を含む１つ以上のプログラムを支援することができるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｍａｃ ＯＳ Ｘ等の任意のオペレーティングシステムで作動する任意の種類のプロセッサ系プラットフォームでよい。いくつかの実施形態は、他のアプリケーションプログラム（例えば、アプリケーション）を実行するパーソナルコンピュータを含む。これらのアプリケーションは、メモリに含まれてもよく、また、例えば、文書作成アプリケーション、スプレッドシートアプリケーション、電子メールアプリケーション、インスタントメッセンジャーアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザアプリケーション、カレンダー／スケジュール管理アプリケーション、及びクライアントのデバイスによって実行することが可能な任意の他のアプリケーションを含み得る。

該技術に関連する本明細書に記載のすべてのかかるコンポーネント、コンピュータ、及びシステムは、ロジカルでもバーチャルでもよい。

本明細書に提供するのは、対象から採取される試料におけるＨＣＣのスクリーニング方法に関する技術であり、該方法は、対象から採取される試料におけるマーカーのメチル化状態をアッセイすること、及び該マーカーのメチル化状態が、ＨＣＣを有さない対象（例えば、ＨＣＣを有さない対象）（例えば、ＨＣＣを有さないが肝硬変を有する対象）においてアッセイされたマーカーのメチル化状態と異なる場合に、該対象がＨＣＣを有していることを特定することを含み、該マーカーは、表１及び４に示すＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１から選択される１つ以上の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の塩基を含む。

該技術は、評価されるメチル化状態に限定されない。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態の評価は、１つの塩基のメチル化状態を測定することを含む。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態の評価は、複数の塩基でメチル化の程度を測定することを含む。さらに、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、当該マーカーの通常のメチル化状態に対する該マーカーのメチル化の増加を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、当該マーカーの通常のメチル化状態に対する該マーカーのメチル化の減少を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、当該マーカーの通常のメチル化状態に対する該マーカーの異なるメチル化パターンを含む。

さらに、いくつかの実施形態では、該マーカーは、１００以下の塩基の領域であり、該マーカーは、５００以下の塩基の領域であり、該マーカーは、１０００以下の塩基の領域であり、該マーカーは、５０００以下の塩基の領域であるか、または、いくつかの実施形態では、該マーカーは、１つの塩基である。いくつかの実施形態では、該マーカーは、高ＣｐＧ密度のプロモーター内にある。

該技術は、試料の種類によって制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、該試料は血液試料（例えば、血漿、血清、全血）、ふん便試料、組織試料（例えば、胃組織、膵臓組織、胆管／肝臓組織、膵液、及び結腸直腸組織）、排せつ物、または尿試料である。

さらに、該技術は、メチル化状態を測定するために使用される方法に限定されない。いくつかの実施形態では、該アッセイは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量ベースの分離、または標的捕獲を使用することを含む。いくつかの実施形態では、該アッセイは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、該技術は、超並列配列決定（例えば、次世代シーケンシング）、例えば、合成による配列決定、リアルタイム（例えば、単一分子）配列決定、ビーズエマルション配列決定、ナノ細孔配列決定等を用いてメチル化状態を測定する。

該技術は、ＤＭＲを検出するための試薬を提供し、例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１～９４（表２及び５）が示す配列を含む一連のオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲの塩基を有する染色体領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＭＲのメチル化状態に感受性のあるオリゴヌクレオチドを提供する。

該技術は、様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、該マーカーは、表１または３に示され、該マーカーを含むアノテーションを有する染色体領域を含む。さらに、実施形態は、ＤＭＲ番号１～４００の１つ以上である表１及び／または４からのＤＭＲを分析する方法を提供する。

キットの実施形態、例えば、バイサルファイト試薬、ならびにＤＭＲ１～４００（表１及び４より）からなる群から選択されるＤＭＲ由来の配列を含み、ＨＣＣを有さない対象（例えば、ＨＣＣを有さず、肝硬変を有さない対象）（例えば、ＨＣＣを有さないが肝硬変を有する対象）と関連するメチル化状態を有する対照核酸を含むキットを提供する。キットの実施形態、例えば、バイサルファイト試薬、ならびにＤＭＲ１～４００（表１及び４より）からなる群から選択されるＤＭＲ由来の配列を含み、ＨＣＣを有さない対象と関連するメチル化状態を有する対照核酸を含むキットを提供する。

いくつかのキットの実施形態は、対象から試料（例えば、ふん便試料）を採取するための試料コレクター、該試料から核酸を単離するための試薬、バイサルファイト試薬、及び本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。

該技術は、組成物（例えば、反応混合物）の実施形態に関する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲを含む核酸及びバイサルファイト試薬を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸及び本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸及びメチル化感受性制限酵素を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸及びポリメラーゼを含む組成物を提供する。

対象から採取される試料（例えば、血漿試料）中のＨＣＣをスクリーニングするためのさらなる関連する方法の実施形態を提供する。例えば、ある方法は、ＤＭＲ１～４００（表１及び４より）の１つ以上であるＤＭＲの塩基を含む試料中のマーカーのメチル化状態を測定すること、該対象の試料由来のマーカーのメチル化状態を、ＨＣＣを有さない対象からの正常対照試料由来のマーカーのメチル化状態と比較すること、ならびに該対象の試料と該正常対照試料のメチル化状態の差の信頼区間及び／またはｐ値を測定することを含む。

いくつかの実施形態では、該信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％であり、該ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００１である。いくつかの方法の実施形態は、ＤＭＲを含む核酸をバイサルファイト試薬と反応させてバイサルファイトを反応させた核酸を生成し、該バイサルファイトと反応させた核酸の配列を決定して該バイサルファイトと反応させた核酸のヌクレオチド配列を与え、該バイサルファイトと反応させた核酸のヌクレオチド配列を、がんを有さない対象由来のＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較してこれら２つの配列の差を特定し、差が存在する場合に該対象が腫瘍を有すると特定するステップを提供する。

対象から採取される試料中のＨＣＣをスクリーニングするシステムが該技術によって提供される。例示的なシステムの実施形態としては、例えば、対象から採取される試料中のＨＣＣをスクリーニングするためのシステムが挙げられ、該システムは、試料のメチル化状態を測定するように構成された分析コンポーネント、該試料のメチル化状態を、データベースに記録された対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されたソフトウェアコンポーネント、及びＨＣＣ関連のメチル化状態（例えば、ＨＣＣがない場合のメチル化状態、ＨＣＣのメチル化状態）を使用者に警告するように構成された警告コンポーネントを含む。警告は、いくつかの実施形態では、複数のアッセイ（例えば、複数のマーカー、例えば、ＤＭＲ、例えば、表１及び４に示されるもののメチル化状態を測定する）からの結果を受け取り、これら複数の結果に基づいて、報告する値または結果を計算するソフトウェアコンポーネントによって決定される。いくつかの実施形態は、使用者（例えば、医師、看護師、臨床医等）に報告する値もしくは結果の計算及び／または警告に使用するための本明細書に提供する各ＤＭＲに関連する加重パラメータのデータベースを提供する。いくつかの実施形態では、複数のアッセイからのすべての結果が報告され、いくつかの実施形態では、１つ以上の結果を用いて、複数のアッセイからの１つ以上の結果の混合に基づくスコア、値、または結果を提供し、これが対象におけるＨＣＣのリスクを示す。

いくつかのシステムの実施形態では、試料は、ＤＭＲを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、該システムはさらに、核酸を単離するためのコンポーネント、試料を採取するためのコンポーネント、例えば、血漿試料を採取するためのコンポーネントを含む。いくつかの実施形態では、該システムは、ＤＭＲを含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該データベースは、ＨＣＣを有さない対象由来の核酸配列を含む。核酸、例えば、各核酸がＤＭＲを含む配列を有する核酸のセットもまた提供する。いくつかの実施形態では、該核酸のセットは、各核酸がＨＣＣを有さない対象由来の配列を有する。関連するシステムの実施形態は、記載された核酸のセット及び該核酸のセットと関連する核酸配列のデータベースを含む。いくつかの実施形態は、さらに、バイサルファイト試薬を含む。また、いくつかの実施形態は、さらに、核酸シーケンサーを含む。

ある特定の実施形態では、対象から採取される試料（例えば、血漿試料）中のＨＣＣを検出する方法を提供し、これは、ａ）対象からＤＮＡを含む試料を採取すること、ｂ）採取したＤＮＡを、該採取したＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬で処理すること、ｃ）ステップｂ）の処理を受けたＤＮＡにおける１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを測定すること、ここで、１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーは、ＤＭＲ１～４００（表１及び４より）が示す差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の塩基を含み、ｄ）測定された該１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを、ＨＣＣを有さない対象についての１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベル参照と比較すること、及びｅ）差が存在する場合に該対象がＨＣＣを有すると特定することを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーにおけるメチル化上昇の測定はＣｐＧアイランド及びＣｐＧアイランドショアからなる群から選択される領域内のメチル化の変化の測定を含む。

いくつかの実施形態では、該ＣｐＧアイランドまたはＣｐＧショア内のメチル化の上昇の測定は、当該ＤＮＡメチル化マーカーのコード領域または調節領域内のメチル化の上昇を含む。

いくつかの実施形態では、ステップｂ）の処理を受けたＤＮＡにおける１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、該１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化スコア及び／またはメチル化の頻度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｂ）の処理は、採取されたＤＮＡのバイサルファイト修飾により達成される。

いくつかの実施形態では、ステップｂ）の処理を受けたＤＮＡにおける１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的バイサルファイトピロシーケンシング、及びバイサルファイトゲノム配列決定ＰＣＲからなる群から選択される技術によって達成される。

さらなる実施形態は、本明細書に含まれる開示に基づいて、当業者には明らかになろう。

ＨＣＣのＤＮＡ試料を、正常対照（例えば、肝硬変を有するまたは有さない非ＨＣＣの個体）由来のＤＮＡと区別するための、３１１の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の特定に関与する四段階の描写。 相補的な３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＬＲＲＣ４、及びＢＤＨ１）は、血漿中で２０／２１のＨＣＣ及び３２／３３の対照を識別した。１つのＨＣＣはＢＤＨ１が低レベルであり、１つの対照はＬＲＲＣ４が高かった。このパネルは、ＨＣＣに対して、特異度９７％（９５％信頼区間（ＣＩ）、８２％～１００％）で感度９５％（９５％ＣＩ、７４％～１００％）であり、ＡＵＣ０．９８を達成した（図２参照）。 図３Ａ～Ｉ：ＡＣＰ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、及びＴＳＰＹＬ５に関する受信者操作特性曲線下面積の情報。 図４Ａ～ＣＣ：生物組織検証データからの２７の胃癌マーカー（フィット点分析を加えて２９）の箱ひげ図（対数目盛）。試料は、左端に正常肝、次に肝硬変なしのＨＣＣ、肝硬変を有するＨＣＣ、及び肝硬変対照（炎症性）で並べている。縦軸は、メチル化度である（β－アクチン鎖に対して正規化）。 ９５％正常特異度のマトリックス形式での７５のＨＣＣ組織試料及び２９の対照（肝硬変１６、正常肝１３）における２７のＨＣＣ癌マーカーの性能。マーカーは縦に、試料は横に記載している。試料は、左端に正常肝（ＮＩ）、次に肝硬変なしのＨＣＣ（ＨＮ）、肝硬変を有するＨＣＣ（ＨＣ）、及び肝硬変対照（Ｉｎ）で並べている。ポジティブヒットはライトグレーであり、ミスはダークグレーである。このプロットにより、マーカーを補完的に評価することができる。注：２つのマーカー、すなわち、ＴＢＸ１５及びＥＧＲ２は、ｑＭＳＰデータに対してフィット点法を用いて二度目に分析し、ここに含める。 ＱｕＡＲＴｓ（定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅）アッセイによるメチル化ＤＮＡシグネチャーの検出に使用されるＦＲＥＴカセットのオリゴヌクレオチド配列を示す。各ＦＲＥＴ配列は、３つの別々のアッセイに一緒に多重化することができるフルオロフォア及びクエンチャを含む。 Ａ）上位３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＢＤＨ１、ＬＲＲＣ４）についてのカットオフでのｒＰａｒｔ二分木。この木は、以下のプロセスで構築される。すなわち、第一に、データを２群に最適に分割する単一変数（マーカー）を見出す。このデータを分割し、その後、当該下位群が最小のサイズに達するまで、またはそれ以上改善がなされなくなるまでのいずれか、このプロセスを各下位群等に別々に再帰的に適用する。カットオフを満たす、またはカットオフを満たさない対照試料数は、分子の位置に表し、症例の試料は分母の位置に表す。ここでは、この組み合わせが血漿中２１のＨＣＣのうちの２０及び３３対照のうちの３２を識別した。Ｂ）上位３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＴＳＰＹＬ５）についてのカットオフでのｒＰａｒｔ二分木。Ｃ）上位３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＡＣＰ１）についてのカットオフでのｒＰａｒｔ二分木。Ｄ）上位３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＳＰＩＮＴ２）についてのカットオフでのｒＰａｒｔ二分木。 メチル化マーカーＥＭＸ１を用いた１００％の特異度でステージＡ～Ｃによる血漿中のＨＣＣ感度を示す棒グラフ。Ｕに分類された試料は、ステージが不明確であった。 この分析で検討されたメチル化マーカー（ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１）の各々の相対的重要性を示すグラフ。マーカーの全パネルの感度及び特異度の交差検定推定値は、それぞれ、７５％及び９６％であった。

詳細な説明
本明細書に提供するのは、肝細胞癌のスクリーニング用の技術であり、具体的には、限定されないが、肝細胞癌の存在を検出するための方法、組成物、及び関連する使用である。

該技術が本明細書に記載される場合、使用されるセクションの見出しは、構成する目的のためのみであり、その主題を限定するものとは決して解釈されない。

様々な実施形態のこの詳細な説明では、説明の目的で、多数の具体的な詳細を記載し、本開示の実施形態の完全な理解を与える。しかしながら、当業者にはこれらの様々な実施形態がこれらの具体的な詳細の有無にかかわらず実施され得ることが理解されよう。他の例では、構造及び装置がブロック図の形で示される。さらに、当業者には、方法が提示され、実行される特定の順序が例示的であり、これらの順序は変更することができ、本明細書に開示する様々な実施形態の趣旨及び範囲内になお留まることが企図されることが容易に理解され得る。

本出願に引用するすべての文献及び同種の資料、すなわち、限定されないが、特許、特許出願、記事、本、論文、及びインターネットのウェブページ等は、あらゆる目的のため、参照することによりそれらの全体が明示的に組み込まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載の様々な実施形態が属する当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。組み込まれた参考文献での用語の定義が本開示に提供する定義と異なると思われる場合、本開示に提供する定義が統制するものとする。

定義
本技術の理解を容易にするため、いくつかの用語及び表現を以下に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載する。

本明細書及び特許請求の範囲を通して、以下の用語は、その文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、本明細書に明白に関連する意味を取る。本明細書で使用される「１つの実施形態では」という表現は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態では」という表現は、必ずしも異なる実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。従って、以下に記載する通り、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせられ得る。

さらに、本明細書で使用される、「または」という用語は、包括的な「または」演算子であり、その文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、「及び／または」という用語と同等である。「～に基づく」という用語は、排他的ではなく、その文脈が明らかそうではないと指示しない限り、記載されていないさらなる因子に基づいていることを許可する。さらに、本明細書を通して、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の言及を含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。

本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、概して、任意のリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指し、これは、未修飾もしくは修飾ＤＮＡまたはＲＮＡでよい。「核酸」としては、制限なく、一本鎖及び二本鎖核酸が挙げられる。本明細書で使用される「核酸」という用語は、１つ以上の修飾塩基を含む上記のＤＮＡもまた含む。従って、安定性のため、または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡは「核酸」である。本明細書で使用される「核酸」という用語は、かかる化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形の核酸、ならびに、例えば、単純型細胞及び複雑型細胞を含めたウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡの化学形を包含する。

「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２個以上の、好ましくは３個を超える、通常は１０個を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する分子を指す。正確なサイズは、多くの要因によって決まり、同様にして該オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用によって決まる。該オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含めた任意の方法で生成され得る。典型的なＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニンである。典型的なＲＮＡのリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、及びグアニンである。

本明細書で使用される、核酸の「遺伝子座」または「領域」という用語は、核酸の小領域、例えば、染色体上の遺伝子、一塩基、ＣｐＧアイランド等を指す。

「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合則によって結びつけられるヌクレオチド（例えば、１つのヌクレオチド）またはポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’と相補的である。相補性は、当該核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って適合する「部分的」でもよい。または、当該核酸間で「完全な」もしくは「全体の」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度をもたらす。これは、核酸間の結合に依存する増幅反応及び検出方法において特に重要である。

「遺伝子」という用語は、ＲＮＡの産生、またはポリペプチドもしくはその前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能性のポリペプチドは、完全長コード配列によって、または、該ポリペプチドの所望の活性もしくは機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持される限り、該コード配列の任意の部分によってコードされ得る。遺伝子に関して使用される場合、「部分」という用語は、その遺伝子の断片を指す。該断片は、数個のヌクレオチドから全遺伝子配列マイナス１個のヌクレオチドまでのサイズに及び得る。従って、「遺伝子の少なくとも部分を含むヌクレオチド」は、当該遺伝子の断片を含む場合もあれば全遺伝子を含む場合もある。

「遺伝子」という用語はまた、該遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（例えば、コード配列、調節配列、構造配列、及び他の配列を含む）の長さに相当するように、構造遺伝子のコード領域も包含し、５’及び３’両末端のコード領域に隣接して、例えば、いずれかの末端の約１ｋｂの距離の間に位置する配列を含む。該コード領域の５’に位置し、該ｍＲＮＡに存在する配列は、５’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と呼ばれる。該コード領域の３’または下流に位置し、該ｍＲＮＡに存在する配列は、３’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ及びゲノム形態の遺伝子の両方を包含する。いくつかの生物（例えば、真核生物）では、遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」もしくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーのような調節要素を含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライスアウト」され、イントロンはそれ故、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。該ｍＲＮＡは、翻訳の過程で新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。

イントロンを含むことに加えて、ゲノム形態の遺伝子はまた、当該ＲＮＡ転写物に存在する配列の５’及び３’両末端に位置する配列を含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と呼ばれる（これらのフランキング配列は、該ｍＲＮＡ転写物に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するまたはこれに影響を与えるプロモーター及びエンハンサー等の調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後切断、及びポリアデニル化を指示する配列を含み得る。

「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の多様性を指し、該多様性には、バリアント及び変異体、多型座、及び一塩基多型座、フレームシフト、ならびにスプライス変異が含まれるがこれらに限定されない。対立遺伝子は、集団内で自然発生する場合もあれば、集団の任意の特定の個体の一生の間に生じる場合もある。

従って、ヌクレオチド配列に関して使用される場合の「バリアント」及び「変異体」という用語は、別の、通常は関連するヌクレオチド酸配列と１つ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列を指す。「多様性」は、２つの異なるヌクレオチド配列の間の差であり、通常は、一方の配列が参照配列である。

「増幅」は、鋳型特異性に関与する核酸複製の特殊な場合である。これは、非特異的鋳型複製（例えば、鋳型に依存するが特定の鋳型には依存しない複製）と対比される。鋳型特異性は、ここでは、複製の忠実度（例えば、適切なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボまたはデオキシリボ）特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」特異性の観点から記載される。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることが求められるという意味で「標的」である。増幅技術は、主にこの選別のために設計されている。

核酸の増幅は、一般に、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部の複数のコピーの生成を指し、通常は、少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子、ポリヌクレオチド分子の１０～１００個のコピー、これらは厳密に同じでも同じでなくてもよい）から開始し、その増幅産物またはアンプリコンは一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的及び酵素的過程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えば、米国特許第５，４９４，８１０号参照）の過程での標的もしくは鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは数個のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は、ある種の増幅である。増幅のさらなる種類としては、限定されないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号参照）、アセンブリＰＣＲ（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号参照）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，６６２，５９４号参照）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号及び第５，３３８，６７１号参照）、配列間特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ，ｅｔ ａｌｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：８１８６参照）、ライゲーション媒介ＰＣＲ（例えば、Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１８５４－１８５８（１９９７）、米国特許第５，５０８，１６９号参照）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ ９３（１３）９８２１－９８２６参照）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１２）：ｅ５７参照）、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（２３）１１１４１－１１１５６、Ｂａｌｌａｂｉｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８４（６）５７１－５７３、Ｈａｙｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：８０参照）、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（１５）７３５１－７３６７参照）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３－４１７、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６－１０３０参照）、逆転写ＰＣＲ（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２５：１６９－１９３参照）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、及びタッチダウンＰＣＲ（例えば、Ｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（１４）４００８、Ｒｏｕｘ，Ｋ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（５）８１２－８１４、Ｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０（３）４７８－４８５参照）が挙げられる。ポリヌクレオチドの増幅はまた、デジタルＰＣＲを用いても達成することができる（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５、１９９９－２００４，（１９９７）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６、９２３６－４１，（１９９９）、国際特許公開第ＷＯ０５０２３０９１Ａ２号、米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号参照）。

「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号の方法を指し、これらは、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を、クローニングや精製をすることなく増加させるための方法を記載している。標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクルを行うことからなる。これら２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれらのそれぞれの鎖と相補的である。増幅を生じさせるため、該混合物を変性し、その後、該プライマーを当該標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングさせる。アニーリングの後、これらプライマーをポリメラーゼで伸長させ、新たな相補鎖の対を形成する。変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長のステップを多数回繰り返し（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長が１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」があり得る）、高濃度の所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決まり、従って、この長さは、制御可能なパラメータである。この工程の繰り返しの観点から、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが当該混合物中で優勢な配列（濃度の点で）になるため、それらは、「ＰＣＲで増幅された」といわれ、「ＰＣＲ産物」または「アンプリコン」である。

鋳型特異性は、ほとんどの増幅技術において、酵素の選択により達成される。増幅酵素は、それらが使用される条件下、核酸の異種混合物中の核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合は、ＭＤＶ－１ ＲＮＡが該レプリカーゼの特異的鋳型である（Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：３０３８［１９７２］）。他の核酸は、この増幅酵素によって複製されない。同様に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自体のプロモーターに対して厳密な特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２２８：２２７［１９７０］）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、該酵素は、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを結合しない。ここでは、当該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質と鋳型間にライゲーションの接合部でミスマッチがある（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０）。最後に、熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）は、高温で機能する能力のため、プライマーによって囲まれ、それ故画定される配列に対して高い特異性を示すことが分かる。高温は、標的配列とのプライマーのハイブリダイゼーションには有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには都合が悪い熱力学的条件をもたらす（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。

本明細書で使用される「核酸検出アッセイ」という用語は、目的の核酸のヌクレオチド組成を決定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイとしては、限定されないが、ＤＮＡ配列決定法、プローブハイブリダイゼーション法、構造特異的切断アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）（例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、第５，９８５，５５７号、第５，９９４，０６９号、第６，００１，５６７号、第６，０９０，５４３号、及び第６，８７２，８１６号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、ならびにＵＳ２００９／０２５３１４２）に記載されている）、酵素ミスマッチ切断法（例えば、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、第５，９５８，６９２号、第５，８５１，７７０号）、ポリメラーゼ連鎖反応、分岐ハイブリダイゼーション法（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、第５，７１０，２６４号、第５，１２４，２４６号、及び第５，６２４，８０２号）、ローリングサークル複製（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号、第６，１８３，９６０号、及び第６，２３５，５０２号）、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号）、分子標識技術（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号）、Ｅセンサー技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、第６，２２１，５８３号、第６，０１３，１７０号、及び第６，０６３，５７３号）、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５，４０３，７１１号、第５，０１１，７６９号、及び第５，６６０，９８８号）、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅法（例えば、米国特許第６，１２１，００１号、第６，１１０，６７７号、第５，９１４，２３０号、第５，８８２，８６７号、及び第５，７９２，６１４号）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒｎａｙ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１８９－９３（１９９１））、ならびにサンドイッチハイブリダイゼーション法（例えば、米国特許第５，２８８，６０９号）が挙げられる。

「増幅可能な核酸」という用語は、任意の増幅法で増幅され得る核酸を指す。「増幅可能な核酸」は、通常、「試料鋳型」を含むことが企図される。

「試料鋳型」という用語は、「標的」（以下に定義する）の存在について分析される試料に由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料中に存在する場合もしない場合もある試料鋳型以外の核酸に関して使用される。バックグラウンド鋳型は、ほとんどの場合不注意である。それはキャリーオーバーの結果の場合もあれば、当該試料から精製されることが求められている核酸混入物質の存在に起因する場合もある。例えば、検出されるべきもの以外の生物由来の核酸が、試験試料中にバックグラウンドとして存在する場合がある。

「プライマー」という用語は、精製された制限消化物において見られるように天然に存在するか合成的に生成されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマーの伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチド及び誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ならびに適切な温度及びｐＨ）に置かれた場合に合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖でもよい。二本鎖の場合、プライマーは、最初にその鎖を分離するための処理をされ、その後伸長産物の調製に使用される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、及び当該方法の用途を含めた多くの要因に依存する。

「プローブ」という用語は、精製された制限消化物において見られるように天然に存在するか、または合成的に、組み換え的に、もしくはＰＣＲ増幅により生成されるかにかかわらず、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、識別、及び単離に有用である（例えば、「捕捉プローブ」）。本発明で使用される任意のプローブは、いくつかの実施形態では、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性、及び発光システムを含めた任意の検出システムで検出できるように、任意の「レポーター分子」で標識され得ることが企図される。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。

本明細書で使用される「メチル化」は、シトシンのＣ５またはＮ４位でのシトシンメチル化、アデニンのＮ６位、または他の種類の核酸のメチル化を指す。通常のインビトロＤＮＡ増幅法は、増幅鋳型のメチル化パターンを保持しないため、インビトロ増幅ＤＮＡは、通常メチル化されていない。しかしながら、「非メチル化ＤＮＡ」または「メチル化ＤＮＡ」は、それらの元の鋳型がそれぞれメチル化されていないまたはメチル化されている増幅ＤＮＡも指す場合がある。

従って、本明細書で使用される「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」は、当該メチル部分が広く認められている典型的なヌクレオチド塩基には存在しないヌクレオチド塩基のメチル部分の存在を指す。例えば、シトシンは、そのピリミジン環にメチル部分を含まないが、５－メチルシトシンはそのピリミジン環の５位にメチル部分を含む。従って、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンはそのピリミジン環の５位にメチル部分を含むが、本明細書の目的のため、チミンはＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるため、ＤＮＡに含まれる場合、チミンをメチル化ヌクレオチドと見なさない。

本明細書で使用される「メチル化核酸分子」は、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを含む核酸分子を指す。

本明細書で使用される、核酸分子の「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）」は、該核酸分子中での１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の存在または非存在を指す。例えば、メチル化シトシンを含む核酸分子は、メチル化されていると見なされる（例えば、該核酸分子のメチル化状態は、メチル化である）。メチル化ヌクレオチドを少しも含まない核酸分子は、非メチル化と見なされる。

特定の核酸配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）のメチル化状態は、該配列のすべての塩基のメチル化状態を示す場合もあれば、該配列内の塩基のサブセット（例えば、１つ以上のシトシンの）のメチル化状態を示す場合もあれば、該配列内の局所的なメチル化の密度に関する情報を、メチル化が生じる配列内の正確な位置情報を提供して、または提供せずに示す場合もある。

核酸分子のヌクレオチドの遺伝子座のメチル化状態は、該核酸分子の特定の遺伝子座においてメチル化されたヌクレオチドの存在または非存在を指す。例えば、核酸分子の７番目のヌクレオチドでのシトシンのメチル化状態は、該核酸分子の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンである場合にメチル化である。同様に、核酸分子の７番目のヌクレオチドでのシトシンのメチル化状態は、該核酸分子の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（５－メチルシトシンでない）場合に非メチル化である。

該メチル化状態は、任意に、「メチル化値」によって表すことまたは示すことができる（例えば、メチル化の頻度、割合、比率、パーセント等を表す）。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素による制限消化後に存在するインタクトな核酸の量を定量することによっても、バイサルファイト反応後の増幅プロファイルを比較することによっても、バイサルファイト処理及び未処理の核酸の配列を比較することによっても生成することができる。従って、ある値、例えば、メチル化値は、メチル化状態を表し、ひいては、遺伝子座の複数のコピーにわたるメチル化状態の数値指標として使用することができる。これは、試料中のある配列のメチル化状態を閾値または基準値と比較することが望ましい場合に特に有用である。

本明細書で使用される「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座が非メチル化である場合の数に対する分子または遺伝子座がメチル化である場合の数を指す。

このように、該メチル化状態は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化状態を表す。さらに、該メチル化状態は、メチル化と関連する特定のゲノム遺伝子座での核酸セグメントの特徴を指す。かかる特徴としては、限定されないが、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化Ｃ残基（複数可）の位置、核酸の任意の特定の領域にわたるメチル化Ｃの頻度またはパーセンテージ、及び、例えば、当該対立遺伝子の起源の差に起因する対立遺伝子のメチル化の差が挙げられる。「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）」という用語はまた、生体試料の核酸の任意の特定の領域にわたるメチル化Ｃまたは非メチル化Ｃの相対濃度、絶対濃度、またはパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合、「高度メチル化」または「メチル化が増加」していると呼ばれ得る一方、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合、「低メチル化」または「メチル化が減少」していると呼ばれ得る。同様に、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域由来または異なる個体由来のもの等）と比較してメチル化されている場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して高度メチル化またはメチル化が増加していると見なされる。代替的に、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が、別の核酸配列（例えば、異なる領域由来または異なる個体由来のもの等）と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して低メチル化またはメチル化が減少していると見なされる。さらに、本明細書で使用される「メチル化パターン」という用語は、核酸のある領域にわたるメチル化及び非メチル化ヌクレオチドの集合部位を指す。２つの核酸は、当該領域にわたってメチル化及び非メチル化ヌクレオチドの数が同一または同様であるが、メチル化及び非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合、同一または同様のメチル化頻度またはメチル化パーセントを有し得るが、異なるメチル化パターンを有し得る。配列は、メチル化の程度が異なる（例えば、一方が他方に対してメチル化が増加または減少している）、頻度が異なる、またはパターンが異なる場合「差次的メチル化」、または「メチル化の差」を有する、または「異なるメチル化状態」を有するといわれる。「差次的メチル化」という用語は、がん陰性試料における核酸のメチル化のレベルまたはパターンと比較した、がん陽性試料における核酸のメチル化のレベルまたはパターンの差を指す。これはまた、手術後にがんが再発した患者と再発していない患者の間のレベルまたはパターンの差を指す場合もある。差次的メチル化及び特定のレベルまたはパターンのＤＮＡメチル化は、例えば、正しいカットオフまたは予測特性が定義されると、予後及び予測バイオマーカーである。

メチル化状態の頻度は、個体の集団または単一の個体由来の試料を説明するために使用することができる。例えば、メチル化状態の頻度５０％を有するヌクレオチド遺伝子座は、５０％の事例がメチル化されており、５０％の事例が非メチル化である。かかる頻度を用いて、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が、個体の集団または核酸の一群においてメチル化される程度を示すことができる。従って、核酸分子の第一の集団またはプールにおけるメチル化が核酸分子の第二の集団またはプールにおけるメチル化と異なる場合、該第一の集団またはプールのメチル化状態の頻度は、該第二の集団またはプールのメチル化状態の頻度と異なる。かかる頻度を用いて、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が、単一の個体においてメチル化される程度を示すこともできる。例えば、かかる頻度を用いて、組織試料由来の細胞群がヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化されているまたはメチル化されていない程度を示すことができる。

本明細書で使用される「ヌクレオチド遺伝子座」は、核酸分子におけるヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座は、核酸分子におけるメチル化ヌクレオチドの位置を指す。

通常、ヒトＤＮＡのメチル化は、隣接するグアニンとシトシンを含み、シトシンがグアニンの５’に位置するジヌクレオチド配列（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも呼ばれる）で起こる。ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンはほとんど、ヒトゲノムではメチル化されているが、ＣｐＧアイランドとして知られる特定の高ＣｐＧジヌクレオチドのゲノム領域では一部非メチル化のままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：５０３－５１４参照）。

本明細書で使用される「ＣｐＧアイランド」とは、全ゲノムＤＮＡに対して増加したＣｐＧジヌクレオチド数を含むゲノムＤＮＡの高Ｇ：Ｃ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、長さが少なくとも１００、２００、またはそれ以上の塩基対であることができ、ここでは、当該領域のＧ：Ｃ含量は、少なくとも５０％であり、観察されるＣｐＧ頻度の予測される頻度に対する比は、０．６であり、いくつかの場合では、ＣｐＧアイランドは、長さが少なくとも５００塩基対であることができ、ここでは、当該領域のＧ：Ｃ含量は、少なくとも５５％であり、観察されるＣｐＧ頻度の予測される頻度に対する比は０．６５である。予測される頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１－２８１に示される方法に従って計算することができる。例えば、予測される頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って計算することができ、ここで、Ｒは、観察されるＣｐＧ頻度の予測される頻度に対する比であり、Ａは、分析される配列におけるＣｐＧジヌクレオチドの数であり、Ｂは、分析される配列におけるヌクレオチドの総数であり、Ｃは、分析される配列におけるＣヌクレオチドの総数であり、Ｄは、分析される配列におけるＧヌクレオチドの総数である。メチル化状態は、通常、ＣｐＧアイランドの、例えば、プロモーター領域で測定される。しかしながら、ヒトゲノムにおける他の配列、例えば、ＣｐＡ及びＣｐＴがＤＮＡメチル化をしやすいことが理解されよう（例えば、Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５２３７－５２４２、Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０４：３４０－３５１、Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２８２７－２８４２、Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４３５３－４３６７、Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４５：８８８－８９４参照）。

本明細書で使用される、当該核酸分子のメチル化状態に応じて該核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬、すなわち、メチル化特異的試薬とは、該核酸分子のメチル化状態を反映する方法で核酸分子のヌクレオチド配列を変化させることができる化合物もしくは組成物または他の薬剤を指す。かかる試薬で核酸分子を処理する方法は、該核酸分子を該試薬と接触させ、所望であればさらなるステップと組み合わせ、所望のヌクレオチド配列の変化を達成することを含み得る。該核酸分子のヌクレオチド配列のかかる変化は、メチル化ヌクレオチドの各々が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらすことができる。該核酸のヌクレオチド配列のかかる変化は、非メチル化ヌクレオチドの各々が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらすことができる。該核酸のヌクレオチド配列におけるかかる変化は、選択された非メチル化ヌクレオチドの各々（例えば、各非メチル化シトシン）が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらすことができる。該核酸のヌクレオチド配列を変更するためのかかる試薬の使用は、メチル化ヌクレオチドである各ヌクレオチド（例えば、各メチル化シトシン）が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらすことができる。本明細書で使用される、選択されたヌクレオチドを修飾する試薬の使用とは、核酸分子に通常生じる４種のヌクレオチド（ＤＮＡではＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡならびにＲＮＡではＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１種のヌクレオチドを修飾する試薬を指し、従って、該試薬は他の３種のヌクレオチドを修飾することなく該１種のヌクレオチドを修飾する。１つの例示的な実施形態では、かかる試薬は、選択された非メチル化ヌクレオチドを修飾して異なるヌクレオチドを生成する。別の例示的な実施形態では、かかる試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる。例示的な試薬はバイサルファイトである。

本明細書で使用される「バイサルファイト試薬」という用語は、いくつかの実施形態では、メチル化及び非メチル化シチジンを、例えば、ＣｐＧジヌクレオチド配列において区別するためのバイサルファイト、ジサルファイト、ハイドロジェンサルファイト、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指す。

「メチル化アッセイ」という用語は、ある核酸の配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を測定するための任意のアッセイを指す。

「ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ」（メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応）という用語は、高ＣＧプライマーを用いたゲノムの全体的なスキャンを可能にし、ＣｐＧジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に焦点を合わせるものであり、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４－５９９に記載されている、当技術分野で認められている技術を指す。

「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」という用語は、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６に記載されている、当技術分野で認められている蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ技術を指す。

「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」という用語は、増幅プライマー間の、またはこれらに覆われたＣｐＧ部分を覆うメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーとも呼ばれる）が、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にするアッセイを指す。

「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ここでは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが増幅プライマー間のＣｐＧ位置を覆うメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。

「Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）という用語は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１に記載の当技術分野で認められているアッセイを指す。

「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）という用語は、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６、及び米国特許第５，７８６，１４６号に記載の当技術分野で認められているメチル化アッセイを指す。

「ＣＯＢＲＡ」（複合バイサルファイト制限分析）という用語は、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４に記載の当技術分野で認められているメチル化アッセイを指す。

「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）という用語は、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２、及びＷＯ００／２６４０１Ａ１に記載のメチル化アッセイを指す。

本明細書で使用される「選択されたヌクレオチド」とは、核酸分子に通常生じる４種のヌクレオチド（ＤＮＡではＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡならびにＲＮＡではＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１種のヌクレオチドを指し、該通常生じるヌクレオチドのメチル化誘導体を含む場合がある（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドの場合、メチル化及び非メチル化Ｃの両方が選択されたヌクレオチドの意味に含まれる）一方、メチル化された選択されたヌクレオチドは、メチル化された通常生じるヌクレオチドを特異的に指し、メチル化されていない選択されたヌクレオチドは、メチル化されていない通常生じるヌクレオチドを特異的に指す。

「メチル化特異的制限酵素」または「メチル化感受性制限酵素」という用語は、その認識部位のメチル化状態に依存して、核酸を選択的に消化する酵素を指す。認識部位がメチル化されていない、またはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合は、認識部位がメチル化されている場合には切断が起こらないか、または著しく低下した効率で起こる。認識部位がメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合は、認識部位がメチル化されていない場合には切断が起こらないか、または著しく低下した効率で起こる。好ましいのは、その認識配列が、ＣＧジヌクレオチド（例えば、ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧ等の認識配列）を含むメチル化特異的制限酵素である。いくつかの実施形態にとってさらに好ましいのは、このジヌクレオチドのシトシンが、炭素原子Ｃ５においてメチル化されている場合に切断しない制限酵素である。

本明細書で使用される「異なるヌクレオチド」とは、選択されたヌクレオチドとは化学的に異なるヌクレオチドを指し、通常は、従って、該異なるヌクレオチドは、該選択されたヌクレオチドとは異なるワトソン・クリックの塩基対合特性を有し、それにより、該選択されたヌクレオチドに相補的な通常生じるヌクレオチドは、該異なるヌクレオチドに相補的な通常生じるヌクレオチドと同じではない。例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、ＵまたはＴが異なるヌクレオチドである可能性があり、これは、ＣとＧの相補性及びＵまたはＴとＡの相補性によって例示される。本明細書で使用される、選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドまたは異なるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドとは、高ストリンジェンシー条件下で、該選択されたヌクレオチドまたは異なるヌクレオチドと、４種の通常生じるヌクレオチドのうちの３種との相補的ヌクレオチドの塩基対合より高い親和性で塩基対合するヌクレオチドを指す。相補性の例は、ＤＮＡ（例えば、Ａ－Ｔ及びＣ－Ｇ）ならびにＲＮＡ（例えば、Ａ－Ｕ及びＣ－Ｇ）のワトソン・クリック塩基対である。従って、例えば、ＧはＣと、高ストリンジェンシー条件下で、ＧがＧ、Ａ、またはＴと塩基対合するより高い親和性で塩基対合し、それ故、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、Ｇが、該選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドである。

本明細書で使用される、所与のマーカーの「感度」とは、腫瘍性試料と非腫瘍性試料を区別する閾値を超えるＤＮＡメチル化値を報告する試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陽性は、閾値を超えるＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認される新生物形成として定義され、偽陰性は、閾値未満のＤＮＡメチル化値（例えば、無疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認される新生物形成として定義される。感度の値は、従って、既知の病変試料由来の所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が疾患関連測定値の範囲内である確率を反映する。本明細書で定義される通り、計算された感度値の臨床的関連性は、臨床症状を有する対象に適用された場合に所与のマーカーがその臨床症状の存在を検出する確率の推定を表す。

本明細書で使用される、所与のマーカーの「特異度」とは、腫瘍性試料と非腫瘍性試料を区別する閾値未満のＤＮＡメチル化値を報告する非腫瘍性試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陰性は、閾値未満のＤＮＡメチル化値（例えば、無疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認される非腫瘍性試料として定義され、偽陽性は、閾値を超えるＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認される非腫瘍性試料として定義される。特異度の値は、従って、既知の非腫瘍性試料由来の所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が無疾患関連測定値の範囲内である確率を反映する。本明細書で定義される通り、計算された特異度値の臨床的関連性は、臨床症状がない患者に適用された場合に所与のマーカーがその臨床症状の欠如を検出する確率の推定を表す。

本明細書で使用される「ＡＵＣ」という用語は、「曲線下面積」の略語である。特に、これは、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線は、診断試験の異なる可能なカットポイントに関する偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに応じた感度と特異度の間のトレードオフを示す（感度の何らかの増加は、特異度の減少を伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断試験の正確さの尺度である（面積が大きいほど良好である。最適は１である。ランダム試験は、面積０．５の対角線にＲＯＣ曲線を有する。参考までに、Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．（１９７５）Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ＲＯＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、「その増殖が正常組織のものを上回り、それと調和しない異常な組織の塊」を指す。例えば、Ｗｉｌｌｉｓ ＲＡ，“Ｔｈｅ Ｓｐｒｅａｄ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｄｙ”，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ ＆ Ｃｏ，１９５２を参照されたい。

本明細書で使用される「腺腫」という用語は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの腫瘍は両性であるが、時間とともにそれらが進行して悪性になる可能性がある。

「前がん状態」または「新生物発生前」という用語及びそれらの等価物は、悪性転換を受けている任意の細胞増殖性疾患を指す。

腫瘍、腺腫、がん等の「部位」または「領域」は、該腫瘍、腺腫、がん等が位置する対象の体内の組織、器官、細胞型、解剖学的領域、身体部分等である。

本明細書で使用される「診断」試験の適用は、対象の病態や病状の検出または特定を含み、対象が所与の疾患または状態に罹患する可能性を判断し、疾患または状態を有する対象が治療に反応する可能性を判断し、疾患または状態を有する対象の予後（またはその推定進行もしくは後退）を決定し、疾患または状態を有する対象に対する治療の効果を判断する。例えば、ある診断は、腫瘍に罹患している対象の存在もしくは可能性、またはそのような対象が化合物（例えば、医薬品、例えば、薬物）または他の治療に好都合に反応する可能性を検出するために使用することができる。

本明細書で使用される「マーカー」という用語は、正常細胞と障害関連細胞（例えば、該障害と関連する非がん性細胞）（例えば、該障害と関連するがん性細胞）を、例えばそのメチル化状態に基づいて区別することによって、障害（例えば、非がん性障害）（例えば、がん性障害）と診断することができる物質（例えば、核酸または核酸のある領域）を指す。

「単離されたオリゴヌクレオチド」のように、核酸に関して使用される場合の「単離された」という用語は、ある核酸配列がその天然の供給源において通常関連する少なくとも１つの核酸混入物質から識別及び分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然に見出されるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見られる。単離されていない核酸の例としては、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞の染色体に見出される所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）、ＲＮＡ配列、例えば、多数のタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞に存在する、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列が挙げられる。しかしながら、特定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、該タンパク質を通常発現する細胞内のかかる核酸を含み、ここで、該核酸は、天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるか、または、天然に見られるものとは異なる核酸配列が横に配置されている。該単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態で存在する場合もあれば、二本鎖の形態で存在する場合もある。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、該オリゴヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわち、該オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、該オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る）。単離された核酸は、その天然のまたは通常の環境から単離後、他の核酸または分子と組み合わされ得る。例えば、単離された核酸は、例えば、異種発現のため、それが配置されている宿主細胞に含まれてもよい。

「精製された」という用語は、それらの天然の環境から取り出された、単離された、または分離された核酸またはアミノ酸配列のいずれかの分子を指す。「単離された核酸配列」は、従って、精製された核酸配列であり得る。「実質的に精製された」分子は、それらと天然に結びついている他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、及びより好ましくは少なくとも９０％含まない。本明細書で使用される「精製された」または「精製すること」という用語はまた、試料からの混入物質の除去も指す。夾雑タンパク質の除去により、試料中の目的のポリペプチドまたは核酸の割合が増加する。別の例では、組み換えポリペプチドは、植物、細菌、酵母、または哺乳類の宿主細胞で発現され、これらのポリペプチドは、宿主細胞のタンパク質の除去により精製され、組み換えポリペプチドの割合は、それにより当該試料中で増加する。

所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを「含む組成物」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含む任意の組成物を広く指す。該組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、及び他の成分（例えば、デンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液を含み得る。

「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。ある意味では、それは動物細胞または組織を指すことができる。別の意味では、それは、任意の供給源、ならびに生体試料及び環境試料由来の標本または培養を含むことを意味する。生体試料は、植物または動物（ヒトを含む）から採取してよく、流体、固体、組織、及び気体を包含する。環境試料には、環境物質、例えば、表面物質、土壌、水、及び工業試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定すると解釈されない。

本明細書で使用される、一部の状況で用いられる「遠隔試料」は、当該試料の細胞、組織、または器官供給源ではない部位から間接的に採取された試料に関連する。例えば、膵臓由来の試料物質がふん便試料中（例えば、膵臓から直接取った試料からではない）で評価される場合、この試料は遠隔試料である。

本明細書で使用される「患者」または「対象」という用語は、当該技術が提供する様々な試験に供される生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくは、ヒトを含めた哺乳類を含む。好ましい実施形態では、該対象は霊長類である。さらにいっそう好ましい実施形態では、該対象はヒトである。

本明細書で使用される「キット」という用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイとの関係において、かかる送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器の中のオリゴヌクレオチド、酵素等）及び／または支持材（例えば、緩衝剤、アッセイを行うための取扱説明書等）の保存、輸送、もしくは送達をある位置から別の位置へと可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／または支持材を含む１つ以上の筐体（例えば、箱）を具備する。本明細書で使用される「断片化したキット」という用語は、各々が全キット成分の小部分を含む２つ以上の別々の容器を含む送達システムを指す。これらの容器は、対象とされるレシピエントに対して一緒にまたは別々に供給され得る。例えば、第一の容器は、アッセイに使用するための酵素を含む場合がある一方、第二の容器はオリゴヌクレオチドを含む。「断片化されたキット」という用語は、連邦食品・医薬品・化粧品法第５２０条（ｅ）の定めにより規制されるアナライト特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することを意図しているが、それに限定されない。実際、各々が全キット成分の小部分を含む２つ以上の別々の容器を含む任意の送達システムは、「断片化されたキット」という用語に含まれる。対照的に、「混合型キット」とは、単一の容器に（例えば、所望の成分の各々を含む単一の箱に）反応アッセイの成分のすべてを含む送達システムを指す。「キット」という用語は、断片化されたキット及び混合型キットの両方が含まれる。

技術の実施形態
本明細書に提供するのは、ＨＣＣのスクリーニング（例えば、調査）用の技術であり、具体的には、限定されないが、対象におけるＨＣＣの存在を検出するための方法、組成物、及び関連する使用である。

マーカー及び／またはマーカーのパネルは、ＨＣＣ（実施例Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ参照）（例えば、ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１）を検出することができると確認された（例えば、表１及び４に示されるアノテーションを有する染色体領域）。

本明細書の開示は、ある特定の例示された実施形態に言及しているが、これらの実施形態は、例として示されており、限定としてではないことを理解されたい。

該方法は、対象から単離した生体試料中の少なくとも１つのメチル化マーカーのメチル化状態を測定することを含み、ここで、該マーカーのメチル化状態の変化は、ＨＣＣの存在、またはＨＣＣのクラスを示す。特定の実施形態は、差次的メチル化領域（ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１～４００（表１及び４より））を含み、ＨＣＣの診断（例えば、スクリーニング）に使用されるマーカーに関する。

本明細書に提供され、表１及び３に記載されるＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４００）を含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のメチル化分析が分析される実施形態に加えて、該技術は、さらに、対象におけるＨＣＣの検出に有用なＤＭＲを含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基を含むマーカーのパネルを提供する。

該技術のいくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のＣｐＧメチル化状態の分析に基づいている。

いくつかの実施形態では、本技術は、ＤＭＲ（例えば、表１及び４に提供される（例えば、ＤＭＲ１～４００））を含む少なくとも１つのマーカー内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を測定するための１つ以上のメチル化アッセイと組み合わせたバイサルファイト技術の使用を提供する。ゲノムＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化される場合もされない場合もある（代替的に、それぞれアップ及びダウンメチル化として知られる）。しかしながら、本発明の方法は、異種性の生体試料、例えば、低濃度の腫瘍細胞、またはそれ由来の生体物質の、遠隔試料（例えば、血液、器官溶出液、またはふん便）のバックグラウンド内での分析に適する。従って、かかる試料内のＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する場合、特定のＣｐＧ位置でのメチル化のレベル（例えば、パーセント、割合、比率、比、または程度）を測定するための定量的アッセイを使用してもよい。

本技術によれば、ＤＭＲを含むマーカーにおけるＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態の測定は、対象におけるＨＣＣの診断及び特徴づけの両方において有用性がある。

マーカーの組み合わせ
いくつかの実施形態では、該技術は、表１及び／または４からの２つ以上のＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ番号１～４００からの２つ以上のＤＭＲ）を含むマーカーの組み合わせのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態では、２つ以上のマーカーのメチル化状態を評価することで、対象におけるＨＣＣの存在を特定するためのスクリー二ングまたは診断の特異度及び／または感度が増加する。

様々ながんが様々なマーカーの組み合わせによって予測される。例えば、予測の特異度及び感度に関連する統計的技術によって特定される。該技術は、いくつかのがんに関する予測の組み合わせ及び有効な予測の組み合わせを特定するための方法を提供する。

例えば、マーカー及び／またはマーカーのパネルは、ＨＣＣ（実施例Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ参照）（例えば、ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１）を検出することができると認定された（例えば、表１及び４に示されるアノテーションを有する染色体領域）。

メチル化状態のアッセイ方法
５－メチルシトシンの存在に関して、核酸を分析するために最も頻繁に用いられる方法は、ＤＮＡ中の５－メチルシトシンの検出に関してＦｒｏｍｍｅｒらによって記載されたバイサルファイト法（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－３１）またはその変形に基づいている。５－メチルシトシンをマッピングするこのバイサルファイト法は、５－メチルシトシンではなくシトシンがハイドロジェンサルファイトイオン（バイサルファイトとしても知られる）と反応するという観察に基づいている。この反応は、通常、以下のステップに従って行われる。すなわち、第一に、シトシンがハイドロジェンサルファイトと反応してスルホン化シトシンを形成する。次に、このスルホン化された反応中間物の自発的な脱アミノ化でスルホン化ウラシルが得られる。最後に、このスルホン化ウラシルがアルカリ性条件下で脱スルホン化されてウラシルを生じる。ウラシルはアデニンと塩基対を形成する（それ故チミンのように振る舞う）一方、５－メチルシトシンはグアニンと塩基対合する（それ故シトシンのように振る舞う）ため、検出が可能である。これは、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を、例えば、バイサルファイトゲノム配列決定（Ｇｒｉｇｇ Ｇ，＆ Ｃｌａｒｋ Ｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９４）１６：４３１－３６、Ｇｒｉｇｇ
Ｇ，ＤＮＡ Ｓｅｑ．（１９９６）６：１８９－９８）または、例えば、米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により可能にする。

いくつかの従来の技術は、分析されるＤＮＡをアガロースのマトリックスに封入し、それにより、ＤＮＡの拡散及び再生を防止し（バイサルファイトは一本鎖ＤＮＡとしか反応しない）、高速透析で沈殿及び精製のステップを置き換える（Ｏｌｅｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４－６）ことを含む方法に関する。それ故、個々の細胞のメチル化状態を分析することが可能であり、この方法の有用性及び感度を説明している。５－メチルシトシンを検出するための従来法の概説は、Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２５５に示されている。

該バイサルファイト技術は通常、バイサルファイト処理に続いて、既知の核酸の短い特定の断片を増幅し、その後、その生成物を配列決定（Ｏｌｅｋ ＆ Ｗａｌｔｅｒ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２７５－６）によって分析するか、またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：２５２９－３１、ＷＯ９５／００６６９、米国特許第６，２５１，５９４号）で個々のシトシン位置を分析することを含む。いくつかの方法は、酵素消化を用いる（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－４）。ハイブリダイゼーションによる検出もまた、当技術分野で記載されている（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化の検出のためのバイサルファイト技術の使用が記載されている（Ｇｒｉｇｇ
＆ Ｃｌａｒｋ（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６：４３１－６、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．６：３８７－９５、Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：６９５、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５７：２６１－４、ＷＯ９７４６７０５、ＷＯ９５１５３７３）。

様々なメチル化アッセイ手法が当技術分野で知られており、本発明の技術に従うバイサルファイト処理と組み合わせて使用することができる。これらのアッセイは、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態の測定を可能にする。かかるアッセイには、他の技術の中でも、バイサルファイト処理核酸の配列決定、ＰＣＲ（配列特異的増幅用）、サザンブロット分析、及びメチル化感受性制限酵素の使用が含まれる。

例えば、ゲノム配列決定は、バイサルファイト処理を使用することによってメチル化パターン及び５－メチルシトシン分布の分析について単純化されている（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１）。さらに、バイサルファイト変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素による消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９に記載されるように、または、ＣＯＢＲＡ（複合バイサルファイト制限分析）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）として知られる方法に具体化されているように、メチル化状態の評価に用途を見出している。

ＣＯＢＲＡ（商標）分析は、少量のゲノムＤＮＡ中、特定の遺伝子座でＤＮＡメチル化レベルを測定するのに有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４，１９９７）。簡潔には、制限酵素による消化を用いて、重亜硫酸ナトリウムで処理されたＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化依存性の配列の相違を明らかにする。メチル化依存性の配列の相違は、Ｆｒｏｍｍｅｒらによって記載された手順（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１，１９９２）に従う標準的なバイサルファイト処理によって最初にゲノムＤＮＡに導入される。バイサルファイト変換ＤＮＡのＰＣＲ増幅をその後、目的のＣｐＧアイランドに対して特異的なプライマーを使用して行い、続いて、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的標識ハイブリダイゼーションプローブを用いた検出を行う。元のＤＮＡ試料中のメチル化レベルは、消化及び未消化のＰＣＲ産物の相対量によって、広範囲のＤＮＡメチル化レベルにわたって直線的に定量的に表される。さらに、この技術は、確実に、顕微解剖されたパラフィン包埋組織試料由来のＤＮＡに適用することができる。

ＣＯＢＲＡ（商標）分析用の通常の試薬（例えば、通常のＣＯＢＲＡ（商標）ベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）に対するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切な緩衝剤、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、対照のハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ用のキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドが含まれ得る。さらに、バイサルファイト変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝剤、スルホン化緩衝剤、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）、脱スルホン化緩衝剤、及びＤＮＡ回収成分を含み得る。

好ましくは、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ技術）（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２，１９９９）等のアッセイが単独で、または1つ以上のこれら方法と組み合わせて使用される。

「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ、すなわち技術は、バイサルファイト処理ＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づくメチル化の差を評価するための定量的方法である。増幅プライマー間の、またはこれらに覆われたＣｐＧ位置を覆うメチル化特異的ブロッキングプローブ（「ブロッカー」）が、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。

「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ここでは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが増幅プライマー間のＣｐＧ位置を覆うメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。このＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用してもよい。

ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）分析用の通常の試薬（例えば、通常のＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、またはバイサルファイト処理ＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド等）に対するＰＣＲプライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド、最適化ＰＣＲ緩衝剤及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得る。

ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、ＣｐＧアイランド内の事実上任意の群のＣｐＧ部位のメチル化状態を、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に評価することを可能にする（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）。簡潔には、ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで修飾し、これにより、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンをウラシルに変換し、その生成物を続いて、非メチル化に対比してメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅する。ＭＳＰは、少量のＤＮＡしか必要とせず、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に感受性であり、パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡで行うことができる。ＭＳＰ分析用の通常の試薬（例えば、通常のＭＳＰベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）に対するメチル化及び非メチル化ＰＣＲプライマー、最適化ＰＣＲ緩衝剤及びデオキシヌクレオチド、ならびに特定のプローブを含み得る。

ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップ後にさらなる操作を必要としない蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）。簡潔には、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、ゲノムＤＮＡの混合試料から始め、標準的な手順に従ってこれを重亜硫酸ナトリウム反応で変換してメチル化依存性の配列の相違の混合プールにする（このバイサルファイト工程で非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される）。その後、例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドに重なるＰＣＲプライマーを用い、「偏りのある」反応で蛍光ベースのＰＣＲを行う。配列識別は、増幅工程のレベル及び蛍光検出工程のレベルの両方で起こる。

ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ試料におけるメチル化パターンについての定量試験として使用され、配列識別はプローブのハイブリダイゼーションのレベルで起こる。定量型では、そのＰＣＲ反応は、特定の推定メチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下、メチル化特異的増幅を与える。投入したＤＮＡ量に対する偏りのない対照は、プライマーもプローブも、いずれのＣｐＧジヌクレオチドにも重ならない反応によって提供される。代替的に、ゲノムメチル化の定性試験は、偏りのあるＰＣＲプールを、既知のメチル化部位を覆わない対照オリゴヌクレオチドで（例えば、蛍光ベース型のＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技術）、または潜在的なメチル化部位を覆うオリゴヌクレオチドのいずれかでプローブすることによって達成される。

ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、任意の適切なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ等）とともに使用される。例えば、いくつかの用途では、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、例えば、ＭＳＰプライマー、及び／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチド及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる２組のＰＣＲ反応のうちの１つに供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャ」分子で二重に標識され、比較的高ＧＣ含量の領域に特異的であるように設計されているため、ＰＣＲサイクルにおいて、順方向または逆方法プライマーより約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがＰＣＲのアニーリング／伸長ステップの過程で完全にハイブリダイズされたままになる。ＰＣＲの過程でＴａｑポリメラーゼが新たな鎖を酵素的に合成するため、最終的にアニーリングされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに至る。Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性は、その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化して外し、該蛍光レポーター分子を放出して、ここでクエンチが外された状態のそのシグナルの定量的検出のため、リアルタイム蛍光検出システムを用いる。

ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析用の通常の試薬（例えば、通常のＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）に対するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）プローブ、最適化ＰＣＲ緩衝剤及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得る。

ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料におけるメチル化パターンの代替的な定量試験であり、配列識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量型では、そのＰＣＲ反応は、特定の推定メチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下、偏りのない増幅を与える。投入したＤＮＡ量に対する偏りのない対照は、プライマーもプローブも、いずれのＣｐＧジヌクレオチドにも重ならない反応によって提供される。代替的に、ゲノムメチル化の定性試験は、偏りのあるＰＣＲプールを、既知のメチル化部位を覆わない対照オリゴヌクレオチドで（蛍光ベース型のＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技術）、または潜在的なメチル化部位を覆うオリゴヌクレオチドでプローブすることによって達成される。

ＱＭ（商標）工程は、任意の適切なプローブ、例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ等とともに増幅工程で使用され得る。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、偏りのないプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャ」分子で二重に標識され、比較的高ＧＣ含量の領域に特異的であるように設計されているため、ＰＣＲサイクルにおいて、順方向または逆方法プライマーより約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがＰＣＲのアニーリング／伸長ステップの過程で完全にハイブリダイズされたままになる。ＰＣＲの過程でＴａｑポリメラーゼが新たな鎖を酵素的に合成するため、最終的にアニーリングされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに至る。Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性は、その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化して外し、該蛍光レポーター分子を放出して、ここでクエンチが外された状態のそのシグナルの定量的検出のため、リアルタイム蛍光検出システムを用いる。ＱＭ（商標）分析用の通常の試薬（例えば、通常のＱＭ（商標）ベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）に対するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）プローブ、最適化ＰＣＲ緩衝剤及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼを含み得る。

Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）技術は、ＤＮＡのバイサルファイト処理と、それに続く単一ヌクレオチドのプライマー伸長に基づく特定のＣｐＧ部位でのメチル化の違いを評価するための定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）。簡潔には、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させて非メチル化シトシンをウラシルに変換すると同時に５－メチルシトシンを変化させずにおく。所望の標的配列の増幅をその後、バイサルファイト変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを用いて行い、得られた生成物を単離し、目的のＣｐＧ部位でのメチル化分析用の鋳型として使用する。少量のＤＮＡ（例えば、顕微解剖された病理切片）を分析することができ、ＣｐＧ部位でのメチル化状態を測定するための制限酵素の利用を回避する。

Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）分析用の通常の試薬（例えば、通常のＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）ベースのキットに見出だされ得るもの）としては、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、バイサルファイト処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）に対するＰＣＲプライマー、最適化ＰＣＲ緩衝剤及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、特定の遺伝子に対するＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、反応緩衝剤（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ反応用）、ならびに標識ヌクレオチドを含み得る。さらに、バイサルファイト変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝剤、スルホン化緩衝剤、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）、脱スルホン化緩衝剤、及びＤＮＡ回収成分が含まれ得る。

Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）は、すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換させるための核酸のバイサルファイト処理で始まり、制限酵素による消化（例えば、ＭｓｐＩ等のＣＧ配列を含む部位を認識する酵素による）及びアダプターリガンドへの結合後の断片の完全な配列決定が続く。制限酵素を選択することで、ＣｐＧ高密度領域用の断片を濃縮し、分析過程で複数の遺伝子位置に位置し得る不必要な配列の数を減らす。このように、ＲＲＢＳは、配列決定用の制限断片のサブセットを選択することにより（例えば、分取ゲル電気泳動を用いるサイズ選択により）核酸試料の複雑さを減少させる。全ゲノムバイサルファイト配列決定とは対照的に、制限酵素による消化によって生成されたすべての断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドに関するＤＮＡメチル化情報を含む。このように、ＲＲＢＳは、それらの領域内に高頻度の制限酵素切断部位を有するプロモーター、ＣｐＧアイランド、及び他のゲノムの特徴用の試料を濃縮し、ひいては、1つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するアッセイを提供する。

ＲＲＢＳの典型的なプロトコルは、ＭｓｐＩ等の制限酵素で核酸試料を消化するステップ、オーバーハングを埋める及びＡ－テーリングのステップ、アダプターを結合するステップ、バイサルファイト変換ステップ、ならびにＰＣＲのステップを含む。例えば、ｅｔ
ａｌ．（２００５）“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１３３－６、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：５８６８－７７を参照されたい。

いくつかの実施形態では、定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）アッセイを用いてメチル化状態を評価する。一次反応における増幅（反応１）及び標的プローブ切断（反応２）、ならびに二次反応におけるＦＲＥＴ切断及び蛍光シグナル生成（反応３）を含む３つの反応が各ＱｕＡＲＴＳアッセイで連続して起こる。標的核酸が特定のプライマーで増幅された場合、フラップ配列を有する特定の検出プローブが当該アンプリコンにゆるく結合する。該標的結合部位における特定の侵入性オリゴヌクレオチドの存在が亀裂を引き起こし、該検出プローブと該フラップ配列の間を切断することにより該フラップ配列を放出する。該フラップ配列は、対応するＦＲＥＴカセットの非ヘアピン部分と相補的である。従って、該フラップ配列は、該ＦＲＥＴカセットに対して侵入性のオリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットのフルオロフォアとクエンチャの間の切断をもたらし、これが蛍光シグナルを生成する。この切断反応は、１つの標的につき複数のプローブを切断し、ひいては１つのフラップにつき複数のフルオロフォアを放出し、指数関数的シグナル増幅を与える。ＱｕＡＲＴＳは、ＦＲＥＴカセットを異なる色素とともに用いることによって、単一の反応において複数の標的を十分に検出することができる。例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ
ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９、米国特許出願第１２／９４６，７３７号、第１２／９４６，７４５号、第１２／９４６，７５２号、及び第６１／５４８，６３９号を参照されたい。

「バイサルファイト試薬」という用語は、バイサルファイト、ジサルファイト、ハイドロジェンサルファイト、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指し、本明細書に開示の通り、メチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の区別に有用である。当該処理方法は、当技術分野で知られている（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５）。該バイサルファイト処理は、ｎ－アルキレングリコールまたはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）等であるがこれらに限定されない変性溶媒の存在下で、または、ジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行うのが好ましい。いくつかの実施形態では、該変性溶媒は、濃度１％～３５％（ｖ／ｖ）で使用される。いくつかの実施形態では、該バイサルファイト反応は、クロマン誘導体、例えば、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン２－カルボン酸またはトリヒドロキシベンゾン酸及びその誘導体、例えば、没食子酸等であるがこれらに限定されない捕捉剤の存在下で行われる（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５参照）。このバイサルファイト変換は、好ましくは、反応温度３０℃～７０℃で行われ、それにより、該温度は反応中に短時間８５℃超に上昇する（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５参照）。このバイサルファイトで処理されたＤＮＡは、好ましくは、定量化の前に精製される。これは、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、これに限定されないが、限外濾過により、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）製）を用いて行ってもよい。この精製は、修正された製造業者のプロトコルに従って行われる（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５参照）。

いくつかの実施形態では、処理されたＤＮＡの断片は、本発明に従うプライマーオリゴヌクレオチド（例えば、表２参照）と増幅酵素のセットを用いて増幅される。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、１つの同じ反応容器で同時に行うことができる。通常、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。アンプリコンは、通常、長さ１００～２０００塩基対である。

該方法の別の実施形態では、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４００、表１及び４）を含むマーカー内またはその近くのＣｐＧ位置のメチル化状態は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。この技術（ＭＳＰ）は、Ｈｅｒｍａｎの米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。バイサルファイト処理ＤＮＡの増幅用のメチル化状態特異的プライマーの使用で、メチル化核酸と非メチル化核酸の識別が可能になる。ＭＳＰプライマー対は、バイサルファイト処理ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。従って、当該プライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧのＣ位置の位置に「Ｔ」を含む。

増幅によって得られた断片は、直接的または間接的に検出可能な標識を担持することができる。いくつかの実施形態では、これらの標識は、蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出できる典型的な質量を有する分離可能な分子断片である。該標識が質量標識の場合、いくつかの実施形態は、標識されたアンプリコンが単一の正または負の正味電荷を有すると定め、質量分析計でのより良好な検出性を可能にする。この検出は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を用いて実施及び可視化され得る。

これらのアッセイ技術に適したＤＮＡの単離方法は、当技術分野で知られている。特に、いくつかの実施形態は、米国特許出願第１３／４７０，２５１号（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”）に記載の核酸の単離を含む。

方法
いくつかの実施形態では、以下のステップを含む技術、すなわち、方法を提供する。
１）対象から採取される核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、血液試料（例えば、血漿試料）等の体液、ふん便試料、または組織試料から単離されたもの）を、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４００（表１及び４より））を含む少なくとも１つのマーカー内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させ、
２）ＨＣＣの欠如を検出する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異度で与えられる）。

いくつかの実施形態では、以下のステップを含む技術、すなわち、方法を提供する。
１）対象から採取される核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、血液試料（例えば、血漿試料）等の体液、ふん便試料、または組織試料から単離されたもの）を、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４００（表１及び４より））を含む少なくとも１つのマーカー内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させ、
２）ＨＣＣを分類する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異度で与えられる）。
好ましくは、該感度は約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、もしくは約８０％～約８５％である。好ましくは、該特異度は、約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、もしくは約８０％～約８５％である。

ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含め、任意の方法で単離され得る。簡潔には、目的のＤＮＡが細胞膜に封入されている場合、当該生体試料を、酵素的、化学的、または機械的手段で破壊及び溶解する必要がある。そのＤＮＡ溶液からその後、例えば、プロテイナーゼＫで消化することにより、タンパク質及び他の混入物質が除去され得る。そのゲノムＤＮＡを次いでその溶液から回収する。これは、塩析、有機抽出、またはそのＤＮＡを固相支持体に結合させることを含めた様々な方法で行われ得る。方法の選択は、時間、費用、及びＤＮＡの必要量を含めたいくつかの要因に影響を受ける。腫瘍性物または前腫瘍性物を含むすべての臨床試料タイプ、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、ふん便、結腸溶出液、尿、血漿、血清、全血、単離された血球、血液から単離された細胞、及びそれらの組み合わせが本発明の方法での使用に適する。

該技術は、試料を調製するため及び試験用の核酸を与えるために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ふん便試料から、または血液から、または血漿試料から、例えば、米国特許出願第６１／４８５３８６号に詳述されている直接遺伝子捕獲または関連する方法を用いて単離される。

ゲノムＤＮＡ試料をその後、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４００、例えば、表１及び４により示される）を含む少なくとも１つのマーカー内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬、または一連の試薬で処理する。

いくつかの実施形態では、該試薬は、５’位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換する。しかしながら、いくつかの実施形態では、該試薬は、メチル化感受性制限酵素であり得る。

いくつかの実施形態では、該ゲノムＤＮＡ試料は、５’位でメチル化されていないシトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換されるような方法で処理される。いくつかの実施形態では、この処理は、バイサルファイト（ハイドロジェンサルファイト、ジサルファイト）を用いて行われ、その後、アルカリ加水分解が続く。

処理された核酸をその後分析し、標的遺伝子配列（ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１～４００、例えば、表１及び４に示すものから選択される少なくとも１つのＤＭＲを含むマーカー由来の少なくとも１つの遺伝子、ゲノム配列、またはヌクレオチド）のメチル化状態を決定する。分析方法は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で知られているもの、例えば、本明細書に記載のＱｕＡＲＴＳ及びＭＳＰから選択され得る。

該技術は、ＨＣＣと関連する任意の試料の分析に関する。例えば、いくつかの実施形態では、該試料は、患者由来の血漿試料を含む。いくつかの実施形態では、該試料は、患者から採取された組織及び／または体液を含む。いくつかの実施形態では、該試料は、肝臓組織を含む。いくつかの実施形態では、該組織は、分泌物を含む。いくつかの実施形態では、該試料は、血液、血漿、及び／または血清を含む。いくつかの実施形態では、該対象はヒトである。これらの試料は、上部消化管、下部消化管が起源であっても、上部消化管及び下部消化管の両方由来の細胞、組織、及び／または分泌物を含んでもよい。該試料は、肝臓、胆管、膵臓、胃、結腸、直腸、食道、小腸、虫垂、十二指腸、ポリープ、胆嚢、肛門、及び／または腹膜由来の細胞、分泌物、または組織を含み得る。いくつかの実施形態では、該試料は、細胞液、腹水、尿、便、膵液、内視鏡検査の過程で得られる液、血液、粘液、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、該試料はふん便試料である。

かかる試料は、当技術分野で知られている、例えば、当業者に明らかな様々な手段で採取することができる。例えば、尿及び便試料は容易に獲得可能である一方、血液、腹水、血清、または膵液試料は、例えば針と注射器を用いることによって非経口的に採取することができる。無細胞または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及び濾過が挙げられるがこれらに限定されない当技術分野で知られている様々な技術に試料を供することによって獲得することができる。侵襲的な技術を用いずに試料を採取することが一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織切片、及び生検標本などの試料を得ることが好ましい場合もある。

該技術のいくつかの実施形態では、対象のＨＣＣを診断する方法を提供する。本明細書で使用される「診断すること」及び「診断」という用語は、ある対象が所与の疾患または状態に罹患しているかどうか、または将来所与の疾患または状態を発症し得るかどうかを当業者が推定及びさらには判断することができる方法を指す。当業者は、多くの場合１つ以上の診断上の指標、例えば、該状態の存在、重症度、または非存在をそのメチル化状態が示すバイオマーカー（例えば、本明細書に開示するＤＭＲ）に基づいて診断する。

診断とともに、臨床的ながんの予後（例えば、ＨＣＣについて）は、がんの悪性度及び腫瘍の再発の可能性を判断して最も効果的な治療を計画することに関わる。より正確な予後診断を行うことができるか、またはがんの発症の潜在的なリスクさえも評価することができれば、当該患者にとって適切な治療、及び場合によってはあまり厳しくない治療を選択することができる。がんのバイオマーカーの評価（例えば、メチル化状態の測定）は、予後が良好であり、及び／またはがんの発症のリスクが低く、治療を必要としないか、または限定的な治療を必要とする対象を、がんの発症またはがんの再発の可能性がより高く、より集中的な治療が有効である対象と切り離すのに有用である。

このように、本明細書で使用される「診断を行うこと」または「診断すること」とは、さらに、がんを発症するリスクを判断することまたは予後を決定することを含み、これにより、本明細書に開示される診断的バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）の測定値に基づいて、臨床転帰が予測され（医療の有無にかかわらず）、適切な治療が選択され（もしくは治療が有効かどうか）、または現行の治療が管理され及び潜在的にその治療の変更がなされ得る。さらに、本開示の主題のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの経時的な複数の測定を行い、診断及び／または予後を容易にすることができる。バイオマーカーの時間変化を用いて臨床転帰を予測し、ＨＣＣの進行を監視し、及び／またはがんに対する適切な治療の有効性を観察することができる。かかる実施形態では、例えば、有効な治療の過程で、生体試料における本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）（及び観察される場合には潜在的に１つ以上のさらなるバイオマーカー）のメチル化状態の経時的変化を期待し得る。

本開示の主題はさらに、いくつかの実施形態では、対象におけるＨＣＣの予防もしくは治療を開始または継続するかどうかを判断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、当該対象からある期間にわたって一連の生体試料を供給し、該一連の生体試料を分析して該生体試料の各々における本明細書に開示する少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態を測定し、該生体試料の各々における該バイオマーカーの１つ以上のメチル化状態の任意の測定可能な変化を比較することを含む。該期間にわたるバイオマーカーのメチル化状態の任意の変化を用いて、ＨＣＣの発症リスクを予測し、臨床転帰を予測し、該がんの予防もしくは治療を開始または継続するかどうかを判断し、現行の治療が効果的にＨＣＣを治療しているかどうかを判断することができる。例えば、第一の時点を治療の開始前に選択することができ、第二の時点を該治療の開始後のある時点で選択することができる。メチル化状態は、異なる時点から採取された試料の各々で測定することができ、定性的及び／または定量的な違いが指摘される。異なる試料からのバイオマーカーレベルのメチル化状態の変化は、当該対象における障害のリスク（例えば、ＨＣＣのリスク）、予後、治療有効性の判断、及び／または進行と相関し得る。

好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、疾患の初期段階での、例えば、該疾患の症状が現れる前の治療または診断用である。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、ある臨床ステージでの疾患の治療または診断用である。

述べたように、いくつかの実施形態では、１つ以上の診断または予後バイオマーカーの複数の測定を行うことができ、該マーカーの時間変化を用いて診断または予後を判断することができる。例えば、診断マーカーを最初の時点で測定し、第二の時点で再度測定することができる。かかる実施形態では、最初の時点から第二の時点への該マーカーの増加は、特定のタイプもしくは重症度の障害、または所与の予後の診断となり得る。同様に、最初の時点から第二の時点への該マーカーの減少は、特定のタイプもしくは重症度の障害、または所与の予後の指標となり得る。さらに、１つ以上のマーカーの変化の程度は、障害の重症度及び将来的な有害事象に関連し得る。当業者には、ある特定の実施形態では複数の時点で同じバイオマーカーについて比較測定を行うことができる一方で、所与のバイオマーカーを１つの時点で、第二のバイオマーカーを第二の時点で測定することもでき、これらのマーカーの比較が診断情報を与え得ることが理解されよう。

本明細書で使用される「予後を判断する」という表現は、当業者がある対象における状態の経過または転帰を予測することができる方法を指す。「予後」という用語は、１００％の正確さで状態の経過または転帰を予測する能力を指すのではなく、バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態に基づいて、所与の経過または転帰が予想通りに事実上起こる可能性が高いことを指すのでもない。その代わり、当業者には、「予後」という用語が、ある特定の経過または転帰が起こる確率の増加、すなわち、ある経過または転帰が、所与の状態を示している対象において、該状態を示していない個体と比較して起こりやすいことを指すことが理解されよう。例えば、該状態を示していない（例えば、１つ以上のＤＭＲの通常のメチル化状態を有する）個体では、所与の転帰の可能性は極めて低い場合がある。

いくつかの実施形態では、ある統計分析は、予後指標を有害転帰への傾向と結びつける。例えば、いくつかの実施形態では、統計的有意水準で測定される、障害を有さない患者由来の正常対照試料のものと異なるメチル化状態は、ある対象が、該対照試料におけるメチル化状態とより類似したレベルを有する対象より、ある障害に罹患しやすいことを示唆する可能性がある。さらに、ベースライン（例えば、「正常」）レベルからのメチル化状態の変化は、対象の予後を反映する可能性があり、メチル化状態の変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合、２つ以上の集団を比較し、信頼区間及び／またはｐ値を決定することによって決定される（例えば、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ
Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３参照）。本主題の例示的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、及び９９．９９％であり、例示的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。

他の実施形態では、本明細書に開示する予後または診断バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態の変化度の閾値を規定することができ、生体試料中のバイオマーカーのメチル化状態の変化度を、単純に該メチル化状態の変化度の閾値と比較する。本明細書に提供するバイオマーカーのメチル化状態における好ましい閾値変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、及び約１５０％である。さらに他の実施形態では、「ノモグラム」を規定することができ、これにより、予後または診断指標（バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ）のメチル化状態が、所与の転帰への関連する傾向と直接的に関連する。当業者であれば、母集団の平均ではなく個々の試料の測定値が参照されるため、この測定における不確実性がマーカー濃度の不確実性と同じであるという理解のもとで、２つの数値を関連させるためのかかるノモグラムの使用に精通している。

いくつかの実施形態では、生体試料から得られる結果を対照試料から得られる結果と比較することができるように、対照試料を生体試料と同時に分析する。さらに、生体試料についてのアッセイの結果が比較され得る標準曲線が提供され得ることが企図される。かかる標準曲線は、バイオマーカーのメチル化状態をアッセイ単位、例えば、蛍光標識が使用される場合、蛍光シグナル強度の関数として示す。複数のドナーから採取した試料を用いて、標準曲線は、正常組織における１つ以上のバイオマーカーの対照メチル化状態に関してだけでなく、化生のドナーまたは障害（例えば、ＨＣＣ）を有するドナーから採取した組織における１つ以上のバイオマーカーの「リスクがある」レベルに関しても提供することができる。該方法のある特定の実施形態では、ある対象は、該対象由来の生体試料において本明細書に提供する１つ以上のＤＭＲの異常なメチル化状態を特定すると、ＨＣＣを有すると特定される。該方法の他の実施形態では、当該対象由来の生体試料における１つ以上のかかるバイオマーカーの異常なメチル化状態の検出により、結果的に該対象がＨＣＣを有すると特定される。

マーカーの分析は、１つの試験試料内のさらなるマーカーとは別に行っても同時に行ってもよい。例えば、多様な試料の効率的な処理のため、及び潜在的に診断及び／または予後の正確さを高めるために、いくつかのマーカーを１つの試験に統合することができる。さらに、当業者には、同じ対象由来の複数の試料（例えば、連続する時点での）を調べる価値が認識されよう。連続する試料のかかる試験は、マーカーのメチル化状態の経時変化の特定を可能にし得る。メチル化状態の変化だけでなく、メチル化状態の変化の欠如は、疾患状態に関する有用な情報を提供することができる。これに含まれるのは、事象の発生からのおおよその時間、救済可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な治療の有効性、ならびに将来的な事象のリスクを含めた当該対象の転帰の同定であるがこれらに限定されない。

バイオマーカーの分析は、様々な物理的形式で実行することができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を使用して、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。代替的に、単一試料の形式を開発して、例えば、外来輸送時、または緊急治療室の設定において、適時に緊急の処理及び診断を容易にすることができる。

いくつかの実施形態では、該対象は、対照のメチル化状態と比較した場合に、当該試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な違いがあれば、ＨＣＣを有すると診断される。反対に、当該生体試料中でメチル化状態に変化が特定されない場合、該対象は、ＨＣＣではない、ＨＣＣのリスクがない、またはＨＣＣのリスクが低いと特定され得る。これに関して、ＨＣＣまたはそのリスクを有する対象は、ＨＣＣまたはそのリスクが低～実質的にない対象と区別され得る。ＨＣＣを発症するリスクがあるそれらの対象は、より集中的な及び／または定期的なスクリーニングの予定を入れられ得る。

上述の通り、本技術の方法の実施形態に応じて、１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態の変化を検出することは、定性的な測定である場合もあれば、定量的な測定である場合もある。従って、ある対象がＨＣＣを有する、またはＨＣＣを発症するリスクを有すると診断するステップは、ある特定の閾値の測定がなされること、例えば、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態が、所定の対照メチル化状態とは異なることを示す。該方法のいくつかの実施形態では、該対照のメチル化状態は、該バイオマーカーの任意の検出可能なメチル化状態である。対照試料が生体試料と同時に試験される方法の他の実施形態では、該所定のメチル化状態は、該対照試料のメチル化状態である。該方法の他の実施形態では、該所定のメチル化状態は、標準曲線に基づいている、及び／または標準曲線によって特定される。該方法の他の実施形態では、該所定のメチル化状態は、具体的な状態または状態の範囲である。従って、該所定のメチル化状態は、一部には、実施されている方法の実施形態及び所望の特異度等に基づいて、当業者には明白であろう許容範囲内で選択することができる。

さらに、診断方法に関しては、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は、温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。好ましい哺乳類は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される「対象」という用語には、ヒト及び動物の両方の対象が含まれる。従って、動物の治療上の使用を本明細書に提供する。従って、本技術は、ヒト等の哺乳類だけでなく、絶滅の危機に瀕した重要な動物、例えば、シベリアトラ、経済的に重要な動物、例えば、ヒトが消費するために養殖された動物、及び／またはヒトにとって社会的に重要な動物、例えば、ペットとしてまたは動物園で飼育されている動物の診断を提供する。かかる動物の例としては、限定されないが、肉食動物、例えば、ネコ及びイヌ、ブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｈｏｇ）、及びイノシシを含めたブタ（ｓｗｉｎｅ）、反芻動物及び／または有蹄動物、例えば、畜牛、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダ、ならびにウマが挙げられる。従って、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）等が挙げられるがこれらに限定されない家畜類の診断及び治療もまた提供する。本開示の主題はさらに、対象におけるＨＣＣを診断するシステムを含む。該システムは、例えば、生体試料を採取した対象におけるかかる障害のリスクをスクリーニングするために使用することができる市販のキットとして提供され得る。本技術に従って提供される例示的なシステムは、表１及び／または４に示すＤＭＲのメチル化状態を評価することを含む。

実施例Ｉ．
本実施例は、ＨＣＣのＤＮＡ試料を、正常対照（例えば、肝硬変を有するまたは有さない非ＨＣＣの個体）由来のＤＮＡと区別するための、３１１の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の特定を記載する。

実験は、四段階で行った。

第一に、ＤＮＡメチル化マーカーの発見を、凍結腫瘍ＨＣＣ組織（肝硬変を伴うもの及び伴わないもの）ならびに凍結正常肝臓組織（肝硬変を伴うもの及び伴わないもの）、ならびに健常志願者由来のバフィーコート試料から抽出したＤＮＡに対してＲＲＢＳを用いて行った。判別差次的メチル化領域（ＤＭＲ）は、厳密な濾過基準により特定し、同じまたは拡大した標本のいずれかで再度アッセイし、リアルタイムメチル化特異的定量ＰＣＲアッセイ（ｑＭＳＰ）を用いた結果の再現性を確保した（技術的検証）。

第二に、候補マーカーを、独立した保存症例及び対照の組織から抽出したＤＮＡに対する盲検ｑＭＳＰアッセイによる生物学的検証の基準をさらにランク付けすることによって選択した。

第三に、これら候補マーカーに関する配列決定の結果を、汎ＧＩ ＲＲＢＳ配列決定セットにわたって比較し、メチル化特異度のレベルを測定した。

第四に、別の決定モデルを適用し、大部分のＤＮＡが非肝臓源由来である血液ベースの環境で最も良好に機能するであろうＨＣＣマーカーの小セットを選択した。選択されたマーカーを次に、独立した血漿試料にて盲検で調べ、臨床媒体でのＨＣＣ検出を評価した。

図１にこれら四段階を要約する。

結果
偏りのない全メチローム配列決定を１８のＨＣＣ及び３５の対照（肝硬変９、正常肝２６）組織から抽出したＤＮＡに対して行った。組織検証を通じて、７５のＨＣＣ及び２９の対照（肝硬変１６、正常肝１３）由来の独立した組織から抽出したＤＮＡにて、メチル化特異的ＰＣＲを用いて最良のＤＭＲを確認した。２１のＨＣＣ症例（ＢＣＬＣ［バルセロナ臨床肝癌病期分類］ステージＡ ９、ステージＢ ６、ステージＣ ６）及び３３の肝硬変対照を含む独立した患者のセット由来の血漿ＤＮＡに対して、上位ＤＭＲを標的とした盲検定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅アッセイを次に行った。再起分割決定分析を用いて、最良のＤＭＲの組み合わせを特定した。最初の配列決定で、ＡＵＣが０．７５超の３１１のＤＭＲを特定した。生物学的検証の後、上位１２のＤＭＲ（ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１）を選択し、血漿試験に進めた。プラズマ中の最も多くの判別マーカーであるＥＭＸ１は、単独でＡＵＣ０．８９を有していた。相補的な３マーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＬＲＲＣ４、及びＢＤＨ１）は、血漿中２０／２１のＨＣＣ及び３２／３３の対照を特定し、１つのＨＣＣは低レベルのＢＤＨ１を有し、１つの対照は上昇したＬＲＲＣ４を有していた。このパネルは、９７％の特異度（９５％ＣＩ、８２％～１００％）でＨＣＣに対して９５％の感度（９５％ＣＩ、７４％～１００％）であり、ＡＵＣ０．９８を達成した（図２参照）。この生物組織検証段階からのＡＣＰ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、及びＴＳＰＹＬ５に対する受信者操作特性曲線下面積の情報を図３Ａ～Ｉで示す。

図４Ａ～ＣＣは、生物組織検証データからの２７の胃癌マーカー（フィット点分析を加えて２９）の箱ひげ図（対数目盛）を提供する。試料は、左端に正常肝、次に肝硬変なしのＨＣＣ、肝硬変を有するＨＣＣ、及び肝硬変対照（炎症性）で並べている。縦軸は、メチル化度である（β－アクチン鎖に対して正規化）。

図５は、９５％正常特異度のマトリックス形式での７５のＨＣＣ組織試料及び２９の対照（肝硬変１６、正常肝１３）における２７のＨＣＣ癌マーカーの性能を示す。マーカーは縦に、試料は横に記載している。試料は、左端に正常肝（ＮＩ）、次に肝硬変なしのＨＣＣ（ＨＮ）、肝硬変を有するＨＣＣ（ＨＣ）、及び肝硬変対照（Ｉｎ）で並べている。ポジティブヒットはライトグレーであり、ミスはダークグレーである。このプロットにより、マーカーを補完的に評価することができる。注：２つのマーカー、すなわち、ＴＢＸ１５及びＥＧＲ２は、ｑＭＳＰデータに対してフィット点法を用いて二度目に分析し、ここに含める。

表１は、ＨＣＣを正常対照と区別するためのＤＭＲの情報を示す。

表２は、表１から選択されたＤＭＲに関するプライマー情報を示す。

表３は、ＨＣＣと正常肝の比較における特定のＤＭＲのＡＵＣ及び比の情報を提供し、この比は、症例のメチル化度の対照のメチル化度に対する比率である。

かかる実験はさらに、肝臓（癌及び正常）ではメチル化されるが正常白血球ＤＮＡ試料ではされない８９の肝上皮ＤＭＲの特定をもたらした。

表４は、肝臓（癌及び正常）ではメチル化されるが正常白血球ＤＮＡ試料ではされない肝上皮ＤＭＲに関する情報を示す。

試験対象及び試料
この試験は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ）によって承認された。新鮮凍結（ＦＦ）組織、血漿、及びバフィーコート試料は、ＩＲＢ承認の患者バイオバンクによって提供された。腫瘍組織切片は、専門のＧＩ病理学者が再度見直して診断を確定し、腫瘍性の細胞充実度を推定した。切片を次に巨視的に解剖した。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を用いて精製し、続いて、ＡＭＰｕｒｅ
ＸＰキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ ＣＡ）で再精製した。

Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇライブラリの調製
配列決定ライブラリを、先に公開された方法の修正版を用いて調製した。ゲノムＤＮＡ（３００ｎｇ）を１０ＵのＭｓｐＩで一夜消化した。これ以降のステップで用いた酵素はすべて、特に明記しない限り、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）によって提供された。断片は、５Ｕのクレノウ断片（３’－５’エキソ－）を用いて末端修復及びＡ－テール化し、バーコード配列及び普遍的にメチル化されたシトシンを含むＴｒｕＳｅｑアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に一夜結合させた。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０－Ｒｏｃｈｅ）を用いて結合効率及び断片の品質を評価した。試料を、修正ＥｐｉＴｅｃｔプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてバイサルファイト処理及び精製し（２回）、その後最後のＡＭＰｕｒｅ ＸＰクリーンアップを行った。ｑＰＣＲを用いて、ライブラリ濃縮のために最適なＰＣＲサイクルを決めた。以下の条件を濃縮ＰＣＲに用いた。各５０ｕＬの反応物には、５ｕＬの１０倍緩衝液、１．２５ｕＬの１０ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、（ｄＮＴＰ）、５ｕＬのプライマーカクテル（約５ｕＭ）、１５ｕＬの試料、１ｕＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｃｘホットスタート、及び２２．７５μＬの水を含めた。温度及び時間は、それぞれ、９５Ｃ－５分、９８Ｃ－３０秒、１２～１６サイクルの９８Ｃ－１０秒、６５Ｃ－３０秒、７２Ｃ－３０秒、７２Ｃ－５分、及び４Ｃ保持であった。試料は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で定量し、ランダム化４重ライブラリに統合し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）でサイズ検証のための試験をした。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製／サイズ選択のさらなるラウンドを、アダプターダイマーの混入を最小にし、３５０ｂｐより大きい挿入物を除去するために経験的に決定された緩衝液濃度で行った。最終的なライブラリの評価は、ｑＰＣＲにより、ファイＸ対照標準（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びアダプター特異的プライマーを用いて達成した。

超並列配列決定及びバイオインフォマティクス
試料をランダム化レーン割り当てに従ってフローセルにロードし、さらなるレーンを内部アッセイ対照用に確保した。配列決定は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００で行った。リードは、１０１サイクルに対して一方向性であった。各フローセルのレーンは、アラインされる配列について３０～５０倍の配列決定深度の中央値カバレッジに十分な１億～１億２０００万のリードを生成した。標準的なＩｌｌｕｍｉｎａのパイプラインソフトウェアはベースを呼び出し、ｆａｓｔｑ形式でリードを生成した。ＳＡＡＰ－ＲＲＢＳ（ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための流線解析及びアノテーションパイプライン）を配列リードの評価及びクリーンアップ、参照ゲノムへのアラインメント、メチル化状態の抽出、ならびにＣｐＧの報告及びアノテーションに使用した。低カバレッジ（≦１０）のＣｐＧを除外した。三次分析は、無情報または低試料カバレッジのＣｐＧを除去すること、及びスライドする１００ｂｐのウインドウ内で低バックグラウンド及び高密度集団を有するメチル化ＣｐＧ領域を特定することで構成した。リード－深度の基準は、症例と対照の間のメチル化％における１０％の差を検出するために望ましい検出力を基にした。統計的有意性は、リード数に基づいて、ＤＭＲごとのメチル化パーセンテージのロジスティック回帰によって決定した。個々の対象間で異なるリード深度を説明するため、過分散ロジスティック回帰モデルを用い、分散パラメータは、近似モデルからの残差のピアソンカイ２乗統計を用いて推定した。有意水準に従ってランク付けしたＤＭＲを、対照群におけるメチル化％が、がんにおいて≦１％及び≧１０％である場合にさらに検討した。ほとんどの器官部位では、これにより数百の潜在的候補が得られた。使用したさらなるフィルターは、受信者操作特性曲線下面積、シグナル対バックグラウンドメチル化％比率（比）、及びＤＭＲ全体（ならびに対照においてはその欠如）にわたるＣｐＧの陽性試料対試料共メチル化であった。

技術的及び生物組織検証
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）マーカーのアッセイを、上記の基準で判断された、肝臓探索データセットからの３０の最も見込みのあるＤＭＲについて発展させた。プライマーを、ソフトウェア（Ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ、ＭＳＰ Ｐｒｉｍｅｒ－Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）または手動のいずれかで設計した。アッセイは、バイサルファイトで変換された（メチル化及び非メチル化ゲノムＤＮＡ）、変換されていない、及び非鋳型対照に対するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲによって厳密に試験し、最適化した。陰性対照と交差反応したアッセイは、再設計または廃棄のいずれかとした。さらに、融解曲線分析を行い、特異的増幅が生じていることを確認した。技術的検証段階では、ＲＲＢＳの発見に用いた同じ試料をｑＭＳＰで再試験した。メチル化が見えないように設計したβ－アクチンアッセイを、全ＤＮＡコピーを表す分母として用いた。これらのデータをロジスティック回帰で分析し、ＡＵＣ及びシグナル対バックグラウンドの結果を発見値と比較した。半数よりやや少ないマーカーは働きが悪く、除外された。残り（Ｎ＝１６）をｑＭＳＰにより、１０４の独立した組織試料の拡張セットで調べた。さらに、実験には、１１個のメチル化がんマーカーを含めた。これらは、他のＧＩ癌（結腸、食道、膵臓、胆管）での以前の配列決定試験で特定及び検証されたとともに、強力な多臓器がんマーカーである。転帰の測定基準は、ＡＵＣ及び比であった（表３）。アッセイされたマーカーに関する箱ひげ図及び相補性マトリックスは、それぞれ図４及び５に描かれている。

全器官での検証
最良のメチル化マーカーが肝臓の外でどのように機能するかを評価するため、実験で、比較ＣｐＧメチル化％マトリックスを、ＨＣＣ試料ならびに以前に配列決定された他の主なＧＩ癌、すなわち、結腸、膵臓、食道、及び胃癌にわたる検証ＤＭＲに関する配列決定リードを用いて構築した。最終的なマーカーのパネルは、１）生物組織検証段階における全体的な性能及び２）他のがんにわたるマーカーの部位特異的特性に基づいて選択し、血漿中で試験した。血中で最も良好にＨＣＣを検出するため、非ＨＣＣのＤＮＡの過剰を前提として、普遍的かつ肝臓に特異的ながんのシグナルの両方を示すであろうロバストな１２マーカーのパネルを選択した。これらマーカーのうちの１０個は、組織検証からのものであり、異常な肝臓部位特異性を示す２つのさらなるマーカーであるＥＦＮＢ２及びＢＤＨ１は、ＲＲＢＳのデータからその後の組織検証をせずに、直接設計及び使用した。

血漿での検証
血漿ＤＮＡは、Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにて開発された自動シリカビーズ法により、２ｍＬの画分から抽出した。

このＤＮＡをその後以下に概説する独自方法を用いてバイサルファイトで変換し、精製した。

試料は、ＤＭＲ配列から作製したプライマー及びプローブ（表２参照）、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｃｌｅａｖａｓｅ ＩＩ（Ｈｏｌｏｇｉｃ）、ならびにＦＡＭ、ＨＥＸ、及びＱｕａｓａｒ ６７０色素を含む蛍光共鳴エネルギー移動レポーターカセット（ＦＲＥＴ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＱｕＡＲＴｓ形式（米国特許第８，３６１，７２０号参照）のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０）でランした。

図６は、ＱｕＡＲＴｓ（定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅）アッセイによるメチル化ＤＮＡシグネチャーの検出に使用されるＦＲＥＴカセットのオリゴヌクレオチド配列を示す。各ＦＲＥＴ配列は、３つの別々のアッセイに一緒に多重化することができるフルオロフォア及びクエンチャを含む。

目的のマーカー配列を含むプラスミドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから入手し、１× ＱｕＡＲＴｓ試薬で希釈し、設定濃度１５ｕｌの反応物当たり１コピーとした。この反応混合物を３８４ウェルの各々に分配し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで４５サイクルを繰り返し、データを収集した。ウェルには、試料を含むか含まないかのいずれかのコールを与えた。ポアソン確率変数を１に設定し、平均成功率の値を試行錯誤で入力し、それを用いてその値についての累積確率を計算した。その累積確率がシグナルを伴うウェルのパーセントと等しい場合、正しい平均成功率、この場合コピー数が見出された。これらのプラスミドを希釈し、アッセイ標準として使用した。

ＱｕＡＲＴｓ－Ｘ（米国仮特許第６２／２４９，０９７号参照）を、１１サイクルの増幅を受ける１２個までの標的に対して、プライマーを用いて行われる試料の予備増幅プレートを最初に作製することによって行う。この産物をその後１：９に希釈し、三重反応で３つの標的しか含まない後続のＱｕＡＲＴｓ反応用の鋳型として用いる。鎖の数を計算するために用いる標準は、この予備増幅を経由しない。標準ではなく試料を予備増幅することで、このアッセイの感度が増加する。

結果を回帰分割（ｒＰａｒｔ）で分析した。複数のメチル化マーカーを単一のリスクスコアに統合するためのロジスティック回帰を用いることは、標準的な手法である。しかしながら、ロジスティックモデル内でマーカー間に高次相互作用を発見すること及び／またはモデル化することは困難である。かかる効果が存在する場合、このことが我々のマーカーのパネルの予測能力を制限する。回帰分割木（ｒＰａｒｔ）は、決定木のアプローチであり、これは、マーカーのパネルの予測精度を最大にするような方法でマーカー間の高次相互作用を発見することができる。ｒＰａｒｔでは、上位３つのマーカーの組み合わせ（ＥＭＸ１、ＢＤＨ１、ＬＲＲＣ４）に関するＨＣＣ血液試料の感度及び特異度は、それぞれ、９７％及び９５％であった（図７Ａ）。別の３つのマーカーの組み合わせをモデル化した。すなわち、
選択肢番号１（ＥＭＸ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＴＳＰＹＬ５）：特異度＝１００％ 感度＝９０％（図７Ｂ）
選択肢番号２（ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＡＣＰ１）：特異度＝８８％ 感度＝１００％（図７Ｃ）
選択肢番号３（ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＳＰＩＮＴ２）：特異度＝１００％ 感度＝９０％（図７Ｄ）
血漿中の優良単一マーカーであるＥＭＸ１は、１００％の特異度で７７％の感度とともにＡＵＣ０．８９を有した。ＥＭＸ１に対するシグナルは、ステージが上がるほど高いベータアクチン正規化シグナルを示した（図８）。

実施例ＩＩ．
組織試料（ＨＣＣ７５、肝硬変２０、正常３０）は、ＤＭＲ配列から作製したプライマー及びプローブ（表５参照）、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｃｌｅａｖａｓｅ２．０（Ｈｏｌｏｇｉｃ）、ならびにＦＡＭ、ＨＥＸ、及びＱｕａｓａｒ
６７０色素を含む蛍光共鳴エネルギー移動レポーターカセット（ＦＲＥＴ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＱｕＡＲＴｓ形式（米国特許第８，３６１，７２０号参照）のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０）でランした。表６は、各マーカーが１００％の感度でＨＣＣを肝硬変及び正常から区別する能力を示す。

実施例ＩＩＩ．
この主な目的は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を予測するマーカーのパネルを決定することであった。２４４名の対象（肝細胞癌９５名、対照１４９名）由来の血漿を２ｍＬに調整し、抽出した。対照１４９名は、肝硬変患者５１名及び正常患者９８名からなっていた。

図９は、この分析で検討されたメチル化マーカーの各々の相対的重要性を示す。マーカーの全パネルの感度及び特異度の交差検定推定値は、それぞれ、７５％及び９６％であった。

正常に対して対照の８８．６％の特異度で、以下のマーカーのパネル（Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＣＣＮＪ＿３７０７）は、ＨＣＣに対して８５．３％の感度であった（表７）。

同じパネル（Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＥＭＸ１、ＨＯＸＡ１、ＣＣＮＪ＿３７０７）は、正常及び肝硬変（対照群）患者に対して以下の特異度の内訳であった（表８）。

４ｍＬの血漿試料からＤＮＡを単離する例示的な手順は、以下の通りに行われる。
・２ｍＬの血漿試料に、３００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を加えて混合する。試料が２ｍＬ未満の血漿である場合、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて２ｍＬに調整する。
・６ｍＬの血漿溶解緩衝液１を血漿に加え、室温で混合する。

血漿溶解緩衝液は、
－ ４．３Ｍのグアニジンチオシアネート
－ １０％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、分岐）である（５．３ｇのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０が４５ｍＬの４．８Ｍグアニジンチオシアネートと混合される）
・２００μＬの磁性シリカ結合ビーズ［１６μｇのビーズ／μＬ］を加え、再度混合する。
・７ｍＬの溶解緩衝液２をチューブに加える。

血漿溶解緩衝液２は、６０％の割合の溶解緩衝液１を４０％のイソプロパノールと混合して調製する。
・試料を溶解緩衝液２と６０分間混合する。
・チューブを磁石の上に置き、１０分間ビーズを集める。その上清を吸引して捨てる。
・１０００μＬの洗浄用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、８０％ＥｔＯＨ）をビーズに加え、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。
・チューブを磁石の上に置き、ビーズを集める。その上清を吸引して捨てる。
・５００μＬの洗浄用緩衝液をビーズに加え、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。
・チューブを磁石の上に置き、ビーズを集める。その上清を吸引して捨てる。
・２５０μＬの洗浄用緩衝液を加え、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。・チューブを磁石の上に置き、ビーズを集める。残りの緩衝液を吸引して捨てる。
・２５０μＬの洗浄用緩衝液を加え、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。・チューブを磁石の上に置き、ビーズを集める。残りの緩衝液を吸引して捨てる。
・振盪しながらビーズを７０℃で１５分間乾燥させる。
・１２５μＬの溶出用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）をビーズに加え、振盪しながら６５℃で２５分間インキュベートする。
・チューブを磁石の上に置き、ビーズを１０分間集める。
・ＤＮＡを含む上清を、新たな容器またはチューブに吸引して移す。
バイサルファイト変換
Ｉ．亜硫酸水素アンモニウムを用いたＤＮＡのスルホン化
１．各チューブに、６４μＬのＤＮＡ、７μＬの１Ｎ ＮａＯＨ、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．２５ｍｇ／ｍＬのフィッシュＤＮＡを含む９μＬの担体溶液を合わせる。
２．４２℃で２０分間インキュベートする。
３．１２０μＬの４５％亜硫酸水素アンモニウムを加え、６６℃で７５分間インキュベートする。
４．４℃で１０分間インキュベートする。
ＩＩ．磁気ビーズを用いた脱スルホン化
材料
磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＭａｇｎｅＳｉｌ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＡＳ１０５０、１６μｇ／μＬ）。
結合用緩衝液：６．５～７Ｍグアニジン塩酸塩。
変換後洗浄用緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌを含む８０％エタノール（ｐＨ８．０）。
脱スルホン化用緩衝液：７０％イソプロピルアルコール、０．１Ｎ ＮａＯＨを脱スルホン化用緩衝液として選択した。

本質的に以下に記載の温度及び混合速度で試料を混合もしくはインキュベートするのに適切な任意の装置または技術を用いて試料を混合する。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を試料の混合またはインキュベーションに使用することができる。例示的な脱スルホン化は以下の通りである。
１．ボトルを１分間ボルテックスし、ビーズストックを完全に混合する。
２．５０μＬのビーズを２．０ｍＬのチューブ（例えば、ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に分取する。
３．７５０μＬの結合用緩衝液をビーズに加える。
４．ステップＩからのスルホン化ＤＮＡを１５０μＬ加える。
５．混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて３０分間）。
６．磁石スタンドにチューブを置き、５分間置いておく。チューブをスタンドに置いたまま、その上清を取り出して捨てる。
７．１，０００μＬの洗浄用緩衝液を加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて３分間）。
８．磁石スタンドにチューブを置き、５分間置いておく。チューブをスタンドに置いたまま、その上清を取り出して捨てる。
９．２５０μＬの洗浄用緩衝液を加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて３分間）。
１０．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り出して捨てる。
１１．２００μＬの脱スルホン化用緩衝液を加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて５分間）。
１２．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り出して捨てる。
１３．２５０μＬの洗浄用緩衝液を加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて３分間）。
１４．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り出して捨てる。
１５．２５０μＬの洗浄用緩衝液をチューブに加える。混合する（例えば、１０００ＲＰＭで３０℃にて３分間）。
１６．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り出して捨てる。
１７．すべてのチューブを３０℃で、ふたを開けたまま１５分間インキュベートする。
１８．磁気ラックからチューブを取り出し、７０μＬの溶出用緩衝液を直接ビーズに加える。
１９．ビーズを溶出用緩衝液とともにインキュベートする（例えば、１０００ＲＰＭで４０℃にて４５分間）。
２０．チューブを磁気ラックに約１分間置き、その上清を取り出して保存する。

変換されたＤＮＡをその後予備増幅及び／またはフラップエンドヌクレアーゼアッセイに用いる。

上記明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。記載された該技術の組成物、方法、及び使用の様々な修正及び変形は、記載された技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。該技術を特定の例示的な実施形態に関連して説明してきたが、請求項にかかる本発明は、かかる特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、薬理学、生化学、医科学、または関連する分野の当業者にとって明らかである本発明を実施するために記載された方法の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (1)

1. 対象から採取される試料中の肝細胞癌（ＨＣＣ）をスクリーニングする方法であって、ａ）対象から採取される試料におけるマーカーのメチル化状態をアッセイすること、及びｂ）前記マーカーの前記メチル化状態が、ＨＣＣを有さない対象においてアッセイされた前記マーカーのメチル化状態と異なる場合に、前記対象がＨＣＣを有していると特定することを含む前記方法であり、前記マーカーは、ＡＣＰ１、ＢＤＨ１、Ｃｈｒ１２．１３３、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＢＮＬ、ＥＭＸ１、ＥＦＮＢ２、ＨＯＸＡ１、ＬＲＲＣ４、ＳＰＩＮＴ２、ＴＳＰＹＬ５、ＣＣＮＪ＿３７０７、ＣＣＮＪ＿３１２４、ＰＦＫＰ、ＳＣＲＮ１、及びＥＣＥ１から選択される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の塩基を含む、前記方法。

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